CN113817049A - 修饰的Fc片段在免疫疗法中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗体Fc片段在治疗自身免疫疾病和/或炎性疾病中的用途，所述Fc片段是分离的重组Fc片段，其对至少一种Fc受体(FcR)具有修饰的亲和力，特别是对FcRn具有增加的亲和力。

Description

修饰的Fc片段在免疫疗法中的应用

本申请为2016年7月6日提交的、发明名称为“修饰的Fc片段在免疫疗法中的应用”的PCT申请PCT/FR2016/051708的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2018年3月5日，申请号为201680051282.5。

技术领域：

本发明涉及自身免疫性疾病和/或炎性疾病的免疫疗法。

背景技术：

免疫疗法包括向患者施用外源性抗体，其目前广泛用于治疗各种病理，特别是用于自身免疫性疾病和炎性疾病的病理。

典型地提出了两种基于免疫球蛋白的疗法用于治疗这些疾病：i)基于静脉内免疫球蛋白(IVIg)的疗法，其包括向患者静脉内施用源自人血浆库的免疫球蛋白(最常见的是IgG)和ii)基于使用重组抗体(即通过基因工程获得的抗体)的疗法。后者使得炎性疾病和自身免疫性疾病患者的处理得到了真正的进步，这主要是因为它们提供了避免与使用来自血浆的免疫球蛋白相关的缺点的可能性，特别是供应短缺的风险以及传播可能存在于血浆中的病原体的风险。

免疫球蛋白中Fab片段的存在可能是负责被治疗患者中的显著不良反应。为了避免这些副作用，专利申请WO 2004/099374公开了分离的重组Fc片段用于治疗患者，特别是用于患有自身免疫性疾病的患者的用途。

然而仍然需要优化这些Fc片段，特别是为了增加它们的半衰期和/或治疗功效。

发明内容：

发明人现在提出使用与亲本Fc片段相比对至少一种Fc受体(FcR)具有修饰的亲和力的Fc片段。根据本发明，Fc片段是分离的，即它们不与Fab片段联合或不与任何其它蛋白质、多肽或肽缀合或融合。特别地，它们不是完整的免疫球蛋白。

本发明涉及用于治疗自身免疫性和/或炎性疾病的包含抗体Fc片段的组合物，所述Fc片段是与亲本Fc片段相比对Fc-γ受体III(FcγRIII)具有改善的亲和力的分离的Fc片段。

在优选的方面，它们是

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比，具有突变315D/330V/361D/378V/434Y的组合的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:11组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比，具有突变T260A和315D/330V/361D/378V/434Y的组合的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:12组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比，具有突变E258I和315D/330V/361D/378V/434Y的组合的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:13组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比，具有突变K290Y和315D/330V/361D/378V/434Y的组合的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:14组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比，具有突变E294A和315D/330V/361D/378V/434Y的组合的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:15组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比，具有突变Y296W和315D/330V/361D/378V/434Y的组合的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:16组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比，具有突变K334N/P352S/A378V/V397M组合的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:19组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比，具有突变G316D/K326E/A378V的组合的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:20组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变A378V/P396L/N421T的组合的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:21组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变T260A的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:17组成

-与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变K290Y的Fc片段，优选其中Fc片段由序列SEQ ID NO:18组成。

本发明还更一般地提供包含抗体Fc片段的组合物，其用于治疗自身免疫性和/或炎性疾病，所述Fc片段是与亲本Fc片段相比对至少一种Fc受体(FcR)具有修饰的亲和力的分离的Fc片段。

在一个具体的实施方案中，组合物包含具有一个或多个氨基酸的至少一个突变和/或在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖的抗体Fc片段，所述Fc片段的N-聚糖具有低于65％的岩藻糖基化程度。

附图简要说明：

图1示出了天然人IgG1关于216位至447位(根据EU索引)与人IgG2(SEQ ID NO:7)，人IgG3(SEQ ID NO:8)和人IgG4(SEQ ID NO:9)的相应序列的序列比对。IgG1序列是指G1m1，17同种异型(SEQ ID NO:6)和G1m3同种异型(SEQ ID NO:10)。IgG1的“CH2-CH3下部铰链”结构域从226位开始(参见箭头)。CH2结构域以灰色突出显示，并且CH3结构域以斜体显示。

图2示出了IgG1Fc(A)和scFc(B)的示意图。CH2以灰色表示，CH3以白色表示。二硫桥由细的灰色虚线表示。在scFc中，两个CH2-CH3多肽通过粗虚线表示的肽接头连接。

图3示出了能够存在于本发明的Fc片段上的聚糖结构的G0，G0F，G1和G1F形式。

图4是呈现在加入不同量的多价免疫球蛋白(IVIg)或重组Fc片段(未突变或突变(含有突变315D/330V/361D/378V/434Y的Fc片段))之后观察到的，在单克隆抗恒河猴D(RhD)抗体存在下，恒河猴D+红血细胞的效应细胞介导的裂解百分比。

图5是呈现在加入不同量的多价免疫球蛋白(IVIg)或重组Fc片段(未突变或突变(含有根据表1的突变的Fc片段))之后观察到的，在单克隆抗恒河猴D(RhD)抗体存在下，恒河猴D+红血细胞的效应细胞介导的裂解百分比。“rFc WT”表示野生型重组Fc片段。阳性对照表示为：IVIG(即，从人血浆提取的血浆抗体的混合物——IVIG是特发性血小板减少性紫癜(ITP)的参考治疗)；和对应于赫赛汀Fc片段(在哺乳动物中转基因产生的抗体，然后进行木瓜蛋白酶消化以产生Fc片段)的“IgG Mabs starting”。

图6表示通过使用Biacore的表面等离子体共振(SPR)评估的、测量WT(野生型)和突变Fc片段对人FcRn(A)和CD16aV(在CD16的158位的V多态性)的亲和力(Kd)的体外结合测定法。

图7示出了用于表达下文定义的变体T5A-74的pCEP4载体的图谱和用于表达变体T5A-74的OptiCHO载体的图谱。

发明详述：

定义

在本说明书全文中，Fc片段中残基的编号是根据EU索引的免疫球蛋白重链的编号或如Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，通过引用明确地并入本文。本文中“EU索引”或“EU索引或Kabat等效物”是指人IgG1抗体残基的编号。

术语“免疫球蛋白”是指构成抗体的天然状态生物形式的结构，包括恒定区和可变区(也称为片段)。免疫球蛋白分子是一种分子，其基本单位是由两条各约50-70kDa的重链(H)和两条各约25kDa的轻链(L)组成的异源四聚体，通过链内和链间二硫键连接在一起。

每条链由以下构成：在N-末端位置，可变结构域或区(在轻链的情况下称为VL，在重链的情况下称为VH)；在C-末端位置，恒定区(其由在轻链的情况下被称为CL的单个结构域，以及在重链的情况下被称为CH1、CH2、CH3和CH4的三个或四个结构域组成)。

只有IgM和IgE具有CH4结构域。

每个结构域包含约110个氨基酸，并以可比的方式构建结构。两条重链通过CH2结构域处的二硫键连接，并且每条重链通过CH1和CL之间的二硫键连接至轻链。决定抗体对抗原特异性的区域由可变部分携带，而恒定部分可以与效应细胞或分子如补体蛋白的Fc受体(FcR)相互作用以诱导各种功能性质。构成抗体的链的组装使得可以定义特征性的Y形三维结构，其中，

-Y的碱基对应于被补体和Fc受体识别的恒定Fc区(或Fc片段)以介导分子的效应子功能，和

-Y的臂的末端对应于轻链可变区和重链可变区的相应组装，所述末端构成Fab片段并确定抗体对抗原的特异性。

更确切地说，存在五种重链同种型(γ、α、μ、δ和ε)和两种轻链同种型(κ和λ，λ链本身被分成两种类型：λ1和λ2)。重链决定免疫球蛋白类别。因此有五类Ig：IgG(γ同种型)、IgA(α同种型)、IgM(μ同种型)、IgD(δ同种型)和IgE(ε同种型)。

