CN113812600B - 一种两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法，属于食品技术领域。本发明提供了一种使用大豆蛋白替代奶油两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法，本发明用大豆蛋白部分替代奶油作为蛋白源辅助底物，将植物蛋白与动物蛋白相结合，提高营养价值。更将两步酶解法与乳酸菌发酵合理结合，更高效地发挥菌酶的作用，提高原料利用率，在保证特征风味的前提下加快产香速率以及提高香气强度，同时使香气更为细腻自然、柔和丰富。

Description

一种两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法

技术领域

本发明涉及一种两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法，属于食品技术领域。

背景技术

奶油因其较高的风味价值广受人们喜爱，在菜式、甜点和烘焙食品中应用广泛，但成本较高，蛋白源营养与风味物质的种类和含量都较为匮乏。因此需对奶油进行增香处理、丰富其蛋白源物质的组成，减少奶油用量成本的同时达到较高的风味要求和营养价值。

大豆蛋白是以大豆为原料生产的一种优质植物蛋白，可作为动物蛋白的替代品种之一。其营养全面，高蛋白低脂，不含胆固醇，氨基酸种类、含量丰富，具有增钙、降胆固醇等功效，将其用于食品中，可提高食品的蛋白质含量，增强营养价值。同时，其良好的功能特性如乳化性、水合性、吸油性、凝胶性等更能够进一步帮助提高食品的品质，被广泛应用于面制品、鱼糜制品、乳制品、肉类制品中。

然而我国对大豆蛋白的利用仍处于初级阶段，产品种类单一，资源利用率低，因此我们需要加强新产品的研发。

在奶味香基的制备方法中，勾兑、香精等处理不符合目前食品绿色化健康化的趋势，同时获得的香味刺激不柔和。而生物法，即以奶油为主要原料，通过微生物、酶的作用得到香味增强150～250倍的风味香基，在克服上述不足的同时，其口感更细腻，香味更丰富，同时还可以获得某些有益物质，在一定程度上增强营养价值。

发酵工程技术和酶工程技术是制备奶味香基的关键技术，而现有的奶味香基多为单一酶法、微生物法或是将一步酶法与微生物法简单结合，即在发酵时同时加入蛋白酶和/或脂肪酶等制备而得，但是，采用目前的方法制备得到的奶味香基存在蛋白源营养与风味物质单一匮乏、香气类型单调、产香周期长速率低、风味刺激不柔和，容易产生刺激性风味，产率较低且耗时较长等缺点。

例如，周美玉等在“复合酶酶解黄油制备天然奶油香精”论文中采用了酶工程的技术手段制备得到了奶味香基，虽然该技术方案达到了提高风味强度的效果，但是缺点是香气类型单调，容易产生刺激性风味；又如，汪薇等在“乳酸菌发酵制备天然奶味香精的研究”论文中采用发酵工程的技术方案，虽然改善了酶工程的香气类型单调，容易产生刺激性风味的缺点，达到了香气独特柔和，丰富细腻的效果，但其香气强度小、产率较低且耗时较长；又如，林伟锋等在“蛋白酶和脂肪酶对稀奶油-乳清体系发酵特性及风味的影响”论文中，采用了酶工程与发酵工程简单相结合的技术方案，虽然达到了一定程度上弥补了某种单一方法的不足的效果，但是缺点是脂肪水解生成大量游离脂肪酸抑制蛋白质水解、乳酸菌生长的同时脂肪酶也会被蛋白酶水解，从而导致菌酶效益无法最大化，浪费资源，成本提高等问题；因此需要一种更加合理而高效制备具有发酵香气和浓厚干酪风味的奶味香基的方法。

发明内容

为了解决现有的奶味香基存在蛋白源营养与风味物质单一匮乏、香气类型单调、产香周期长速率低、风味刺激不柔和、不够绿色安全天然以及制备过程中菌酶作用间产生拮抗作用无法效益最大化等缺点，同时，以大豆蛋白(包括大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白等)制作的产品存在种类单一、加工程度低、资源利用率低等不足，本发明提供了一种奶味复合香基的制备方法，不仅丰富大豆蛋白加工产品，延伸其产业链，并且提供一种更合理有效地将发酵酶解结合、过程程度更可控，产香快速，香气自然强烈、丰富柔和、细腻饱满的绿色天然奶味复合香基，同时在一定程度上增强其营养价值。

