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CN113767110A - 用于双重聚糖结合aav2.5载体的方法和组合物 - Google Patents

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CN113767110A
CN113767110A CN202080031323.0A CN202080031323A CN113767110A CN 113767110 A CN113767110 A CN 113767110A CN 202080031323 A CN202080031323 A CN 202080031323A CN 113767110 A CN113767110 A CN 113767110A
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R·J·萨穆尔斯基
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University of North Carolina at Chapel Hill
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Abstract

本文公开了包含腺相关病毒2.5(AAV2.5)衣壳蛋白的方法和组合物，所述衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中所述取代将新的聚糖结合位点引入到所述AAV衣壳蛋白中。

Description

用于双重聚糖结合AAV2.5载体的方法和组合物
优先权的声明
本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2019年4月26日提交的美国临时申请序列号62/839,196的权益，其全部内容通过参考结合至本文中。
政府支持的声明
本发明根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号HL085794和OD011107在政府支持下进行。政府对本发明拥有一定权利。
关于序列表电子提交的声明
提供根据37 C.F.R. § 1.821提交的ASCII文本格式的序列表，其标题为5470-856WO_ST25.txt，大小为13,058字节，于2020年2月27日生成并经EFS-Web提交，以代替纸印本。该序列表特此通过参考结合至本文中并入说明书中用于其公开内容。
发明领域
本发明涉及来自腺相关病毒(AAV)的修饰的衣壳蛋白、病毒衣壳和包含它们的病毒载体及其使用方法。
发明背景
先天性代谢错误为造成一组不同的先天性疾病的原因，其中单个基因产生神经系统功能的发育和维持以及神经元存活所必需的功能失调的酶。不幸的是，其中许多为快速进展的神经退行性障碍，导致在生命的第一或第二个十年过早死亡。这些酶基因中的功能丧失突变一般地遵循常染色体隐性或X连锁遗传模式，这使得它们对于简单的基因置换策略具有吸引力。为这组疾病开发基因疗法的一个主要挑战为成功的治疗干预必须发生于发育的非常早期，因为损伤可能是不可逆转的。在过去的二十年中研究一致表明，当在神经退行性过程开始之前进行干预时存在获得成功的最大机会。例如，粘多糖贮积症(MPS)和脑白质营养不良为罕见的儿科神经退行性障碍，由碳水化合物分子或脂肪酸的代谢受损引起，但可通过细胞疗法和酶替代策略进行治疗。多项研究表明，在表现出行为或身体症状之后干预无法减缓或逆转疾病进展。然而，治疗时无症状的儿童从干预中获益最多，并且存活的几率最大。
临床上，MPS和脑白质营养不良的发作一般地在婴儿和幼儿期观察到，并伴有进行性中枢和外周神经系统受累。主要症状包括精细和大幅度动作运动丧失、感觉损伤、远端肌肉无力和腱挛缩。受影响的患者经常变得依赖轮椅、听力和视力受损，并且这些疾病经常到2-8岁的寿命时致命。已知与脑白质营养不良相关的基因含有芳基硫酸酯酶A (ASA) (造成异染性脑白质营养不良)、半乳糖神经酰胺酶(GALC) (造成克拉伯病)、天冬氨酸酰化酶(ASPA) (造成卡纳万病)和过氧化物酶体ATP结合盒(ABCD1) (造成X连锁肾上腺脑白质营养不良)中的突变。腺相关病毒(AAV)载体为有效的靶向基因疗法提供一种有吸引力的选项，因为其为非致病性的，在人类中具有很强的安全特性。天然存在的AAV血清型已显示出对多种组织具有向性，并且因此本领域需要开发使AAV载体靶向于特定期望的靶组织，同时具有最小的脱靶表达的方法。
病毒-聚糖相互作用为宿主细胞入侵的关键决定因素。细胞表面碳水化合物比如唾液酸、神经节苷脂或硫酸乙酰肝素被大量病毒(比如流感、疱疹病毒、SV40、多瘤病毒、乳头状瘤病毒和其他病原体)利用。在大多数情况下，单个类别的聚糖主要用作病毒的细胞表面附着因子，导致其他受体/辅助受体依序或平行接合用于细胞进入。腺相关病毒(AAV)为辅助病毒依赖型细小病毒，其利用硫酸乙酰肝素(HS)、半乳糖(Gal)或唾液酸(Sia)作为细胞表面结合的主要受体。例如，AAV血清型2和3b利用HS；AAV1、4和5以不同的连接特异性结合Sia；而AAV9利用Gal进行宿主细胞附着。不同的AAV毒株还需要随后与辅助受体(比如整联蛋白αVβ5或α5β1、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、表皮生长因子受体(EGFR)、肝细胞生长因子受体(HGFR))或层粘连蛋白受体)相互作用用于细胞摄取。
特定AAV毒株和单个类别的碳水化合物之间的单配关系的一个显著例外为AAV血清型6，其识别Sia和HS两者。然而，仅Sia显示出为病毒转导所必需的。AAV1、AAV4、AAV5和AAV6的Sia结合足迹仍有待确定。最近以来，与AAV9衣壳的Gal识别相关的关键氨基酸残基通过使用分子对接和定点诱变的组合进行鉴定。需要的是具有多重聚糖结合能力的病毒载体，以利用备选途径进行细胞进入和转导。
本发明通过提供具有多重聚糖结合位点的修饰的衣壳蛋白、包含这些衣壳蛋白的AAV载体及其在障碍比如神经退行性脑白质营养不良和MPS中用作治疗载体的方法而克服本领域中的先前缺点。
发明概述
本发明的方面涉及一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含AAV 2.5衣壳蛋白，所述AAV 2.5衣壳蛋白包含一个或多个引入新的聚糖结合位点的氨基酸取代。
在本文描述的衣壳蛋白、衣壳、病毒载体和方法的实施方案中，一个或多个氨基酸取代包括A267S、SQAGASDIRDQSR464-476SX1AGX2SX3X4X5X6QX7R (其中X1-7可为任何氨基酸)和EYSW 500-503EX8X9W (其中X8-9可为任何氨基酸)。
在本文所述的衣壳蛋白、衣壳、病毒载体和方法的实施方案中，X1为V或其保守取代；X2为P或其保守取代；X3为N或其保守取代；X4为M或其保守取代；X5为A或其保守取代；X6为V或其保守取代；X7为G或其保守取代；X8为F或其保守取代；和/或X9为A或其保守取代。
在本文所述的衣壳蛋白、衣壳、病毒载体和方法的实施方案中，X1为V，X为P，X3为N，X4为M，X5为A，X6为V，X7为G，X8为F，和X9为A，其中新的聚糖结合位点为半乳糖结合位点。
在本文所述的衣壳蛋白、衣壳、病毒载体和方法的实施方案中，AAV2.5衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或其功能衍生物。
在本文所述的衣壳蛋白、衣壳、病毒载体和方法的实施方案中，氨基酸序列为SEQID NO:2或其功能衍生物。
本发明的方面涉及一种包含上述AAV衣壳蛋白的病毒衣壳。
本发明的方面涉及一种包含上述病毒衣壳和包含至少一个末端重复序列的核酸的病毒载体，其中核酸被病毒衣壳壳体化。
本发明的方面涉及一种包含在药学上可接受的载剂中的上述AAV衣壳蛋白、上述病毒衣壳和/或上述病毒载体的组合物。
本发明的方面涉及一种将核酸引入到细胞中的方法，其包括使细胞与上述病毒载体接触。在本文所述方法的一些实施方案中，细胞处于神经组织中。在本文所述方法的一些实施方案中，细胞为神经元或神经胶质细胞。在本文所述方法的一些实施方案中，神经胶质细胞为星形胶质细胞。在本文所述方法的一些实施方案中，与AAV1、AAV2、AAV9或AAV2.5病毒载体相比较，病毒载体具有增强的神经组织转导。在本文所述方法的一些实施方案中，细胞处于受试者中。在本文所述方法的一些实施方案中，受试者为人类受试者。在本文所述方法的一些实施方案中，受试者为儿童。在本文所述方法的一些实施方案中，儿童为婴儿。在本文所述方法的一些实施方案中，受试者处于子宫内。在本文所述方法的一些实施方案中，当与同AAV1、AAV2、AAV9或AAV2.5病毒载体接触时相比较，受试者在同病毒载体接触时具有降低的免疫学特征。