κ和λ轻链由所有类别和亚类共享。在人体中，所产生的κ和λ的比例是2比1。

IgG是血清中最丰富的免疫球蛋白(循环抗体的75％至80％)。以单体形式存在时，它们具有所有免疫球蛋白最长的血清半衰期(约21天)。

有四种类型的γ重链，它们决定了四种IgG亚类(γ1的IgG1、γ2的IgG2、γ3的IgG3和γ4的IgG4)。这四种亚类在二硫桥的可变数目和位置方面不同(Basic andClinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994年，第71页和第6章)。

尽管具有高度同源性的结构(Fc区域的95％以上的序列同源性)，四种人类IgG亚类的生物学活性还有所区别。

术语“生物学活性”尤其是指IgG恒定区与补体蛋白特别是(例如蛋白C1q)[Basicand Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编著)])和/或与IgG受体：FcγR(FcγRI、FcγRII、FcγRIII；Ravetch和Kinet，AnnualReview of Immunology，卷9：457-492(1991))结合的能力。

取决于结合的类型，可以激活各种作用机制：例如，调理作用，吞噬作用，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。参见Uananue和Benacerraf，Textbook ofImmunology，第二版，Williams&Wilkins，p.218(1984))以获得进一步的细节。

术语“Fc片段”是指排除第一免疫球蛋白恒定区结构域的全长免疫球蛋白的恒定区。因此，“Fc片段”是指IgA、IgD、IgG的最后两个恒定结构域(CH2-CH3)以及IgE和IgM的最后三个恒定结构域(CH2-CH3-CH4)，以及这些结构域的N末端柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc片段可以包含J链。对于IgG，Fc片段包含CH2，CH3结构域和CH1和CH2之间的下铰链区。换言之，IgG1的Fc区由CH2-CH3下铰链，即从氨基酸C226到羧基末端的部分构成，编号根据EU索引或Kabat等效物表示。其他IgG亚类的类似结构域可以通过IgG亚类的重链或重链片段的氨基酸序列与人IgG1的氨基酸序列的比对来确定(参见图1)。根据本发明使用的Fc片段还可以包含226位上游(根据EU索引)的上部铰链区的一部分。在这种情况下，优选使用包含位于位置216和226之间的区域的一部分的人IgG1的Fc片段。在这种情况下，“人IgG1的Fc片段”是指从氨基酸216，217，218，219，220，221，222，223，224或225至羧基末端的部分。术语“Fc片段”也指单链Fc(scFc)片段。术语“scFc片段”是指通过由多肽接头连接的两个Fc单体的基因融合而获得的单链Fc片段。scFc自然折叠成功能性二聚体Fc区域。

如本文所用，术语“亲本Fc片段”或“亲本多肽”是指野生型Fc区中的参考多肽或任选含有除所考虑之外的突变的变体。术语“野生型”或“WT”在本文中是指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，即其是天然来源的(包括等位基因变异)，并且尚未通过分子生物学技术有意修饰如诱变。例如，“野生型”Fc区特别指具有序列SEQ ID NO:1的IgG1 Fc区(G1m1，17同种异型)，具有序列SEQ ID NO:2的IgG2 Fc区，具有序列SEQ ID NO:3的IgG3 Fc区，具有序列SEQ ID NO:4的IgG4 Fc区和具有序列SEQ ID NO:5(G1m3同种异型)的IgG1Fc区。

用于本发明的Fc片段是单体形式的，即它们彼此不融合或不缀合。

术语“修饰的亲和力”是指与亲本Fc片段相比亲和力降低或增加。

如本文所用的术语“新生儿Fc受体”或“FcRn”是指与IgG Fc区结合并且至少部分由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。如现有技术中已知的，功能性FcRn蛋白包含两种多肽，通常以重链和轻链的名称命名。轻链是β2-微球蛋白，重链是由FcRn基因编码。除非本文另外指明，否则术语“FcRn”或“FcRn蛋白质”是指α链与β2-微球蛋白的复合物。在人类中，编码FcRn的基因被称为FCGRT。

如本文所用的术语“FcRn结合增加”是指与亲本多肽相比，本发明的突变Fc片段对FcRn的体内或体外结合亲和力的增加。如例如专利申请WO2010/106180中所述，可以通过ELISA在体外评估本发明的突变的Fc片段结合FcRn的能力。

在本发明中，术语“半衰期”是指Fc片段一旦存在于施用其的患者的血清中，从循环中或从其他组织消除一半的时间量。

术语“Fcγ受体”或“FcγR”是指称为CD64(FcγRI)、CD32(FcγRII)和CD16(FcγRIII)的IgG型免疫球蛋白受体，特别是五种表达的受体(FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb)。除了人FcγRIIb(其是抑制免疫细胞活化的受体)之外，它们都是效应细胞活化受体(Muta T等人，Nature，1994，368：70-73)。

术语“效应细胞”是指任何带有Fc受体的细胞，例如淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、树突细胞、郎格罕细胞和血小板。

在本发明的上下文中，术语“糖基化”是指通过酶促反应将一种或多种碳水化合物添加到重组Fc片段的序列中。

在本发明的上下文中，术语“高唾液酸化”是指将一个或多个唾液酸基团添加到Fc片段的序列中。一个或多个唾液酸基团的添加可以通过酶促反应、通过细胞反应或通过靶向Fc唾液酸化中涉及的一个或多个氨基酸的Fc的定向诱变来进行。

术语“患者”是指任何人或动物受试者，优选哺乳动物。在一个优选的实施方案中，患者是人，无论年龄和性别如何。

术语“治疗(名词)”或“治疗(动词)”是指改善或预防或逆转疾病或病症，或至少可与之区分的症状，或改善或预防或逆转与待治疗的疾病或病症相关的至少一个可测量的身体参数，其不一定在被治疗的受试者中可区分或可由受治疗的受试者区分。术语“治疗(名词)”或“治疗(动词)”进一步包括抑制或减缓疾病或病症的进展，物理上，例如稳定可区分的症状，生理学上，例如稳定身体参数，或两者。

根据本发明的Fc片段的组成

本发明中使用的抗体Fc片段优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc片段，其与亲本Fc片段相比对至少一种Fc受体(FcR)具有修饰的亲和力。

与亲本Fc片段相比，根据本发明的Fc片段对至少一种Fc受体具有降低的亲和力和/或对至少一种Fc受体具有增加的亲和力。

优选地，与亲本Fc相比亲和力以至少等于2，优选高于5，优选高于10，优选高于15，优选高于20，优选高于25并且优选高于30的比率增加。换言之，突变的Fc区对FcR的亲和力高于亲本多肽的亲和力。或者，所述突变的Fc区对至少一个FcR具有降低的亲和力。优选地，与亲本Fc相比，亲和力以至少等于2，优选高于5，优选高于10，优选高于15，优选高于20，优选高于25并且优选高于30的比率降低。换言之，突变的Fc区对FcR的亲和力低于亲本多肽的亲和力。

包含Fc区的多肽对FcR的亲和力可以通过现有技术中公知的方法来评估。例如，本领域技术人员可以通过使用可以通过Biacore系统测量的表面等离子体共振(SPR)来确定亲和力(Kd)。或者，本领域技术人员可以进行合适的ELISA。可以使用合适的ELISA来比较亲本Fc和突变Fc的结合力。比较来自突变的Fc和来自亲本Fc的特定信号。结合亲和力可以通过评估整个多肽或通过评估从其分离的Fc区而相等地确定。

特别地，与亲本Fc片段比较，根据本发明使用的Fc片段具有对于至少一种Fc受体(选自FcRn、Fcγ受体和补体C1q)的下降的亲和力，和/或对于至少一种Fc受体(选自FcRn、Fcγ受体和补体C1q)的增加的亲和力。

根据具体的实施方案，根据本发明使用的Fc片段对FcRn具有修饰的亲和力，有利地增加的亲和力。FcRn结合的这种增加导致体内血清驻留的改善，并因此导致半衰期的增加。

Fc片段可以单独或混合使用；例如，具有不同突变的若干Fc片段可以以混合物的形式给药或共同给药。

本发明的Fc片段也可以用于包含单一类型的突变的Fc片段的组合物中。换言之，组合物包含相同序列的Fc片段的分子。

根据本发明的一个方面，与亲本Fc片段相比，对至少一种Fc受体具有修饰的亲和力的Fc片段含有至少一个氨基酸的突变。所涉及的突变不是定义免疫球蛋白同种型的天然变异，而是人造突变，即产生含有所需突变的Fc片段的生产方法。