本发明提供了一种奶味复合香基的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)配制底物：

将乳脂与植物蛋白按质量比为(1:5)～(20:1)的比例混合后，得到混合物；将混合物与水按照质量比为(1:0)～(1:9)的比例进行混合，配制得到底物，将底物均质；

(2)发酵、蛋白酶解：

将乳杆菌菌种按照1×10³～1×10⁸CFU/g的接种量接种至步骤(1)制备得到的均质后的底物中，同时向底物中按照质量分数为0.05～1％的比例添加蛋白水解酶，并在28～32℃条件下培养6～48h；

(3)脂肪酶解

向步骤(2)制备得到的产物中按照质量分数为0.05～1％的比例添加脂肪水解酶，并在35～50℃的条件下酶解1～4h，即得奶味复合香基。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)为：将奶油与植物蛋白按质量比为(1:5)～(20:1)的比例充分混合后，适量加水，制得质量浓度为10～90％的液体底物，均质，灭菌后，降温至25～35℃。

在本发明的一种实施方式中，所述均质的条件为：75℃，20Mpa。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，在28～32℃条件下培养6～48h后，进行灭菌，降温至室温。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，在35～50℃的条件下酶解1～4h后，进行灭菌，即得奶味复合香基。

在本发明的一种实施方式中，灭菌条件为在80-95℃下灭菌15-30min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中的乳脂可为稀奶油、奶油、无水奶油中的一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中的植物蛋白包括大豆蛋白、花生蛋白、小麦蛋白等其他植物源性的蛋白、植物蛋白浓缩物和衍生物中的一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，所述植物蛋白为大豆蛋白。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中的菌种为保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、德式乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌，副干酪乳杆菌，乳酸乳球菌，植物乳杆菌等中的一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，所述菌均购于北纳生物科技有限公司，保加利亚乳杆菌保藏号为BNCC223782，所述瑞士乳杆菌保藏号为BNCC193203，所述德式乳杆菌保藏号为BNCC168312，所述嗜热链球菌保藏号为BNCC340813，所述干酪乳杆菌保藏号为BNCC137633，所述副干酪乳杆菌保藏号为BNCC345679，所述乳酸乳球菌保藏号为BNCC223809，所述植物乳杆菌保藏号为BNCC194165。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中的蛋白水解酶为肽酶，风味蛋白酶，复合蛋白酶，中性蛋白酶，碱性蛋白酶，酸性蛋白酶中的一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，所述肽酶为Peptidase R，所述风味蛋白酶为Flavourzyme500MG，所述复合蛋白酶为Protamex，所述中性蛋白酶为Neutrase 0.5L，所述碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L，所述酸性蛋白酶购自湖南新鸿鹰生物工程有限公司。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中的脂肪水解酶为脂肪酶和/磷脂酶。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶为Palatase 20000L，所述磷脂酶购自山东科技文兴生物科技有限公司。

本发明还提供了采用上述方法制备得到的奶味复合香基。

本发明还提供了一种含有上述奶味复合香基的产品。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或保健品。

在本发明的一种实施方式中，所述食品包括菜肴、烘焙食品、发酵食品、冷饮、甜品中的任一种。

在本发明的一种实施方式中，所述保健品包括低脂健身粉、精华胶囊。

本发明还提供了上述奶味复合香基在制备菜肴、烘焙食品、发酵食品、冷饮、甜品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用为，将上述奶味复合香基直接作为原料于菜肴、烘焙食品、发酵食品、冷饮、甜品的制备过程中进行添加或者将其作为一种基料进行喷雾干燥处理制成奶味香精应用于各类产品。