本发明的方面涉及一种在需要它的受试者中治疗疾病或障碍的方法，其包括通过在治疗性核酸藉此在受试者的细胞中表达的条件下给予受试者本文所述的病毒载体和/或本文所述的组合物，将治疗性核酸引入到受试者的细胞中。在本文所述方法的一些实施方案中，受试者为人类。在本文所述方法的一些实施方案中，受试者处于子宫内。在本文所述方法的一些实施方案中，受试者患有CNS疾病或障碍或者处于其风险下。在本文所述方法的一些实施方案中，受试者患有先天性神经退行性障碍或处于其风险下。在本文所述方法的一些实施方案中，受试者患有以下疾病或处于其风险下：成人发病的常染色体显性脑白质营养不良(adult-onset autosomal dominant leukodystrophy) (ADLD)、艾卡尔迪-古铁雷斯综合征(Aicardi-Goutieres syndrome)、亚历山大病(Alexander disease)、CADASIL、卡纳万病(Canavan disease)、CARASIL、脑腱黄瘤病(cerebrotendinous xanthomatosis)、儿童期共济失调(childhood ataxia)和脑髓鞘形成低下(cerebral hypomyelination)(CACH))/白质消融性疾病(vanishing white matter disease) (VWMD)、法布里病(Fabrydisease)、岩藻糖苷贮积症(fucosidosis)、GM1神经节苷脂贮积症(GM1 gangliosidosis)、克拉伯病(Krabbe disease)、L-2-羟基戊二酸尿症(L-2-hydroxyglutaric aciduria)、伴皮质下囊肿的巨脑性白质脑病(megalencephalic leukoencephalopathy withsubcortical cysts)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)、多种硫酸酯酶缺乏症(multiple sulfatase deficiency)、佩梅病(Pelizaeus-Merzbacherdisease)、Pol III相关性脑白质营养不良(Pol III-Related Leukodystrophies)、雷夫叙姆病(Refsum disease)、扎拉病(salla disease) (游离唾液酸贮积病(free sialic acidstorage disease))、舍格伦-拉松综合征(Sjogren-Larsson syndrome)、X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy)、泽尔韦格综合征谱系障碍(Zellwegersyndrome spectrum disorders)、粘多糖贮积症I型、粘多糖贮积症II型、粘多糖贮积症III型、粘多糖贮积症IV型、粘多糖贮积症V型、粘多糖贮积症VI型、粘多糖贮积症VII型、粘多糖症贮积IX型及其任何组合。在本文所述方法的一些实施方案中，受试者患有与疾病或障碍相关的疼痛或处于患有其的风险下。在本文所述方法的一些实施方案中，病毒载体或组合物经肠内、胃肠外、鞘内、脑池内、脑内、脑室内、鼻内、耳内、眼内、眼周、直肠内、肌内、腹膜内、静脉内、口服、舌下、皮下和/或经皮途径递送。在本文所述方法的一些实施方案中，病毒载体或组合物颅内和/或脊柱内递送。
本发明的这些和其他方面在以下阐述的本发明描述中更详细地描述。
定义
单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该/所述(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指明。
此外，如本文所用的术语“约”在指可测量的数值，比如多核苷酸或多肽序列的长度、剂量、时间、温度等的量时，意指涵盖指定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或者甚至±0.1%的变化。
同样如本文使用的“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能组合，以及当以备选方式(“或”)解释时组合的缺乏。
除非上下文另外指明，否则特别旨在本文所述发明的各种特征可以任何组合使用。
此外，本发明还考虑在本发明的一些实施方案中可排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。
为了进一步说明，例如如果说明书指明特定氨基酸可选自A、G、I、L和/或V，则该语言还表明氨基酸可选自这些氨基酸的任何子集，例如A、G、I或L；A、G、I或V；A或G；只有L；等等，就好像每个这种子组合均在本文明确阐述一样。此外，这种语言还表明可放弃指定氨基酸中的一个或多个。例如，在特定实施方案中，氨基酸不为A、G或I；不为A；不为G或V；等等，就好像每个这种可能的放弃均在本文明确阐述一样。
如本文使用的术语“向性”是指病毒或病毒载体优先进入到某些细胞或组织类型中或者优先与促进进入到某些细胞或组织类型中的细胞表面相互作用，任选并优选地随后在细胞中表达(例如转录和(任选地)翻译)由病毒基因组携带的序列。
术语“靶细胞”用于指被本文所述的病毒载体感染的细胞。在一些实施方案中，“靶细胞”可指被病毒/病毒载体感染并且其中异源核酸上的调控元件促进表达的细胞类型。
如本文使用的术语“保守取代”或“保守取代突变”是指以下突变，其中氨基酸被具有相似特性的另一氨基酸取代，使得肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构、化学特性和/或亲水性质基本上不变。下组氨基酸在历史上已作为保守变化被彼此取代：(1) ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2) cys、ser、try、thr；(3) val、ile、leu、met、ala、phe；(4) lys、arg、his；和(5) phe、tyr、trp、his。以下列出其他普遍接受的保守取代：
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如本文使用的术语“减少”、“降低”、“下降”及类似术语意指减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、100%或更多。
如本文使用的术语“增强”、“增加”、“强化”及类似术语表示增加至少约 10%、20%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更多。
如本文使用的术语“多肽”涵盖肽和蛋白两者，除非另外指明。
如本文使用的“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”为核苷酸碱基的序列，并且可为RNA、DNA或DNA-RNA杂合序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸两者)，但在代表性实施方案中为单链或双链DNA序列。
如本文使用的“分离的”多核苷酸(例如“分离的DNA”或“分离的RNA”)意指至少部分地与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分(例如通常发现与多核苷酸缔合的细胞或病毒结构组分或者其他多肽或核酸)分开的多核苷酸。在代表性的实施方案中，与起始物料相比较，“分离的”核苷酸被富集至至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。
同样地，“分离的”多肽意指至少部分地与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分(例如通常发现与多肽缔合的细胞或病毒结构组分或者其他多肽或核酸)分开的多肽。在代表性的实施方案中，与起始物料相比较，“分离的”多肽被富集至至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。