优选地，突变是一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。突变的Fc片段可以具有几个突变，影响几个氨基酸，优选从两个到十个。

在一个优选的实施方案中，Fc片段具有选自以下的突变：在氨基酸226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、293、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446或447处的突变，Fc片段氨基酸的编号参照EU索引或Kabat等效物的编号。

从上面的列表的某些氨基酸位置，即226、230、241、256、259、264、307、315、330、342、361、362、378、382、383、389、396、397、421、428和434是优选的。具体地，对FcRn具有高结合亲和力的突变Fc片段可以在所述氨基酸位置处包含至少一个氨基酸改变。其中，位置230、264、307、315、330、378和434是优选的，更优选位置264、315、378和434。

在一个具体的实施方案中，与亲本Fc相比，至少两个，甚至三个、四个或五个氨基酸突变可以显著提高对FcRn的结合亲和力。

在具体的实施方案中，突变是：

(i)选自位置226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434的一个或两个突变；优选230、264、307、315、330、378和434，更优选264、315、378和434；和

(ii)选自位置226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292,293、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355 356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446和447的至少一个其他的，不同的突变，优选226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434。

在一个优选实施方案中，位置378和434中的至少一个突变；并且任选地还有选自226、230、241、264、307、315、330、342、362、378、382、389、396、397、421和434中的至少一个其它位置。

优选地，突变为226G、226Y、227S、227L、228R、228L、230S、230T、230L、230A、230Q、231T、231V、233D、234R、239A、241L、241Y、241R、243L、246R、250A、252L、256N、259I、264A、264E、264M、265G、265N、267N、267R、269D、269G、270N、270E、276S、284L、285Y、288R、289I、290R、290E、291S、291Q 292W、293del、294del、297D、298G、298N、299M、299A、299K、301C、302A、303A、303I、305A、307P、307A、307N、3081、309P、311R、315D、317R、320T、320E、322R、325S、327V、327T、330V、330T、332V、334E、334R、335A、338R、340E、342R、342E、342K、343S、345Q、345G、347R、350A、352S、354P、355Q、355G、356N、359A、360N、360R、361D、361S、362R、362E、369A、370R、371D、375A、375G、378V、378T、378S、380Q、382V、382G、383R、383N、384I、384T、385R、386R、386K、387S、387T、389T、389K、389R、390S、392E、392R、393N、394A、395A、395S、396S、396L、397A、397M、398P、399N、400P、401A、401G、403T、404L、408T、411A、412A、414R、415D、415N、416K、416G、418R、418K、418E、419H、420R、421T、421S、421D、422A、424L、426T、428L、433R、433P、434Y、434S、434H、438R、439R、440R、440N、443R、444F、444P、445S、446A、447N和447E，并且也描述于专利申请WO2010/106180。

在另一实施方案中，Fc片段包括选自226G、227L、230S、230T、230L、231T、241L、243L、250A、256N、259I、264E、265G、267R、290E、293del、294del、303A、305A、307P、307A、308I、315D、322R、325S、327V、330V、342R、347R、352S、361D、362R、362E、370R、378V、378T、382V、383N、386R、386K、387T、389T、389K、392R、395A、396L、397M、403T、404L、415N、416K、421T、426T、428L、433R、434Y、434S和439R、优选226G、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、342R、362R、362E、378V、378T、382V、389T、389K、396L、397M、421T、434Y和434S的至少一个突变。

以下呈现特定的突变组合的实例：

226G/330V、230L/264E、230L/378V、230S/315D、230S/434Y、230T/378V、241L/434S、250A/434Y、264E/378T、305A/315D、305A/330V、305A/434Y、307P/434Y、315D/389T、330V/382V、330V/389T、378V/421T、389K/434Y、389T/434Y、396L/434S、230T/264E、230T/315D、230T/434S、230T/434Y、241L/307P、264E/307P、264E/396L、315D/362R、315D/382V、362R/434Y、378V/434Y、382V/434Y、226G/315D、226G/434Y、241L/378V、307P/378V、241L/264E、378V/434S、264E/378V、264E/434S、315D/330V、330V/434Y和315D/434Y；或

226G/315D/330V、226G/315D/434Y、226G/330V/434Y、230L/264E/378V、230T/264E/378V、230T/264E/434S、230S/315D/434Y、230T/315D/434Y、230T/389T/434S、241L/264E/434S、241L/264E/378V、241L/264E/307P、241L/307P/378V、250A/389K/434Y、256N/378V/434Y、259I/315D/434Y、264E/378T/396L、264E/378V/416K、294del/307P/434Y、264E/307P/378V、264E/396L/434S、264E/378V/434S、305A/315D/330V、305A/315D/434Y、305A/330V/434Y、307P/378V/434Y、315D/330V/382V、315D/330V/389T、315D/378V/434Y、315D/389T/434Y、315D/362R/434Y、315D/382V/434Y、315D/330V/434Y、330V/382V/434Y、330V/389T/434Y和378V/383N/434Y。

在特别有利的实施方案中，Fc片段具有选自315D/330V/361D/378V/434Y(也称为“T5A-74”的突变的组合；具有这种突变组合的Fc片段因此也称为“rFc T5A-74”)，230S/315D/428L/434Y，307A/315D/330V/382V/389T/434Y，259I/315D/434Y，256N/378V/383N/434Y，E294del/T307P/N434Y(突变的组合也称为“C6A_66”；具有这种突变组合的Fc片段因此也被称为“rFc C6A_66”)的突变组合。

在另一个实施方案中，Fc片段具有选自所述Fc片段的V240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262A、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、V266M、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290G、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、Y296W、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302A、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305R和V305S的至少一种突变；编号是EU索引或Kabat等效物的编号。

在一个实施方案中，根据本发明的变体对FcγRIIIa(CD16a)具有增加的亲和力。在该具体的实施方案中，所述变体包含选自i)所述Fc片段的S298A、S298R、F243S、F243L、L242A、L242F、L242G、L242I、L242K、L242S、L242V、V240I、V240M、V240N、V240S、E258I、T260A、K290D、K290E、K290G、K290H、K290Q、K290S、K290Y、Y296H、Y296W的至少一个突变；

编号是EU索引或Kabat等效物的编号。

特定的Fc片段是序列SEQ ID NO:17的片段ZAC2-85(T260A)：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVACVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

或序列SEQ ID NO:18的ZAC3–172(K290Y)：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTYPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

在另一个实施方案中，根据本发明的变体对FcγRIIa(CD32a)具有增加的亲和力。在该具体实施方案中，所述变体包含i)选自F241H、F241Y、F243L、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、V240H、V240I、V240M、V240S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、S267A、S267Q、S267V、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V259C、V259I、V259L、V262A、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、V266M、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、K290D、K290E、K290G、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、Q295I、Q295M、R292I、R292L、R301A、R301P、R301S、S304T、V302A、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303Y、V305A、V305F、V305L、V305R、V305S、Y300I、Y300V或Y300W的至少一个突变；编号是EU索引或Kabat等效物的编号。

在另一个实施方案中，根据本发明的变体对FcγRIIb(CD32b)具有增加的亲和力。在该具体实施方案中，所述变体包含选自i)所述Fc片段的E258R、E258Y、V262A、S267A、S267Q、S267V、V264S、V266L、V266M、K290R、R301A、R301M、S304T、V302A、V302L、V302R、V303S、V305A、V305F、V305I、V305R、Y300V的至少一个突变；编号是EU索引或Kabat等效物的编号。

优选地，根据本发明的变体的特征在于亲本多肽的Fc片段至少包含：

(i)所述Fc片段的V240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262A、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、V266M、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290G、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、Y296W、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302A、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305R和V305S；编号是EU索引或Kabat等效物的编号。

(ii)选自226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、361D、362R、378V、378T、389T、389K、434Y和434S的至少一个突变，