有益效果

(1)本发明制备的奶味复合香基，用大豆蛋白部分替代奶油，作为蛋白源辅助底物，将植物蛋白与动物蛋白相结合，弥补了奶油蛋白类营养物质含量和种类不足的缺陷，构建全新复合底物体系，符合绿色化健康化的食品发展趋势，拓展了奶味香基的营养价值以及风味和口感类型，弥补稀奶油生产成本高以及对大豆蛋白利用不足的缺陷，同时拓宽大豆蛋白利用渠道，延伸产业链，充分利用资源，增加经济效益。

(2)本发明采用蛋白酶和乳酸菌的共同加入的方法，能够更高效地降解蛋白产生多肽和氨基酸，进一步提高了香基的营养价值，而且肽和氨基酸可以促进乳酸菌生长，产酸产香，大大缩短发酵时间，并且可以被乳酸菌代谢利用产生更多的营养、风味物质与风味前体物质。相同条件下，同时添加蛋白酶与乳酸菌时，发酵16小时便可以达到只添加乳酸菌时发酵48小时的菌株数量；相等发酵时间下，同时添加蛋白酶与乳酸菌时氨基酸总量比只添加乳酸菌时氨基酸总量增加了53.40％。

(3)本发明采用发酵、蛋白酶解后添加脂肪酶的制备方法，不仅能够兼具微生物法和酶法所长，提高营养价值以及在保证特征风味的前提下加快产香速率，提高香气强度，获得兼具浓厚发酵香气和干酪风味的奶味复合香基；并且避免乳酸菌、蛋白酶和脂肪酶三者共同添加时由于脂肪水解生成大量游离脂肪酸抑制蛋白质水解以及脂肪酶被蛋白酶水解的问题。如此可以更高效地发挥菌酶的作用，充分水解原料的脂肪和蛋白质，提高原料利用率。此种方法制备得到的香基相较于乳酸菌、蛋白酶和脂肪酶三者共同添加得到的香基，其3-羟基-2-丁酮，作为黄油和奶酪产品中常见的强效气味化合物，含量增加了333.76％，重要的短链挥发性脂肪酸丁酸和己酸含量分别增加98.52％、22.42％，而风味不良的长链脂肪酸含量则都降低。

(4)本发明将两步酶解法与微生物法合理地结合，使得发酵、蛋白酶解与脂肪酶解各自的程度可控性更强，更利于工业化应用，同时可获得的香基的风味口感类型更广，提供更多的选择性与适用性，可广泛用于菜肴、烘焙食品、冷饮、甜品、零食的直接赋香，也可作为奶味香精的一种基料。

附图说明

图1：含有乳酸菌的实施例与对比例的菌株生长曲线。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

下述实施例中所涉及的菌均购于北纳生物科技有限公司，其中，下述实施例中所涉及的保加利亚乳杆菌保藏号为BNCC223782，瑞士乳杆菌保藏号为BNCC193203，德式乳杆菌保藏号为BNCC168312，嗜热链球菌保藏号为BNCC340813，干酪乳杆菌保藏号为BNCC137633，副干酪乳杆菌保藏号为BNCC345679，乳酸乳球菌保藏号为BNCC223809，植物乳杆菌保藏号为BNCC194165。

下述实施例所涉及的碱性蛋白酶Alcalase 2.4L、风味蛋白酶Flavourzyme500MG、复合蛋白酶Protamex、脂肪酶Palatase 20000L购自诺维信(中国)投资有限公司；肽酶Peptidase R、中性蛋白酶Neutrase 0.5L购自天野酶制剂(江苏)有限公司；酸性蛋白酶购自湖南新鸿鹰生物工程有限公司；磷脂酶购自山东科技文兴生物科技有限公司。

下述实施例所涉及的大豆蛋白购于山东香驰豆业科技有限公司；稀奶油购于雀巢食品有限公司；奶油、无水奶油购于恒天然商贸(上海)有限公司。

下述实施例中所涉及的乳酸菌菌落数检测方法如下：

采用梯度稀释平板计数法每隔4h测定乳酸菌活菌菌落数，每组取0.5g奶油样品进行10倍梯度稀释(10⁵～10⁷倍)，取100μL稀释液、生理盐水(空白对照)加入mMRS固体培养基的平板，平板置于30℃厌氧条件下倒置培养，48h后进行菌落计数，每个样品相同稀释浓度下做3个平行。