如本文使用的“分离”或“纯化”(或语法等价物)病毒载体意指病毒载体至少部分地与起始物料中的至少一些其他组分分开。在代表性的实施方案中，与起始物料相比较，“分离的”或“纯化的”病毒载体被富集至至少约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。
“治疗性分子”(例如核酸或多肽)为可减轻、减少、预防、延迟和/或稳定由细胞或受试者中蛋白的缺失或缺陷引起的症状的分子和/或为以其他方式赋予受试者益处的分子。这种治疗性分子可由存在于本文所述的病毒载体中的异源核酸编码，并且处于促进核酸表达的调控序列之下。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“……的治疗(treatment of)”(及其语法变体)意指受试者病症的严重程度降低、至少部分地改善或稳定和/或实现至少一种临床症状的一些减轻、缓解、降低或稳定和/或疾病或障碍的进展存在延迟。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”(及其语法变体)是指相对于在不存在本发明方法的情况下发生的情形，在受试者中预防和/或延迟疾病、障碍和/或临床症状的发作和/或降低疾病、障碍和/或临床症状发作的严重程度。预防可为完全的，例如完全不存在疾病、障碍和/或临床症状。预防也可为部分的，使得受试者中疾病、障碍和/或临床症状的发生和/或发作的严重程度低于在不存在本发明的情况下发生的情形。
如本文使用的“治疗有效”、“治疗”或“有效”量为足以提供给受试者一些改善或益处的量。或者说，“治疗有效”、“治疗”或“有效”量为将在受试者中提供至少一种临床症状的一些减轻、缓解、降低或稳定的量。本领域的技术人员将意识到，治疗效果不必为完全或治愈性的，只要提供给受试者一些益处即可。
如本文使用的“预防有效”量为相对于在不存在本发明方法的情况下发生的情形，足以在受试者中预防和/或延迟疾病、障碍和/或临床症状的发作和/或在受试者中降低和/或延迟疾病、障碍和/或临床症状发作的严重程度的量。本领域的技术人员将意识到，预防的水平不必为完全，只要提供给受试者一些益处即可。
术语“异源核苷酸序列”、“异源核酸”或“异源核酸分子”在本文中可互换使用，并且是指病毒中非天然存在的序列。通常，异源核酸包含编码感兴趣的多肽或非翻译RNA比如治疗或诊断分子(例如用于递送至细胞或受试者)的开放阅读框。
如本文使用的术语“病毒载体”、“载体”或“基因递送载体”是指充当核酸递送媒介物，并且包含包装于病毒粒子内的载体基因组(例如病毒DNA [vDNA])的病毒(例如AAV)颗粒。或者，在某些情况下，术语“载体”可用于指涉单独的载体基因组/vDNA。
如本文使用的，当指涉病毒时，术语“载体”、“颗粒”和“病毒粒子”可互换使用。
本发明的病毒载体可进一步为“靶向”病毒载体(例如具有定向向性)和/或“杂合”细小病毒(即其中病毒TR和病毒衣壳来自不同的细小病毒)，例如如国际专利公开WO 00/28004中所述，其公开通过参考以其全部结合至本文中。
本发明的病毒载体可进一步为如国际专利公开WO 01/92551 (其公开通过参考以其全部结合至本文中)中所述的双链细小病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，双链(双链体)基因组可被包装到本发明的病毒衣壳中。
附图简述
图1显示AAV给予对重量的影响。比较了AAV治疗的(组合AAV9、AAV2-G9和AAV2.5-G9；N=9)和对照胎儿(N=36)的胎脑和体重。组间没有观察到显著差异(p<0.05)。数据显示为平均值±平均值的标准误差。显著性通过学生t检验分析以p ≤ 0.05确定。
图2显示AAV介导的萤火虫荧光素酶转导和表达通过生物发光的检测。来自给予AAV9、AAV2-G9和AAV2.5-G9的胎儿的左右半球(额叶、顶叶、颞叶、枕叶)的单个切片为针对生物发光成像的。每个图像对应于如表3所示的动物编号。总生物发光以光子/秒(p/s)在每个图像下方注明。数据显示为平均值±平均值的标准误差。显著性通过学生t检验分析以p≤ 0.05确定。
发明详述
本发明现参考附图进行描述，其中显示本发明的代表性实施方案。然而，本发明可以不同形式体现，并且不应解释为限于本文阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开彻底和完整，并将本发明的范围完全传达给本领域的技术人员。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文中在本发明的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过参考以其全部结合至本文中。
本发明的方面涉及发现限定聚糖识别足迹的AAV衣壳蛋白上的“口袋”以及将这种识别足迹移植到异源衣壳蛋白上，从而产生新的AAV衣壳蛋白。
限定该口袋的特定氨基酸已被鉴定并在本文中进行描述，例如针对AAV9的半乳糖结合位点。因此，本发明涉及将新的聚糖识别足迹(例如供体AAV毒株衣壳的聚糖识别足迹)分子移植到衣壳蛋白上，从而修饰衣壳蛋白。这种移植由结构建模研究进行指导，并通过定点诱变实现。携带转基因(例如报告基因盒)的重组载体(具有衍生于这种移植的衣壳)在细胞培养和动物模型中显示出快速发生和增强的转基因表达。从该策略产生的病毒载体可解决在人类基因疗法临床试验中观察到的挑战比如剂量依赖性免疫毒性。
在一些实施方案中，取代将聚糖结合位点从第一AAV血清型(“供体”)的衣壳蛋白引入到不同于所述第一AAV血清型的第二AAV血清型(“模板”)的衣壳蛋白中。因此，一方面，本发明涉及腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含含有一个或多个氨基酸取代的AAV 2.5衣壳，其中取代将聚糖结合位点引入到AAV衣壳蛋白中，从而产生“修饰的衣壳蛋白”或“修饰的AAV 2.5 衣壳蛋白”。
在一些实施方案中，聚糖结合位点可为己糖结合位点，其中己糖为半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)或岩藻糖(fuc)。在一些实施方案中，聚糖结合位点可为唾液酸(Sia)结合位点，其中Sia残基为N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)或N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。在一些实施方案中，聚糖结合位点可为二糖结合位点，其中二糖为以形式Sia (α2,3) Gal或Sia (α2,6) Gal与半乳糖连接的唾液酸。
在一些实施方案中，聚糖结合位点为半乳糖结合位点。在一些实施方案中，AAV9半乳糖结合位点(供体)被移植到AAV2.5衣壳蛋白模板中，导致在植入的(修饰的) AAV2.5衣壳蛋白模板中引入新的聚糖结合位点。新的聚糖结合位点为通过将一个或多个氨基酸取代引入到AAV2.5衣壳模板中而产生的。
在一些实施方案中，氨基酸取代包括：
a) A267S；b) SQAGASDIRDQSR464-476SX1AGX2SX3X4X5X6QX7R，其中X1-7可为任何氨基酸；和c) EYSW 500-503EX8X9W，其中X8-9可为任何氨基酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代处于AAV2.5 (SEQ ID NO:1; VP1编号)中的氨基酸267、氨基酸464-476和/或氨基酸500-503中。
在一些实施方案中，X1为V或其保守取代，X2为P或其保守取代，X3为N或其保守取代，X4为M或其保守取代，X5为A或其保守取代，X6为V或其保守取代，X7为G或其保守取代，X8为F或其保守取代，和/或X9为A或其保守取代。
在一些实施方案中，X1为V，X2为P，X3为N，X4为M，X5为A，X6为V，X7为G，X8为F，和X9为A，从而导致新的聚糖结合位点，其为半乳糖结合位点。
AAV 2.5衣壳模板可具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能衍生物。氨基酸序列的功能衍生物可具有基本上保留初始序列的一种或多种特性或者功能的氨基酸取代、插入或缺失。