编号是EU索引或Kabat等效物的编号，以及条件是突变(ii)和(iii)不在相同氨基酸上。

在一个特别有利的实施方案中，Fc片段具有选自以下的突变组合：

(i)T260A和315D/330V/361D/378V/434Y(突变的组合也称为“T5A-74”)。命名为“T5A-74I”的片段是仅通过添加突变T260A而区别于片段T5A-74的Fc片段。

或

(ii)E258I和315D/330V/361D/378V/434Y(突变的组合也称为“T5A-74”)。命名为“T5A-74J”的片段是仅通过添加突变E258I而区别于片段T5A-74的Fc片段。

或

(iii)K290Y和315D/330V/361D/378V/434Y(突变的组合也称为“T5A-74”)。命名为“T5A-74K”的片段是仅通过添加突变K290Y而区别于片段T5A-74的Fc片段。

或

(iv)E294A和315D/330V/361D/378V/434Y(突变的组合也称为“T5A-74”)。命名为“T5A-74L”的片段是仅通过添加突变E294A而区别于片段T5A-74的Fc片段。

或

(v)Y296W和315D/330V/361D/378V/434Y(突变的组合也称为“T5A-74”)。命名为“T5A-74M”的片段是仅通过添加突变Y296W而区别于片段T5A-74的Fc片段。

Fc片段T5A–74，T5A–74I，T5A–74J，T5A–74K，T5A–74L，T5A–74M的序列呈现在所附序列表中。

T5A–74(N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y):

SEQ ID NO:11

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK

T5A–74I(T260A/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)

SEQ ID NO:12

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVACVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK

T5A–74J(E258I/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)

SEQ ID NO:13

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPIVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK

T5A–74K(K290Y/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)

SEQ ID NO:14

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTYPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK

T5A–74L(E294A/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)

SEQ ID NO:15

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREAQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK

T5A–74M(Y296W/N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y)

SEQ ID NO:16

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQWNSTYRVVSVLTVLHQDWLDGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKDQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK

优选地，根据本发明的变体的特征在于亲本多肽的Fc片段至少包含：

(i)所述Fc片段的V240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262A、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、V266M、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290G、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、Y296W、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302A、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305R和V305S；编号是EU索引或Kabat等效物的编号。

(ii)选自378V、378T、434Y和434S的突变。

在另一个实施方案中，Fc片段具有选自下述的至少一个突变：G316D、K326E、N315D、N361H、P396L、T350A、V284L、V323I、P352S、A378V、Y436H、V266M、N421T、G385R、K326T、H435R、K447N、N434K、K334N、V397M、E283G、A378T、F423L、A431V、F423S、N325S、P343S、K290E、S375R、F405V、K322E、K340E、N389S、F243I、T307P、N389T、S442F、K248E、Y349H、N286I、T359A、S383R、K334R、T394P、V259A、T393A、P352L、Q418P、V302A、L398P、F423P、S442P、V363I、S383N、S254F、K320E、G402D、I253F、V284A、A431T、N315H、Y319H、C226Y、F405L、T393I、N434S、R255W、A287T、N286Y、A231V、K274R、V308G、K414R、M428T、E345G、F243L、P247T、Q362R、S440N、Y278H、D312G、V262A、V305A、K246R、V308I、E380G、N276S、K439Q、S267G、F423Y、A231T、K320R、L410R、K320M、V412M、T307N、T366A、P230S、Y349S、A339T、K246E、K274E、A231P、I336T、S298N、L234P、S267N、V263A、E333G、V308A、K439R、K392R、S440G、V397I、I336V、Y373D、K288E、L309P、P227S、V379A、K288R、K320T、V282A、I377T、N421S和C261R，

编号是EU索引或Kabat等效物的编号。

在一个具体的实施方案中，Fc片段至少具有2个突变的组合，所述组合选自：

(i)选自307N，326E，326T，334N，334R，352L，378V，378T，394P，396L，397M和421T的突变，和；

(ii)选自下述的至少一个突变：226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P和447N，

编号是EU索引或Kabat等效物的编号，以及条件是突变(i)和突变(ii)不在相同氨基酸上。

优选地，突变的Fc片段对补体C1q具有增加的亲和力，并且至少包含2个突变的组合，所述组合包含：

i)选自378V、378T、396L、421T、334R和326E的突变；和

ii)选自下述的至少一个突变：361H、290E、316D、248E、410R、421T、334R、394P、307P、447N、378V、284L、421T、396L、286I、315D和397M，

编号是EU索引或Kabat等效物的编号，以及条件是突变(i)和突变(ii)不在相同氨基酸上。

优选地，突变的Fc片段对FcγRIIIa(CD16a)具有增加的亲和力，并且至少包含2个突变的组合，所述组合包含：

i)选自378V、326E、397M、334N和396L的突变；和

ii)选自下述的至少一个突变：316D、397M、334N、248E、231V、246R、336T、421T、361H、366A、439R、290E、394P、307P、378V、378T、286I、286Y和298N，

编号是EU索引或Kabat等效物的编号，以及条件是突变(i)和突变(ii)不在相同氨基酸上。

优选地，突变的Fc片段对FcγRIIa(CD32a)具有增加的亲和力，并且至少包含2个突变的组合，所述组合包含：

i)选自378V、326E、397M、307N、394P、326T、396L和334N的突变；和

ii)选自下述的至少一个突变：316D、334R、334N、323I、231V、246R、336T、378T、286Y、286I、352S、383R、359A、421T、361H、315D、366A、290E、307P和439R，

编号是EU索引或Kabat等效物的编号，以及条件是突变(i)和突变(ii)不在相同氨基酸上。

优选地，突变的Fc片段对FcγRIIIb(CD32b)具有增加的亲和力，并且至少包含2个突变的组合，所述组合包含：

i)选自326E、326T、378V、397M、352L、394P、396L和421T的突变；和

ii)选自下述的至少一个突变：316D、334R、248E、334N、418P、231V、320E、402D、359A、383R、421T和361H，

编号是EU索引或Kabat等效物的编号，以及条件是突变(i)和突变(ii)不在相同氨基酸上。

优选地，突变的Fc片段至少包含3个突变的组合，所述组合包含：

(i)选自326E、326T、352L、378V、378T、396L、397M、421T、334N、334R、307N和394P的突变；和

(ii)选自下述的至少2个突变：226Y、227S、230S、231V、234P、243I、243L、246R、246E、247T、248E、253F、254F、255W、259A、261R、262A、263A、266M、267N、267G、274E、274R、276S、278H、282A、283G、284L、286I、286Y、287T、288E、288R、290E、298N、302A、305A、307P、308A、308I、308G、309P、312G、315D、316D、319H、320T、320R、320M、322E、323I、325S、333G、334N、334R、336T、339T、340E、343S、345G、349S、349H、350A 352S、359A、361H、362R、363I、366A、373D、375R、377T、378V、378T、379A、380G、383R、385R、389S、389T、392R、393A、393I、394P、396L、397I、397M、398P、405V、405L、410R、412M、414R、421T、421S、423L、423Y、423S、423P、428T、431V、431T、434K、434S、435R、436H、439R、440G、440N、442F、442P和447N，

编号是EU索引或Kabat等效物的编号，以及条件是突变(i)和突变(ii)不在相同氨基酸上。

在一个特别有利的实施方案中，Fc片段具有选自K334N/P352S/V397M/A378V(也称为“A3A-184A”的突变的组合；具有该突变组合的Fc片段因此也称为“A3A-184A”)，G316D/K326E/A378V(也称为“A3A-105D”的突变组合；具有该突变组合的Fc片段因此也称为“A3A-105D”)，P396L/N421T/A378V(突变的组合也称为“J3B-118A”；具有该突变组合的Fc片段也称为”J3B-118A“)的突变组合。。

片段A3A-184A(K334N/P352S/A378V/V397M)的序列在序列表中呈现为SEQ ID NO:19：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

片段A3A-105D(G316D/K326E/A378V)的序列在序列表中呈现为SEQ ID NO:20：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNDKEYKCKVSNEALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

片段J3B–118A(A378V/P396L/N421T)的序列在序列表中呈现为SEQ ID NO:21：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGTVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