下述实施例中所涉及的挥发性风味物质的检测方法如下：

称取5g奶油样品到20mL顶空小瓶中并密封，将小瓶在60℃水浴中平衡20min，将老化后的65μm PDMS/DVB萃取头插入小瓶顶部空间并吸附40min，然后取出吸附完挥发性物质的萃取头插入气相色谱质谱联用仪进样孔，解吸附10min。

毛细管色谱柱型号为DB-WAX 122-7032(30m×0.25mm×0.25μm)，高纯氦气作为载气，流速为1mL/min。气质联用仪程序设置如下：40℃保留2min，然后以6℃/min的速度升至100℃，接着以10℃/min的速度升至230℃，保持6min。进样孔温度为250℃，电离方式为EI，离子源温度为200℃，电子能量为70eV，发射电流为200μA，采用全扫描采集方式，质量范围为33～495m/z。所得GC-MS图谱峰与Wiley Library和NIST Library数据进行匹配检索，匹配度和纯度大于900视为有效鉴定结果，采用峰面积表示挥发性风味物质的相对含量。

下述实施例中所涉及的游离氨基酸的检测方法如下：

游离氨基酸的测定在高效液相色谱(HPLC)系统上进行，该系统配备有ODSHypersil毛细管柱、自动进样器和紫外检测器。称取1g奶油样品放入25mL容量瓶中，用5％(w/w)三氯乙酸定容，置于超声仪中在25℃下超声15min，放置2h，然后在10000rpm下离心30min，得到的上清液再次通过过滤器过滤，获得用于测定的最终滤液。

检测参数设置如下：柱温，40℃；检测波长，338nm(脯氨酸为262nm)；流动相A(pH7.2):(27.6mmol/L醋酸钠-三甲胺-四氢呋喃，体积比为500:0.11:2.50)；流动相B(pH7.2)：(80.9mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈，体积比为1:2:2)。梯度洗脱如下进行：8％B，0min；50％B，17.0min；100％B，20.1min；0％B，24.0min，流速为1.0mL/min。

用外标法从峰面积计算游离氨基酸浓度。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

mMRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸出物5.0g，酵母提取物5.0g，麦芽提取物10.0g，葡萄糖5.0g，麦芽糖10.0g，果糖5.0g，K₂HPO₄ 4.0g，KH₂PO₄ 2.6g，NH₄Cl 3.0g，L-cysHCl 0.5g，吐温80 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，MnSO₄·7H₂O 0.05g，加去离子水定容至1000mL，pH 6.2～6.8。

mMRS固体培养基：在mMRS液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂。

实施例1：奶味复合香基的制备

一种使用大豆蛋白替代奶油两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法，步骤如下：

(1)将100g稀奶油与5g大豆蛋白充分混合后，加入7.5g水，制得质量浓度为40％的液体底物，将配制的底物进行均质，均质条件为75℃，20Mpa，均质结束后在95℃的温度环境下灭菌15min，并将底物降温至25℃；

(2)制备乳杆菌菌悬液

挑取保加利亚乳杆菌单菌落接种于1mL mMRS液体培养基中，30℃厌氧培养18h后，制备得到种子液，将种子液以2％(v/v)的接种量转接于mMRS液体培养基中，培养24h后，得到发酵液，将发酵液置于4000r/min条件下离心10min，弃上清液，收集菌体，使用无菌水重悬菌体，获得菌悬液；

(3)将步骤(2)中得到的保加利亚乳杆菌菌悬液接种于步骤(1)的产物中，接种量为1.5×10⁷CFU/g；同时向产物中添加0.06g的风味蛋白酶Flavourzyme 500MG，在28℃的恒温培养箱中培养15h后，在95℃的温度环境下灭菌15min后降至室温；

(4)向步骤(3)制得的产物中加入0.06g的脂肪酶Palatase 20000L，在37℃的条件下恒温酶解4h，并在95℃的温度环境下灭菌15min，灭菌后，即得奶味复合香基1。