功能衍生物具有基本上不影响蛋白功能的氨基酸取代、插入和/或缺失，比如当与初始蛋白(例如SEQ ID NO: 1)相比较，衍生物将保留一种或多种活性(特性或功能)。相对于初始蛋白的一种或多种活性，这种衍生物将保留至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或无法区分(没有显著差异)。这种活性非限制性地包括一种或多种细胞类型和/或组织向性。
在一些实施方案中，功能衍生物由SEQ ID NO:1的一个或多个保守氨基酸取代产生。本文提供保守氨基酸取代的实例。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白模板/骨架来自AAV2.5 (SEQ ID NO:1; VP1编号)，并且氨基酸取代为以任何组合的A267S取代、Q465V取代、A468P取代、D470N取代、I471M取代、R472A取代、D473V取代、S475G取代、Y501F取代和/或S502A取代。因此，在一些实施方案中，本发明提供一种AAV 2.5衣壳蛋白，其包含来自AAV2.5 (SEQ ID NO:1; VP1编号)的AAV衣壳蛋白骨架，该骨架包含A267S取代、Q465V取代、A468P取代、D470N取代、I471M取代、R472A取代、D473V取代、S475G取代、Y501F取代和S502A取代，其中取代将聚糖结合位点引入到AAV2.5衣壳蛋白中。
用作模板的AAV 2.5衣壳蛋白源自对AAV2衣壳序列的特定突变，如美国专利号9,012,224中所述，其内容通过参考结合至本文中。这是通过将AAV2中的5个氨基酸改变以在那些特定位置(Q263A; 265insT; N705A; V708A; T716N)处与AAV1相似而产生。所得氨基酸修饰在以下序列(SEQ ID NO:1)中显示为大写字母。由所得AAV2.5衣壳蛋白赋予病毒颗粒的特性已得到充分表征(美国专利号9,012,224)。非限制性地，AAV 2.5衣壳赋予病毒颗粒的特性包括：与AAV2相比较增强的骨骼肌向性、降低的肝脏-肝细胞向性、神经向性和神经胶质向性(例如星形胶质细胞)以及逃逸来自现有的AAV2和AAV1中和抗体的中和的能力。在本文所述发明的一些实施方案中，AAV 2.5衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其利用VP1编号。在一些实施方案中，AAV2.5衣壳蛋白为具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的衣壳蛋白的功能衍生物。
SEQ ID NO:1. AAV2.5衣壳蛋白
Figure DEST_PATH_IMAGE004
在一些实施方案中，AAV 2.5衣壳具有与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%相似或相同的氨基酸序列。例如，在特定实施方案中，“AAV2.5”衣壳蛋白包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%相似或相同的序列。
确定两个或更多个氨基酸序列之间的序列相似性或同一性的方法为本领域已知的。序列相似性或同一性可使用本领域已知的标准技术来确定，所述标准技术包括(但不限于) Smith & Waterman.Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部序列同一性算法，Needleman & Wunsch.J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的序列同一性比对算法，Pearson &Lipman.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,WI)，由Devereux et al. Nucl. Acid Res. 12:387-395 (1984)描述的Best Fit序列程序，或检查。
另一种合适的算法为Altschul et al.J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)和Karlin et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)中描述的BLAST算法。一种特别有用的BLAST程序为从Altschul et al. Methods in Enzymology 266:460-480(1996); blast.wustl/edu/blast/README.html中获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用多个搜索参数，参数任选地设置为默认值。参数为动态值，由程序本身根据特定序列的组成和搜索感兴趣序列的特定数据库的组成而建立；然而，可调整这些值以提高灵敏度。
进一步地，一种另外的有用算法为如由Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)报道的空位BLAST。
在一些实施方案中，本发明的AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，或者为其功能衍生物。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其具有至少约70%同一性，例如与其具有至少约70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的核苷酸序列，基本上由或由其组成。
SEQ ID NO:2. AAV2.5G9衣壳蛋白
Figure DEST_PATH_IMAGE006
本文提供的实例表明用于从AAV9供体引入半乳糖结合位点的AAV2.5模板中可能的氨基酸取代。这些并非旨在为限制性的实例表明以下原理：通过修饰限定本文所述“口袋”的残基，可将来自供体AAV血清型的聚糖结合位点引入到不同AAV 血清型的衣壳蛋白模板中。
这种包含新的聚糖结合位点的修饰或嵌合的衣壳蛋白可组装成组成病毒颗粒的衣壳，所述病毒颗粒可用作具有增加的细胞表面结合及更快速和增强的体内转基因表达的有益表型的病毒载体。
表2列出了本发明可涵盖的AAV的非限制性示例性血清型以及基因组和衣壳序列的登录号。供体和模板的AAV血清型不限于人类AAV，而是可包括非人类AAV，例如禽或牛AAV，以及非人灵长类动物AAV，其实例如表1所示。如本文使用的术语“腺相关病毒”(AAV)包括(但不限于) AAV 1型、AAV 2型、AAV 2.5型、AAV 3型(包括3A和3B型)、AAV 4型、 AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、羊AAV、进化枝F AAV以及现在已知或以后发现的任何其他AAV。参见例如BERNARD N.FIELDS et al. VIROLOGY, 第2卷, 第69章(第4版, Lippincott-Raven Publishers)。已经鉴定了许多相对新的AAV血清型和进化枝(参见表1)。
AAV的各种血清型的基因组序列，以及天然末端重复(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列为本领域已知的。这种序列的示例性但非限制性实例可在文献或公共数据库比如GenBank®数据库中找到。参见例如GenBank®数据库登录号NC_002077.1、NC_001401.2、NC_001729.1、NC_001863.1、NC_001829.1、NC_006152.1、NC_001862.1、AF513851.1、AF513852.1，其公开通过参考结合至本文中，用于教导细小病毒及AAV核酸和氨基酸序列。还参见例如Srivistava et al. J. Virology 45:555 (1983); Chiorini et al. J. Virology71:6823 (1998); Chiorini et al.J. Virology 73:1309 (1999); Bantel-Schaal et al. J. Virology73:939 (1999); Xiao et al. J. Virology 73:3994(1999); Muramatsu et al. Virology 221:208 (1996); Shade et al. J. Virol.58:921 (1986); Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA99:11854 (2002); 国际专利公开WO 00/28061、WO 99/6160和WO 98/11244；以及美国专利号6,156,303；其公开通过参考结合至本文中，用于教导细小病毒及AAV核酸和氨基酸序列。