根据另一个具体实施方案，用于本发明的突变的Fc片段具有在位置293或294的氨基酸缺失(DEL293或DEL294)，Fc片段氨基酸的编号参照EU索引或Kabat等效物的编号。这种缺失可以是Fc片段的唯一突变，或者可伴随着其他突变，特别是在以上列出的那些突变中的突变。

该单一突变导致片段的特异性糖基化，即高唾液酸化，其在糖蛋白半衰期和炎症过程方面是特别有利的。

根据另一个更具体的实施方案，用于本发明的突变的Fc片段具有在位置293或294的氨基酸缺失，并且在选自以下列表的位置处还具有一个或多个突变：226、230、241、256、259、264、307、315、330、342、361、362、378、382、383、389、396、397、421、428和434。

例如，优选的Fc片段具有突变307P、434Y以及缺失DEL294或DEL293的组合。

根据本发明的另一方面，使用包含多个Fc片段的组合物，所述Fc片段全部具有基本上相同的序列，并且整体上具有特定的糖基化模式。

根据具体的方面，用于本发明上下文中的组合物包含在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖的Fc片段，其特征在于所述Fc片段的所述N-聚糖具有低于65％，优选低于60％，优选低于55％，优选低于50％，更优选低于45％，优选低于40％，优选低于35％，优选低于30％，优选低于25％，优选低于20％的岩藻糖基化程度。

根据又另一方面，用于本发明上下文中的组合物包含Fc片段，所述Fc片段在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖，其特征在于所述Fc片段的N-聚糖具有双触角聚糖结构，该结构具有短链，低唾液酸化，具有末端甘露糖和/或非插入末端N-乙酰葡糖胺。

根据更具体的方面，用于本发明上下文中的组合物包含Fc片段，所述Fc片段在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖，其特征在于Fc片段的大于60％的所述N-聚糖是G0+G1+G0F+G1F形式，G0F+G1F形式少于50％。

根据另一个更具体的方面，用于本发明上下文中的组合物包含Fc片段，所述Fc片段在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖，其特征在于Fc片段的大于60％的所述N-聚糖为G0+G1+G0F+G1F形式，岩藻糖含量低于65％。

根据另一个更具体的方面，用于本发明上下文中的组合物包含Fc片段，所述Fc片段在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖，其特征在于Fc片段的少于40％的所述N-聚糖是G1F+G0F形式。

根据更具体的方面，本发明上下文中使用的组合物包含在其糖基化位点(Asn297)上具有N-聚糖的Fc片段，Fc片段的所述N-聚糖具有等于0％的岩藻糖基化程度。因此，本发明提供了一种组合物，其包含在其糖基化位点Asn297上具有N-聚糖的Fc片段，其特征在于所述Fc片段的所述N-聚糖不含岩藻糖。

而且，根据具体的方面，用于本发明上下文中的组合物包含在其糖基化位点Asn297上具有N-聚糖的Fc片段，其特征在于Fc片段的所述N-聚糖具有介于20％和55％之间的范围内的岩藻糖基化程度。具体地，本发明提供了一种组合物，其包含在其糖基化位点Asn297上具有N-聚糖的Fc片段，其特征在于Fc片段的所述N-聚糖具有介于20％和50％之间，介于25％和55％之间，介于25％和50％之间，介于20％和45％之间或介于25％和45％之间的范围内的岩藻糖基化程度。

根据更具体的方面，根据本发明的有用组合物包含在其糖基化位点Asn297上具有N-聚糖的Fc片段，其特征在于大于60％，优选大于80％的Fc片段的所述N-聚糖是G0+G1+G0F+G1F形式，G0F+G1F形式小于50％，优选小于40％或30％。

根据另一个更具体的方面，组合物中Fc片段的N-聚糖的大于60％是G0+G1+G0F+G1F形式，岩藻糖含量低于65％。

根据又一个更具体的方面，组合物中Fc片段的N-聚糖的小于50％，优选小于40％或30％的N-聚糖是G1F+G0F形式。

G0、G0F、G1和G1F形式选自图3所示的形式。

有利地，组合物中的Fc片段的N-聚糖具有小于25％、20％、15％或10％，优选5％，4％、3％或2％的平均唾液酸含量。

可用于本发明的上下文中的组合物包含在其糖基化位点上(Asn 297)具有N-聚糖的Fc片段，所述Fc片段的所述N-聚糖具有双触角型聚糖结构，短链，低唾液酸化、具有末端甘露糖和/或非插入末端N-乙酰葡糖胺，例如，大于60％的N-聚糖由G0+G1+G0F+G1F形式组成以及低岩藻糖化，低于50％的N-聚糖由G0F+G1F形式组成。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的Fc片段具有聚糖结构，如专利申请WO01/77181中所述。

根据一个有利的实施方案，用于本发明的Fc片段与亲本Fc片段相比包含至少一个氨基酸突变，并且在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖，所述Fc片段的N-聚糖具有低于65％，优选低于60％，优选低于55％，优选低于50％，更优选低于45％，优选低于40％，优选低于35％，优选低于30％，优选低于25％，优选低于20％的岩藻糖基化程度。优选地，Fc片段在选自上文列出的那些位置处具有一个或多个突变，特别是在选自以下列表的位置处：226、230、241、256、259、264、307、315、330、342、361、362、378、382、383、389、396、397、421、428和434；并且此外在其糖基化位点(Asn 297)上具有低于55％，优选低于50％，更优选低于45％，优选低于40％，优选低于35％，优选低于30％，优选低于25％，优选低于20％的岩藻糖基化程度的N-聚糖。

更优选地，根据本发明的组合物的Fc片段具有选自315D/330V/361D/378V/434Y、230S/315D/428L/434Y、307A/315D/330V/382V/389T/434Y、259I/315D/434Y、256N/378V/383N/434Y和DEL294/307P/434Y的突变的组合；并且此外在其糖基化位点(Asn 297)上具有低于55％，优选低于50％，更优选低于45％，优选低于40％，优选低于35％，优选低于30％，优选低于25％，优选低于20％的岩藻糖基化程度的N-聚糖。

有利地，在297位糖基化位点具有修饰的糖基化，特别是低岩藻糖基化的Fc片段具有增加的与Fc-γ受体(FcγR)，特别是FcγRIIIa(CD16a)的结合。

优选地，所述Fc片段具有对CD16a至少等于2×10⁶M^-1，至少等于2×10⁷M^-1，2×10⁸M^-1或2×10⁹M^-1的亲和力，如由Scatchard分析或BIAcore技术(基于无标记表面等离子体共振的技术)。

特别有利地，本发明的突变Fc片段可以与具有不同突变的不同突变Fc片段组合使用。例如，可以有利地使用突变的Fc Fc-Del294，突变的Fc T5A-74(也靶向FcRn)，改良的用于与FcγR结合的突变的Fc(类型A3A-184A)的混合物。

根据本发明的Fc片段生产

本发明中使用的Fc片段可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过化学合成或通过重组来产生。

在一个优选的实施方案中，用于本发明的Fc片段被称为“重组”，即它们通过重组获得。

当根据本发明的Fc片段具有一个或多个氨基酸的突变时，可以任选地通过已知技术如基因合成、定向诱变(特别是通过使用引入所需突变的特异性引物的PCR获得的)或随机诱变引入突变。优选使用如申请WO02/038756中所述的随机诱变，即MutaGen技术。该技术使用人类DNA变位酶，特别选自DNA聚合酶β，η和ι。常规的重组技术涉及宿主细胞中的重组，所述宿主细胞用一个或多个载体转化，所述载体使得能够进行有或没有Fc片段序列分泌入细胞外培养基的表达。载体通常包含启动子，翻译起始和终止信号以及调节转录的适当区域。它可以稳定地保持在宿主细胞中，并且可以任选地具有指定翻译的蛋白质分泌的特定信号。根据所使用的宿主细胞，本领域技术人员选择和优化这些各种元件。

这些载体通过本领域技术人员通常使用的方法制备，并且可以通过标准方法例如脂质转染、电穿孔、聚阳离子剂的使用、热休克或化学方法将所得到的克隆引入合适的宿主中。

宿主细胞可以选自原核或真核系统，例如细菌细胞，也可以选自酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。也可以使用昆虫细胞或植物细胞。