实施例2：奶味复合香基的制备

一种使用大豆蛋白替代奶油两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法，步骤如下：

(1)将120g奶油与50g大豆蛋白充分混合后，加入45.43g水，制得质量浓度为70％的液体底物，将配制的底物进行均质，均质条件为75℃，20Mpa，均质结束后在90℃的温度环境下灭菌17min，并将底物降温至30℃；

(2)制备乳杆菌菌悬液

分别挑取乳酸乳球菌和干酪乳杆菌单菌落，分别接种于1mL mMRS液体培养基中，在30℃厌氧培养18h后，制备得到种子液，将种子液分别以2％(v/v)的接种量转接于mMRS液体培养基中，培养24h后，得到发酵液，将发酵液置于4000r/min条件下离心10min，弃上清液，收集菌体，使用无菌水重悬菌体，获得菌悬液；

(3)将步骤(2)得到的乳酸乳球菌和干酪乳杆菌菌悬液分别按照2×10⁷CFU/g和3×10⁷CFU/g的接种量，同时接种于步骤(1)的产物中，并向产物中添加0.05g的复合蛋白酶Protamex和0.05g的肽酶Peptidase R，在30℃的恒温培养箱中培养10h后，在90℃的温度环境下灭菌17min后降至室温；

(4)向步骤(3)制得的产物中加入0.07g的磷脂酶，在40℃的条件下恒温酶解3.5h，并在90℃的温度环境下灭菌17min，灭菌后，即得奶味复合香基2。

实施例3：奶味复合香基的制备

一种使用大豆蛋白替代奶油两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法，步骤如下：

(1)将150g奶油与150g大豆蛋白充分混合后，加入804g水，制得质量浓度为25％的液体底物，将配制的底物进行均质，均质条件为75℃，20Mpa，均质结束后在85℃的温度环境下灭菌20min，并将底物降温至30℃；

(2)制备乳杆菌菌悬液

分别挑取副干酪乳杆菌和植物乳杆菌单菌落接种，分别接种于于1mL mMRS液体培养基中，30℃厌氧培养18h后制备得到种子液，将种子液分别以2％(v/v)的接种量转接于mMRS液体培养基中，培养24h后，得到发酵液，将发酵液置于4000r/min离心10min，弃上清液，收集菌体，使用无菌水重悬菌体，获得菌悬液；

(3)将步骤(2)得到的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌菌悬液分别按照5×10⁷CFU/g和1×10⁷CFU/g的接种量，同时接种于步骤(1)的产物中，并向产物中添加0.3g的酸性蛋白酶和0.25g的肽酶Peptidase R，在32℃的恒温培养箱中培养7h后，在85℃的温度环境下灭菌20min后降至室温；

(4)向步骤(3)制得的产物中加入0.2g的磷脂酶和0.3g的脂肪酶Palatase20000L，在45℃的条件下恒温酶解2h，并在85℃的温度环境下灭菌20min，灭菌后即得奶味复合香基3。

实施例4：奶味复合香基的制备

一种使用大豆蛋白替代奶油两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法，步骤如下：

(1)将200g无水奶油与200g大豆蛋白充分混合后，加入225g水，制得质量浓度为64％的液体底物，将配制的底物进行均质，均质条件为75℃，20Mpa，均质结束后在80℃的温度环境下灭菌30min，并将底物降温至32℃；

(2)分别挑取德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌和嗜热链球菌单菌落，分别接种于1mL mMRS液体培养基中，30℃厌氧培养18h后，制备得到种子液，将种子液分别以2％(v/v)的接种量转接于mMRS液体培养基中，培养24h后，得到发酵液，将发酵液置于4000r/min条件下离心10min，弃上清液，收集菌体，使用无菌水重悬菌体，获得菌悬液；