自主性细小病毒和AAV的衣壳结构在BERNARD N. FIELDS et al. VIROLOGY, 第2卷, 第69 & 70章(第4版, Lippincott-Raven Publishers)中得到更详细的描述。还参见AAV2 (Xie et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 99:10405-10 (2002)), AAV4 (Padron etal. J. Virol. 79: 5047-58 (2005)), AAV5 (Walters et al. J. Virol.78: 3361-71(2004))和CPV (Xie et al.J. Mol. Biol. 6:497-520 (1996)和Tsao et al. Science251: 1456-64 (1991))的晶体结构的描述。
本发明的其他方面涉及包含本发明的AAV衣壳蛋白的衣壳。
本发明的其他方面涉及包含(a) 本发明的AAV衣壳；和(b) 包含至少一个末端重复序列的核酸的病毒载体或颗粒，其中核酸被衣壳壳体化。
本发明的另一方面涉及在药学上可接受的载剂中包含修饰的AAV衣壳蛋白和/或包含修饰的AAV衣壳蛋白的AAV衣壳和/或病毒载体的组合物。
本发明另外提供一种将核酸引入到细胞中的方法，其包括使细胞与包含修饰的AAV衣壳蛋白的病毒载体接触。细胞可处于受试者中并且在一些实施方案中，受试者可为人类受试者。在一些实施方案中，受试者可处于子宫内。在一些实施方案中，细胞可为神经细胞(例如神经元细胞或神经胶质细胞，例如神经元组织的细胞)。在一些实施方案中，与供体和模板血清型的病毒载体接触细胞时的转导水平相比较，所得病毒载体在接触细胞时在细胞(例如神经细胞，例如神经元细胞)中具有增强的转导(例如增强的核酸表达水平)。例如，如果AAV衣壳蛋白供体为AAV血清型9和AAV衣壳蛋白模板为AAV血清型2.5 (AAV2.5)，则所得病毒载体将与AAV1、AAV2、AAV9、AAV2.5进行比较。
产生病毒载体的方法
本发明还包括包含本发明修饰的衣壳蛋白和衣壳的病毒载体。在特定的实施方案中，病毒载体为细小病毒载体(例如包含细小病毒衣壳和/或载体基因组)，例如AAV载体(例如包含AAV衣壳和/或载体基因组)。在代表性的实施方案中，病毒载体包含含有本发明修饰的衣壳亚基的修饰的AAV衣壳和载体基因组。
例如，在代表性的实施方案中，病毒载体包含：(a) 包含本发明修饰的衣壳蛋白的修饰的病毒衣壳(例如修饰的AAV衣壳)；和(b) 包含末端重复序列(例如AAV TR)的核酸，其中包含末端重复序列的核酸被修饰的病毒衣壳壳体化。核酸可任选地包含两个末端重复(例如两个AAV TR)。
在代表性的实施方案中，病毒载体为重组病毒载体，其中病毒的基因组包含感兴趣的异源核酸。异源核酸可编码感兴趣的多肽或功能性RNA。重组病毒载体在以下更详细地描述。异源核酸可以可操作地连接于适当的控制序列以促进在靶细胞中的表达。例如，异源核酸可与表达控制元件可操作地缔合，所述表达控制元件比如转录/翻译控制信号、复制起点、多聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等。
在特定的实施方案中，与不含修饰的衣壳蛋白的病毒载体的转导水平相比较(例如与具有AAV2.5衣壳蛋白的病毒载体相比较)，本发明的病毒载体具有改变的(例如减少的)肝脏转导。在特定的实施方案中，病毒载体具有针对肌肉的全身转导，例如载体转导遍及全身的多重骨骼肌群并且任选地转导心肌和/或膈肌。在一些实施方案中，与适当的对照相比较(例如与其他组织相比较和/或与其他病毒载体(例如不含修饰的衣壳蛋白的载体，例如AAV1、AAV2、AAV9、AAV2.5或如表1中列出的任何AAV血清型)的转导水平相比较)，本发明的病毒载体在神经(例如神经元、神经胶质，比如星形胶质细胞或少突胶质细胞)组织中具有增强的转导(例如增强的核酸表达水平)。适当的对照可为没有接受移植的聚糖结合位点的在其他方面相同的病毒载体。
本领域的技术人员将理解，本发明修饰的衣壳蛋白、病毒衣壳和病毒载体不包括在其天然状态下于指定位置处具有指定氨基酸的那些衣壳蛋白、衣壳和病毒载体(即未用本文所述的引入聚糖结合位点的取代“修饰”)。
本发明进一步提供产生本发明病毒载体的方法。在一个代表性的实施方案中，本发明提供一种产生病毒载体的方法，该方法包括提供给细胞：(a) 包含至少一个TR序列(例如AAV TR序列)的核酸模板，和(b) 足以复制核酸模板并壳体化到AAV衣壳中的AAV序列(例如编码本发明AAV衣壳的AAV rep序列和AAV cap序列)。任选地，核酸模板进一步包含至少一种异源核酸序列。在特定的实施方案中，核酸模板包含两个AAV ITR序列，其位于异源核酸序列(如果存在的话)的5’和3’，尽管它们不必与其直接邻接。
核酸模板及AAV rep和cap序列在这样的条件下提供，使得在细胞中产生包含包装于AAV衣壳内的核酸模板的病毒载体。该方法可进一步包括从细胞中收集病毒载体的步骤。病毒载体可从培养基中和/或通过裂解细胞进行收集。
细胞可为允许AAV病毒复制的细胞。可采用本领域已知的任何合适的细胞。在特定的实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。作为另一个选项，细胞可为提供从复制缺陷型辅助病毒中缺失的功能的反式互补包装细胞系，例如293细胞或其他E1a反式互补细胞。
AAV复制和衣壳序列可通过本领域已知的任何方法提供。当前的方案一般地在单一质粒上表达AAV rep/cap基因。AAV复制和包装序列不必一起提供，尽管这样做可为便利的。AAV rep和/或cap序列可通过任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可通过杂合腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如插入到缺失的腺病毒载体的E1a或E3区域中)。EBV载体还可用于表达AAV cap和rep基因。该方法的一个优点为EBV载体为附加型，但在整个连续的细胞分裂中仍将保持高拷贝数(即作为染色体外元件稳定整合到细胞中，称为“基于EBV的核附加体”)。
作为另一个备选方案，rep/cap序列可以稳定地掺入到细胞中。
一般地AAV rep/cap序列不会被TR侧接，以防止这些序列的援救和/或包装。
可使用本领域已知的任何方法将核酸模板提供给细胞。例如，模板可由非病毒(例如质粒)或病毒载体提供。在特定的实施方案中，核酸模板由疱疹病毒或腺病毒载体提供(例如插入到缺失的腺病毒的E1a或E3区域中)。作为另一个实例，可使用携带被AAV TR侧接的报告基因的杆状病毒载体。EBV载体也可用于递送模板，如以上关于rep/cap基因所述。
在另一个代表性的实施方案中，核酸模板通过复制rAAV病毒提供。在仍然其他的实施方案中，包含核酸模板的AAV原病毒稳定整合到细胞的染色体中。
为了提高病毒滴度，可将促进生产性AAV感染的辅助病毒功能(例如腺病毒或疱疹病毒)提供给细胞。AAV复制所需的辅助病毒序列为本领域已知的。一般地，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。或者，腺病毒或疱疹病毒序列可由另一种非病毒或病毒载体，例如作为携带所有促进有效AAV产生的辅助基因的非感染性腺病毒极微质粒提供。
进一步地，辅助病毒功能可由具有嵌入染色体中或作为稳定的染色体外元件维持的辅助序列的包装细胞提供。通常，辅助病毒序列不能包装到AAV病毒粒子中，例如不被TR侧接。
本领域的技术人员将意识到，在单一辅助构建体上提供AAV复制和衣壳序列以及辅助病毒序列(例如腺病毒序列)可为有利的。该辅助构建体可为非病毒或病毒构建体。作为一个非限制性说明，辅助构建体可为包含AAV rep/cap基因的杂合腺病毒或杂合疱疹病毒。
在一个特定的实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体提供。该载体可进一步包含核酸模板。AAV rep/cap序列和/或rAAV模板可插入到腺病毒的缺失区域(例如E1a或E3区域)中。