用于本发明的Fc片段可以通过在合适的培养基和培养条件下培养表达所述Fc片段的宿主细胞来产生；并从培养基或所述培养的细胞中回收如此产生的片段。

优选的表达Fc片段的哺乳动物细胞是大鼠细胞系YB2/0，细胞系Vero，仓鼠细胞系CHO，特别是细胞系CHO dhfr-和CHO Lec13，CHO–lec10，CHO–lec1，CHOK1SV

(Lonza，Switzerland)，CHOGnTIII(Glycart，Switzerland)，PER.C6^TM(Crucell)，HEK293，T1080，EB66，K562，NS0，SP2/0，BHK或COS。

另一个生产模式是Fc片段在转基因生物中的表达，例如在植物中(Ayala M，Gavilondo J，Rodríguez M，Fuentes A，Enríquez G，Perez L，Cremata J，PujolM.Production of plantibodies in Nicotiana plants.Methods Mol Biol.2009；483:103–34.)，或者在转基因动物例如兔、山羊、大鼠或猪的乳中的表达(Pollock，D.P.，J.P.Kutzko，E.Birck–Wilson，J.L.Williams，Y.Echelard and H.M.Meade.(1999).Transgenic milk as a method for the production of recombinantantibodies.Journal of Immunological Methods.231:147–157)。在这方面也参见文献WO200748077。

在可选的实施方案中，Fc片段是通过蛋白水解处理自身发生突变的免疫球蛋白获得的。

Fc片段的糖基化可以通过已知技术进行修饰。根据本发明的具有糖基化的Fc片段可以显著地由切割根据WO01/77181中描述的技术产生的抗体来产生，特别是通过木瓜蛋白酶。轻微岩藻糖基化的Fc片段还可以通过如下获得：例如在文献US7700321中所述的在kifunensine存在下培养的细胞中产生，或者在GDP-岩藻糖生产途径被抑制(例如通过抑制岩藻糖生产周期的至少一种酶)的细胞中产生(特别参见文献US 2010291628或US20090228994，EP 1500698，EP 1792987或US 7846725)。如文献US7393683或文献WO2006133148中所述，也可以使用抑制1,6-岩藻糖基转移酶的干扰RNA(RNAi)。例如如文献WO 0200879中所述，这可能是酵母中制备方法的问题。

如果Fc片段具有100％非岩藻糖基化的寡糖，即当Fc片段完全无岩藻糖时，可以使用本领域技术人员已知的制备方法，例如文献EP1176195、US 7214775、US 6994292、US7425449、US2010223686、WO2007099988、EP 1705251(该列表是非限制性的)中公开的那些。这可以是例如使用表达至少一种编码Fc片段的核酸的宿主细胞的方法，其中糖基化通过缺失编码α1,6-岩藻糖基转移酶的基因或通过添加所述基因突变来消除α1,6-岩藻糖基转移酶活性进行修饰，因此表达无岩藻糖的抗体片段。

治疗应用

由于其在功效和优化的效应子功能或降低的副作用方面的许多优点，本文所述的Fc片段可用于治疗自身免疫性和/或炎性疾病。

本文描述了用于治疗患者的自身免疫和/或炎性疾病的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的、对本文所述的至少一种Fc受体具有改变的亲和力的Fc片段。

在本发明中，表述“自身免疫性和/或炎性疾病”是指任选与致病性自身抗体相关的器官特异性或系统性、原发性或继发性自身免疫性和/或炎性疾病。

例如，所述疾病可以选自血小板血栓性紫癜(TTP)，特发性血栓性紫癜(ITP)，器官或移植排斥，移植物抗宿主疾病，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，不同类型的硬化症，原发性干燥综合征(或

综合征)，自身免疫性多发性神经病如多发性硬化症，1型糖尿病，自身免疫性肝炎，强直性脊柱炎，赖特综合征，痛风性关节炎，乳糜泻，克罗恩氏病，桥本氏甲状腺炎(甲状腺功能减退症)，Addison病，自身免疫性肝炎，Basedow病(甲状腺机能亢进症)，溃疡性结肠炎，血管炎如抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关系统性血管炎，成人或儿童自身免疫性血细胞减少症和其他血液学并发症如急性或慢性自身免疫性血小板减少症，自身免疫性溶血性贫血，新生儿溶血病(HDN)，冷凝集素病，血小板减少性血栓性紫癜和获得性自身免疫血友病；Goodpasture综合征，膜外肾病，自身免疫性大疱性皮肤病，顽固性肌无力，混合冷球蛋白血症，牛皮癣，幼年型慢性关节炎，炎性肌炎，儿童皮肌炎和系统性自身免疫性疾病，包括抗磷脂综合征，结缔组织病，不同类型的硬化，肺自身免疫性炎症，格林-巴利综合征，川崎病，多发性运动神经病(MMN)，慢性脱髓鞘性炎症性多发性神经病(CDIP)，自身免疫性甲状腺炎，糖尿病，重症肌无力，眼睛炎性自身免疫病，视神经脊髓炎(Devic氏病)，硬皮病，天疱疮，胰岛素抵抗引起的糖尿病，多肌炎，Biermer贫血，肾小球肾炎，Wegener病，巨细胞动脉炎，结节性动脉周围炎和Churg-Strauss综合征，斯蒂尔病，萎缩性多软骨炎，白塞氏病，单克隆丙种球蛋白病，韦格纳肉芽肿病，狼疮，溃疡性结肠炎，银屑病风湿病，结节病，胶原性结肠炎，疱疹样皮炎，家族性地中海热，伴有IgA沉积的肾小球肾炎，朗伯-伊顿肌无力综合征，交感性眼炎，Fiessinger-Leroy-Reiter综合征和脑膜脑炎综合征。

也包括其它炎性疾病，例如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，急性败血性关节炎，佐剂性关节炎，变应性脑脊髓炎，变应性鼻炎，过敏性血管炎，变态反应，哮喘，动脉粥样硬化，由慢性细菌或病毒感染引起的慢性炎症，慢性阻塞性肺病(COPD)，冠心病，脑炎，炎性肠病，炎性骨溶解，与急性和迟发性过敏反应有关的炎症，与肿瘤相关的炎症，周围神经损伤或脱髓鞘疾病，与组织创伤例如烧伤和缺血相关的炎症，由脑膜炎引起的炎症，多器官功能障碍综合征(MODS)，肺纤维化，败血症和脓毒性休克，Stevens-Johnson综合征，未分化关节炎和未分化脊柱关节病。

在本发明的具体实施方案中，自身免疫性疾病是特发性血栓性紫癜(ITP)和慢性脱髓鞘性炎性多发性神经根神经病(CDIP)。

观察到的效果之一特别是在ITP病理学中观察到的血小板破坏的限制或减少以及CDIP中外周神经的髓鞘损失的限制或减少。

在另一个具体的实施方案中，疾病是炎性疾病，例如特别是移植物抗宿主疾病。在这种情况下，具有诱导高唾液酸化的突变(例如位置294(DEL294)或293(DEL293)处的氨基酸缺失)的Fc片段是特别有利的。

可以设想任何给药途径，特别是胃肠外途径，例如静脉内，肌内，皮下，皮内或局部途径，或通过粘膜途径，例如通过吸入。肠内(口服，直肠)和鞘内途径也是可能的。优选使用静脉途径。

通常将根据本发明的Fc片段配制在包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物内。

药物组合物可以是适合于所选给药途径的任何药物形式。

根据本发明的有用的药物组合物有利地包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或介载体。例如，可以提及与药物使用相容且为本领域技术人员所知的盐水，生理的、等渗的或缓冲的溶液等。组合物可含有一种或多种选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的物质或介载体。可用于制剂(液体和/或可注射和/或固体)的物质或介载体特别是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨醇酯80、甘露醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯胶等。组合物可以任选地通过提供延长释放和/或延迟释放的药物形式或装置来配制。对于这种类型的制剂，有利地使用诸如纤维素、碳酸盐或淀粉的物质。

施用的剂量可以根据本领域技术人员评估的，例如，患者的体重和年龄，以及疾病的严重程度而变化。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的Fc片段的剂量为每天约0.05mg/kg至约1g/kg体重，即对于成人约20mg至约100g。优选地，剂量为每天约330mg/kg至约660mg/kg。