(3)将步骤(2)得到的德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌和嗜热链球菌菌悬液分别按照2×10⁷CFU/g、3×10⁷CFU/g、4×10⁷CFU/g的接种量，同时接种于步骤(1)的产物中，并向产物中添加0.5g的风味蛋白酶Flavourzyme 500MG，0.3g的复合蛋白酶Protamex和0.2g的碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，在32℃的恒温培养箱中培养6h后，在80℃的温度环境下灭菌30min后降至室温；

(4)向步骤(3)制得的产物中加入0.5g的磷脂酶和0.5g的脂肪酶Palatase20000L，在50℃的条件下恒温酶解1h，并在80℃的温度环境下灭菌30min灭菌后，即得奶味复合香基4。

对比例1：

采用实施例1中未经处理的稀奶油作为对比例1。

对比例2：

具体实施方式同实施例1，区别在于，步骤(3)中只接入保加利亚乳杆菌菌悬液且去除步骤(4)；即，具体步骤如下：

步骤(1)和步骤(2)同实施例1；

将步骤(2)中得到的保加利亚乳杆菌菌悬液接种于步骤(1)的产物中，接种量为1.5×10⁷CFU/g；在28℃的恒温培养箱中培养15h后，在95℃的温度环境下灭菌15min后，降至室温，即得奶味复合香基。

对比例3：

具体实施方式同实施例1，区别在于，步骤(3)中只添加风味蛋白酶且去除步骤(2)和步骤(4)；即，具体步骤如下：

步骤(1)同实施例1；

向步骤(1)制备得到的产物中添加0.06g的风味蛋白酶Flavourzyme 500MG，在28℃的恒温培养箱中培养15h后，在95℃的温度环境下灭菌15min后降至室温，即得奶味复合香基。

对比例4：

具体实施方式同实施例1，区别在于，去除步骤(2)和步骤(3)，即，具体步骤如下：

步骤(1)同实施例1；

向步骤(1)制得的产物中加入0.06g的脂肪酶Palatase 20000L，在37℃的条件下恒温酶解4h，并在95℃的温度环境下灭菌15min，灭菌后，即得奶味复合香基。

对比例5：

具体实施方式同实施例1，区别在于，去除步骤(4)，即，按照实施例步骤(1)～(3)的顺序制备得到奶味复合香基。

对比例6：

具体实施方式同实施例1，区别在于，步骤(3)中只接入保加利亚乳杆菌菌悬液；即，具体步骤如下：

步骤(1)和步骤(2)同实施例1；

(3)将步骤(2)中得到的保加利亚乳杆菌菌悬液接种于步骤(1)的产物中，接种量为1.5×10⁷CFU/g；在28℃的恒温培养箱中培养15h后，在95℃的温度环境下灭菌15min后降至室温；

(4)向步骤(3)制得的产物中加入0.06g的脂肪酶Palatase 20000L，在37℃的条件下恒温酶解4h，并在95℃的温度环境下灭菌15min，灭菌后，即得奶味复合香基。

对比例7：

具体实施方式同实施例1，区别在于，步骤(3)中只添加风味蛋白酶；即，具体步骤如下：

步骤(1)同实施例1；

(2)向步骤(1)制备得到的产物中添加0.06g的风味蛋白酶Flavourzyme 500MG，在28℃的恒温培养箱中培养15h后，在95℃的温度环境下灭菌15min后降至室温；

(3)向步骤(2)制得的产物中加入0.06g的脂肪酶Palatase 20000L，在37℃的条件下恒温酶解4h，并在95℃的温度环境下灭菌15min，灭菌后，即得奶味复合香基。

对比例8：

具体实施方式同实施例1，区别在于，步骤(3)中添加风味蛋白酶和脂肪酶，且去除步骤(4)；即，具体步骤如下：

步骤(1)和步骤(2)同实施例1；

(3)将步骤(2)中得到的保加利亚乳杆菌菌悬液接种于步骤(1)的产物中，接种量为1.5×10⁷CFU/g；同时向产物中添加0.06g的风味蛋白酶Flavourzyme 500MG和0.06g的脂肪酶Palatase 20000L，在28℃的恒温培养箱中培养15h后，在95℃的温度环境下灭菌15min，即得奶味复合香基。