在另一个实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体提供。根据该实施方案，rAAV模板可以作为质粒模板提供。
在另一个说明性实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体提供，并且rAAV模板作为原病毒整合到细胞中。或者，rAAV模板由作为染色体外元件(例如作为基于EBV的核附加体)维持于细胞内的EBV载体提供。
在另一个示例性的实施方案中，AAV rep/cap序列和腺病毒辅助序列由单一腺病毒辅助载体提供。rAAV模板可作为单独的复制病毒载体提供。 例如，rAAV模板可由rAAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。
根据前述方法，杂合腺病毒载体一般地包含足以进行腺病毒复制和包装的腺病毒5’和3’顺式序列(即腺病毒末端重复和PAC序列)。AAV rep/cap序列和(如果存在的话)rAAV模板嵌入腺病毒骨架中，并且被5’和3’顺式序列侧接，使得这些序列可包装到腺病毒衣壳中。如上所述，腺病毒辅助序列和AAV rep/cap序列通常不被TR侧接，使得这些序列不会包装到AAV病毒粒子中。
Zhang et al. (Gene Ther. 18:704-12 (2001))描述了包含腺病毒以及AAV rep和cap基因两者的嵌合辅助者。
疱疹病毒还可用作AAV包装方法中的辅助病毒。编码AAV Rep蛋白的杂合疱疹病毒可有利地促进可扩大的AAV载体生产方案。表达AAV-2 rep和cap基因的杂合单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体已得到描述，例如PCT公开号WO 00/17377，通过参考结合至本文中。
作为另一个备选方案，本发明的病毒载体可使用杆状病毒载体在昆虫细胞中产生以递送rep/cap基因和rAAV模板。
可通过本领域已知的任何方法获得不含污染性辅助病毒的AAV载体原种。例如，AAV和辅助病毒可易于基于大小区分。AAV也可基于对肝素底物的亲和力与辅助病毒分离开。可使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，使得任何污染性辅助病毒都不能复制。作为另一个备选方案，可采用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助者，因为仅需要腺病毒早期基因表达以介导 AAV病毒的包装。对于晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体为本领域已知的(例如ts100K和ts149腺病毒突变体)。
重组病毒载体
本发明的病毒载体可用于体外、离体和体内将核酸递送至细胞。特别地，病毒载体可有利地用于将核酸递送或转移至动物细胞，包括例如哺乳动物细胞。
可在本发明的病毒载体中递送任何感兴趣的异源核酸序列。感兴趣的核酸包括编码多肽的核酸，包括治疗性(例如用于医学或兽医用途)和/或免疫原性(例如用于疫苗)多肽。
治疗性多肽包括(但不限于)囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、抗肌萎缩蛋白(包括微型和微小抗肌萎缩蛋白，参见例如Vincent et al. Nature Genetics 5:130 (1993);美国专利公开号2003017131; PCT公开号WO/2008/088895, Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714-13719 (2000); 和Gregorevic et al. Mol. Ther. 16:657-64 (2008))、肌肉生长抑制素前肽(myostatin propeptide)、卵泡抑素、激活素II型可溶性受体、IGF-1、抗炎多肽(比如IκB显性突变体)、肌长蛋白(sarcospan)、肌营养相关蛋白(utrophin) (Tinsley et al. Nature 384:349 (1996))、微型肌营养相关蛋白、 凝血因子(例如因子VIII、因子IX、因子X等)、促红细胞生成素、血管生成抑制素(angiostatin)、内皮抑素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、超氧化物歧化酶、瘦素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白(spectrin)、α1-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶A、支链酮酸脱氢酶、RP65蛋白、细胞因子(例如α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽类生长因子、神经营养因子和激素(例如生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、骨形态发生蛋白[包括RANKL和VEGF]、神经胶质细胞衍生生长因子、转化生长因子-α和-β等)、溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、受体(例如肿瘤坏死生长因子α可溶性受体)、S100A1、小清蛋白(parvalbumin)、腺苷酸环化酶6型、调节钙处理的分子(例如PP1的抑制剂1 SERCA2A及其片段[例如PCT公开号WO 2006/029319和WO 2007/100465])、影响G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子(比如截短的组成型活性bARKct)、抗炎因子(比如IRAP)、抗肌肉生长抑制素蛋白、天冬氨酸酰化酶、单克隆抗体(包括单链单克隆抗体；示例性的Mab为Herceptin® Mab)、神经肽及其片段(例如甘丙肽、神经肽(Neuropeptide) Y (参见美国专利号7,071,172)、血管生成抑制剂比如血管抑制素(Vasohibin)及其他VEGF抑制剂(例如血管抑制素2 [参见PCT公开WO JP2006/073052])。其他说明性异源核酸序列编码自杀基因产物(例如胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子)、赋予对在癌症疗法中使用的药物耐药性的蛋白、肿瘤抑制基因产物(例如p53、Rb、Wt-1)、TRAIL、FAS-配体以及在需要它的受试者中具有治疗效果的任何其他多肽。AAV载体还可用于递送单克隆抗体和抗体片段，例如针对肌肉生长抑制素的抗体或抗体片段(参见例如Fang et al. Nature Biotechnology 23:584-590 (2005))。
编码多肽的异源核酸序列包括编码报告多肽(例如酶)的那些。报告多肽为本领域已知的，并且包括(但不限于)绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。
任选地，异源核酸编码分泌型多肽(例如在其天然状态下为分泌型多肽或者已被设计改造以分泌(例如通过与本领域已知的分泌信号序列可操作地缔合)的多肽)。
或者，在本发明的特定实施方案中，异源核酸可编码反义核酸、核酶(例如如美国专利号5,877,022中所述)、实现剪接体介导的反式剪接的RNA (参见Puttaraju etal.Nature Biotech. 17:246 (1999); 美国专利号6,013,487; 美国专利号6,083,702)、干扰RNA (RNAi) (包括介导基因沉默的siRNA、shRNA或miRNA) (参见Sharp et al.Science 287:2431 (2000))以及其他非翻译RNA (比如“引导”RNA) (Gorman et al.Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929 (1998); Yuan et al.的美国专利号5,869,248)等。示例性的非翻译RNA包括针对多重耐药性(MDR)基因产物的RNAi (例如以治疗和/或预防肿瘤和/或用于给予心脏以预防化疗造成的损伤)、针对肌肉生长抑制素的RNAi (例如用于杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy))、针对VEGF的RNAi (例如以治疗和/或预防肿瘤)、针对受磷蛋白(phospholamban)的RNAi (例如以治疗心血管疾病，参见例如Andinoet al. J. Gene Med. 10:132-142 (2008)和Li et al. Acta Pharmacol Sin. 26:51-55(2005))、受磷蛋白抑制或显性失活分子(比如受磷蛋白S16E) (例如以治疗心血管疾病，参见例如Hoshijima et al. Nat. Med. 8:864-871 (2002))、针对腺苷激酶的RNAi (例如用于癫痫)以及针对致病性生物体和病毒(例如乙型和/或丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、CMV、单纯疱疹病毒、人类乳头状瘤病毒等)的RNAi。