以下实施例说明本发明而不限制其范围。

重组Fc(WT和突变)的表达载体构建：

使用标准PCR方案，将重组Fc(aa221-447)的序列克隆到源自pCEP4(Invitrogen)的通用真核表达载体中以在HEK细胞中表达，以及将其克隆到OptiCHO载体中用于在YB2/0细胞中表达。

通过使用含有突变的两个引物进行重叠PCR，将Fc片段中感兴趣的所有突变插入到表达载体中。然后合并通过PCR得到的片段，并使用标准方案通过PCR扩增得到的片段。PCR产物在1％(w/v)琼脂糖凝胶上纯化，用适当的限制性内切酶消化并克隆到用于重组Fc的表达载体中。

图7示出了用于在HEK细胞中表达变体T5A-74的pCEP4载体的图谱，以及用于在YB2/0细胞中表达变体T5A-74的OptiCHO载体的图谱。

在HEK细胞中的重组Fc产生

根据标准方案(Invitrogen)，用用于重组Fc(WT或突变)的pCEP4表达载体转染HEK293细胞。培养细胞以便瞬时产生抗体。产生的抗体能够根据本领域的标准技术，鉴于其特征来分离和纯化。获得的生产速率在150-500μg/mL的级别。产物的纯度和质量通过SDS-PAGE和SEC验证。

在YB2/0细胞中的重组Fc产生

YB2/0细胞通过电穿孔用用于重组Fc(WT或突变)的OptiCHO表达载体按照标准方案稳定转染。在稳定的池中或在克隆YB2/0细胞后进行生产。

通过细胞培养生产抗体和纯化抗体的步骤是根据本领域的标准技术并鉴于其特征进行。获得的生产速率为3至30μg/mL的级别。产物的纯度和质量通过SDS-PAGE和SEC验证。

实施例1：功效试验(抑制红血细胞裂解)：

为了模拟在特发性血小板减少性紫癜(ITP)中观察到的涉及ITP患者自身抗体的红血细胞裂解的情况，在单克隆抗恒河猴D(RhD)抗体存在下进行效应细胞介导的红血细胞裂解，并评估各种量的多价免疫球蛋白(IVIg)或突变(含有根据下表1突变的重组Fc片段)和未突变的重组Fc片段抑制所述裂解的能力，例如通过与抗RhD竞争结合效应细胞表面的Fc受体。

表1：本发明优选的突变的Fc变体的构建

下表表示在用于功效测试(红血细胞裂解的抑制)以及通过表面等离子体共振(SPR)测试与人FcRn和CD16aV的结合的测试的实验中测试的突变Fc片段的不同变体。

为此，作为效应细胞，通过Ficoll梯度从外周血纯化外周血单核细胞(PBMC)。将从健康Rh-D+献血者获得的Rh-D+红血细胞与抗RhD单克隆抗体混合。将PBMC与经调理的Rh-D+红血细胞(2：1的效应物/靶比例)一起温育。

为了评估候选物(IVIg和重组Fc片段，如根据表1定义突变且未突变的)通过竞争和/或饱和Fc受体来抑制由抗RhD抗体诱导的细胞毒性的能力，每孔加入各种浓度的候选物(0至9.75μM)。16小时后，通过测量释放到上清液中的血红蛋白的量(光密度(OD)的测量)，通过显色评估裂解的红血细胞的百分比。根据下式计算特异性裂解百分比：

OD样品–OD对照0％/OD对照100％-OD对照0％×100＝％裂解

其中：

“OD对照100％”对应于红血球的全部裂解(例如NH₄Cl)

“OD对照0％”对应于用不含抗体的反应混合物观察到的裂解

结果表示为特异性裂解百分比(参见图4和5)。

实施例2：通过Biacore X100上的表面等离子体共振(SPR)的与人FcRn和CD16aV的结合的测试：

使用的蛋白质：

如之前所述(Popov等人，Mol.Immunol.33：521-530(1996))，由GTP Technology(Labège，法国)在杆状病毒细胞中产生重组人FcRn(FcRnα和β2-微球蛋白)。重组人CD16aV可商购(R&D Systems)。

在FcRn上的测试：

将CM5芯片(Biacore，GE Healthcare)的FC1和FC2细胞用0.1MN-羟基琥珀酰亚胺和0.1M 3-(N,N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳化二亚胺的1:1混合物以在30μL/分钟活化3分钟。然后将重组FcRn在10mM乙酸钠缓冲液(pH5)(固定100秒，最终固定水平350RU)中以32.6μg/mL固定在FC2细胞上。使用FC1细胞作为阴性对照，以与FC2相同的方式制备，但不存在重组FcRn。在50mM磷酸钠，150mM NaCl，0.05％Tween 20缓冲液(pH 6)中以6种不同浓度(300nM、150nM、75nM、30nM、15nM和0)将待测重组Fc注射在FC1和FC2细胞上，10μL/分钟，8分钟。通过注射1分钟的50mM磷酸钠，150mM NaCl，0.05％Tween 20缓冲液(pH7.8)，在每个样品浓度之间再生FC1和FC2细胞。用BIAevaluation version 3.1软件(Biacore)分析产生的数据，从FC2上获得的测试信号中减去FC1上获得的对照信号。

在CD16aV上测试：

使用His Capture试剂盒(GE Healthcare，第28-9950-56项)制备CM5芯片(Biacore，GE Healthcare)的FC1和FC2细胞，以便将抗组氨酸抗体固定在50μg/mL(5μL/分钟的流速，7分钟的EDC/NHS活化，7分钟的固定化，在FC1和FC2上的12,000RU的最终固定水平)。以5μL/分钟将重组人CD16aV固定在FC2细胞上(1μg/mL，在HBS-EP+，Biacore，GEHealthcare中)60秒。在单循环动力学(SCK)条件下，在HBS-EP+缓冲液中以5种不同浓度(1000nM、500nM、250nM、125nM和25nM)将待测重组Fc注射到FC1和FC2细胞上，60秒的接触时间，300秒的解离和30μL/min的流速，在每个浓度之间没有再生。各重组Fc之间的最终再生在FC1和FC2细胞中以30μL/min在10mM甘氨酸缓冲液(pH1.5)中进行60秒。用BIAevaluationversion 3.1软件(Biacore)分析产生的数据，从FC2上获得的测试信号中减去FC1上获得的对照信号。

序列表

<110> 法国血液分割暨生化制品实验室(Laboratoire Francais du Fractionnementet des Biotechnologies )

<120> 修饰的Fc片段在免疫疗法中的应用

<130> B2057PC

<160> 21

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc de l'IgG1 G1m1,17

<400> 1

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

1 5 10 15

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

20 25 30

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

35 40 45

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

50 55 60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

65 70 75 80

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

85 90 95

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

115 120 125

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

145 150 155 160

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

165 170 175

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

180 185 190

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

195 200 205

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 2

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc d' IgG2

<400> 2

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80

Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 3

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc d' IgG3

<400> 3

Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

1 5 10 15

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

20 25 30

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

35 40 45

Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

50 55 60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val

65 70 75 80

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

85 90 95

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

115 120 125

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly

145 150 155 160

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp

165 170 175

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

180 185 190

Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

195 200 205

Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 4

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc d' IgG4

<400> 4

Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

1 5 10 15

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

20 25 30

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

35 40 45

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

50 55 60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

65 70 75 80

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

85 90 95

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

115 120 125

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

145 150 155 160

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

165 170 175

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

180 185 190

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

195 200 205

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 5

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc de l'IgG1 G1m3

<400> 5

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

1 5 10 15

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

20 25 30

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

35 40 45

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

50 55 60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

65 70 75 80

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

85 90 95

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

115 120 125

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

145 150 155 160

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

165 170 175

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

180 185 190

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

195 200 205

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 6

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc de l'IgG1 G1m1,17

<400> 6

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 7

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc d' IgG2

<400> 7

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Pro Gly Lys

225

<210> 8

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc d' IgG3

<400> 8

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys

1 5 10 15

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

20 25 30

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

35 40 45

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro

50 55 60

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

65 70 75 80

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

85 90 95

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp

100 105 110

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

115 120 125

Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

130 135 140

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

145 150 155 160

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg

165 170 175

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

180 185 190

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

195 200 205

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn

210 215 220

Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

225 230 235 240

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser

245 250 255

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser

260 265 270

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275

<210> 9

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc d' IgG4

<400> 9

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 10

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc de l'IgG1 G1m3

<400> 10

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 11

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段T5A-74

<400> 11

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 12

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段T5A-74I

<400> 12

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Ala Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 13