实施例5：不同制备方法得到的奶味复合香基性能的表征

对实施例1～4及对比例1～8制备得到的奶味复合香基进行菌落数(表征发酵耗时与产香速率)、游离氨基酸和挥发性风味物质的测定。

本发明的重点在于制备工艺，即，先将乳杆菌和蛋白酶同时加入至乳基体系(大豆蛋白和奶油)中进行反应，后添加脂肪酶进行酶解，这种两步酶解联合发酵法进行反应制备奶味复合香基，其中乳杆菌、蛋白酶和脂肪酶的种类对反应的影响不大，得到的奶味复合香基1～4均符合生产要求，其技术效果同实施例1相差不大；本实施例仅列出实施例1及对比例1～8制备得到的奶味复合香基的相应的性质。

具体结果如图1、表1和表2所示。

表1实施例与对比例游离氨基酸含量测定结果(mg/kg)

表2实施例与对比例挥发性风味物质峰面积

对图1曲线的说明：因对比例1～8及实施例1共涉及4组加菌处理组，且对比例5和实施例1蛋白酶解和发酵过程完全一致，因此前期菌株的生长曲线中，实施例1和对比例5重合，所以菌株生长曲线共呈现3组数据，来说明相对于单独使用发酵工程技术(对比例2)而言，不同的酶工程技术结合使用时(对比例8代表菌、蛋白酶和脂肪酶同时共同加入；实施例1/对比例5代表本发明的两步酶解联合发酵)对菌株生长数量(表征发酵耗时与产香速率)的影响。同时，虽然对比例1～8及实施例1只涉及15h的发酵时间，但菌株生长曲线提供到48h的数据，可为更长发酵时间的实施例提供更广泛的进一步参考作用。

(1)由图1所示，实施例1和对比例8的活菌增长速度以及菌株数量始终明显高于对比例2。16h时，实施例1和对比例8的活菌数比对比例2发酵48h的活菌数还要多，说明蛋白酶和乳酸菌的共同加入即发酵工程与酶工程技术的结合使用可大大促进乳酸菌增殖，进一步引起其旺盛的代谢活动，提高产香速率，因此可大大节约时间成本。

同时，实施例1相较于对比例8，其活菌数始终较高且在8h前的发酵前期阶段增长速度明显更快，同时在32h之后的发酵后期阶段依旧可以保持菌株数量的稳定，这说明不同酶工程技术结合发酵工程技术使用对菌株生长数量(表征发酵耗时与产香速率)影响不同，本发明采用发酵、蛋白酶解后添加脂肪酶的制备方法(实施例1/两步酶解联合发酵)可有效避免三者同时添加时(对比例8)脂肪酶抑制蛋白酶活性以及乳酸菌更快增殖的缺点，使菌、酶实现效益最大化。且进行放大化生产/工业化应用时，因底物总量更高，预计比实验室效果更为突出。

(2)由表1所示，相较于对比例1，其余七组都能不同程度地增加氨基酸含量，说明微生物法和酶法都能提高奶味复合香基的营养与风味价值，以实施例1最为优越，说明本发明采用的两步酶解法联合发酵对氨基酸的积累有更为突出的作用。

同时，虽然对比例3和实施例1的氨基酸总量接近，这是由于乳酸菌数量的激增消耗肽和氨基酸作为营养物质引起的，由对比例5相较于对比例3和实施例1其氨基酸含量较少可以进一步证明乳酸菌对氨基酸的利用作用，但对比例5比对比例2氨基酸总量增加了53.40％，说明乳酸菌数量的激增在消耗氨基酸的同时也可以产生氨基酸并且积累作用大于消耗作用，蛋白酶与乳酸菌共同添加相对于只加菌仍具有显著优越性。实施例1中乳酸菌数量的激增导致的菌的旺盛的代谢活动可以进一步生成相关风味物质或者风味前体物质，所以尽管对比例3和实施例1的氨基酸总量接近，实施例1在风味等方面可以预见仍旧优于对比例3，而实施例1后期脂肪酶的进一步添加可以获得氨基酸的进一步积累，因此实施例1的氨基酸总量仍略高于对比例3。