进一步地，可递送指导可变剪接的核酸序列。为了举例说明，与抗肌萎缩蛋白外显子51的5’和/或3’剪接位点互补的反义序列(或其他抑制性序列)可以与U1或U7小核(sn)RNA启动子一起递送以诱导该外显子的跳跃。例如，包含位于反义/抑制性序列5’的U1或U7snRNA启动子的DNA序列可在本发明修饰的衣壳中包装并递送。
病毒载体还可包含与宿主染色体上的基因座共具同源性并与之重组的异源核酸。该方法可例如用于校正宿主细胞中的遗传缺陷。
本发明还提供表达免疫原性多肽的病毒载体，例如用于疫苗接种。核酸可编码本领域已知的任何感兴趣的免疫原，包括(但不限于)来自人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、流感病毒的免疫原，HIV或SIV gag蛋白，肿瘤抗原，癌症抗原，细菌抗原，病毒抗原等。
细小病毒作为疫苗载体的用途为本领域已知的(参见例如Miyamura et al.Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507 (1994); Young et al.的美国专利号5,916,563、Mazzara et al.的美国专利号5,905,040、美国专利号5,882,652、Samulski et al.的美国专利号5,863,541)。抗原可存在于细小病毒衣壳中。或者，抗原可由引入到重组载体基因组中的异源核酸表达。如本文所述和/或如本领域已知的任何感兴趣的免疫原可由本发明的病毒载体提供。
免疫原性多肽可为适合于引发免疫反应和/或保护受试者免受感染和/或疾病(包括(但不限于)微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和/或病毒感染和疾病)的任何多肽。例如，免疫原性多肽可为正粘病毒免疫原(例如流感病毒免疫原，比如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白或马流感病毒免疫原)或慢病毒免疫原(例如马感染性贫血病毒免疫原、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)免疫原或人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫原，比如HIV或SIV包膜GP160蛋白、HIV或SIV基质/衣壳蛋白以及HIV或SIV gag、pol和env基因产物)。免疫原性多肽还可为沙粒病毒(arenavirus)免疫原(例如拉沙热病毒(Lassa fever virus)免疫原，比如拉沙热病毒(Lassa fever virus)核衣壳蛋白和/或拉沙热包膜糖蛋白)、痘病毒(poxvirus)免疫原(例如牛痘病毒(vaccinia virus)免疫原，比如牛痘(vaccinia) L1或L8基因产物)、黄病毒免疫原(例如黄热病毒(yellow fever virus)免疫原或日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)免疫原)、丝状病毒(filovirus)免疫原(例如埃博拉病毒免疫原或马尔堡病毒(Marburg virus)免疫原，比如NP和GP基因产物)、布尼亚病毒(bunyavirus)免疫原(例如RVFV、CCHF和/或SFS病毒免疫原)或冠状病毒免疫原(例如感染性人类冠状病毒免疫原(比如人类冠状病毒包膜糖蛋白)或猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus)免疫原或禽感染性支气管炎病毒免疫原)。免疫原性多肽可进一步为脊髓灰质炎免疫原、疱疹病毒(herpesvirus)免疫原(例如CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎病毒(mumps virus)免疫原、麻疹病毒(measles virus)免疫原、风疹病毒(rubella virus)免疫原、白喉毒素或其他白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等)免疫原和/或本领域目前已知或以后鉴定为免疫原的任何其他疫苗免疫原。
或者，免疫原性多肽可为任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌症抗原在癌细胞的表面表达。示例性的癌症和肿瘤细胞抗原描述于S.A. Rosenberg (Immunity 10:281(1991))中。其他说明性的癌症和肿瘤抗原包括(但不限于)：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、LAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、半胱天冬酶-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、黑素瘤肿瘤抗原(Kawakami et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515 (1994); Kawakami et al. J. Exp. Med., 180:347 (1994); Kawakami et al. Cancer Res. 54:3124 (1994))、MART-1、gp100 MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、TRP-1、TRP-2、P-15、酪氨酸酶(Brichard et al. J. Exp. Med. 178:489 (1993))、HER-2/neu基因产物(美国专利号4,968,603)、CA125、LK26、FB5 (内皮唾液酸蛋白)、TAG 72、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STN (唾液酸Tn抗原)、c-erbB-2蛋白、PSA、L-CanAg、雌激素受体、乳脂球蛋白、p53肿瘤抑制蛋白(Levine.Ann. Rev. Biochem. 62:623 (1993))；粘蛋白抗原(PCT公开号WO 90/05142)；端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头状瘤病毒抗原；和/或目前已知或以后发现与以下癌症相关的抗原：黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、脑癌和任何其他目前已知或以后鉴定的癌症或恶性病症(参见例如Rosenberg. Ann. Rev. Med. 47:481-91 (1996))。
作为另一个备选方案，异源核酸可编码在体外、离体或体内于细胞中期望产生的任何多肽。例如，可将病毒载体引入到培养的细胞中并从中分离表达的核酸产物。
本领域的技术人员将理解，感兴趣的异源核酸可与适当的控制序列可操作地缔合。例如，异源核酸可与表达控制元件比如转录/翻译控制信号、复制起点、多聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等可操作地缔合。
进一步地，例如通过经选择性阻断特定位点处的剪接活性的寡核苷酸、小分子和/或其他化合物的存在或不存在来调控不同内含子的选择性剪接(例如如PCT公开号WO2006/119137中所述)，可在转录后水平下实现感兴趣的异源核酸的调控表达。