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段T5A-74J

<400> 13

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 14

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段T5A-74K

<400> 14

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Tyr Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 15

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段T5A-74L

<400> 15

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 16

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段T5A-74M

<400> 16

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Trp Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asp Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asp Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 17

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段ZAC2-85

<400> 17

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Ala Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 18

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段ZAC3-172

<400> 18

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Tyr Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 19

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段A3A-184A

<400> 19

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 20

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段A3A-105D

<400> 20

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Asp

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Glu Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 21

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Fc片段J3B-118A

<400> 21

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Thr Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

Claims (30)

1.一种包含抗体Fc片段的组合物，用于治疗自身免疫和/或炎性疾病，所述Fc片段是与亲本Fc片段相比对FcγRIII受体具有改善的亲和力的分离的Fc片段。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变315D/330V/361D/378V/434Y的组合，优选其中所述Fc片段由序列SEQ ID NO:11组成。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变T260A和315D/330V/361D/378V/434Y的组合，优选其中所述Fc片段由序列SEQ IDNO:12组成。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变E258I和315D/330V/361D/378V/434Y的组合，优选其中所述Fc片段由序列SEQ IDNO:13组成。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变K290Y和315D/330V/361D/378V/434Y的组合，优选其中所述Fc片段由序列SEQ IDNO:14组成。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变E294A和315D/330V/361D/378V/434Y的组合，优选其中所述Fc片段由序列SEQ IDNO:15组成。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变Y296W和315D/330V/361D/378V/434Y的组合，优选其中所述Fc片段由序列SEQ IDNO:16组成。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变K334N/P352S/A378V/V397M的组合，优选其中所述Fc片段由序列SEQ ID NO:19组成。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变G316D/K326E/A378V的组合，优选其中所述Fc片段由序列SEQ ID NO:20组成。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变A378V/P396L/N421T的组合，优选其中所述Fc片段由序列SEQ ID NO:21组成。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变T260A，优选其中所述Fc片段由序列SEQ ID NO:17组成。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fc片段与野生型IgG1的亲本Fc片段相比具有突变K290Y，优选其中所述Fc片段由序列SEQ ID NO:18组成。

13.一种包含抗体Fc片段的组合物，用于治疗自身免疫和/或炎性疾病的用途，所述Fc片段是与亲本Fc片段相比对至少一种Fc受体(FcR)具有修饰亲和力的分离的Fc片段。

14.用于根据权利要求13所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述Fc受体选自FcRn、Fcγ受体和补体C1q。

15.用于根据权利要求1、13或14所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述Fc片段具有一个或多个氨基酸的突变。

16.用于根据权利要求15所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述突变是一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。

17.用于根据权利要求1或13至15中任一项所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述Fc片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc片段，其与亲本Fc片段相比具有一个或多个氨基酸的至少一个突变。

18.用于根据权利要求1至17中任一项所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述Fc片段是重组获得的。

19.用于根据权利要求15至18中任一项所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述突变参与与所述亲本Fc片段相比增加半衰期。

20.用于根据权利要求15至19中任一项所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述突变选自氨基酸226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、293、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、383、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446或447处的突变，Fc片段氨基酸的编号参照EU索引或Kabat等效物的编号。

21.用于根据权利要求15至19中任一项所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述突变选自氨基酸240、241、242、243、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304或305处的突变，Fc片段的氨基的编号参照EU索引或Kabat等效物的编号。

22.用于根据权利要求21所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述突变是293或294位氨基酸的缺失(DEL293或DEL294)，所述Fc片段氨基酸的编号参照EU索引或Kabat等效物的编号。

23.用于根据权利要求21或22的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述突变参与Fc片段的糖基化，优选高唾液酸化。

24.用于根据权利要求1至23中任一项所述的用途的包含Fc片段的组合物，所述Fc片段在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖，其特征在于所述Fc片段的N-聚糖具有低于65％，优选低于60％，优选低于55％，优选低于50％，更优选低于45％，优选低于40％，优选低于35％，优选低于30％，优选低于25％，优选低于20％的岩藻糖基化程度。

25.用于根据权利要求1至24中中任一项所述的用途的包含Fc片段的组合物，所述Fc片段在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖，其特征在于所述的Fc片段的N-聚糖具有双触角型聚糖结构，带有短链，低唾液酸化，带有末端甘露糖和/或非插入的末端N-乙酰葡糖胺。

26.用于根据权利要求1至25中任一项所述的用途的包含Fc片段的组合物，所述Fc片段在其糖基化位点上具有N-聚糖(Asn 297)，其特征在于所述Fc片段的N-聚糖的大于60％是G0+G1+G0F+G1F形式，G0F+G1F形式少于50％。

27.用于根据权利要求1至25中任一项所述的包含Fc片段的组合物的用途，所述Fc片段在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖，其特征在于所述Fc片段的N-聚糖的大于60％是G0+G1+G0F+G1F形式，岩藻糖含量低于65％。

28.用于根据权利要求26或27所述的用途的包含Fc片段的组合物，所述Fc片段在其糖基化位点(Asn 297)上具有N-聚糖，其特征在于所述Fc片段的N-聚糖的少于40％是G1F+G0F形式。

29.用于根据权利要求1至28中任一项所述的用途的包含Fc片段的组合物，所述疾病选自特发性血栓性紫癜，慢性脱髓鞘炎性多发性神经根神经病(CDIP)，器官或移植排斥，移植物抗宿主疾病，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，不同类型的硬化症，原发性干燥综合征(或

综合征)，自身免疫性多发性神经病如多发性硬化症，1型糖尿病，自身免疫性肝炎，强直性脊柱炎，赖特综合征，痛风性关节炎，乳糜泻，克罗恩氏病，桥本氏甲状腺炎(甲状腺功能减退症)，Addison病，自身免疫性肝炎，Basedow病(甲状腺机能亢进症)，溃疡性结肠炎，血管炎如抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关系统性血管炎，成人或儿童自身免疫性血细胞减少症和其他血液学并发症如急性或慢性自身免疫性血小板减少症，自身免疫性溶血性贫血，新生儿溶血病(HDN)，冷凝集素病，血小板减少性血栓性紫癜和获得性自身免疫血友病；Goodpasture综合征，膜外肾病，自身免疫性大疱性皮肤病，顽固性肌无力，混合冷球蛋白血症，牛皮癣，幼年型慢性关节炎，炎性肌炎，儿童皮肌炎和系统性自身免疫性疾病，包括抗磷脂综合征，结缔组织病，不同类型的硬化，肺自身免疫性炎症，格林-巴利综合征，川崎病，多发性运动神经病(MMN)，自身免疫性甲状腺炎，糖尿病，重症肌无力，眼睛炎性自身免疫病，天疱疮，胰岛素抵抗引起的糖尿病，多肌炎，Biermer贫血，肾小球肾炎，Wegener病，巨细胞动脉炎，结节性周围动脉炎和Churg-Strauss综合征，斯蒂尔病，萎缩性多软骨炎，白塞氏病，单克隆丙种球蛋白病，韦格纳肉芽肿病，狼疮，溃疡性结肠炎，银屑病风湿病，结节病，胶原性结肠炎，疱疹样皮炎，家族性地中海热，伴有IgA沉积的肾小球肾炎，朗伯-伊顿肌无力综合征，交感性眼炎，Fiessinger-Leroy-Reiter综合征和脑膜脑炎综合征，视神经脊髓炎(Devic病)和硬皮病。

30.用于根据权利要求29所述的用途的包含Fc片段的组合物，其中所述Fc片段在293或294位具有氨基酸缺失(Del293或DEL294)，并且所述疾病是移植物抗宿主疾病。

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