(3)由表2所示，本发明制作的奶味复合香基的关键挥发性风味物质中，对香气的贡献突出的苯甲醛、中短链脂肪酸(乙酸、丁酸、己酸)、3-羟基-2-丁酮、内酯类(γ-十二内酯、δ-十二内酯)和杂环类物质(2-戊基呋喃、糠醛)可分别提供杏仁焦糖香、酸奶油香、酸奶香、花果香和浓甜杏仁香。而己醛具有典型的豆腥味和草腥味，长链脂肪酸(如癸酸、十二酸)超过一定浓度时具有肥皂味或苦味，其高浓度通常不适合食品生产。

实施例1和对比例2、5、6、8的乙酸和3-羟基-2-丁酮实现从0到有，说明发酵工程技术对这两种风味物质的突出作用。

实施例1与对比例5-8相较于对比例1-4，其挥发性风味物质的种类与含量都有明显提高，尤其是丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸等含量从无到有，从有到多，因此可以看出酶工程技术与发酵工程技术结合运用相较于单独作用时的显著优越性。

特别是实施例1和对比例3相比，它们的氨基酸含量虽然相近(表1)，但实施例1挥发性风味化合物种类和含量更为丰富，其乙酸、丁酸、己酸、3-羟基-2-丁酮、δ-十二内酯、糠醛等含量远优于对比例3且己醛含量明显下降，进一步证明激增的乳酸菌代谢氨基酸作为营养物质的同时其旺盛的代谢活动对风味物质的积累由明显的促进作用。

总体来说，实施例1与对比例8的挥发性风味化合物的种类和含量最为丰富。而实施例1与对比例8相比，可以发现本发明使用的两步酶解联合发酵，即发酵、蛋白酶解先同时进行后添加脂肪酶的制备方法(实施例1)对有益的挥发性风味物质的提高以及刺激性不良风味化合物含量的降低相较于乳酸菌、蛋白酶和脂肪酶同时添加时(对比例8)的贡献更为突出，如3-羟基-2-丁酮，作为黄油和奶酪产品中常见的强效气味化合物，实施例1比对比例8中含量增加了333.76％；重要的短链挥发性脂肪酸丁酸和己酸，实施例1比对比例8含量分别增加98.52％、22.42％，而风味不良的长链脂肪酸实施例1相较于对比例8含量则都降低。

综上所述，本发明使用的两步酶解联合发酵制备奶味复合香基的方法更为优越。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种奶味复合香基的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）将100 g稀奶油与5 g大豆蛋白充分混合后，加入7.5 g水，制得质量浓度为40 %的液体底物，将配制的底物进行均质，均质条件为75℃，20Mpa，均质结束后在95℃的温度环境下灭菌15 min，并将底物降温至25℃；

（2）制备乳杆菌菌悬液：

挑取保加利亚乳杆菌单菌落接种于1 mL mMRS 液体培养基中，30℃厌氧培养18 h后，制备得到种子液，将种子液以2%（v/v）的接种量转接于mMRS 液体培养基中，培养24 h后，得到发酵液，将发酵液置于4000 r/min 条件下离心10 min，弃上清液，收集菌体，使用无菌水重悬菌体，获得菌悬液；

（3）将步骤（2）中得到的保加利亚乳杆菌菌悬液接种于步骤（1）的产物中，接种量为1.5×10⁷ CFU/g；同时向产物中添加0.06 g的风味蛋白酶Flavourzyme 500MG，在28℃的恒温培养箱中培养15 h后，在95℃的温度环境下灭菌15 min后降至室温；

（4）向步骤（3）制得的产物中加入0.06 g的脂肪酶Palatase 20000L，在37℃的条件下恒温酶解4 h，并在95℃的温度环境下灭菌15 min，灭菌后，即得奶味复合香基。

2.权利要求1所述的方法制备得到的奶味复合香基。

3.含有权利要求2所述的奶味复合香基的产品。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为食品或保健品。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述食品包括烘焙食品、发酵食品、甜品中的任一种。