本领域的技术人员将意识到，可根据期望的水平和组织特异性表达来使用多种启动子/增强子元件。启动子/增强子可为组成型或诱导型的，这取决于期望的表达模式。启动子/增强子可为天然或外来的，并且可为天然的或合成序列。所谓“外来的”旨在转录起始区于引入转录起始区的野生型宿主中没有发现。
在特定的实施方案中，启动子/增强子元件对于待处理的靶细胞或受试者可为天然的。在代表性的实施方案中，启动子/增强子元件对于异源核酸序列可为天然的。通常选择启动子/增强子元件使得其在感兴趣的靶细胞中起作用。进一步地，在特定的实施方案中，启动子/增强子元件为哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可为组成型的或诱导型的。
诱导型表达控制元件在其中期望提供对异源核酸序列表达的调控的那些应用中一般地为有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可为组织特异性或优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的(包括心脏、骨骼和/或平滑肌特异性或优选的)、神经组织特异性或优选的(包括脑-特异性或优选的)、眼睛特异性或优选(包括视网膜特异性和角膜特异性的)、肝脏特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰腺特异性或优选的、脾脏特异性或优选的和/或肺部特异性或优选的启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性的诱导型启动子/增强子元件包括(但不限于) Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在其中异源核酸序列在靶细胞中转录并然后翻译的实施方案中，通常包括特定起始信号以有效翻译插入的蛋白编码序列。这些外源性翻译控制序列可包括ATG起始密码子和邻近序列，其可具有多种来源，包括天然的和合成的两者。
本发明的病毒载体提供一种用于将异源核酸递送到广泛范围的细胞(包括分裂和非分裂细胞)中的手段。病毒载体可用于例如将感兴趣的核酸体外递送至细胞，例如以在体外产生多肽或用于离体基因疗法。病毒载体另外可用于将核酸递送至需要它的受试者的方法，例如以表达免疫原性和/或治疗性多肽和/或功能性RNA。以这种方式，可在受试者体内产生多肽和/或功能性RNA。受试者可能需要多肽，因为受试者患有多肽缺乏症。进一步地，可实施该方法，因为在受试者中产生多肽和/或功能性RNA可赋予一些有益效果。
病毒载体还可用于在培养的细胞或受试者中产生感兴趣的多肽和/或功能性RNA(例如使用受试者作为生物反应器来产生多肽和/或例如与筛选方法结合观察功能性RNA对受试者的作用)。
通常，本发明的病毒载体可用于递送编码多肽和/或功能性RNA (例如治疗性多肽，例如治疗性核酸)的异源核酸，以治疗和/或预防任何疾病状态或障碍，对所述疾病状态或障碍而言将治疗性多肽和/或功能性RNA递送至例如需要它的受试者(例如其中受试者患有疾病状态或障碍或处于其风险下)为有益的。在一些实施方案中，疾病状态为CNS疾病或障碍。在一些实施方案中，受试者患有与疾病或障碍相关的疼痛或处于患有其的风险下。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者处于子宫内。
说明性的疾病状态包括(但不限于)：囊性纤维化(囊性纤维化跨膜调节蛋白)和其他肺部疾病、血友病A (因子VIII)、血友病B (因子IX)、地中海贫血(β-珠蛋白)、贫血(促红细胞生成素)和其他血液障碍、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease) (GDF；脑啡肽酶)、多发性硬化(β-干扰素)、帕金森病(Parkinson’s disease) (神经胶质细胞系源性神经营养因子[GDNF])、亨廷顿病(Huntington’s disease) (RNAi以去除重复)、肌萎缩侧索硬化、癫痫(甘丙肽、神经营养因子)和其他神经系统障碍、癌症(内皮抑素、血管生成抑制素、TRAIL、FAS-配体、细胞因子(包括干扰素)；RNAi (包括针对VEGF或多重耐药性基因产物的RNAi)、mir-26a [例如用于肝细胞癌])、糖尿病(胰岛素)、肌营养不良(包括杜氏抗肌萎缩蛋白(Duchenne dystrophin)、微型抗肌萎缩蛋白、胰岛素样生长因子I、肌聚糖(sarcoglycan)[例如α、β、γ]、针对肌肉生长抑制素的RNAi、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、激活素II型可溶性受体、抗炎多肽(比如IκB显性突变体)、肌长蛋白、肌营养相关蛋白、微型肌营养相关蛋白、针对抗肌萎缩蛋白基因中的剪接连接点以诱导外显子跳跃的反义物或RNAi [参见例如PCT公开号WO/2003/095647]、针对U7 snRNA以诱导外显子跳跃的反义物[参见例如PCT公开号WO/2006/021724]以及针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段)和贝克尔(Becker)、戈谢病(Gaucher disease) (葡糖脑苷脂酶)、胡尔勒氏病(Hurler’s disease) (α-L-艾杜糖醛酸酶、腺苷脱氨酶缺乏症(腺苷脱氨酶)、糖原贮积病(例如法布里病(Fabry disease) [α-半乳糖苷酶]和庞贝病(Pompe disease) [溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶])和其他代谢障碍、先天性肺气肿(α1-抗胰蛋白酶)、莱施-尼汉综合征(Lesch-NyhanSyndrome) (次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)(鞘磷脂酶)、泰萨克斯病(Tay Sachs disease) (溶酶体氨基己糖苷酶A)、枫糖尿病(MapleSyrup Urine Disease) (支链酮酸脱氢酶)、视网膜退行性疾病(及其他眼睛和视网膜疾病；例如用于黄斑变性的PDGF和/或血管抑制素或其他VEGF抑制剂或其他血管生成抑制剂，以治疗/预防视网膜障碍，例如在I型糖尿病中)、实体器官的疾病比如脑(包括帕金森病[GDNF]、星形细胞瘤[内皮抑素、血管生成抑制素和/或针对VEGF的RNAi]、胶质母细胞瘤[内皮抑素、血管生成抑制素和/或针对VEGF的RNAi])、肝脏、肾脏、心脏包括充血性心力衰竭或外周动脉疾病(PAD) (例如通过递送蛋白磷酸酶抑制剂I (I-1)及其片段(例如I1C)、serca2a、调控受磷蛋白基因的锌指蛋白、Barkct、β2-肾上腺素能受体、β2-肾上腺素能受体激酶(BARK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3激酶))、S100A1、小清蛋白、腺苷酸环化酶6型、影响G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子(比如截短的组成型活性bARKct)；calsarcin、针对受磷蛋白的RNAi；受磷蛋白抑制或显性失活分子比如受磷蛋白S16E等)、关节炎(胰岛素样生长因子)、关节障碍(胰岛素样生长因子1和/或2)、内膜增生(例如通过递送enos、inos)、提高心脏移植的存活率(超氧化物歧化酶)、AIDS (可溶性CD4)、肌肉萎缩(胰岛素样生长因子I)、肾虚(促红细胞生成素)、贫血(促红细胞生成素)、关节炎(抗炎因子比如IRAP和TNFα可溶性受体)、肝炎(α-干扰素)、LDL受体缺乏症(LDL受体)、高氨血症(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、克拉伯病(Krabbe’s disease) (半乳糖脑苷脂酶)、巴滕病(Batten's disease)、脊髓小脑性共济失调(包括SCA1、SCA2和SCA3)、苯丙酮尿症(苯丙氨酸羟化酶)、自身免疫性疾病、先天性神经退行性障碍(例如单基因神经退行性障碍)比如粘多糖贮积症(包括(但不限于)粘多糖贮积症I型(也称为胡尔勒综合征、胡尔勒-沙伊综合征(Hurler-Scheie Syndrome)或沙伊综合征(Scheie Syndrome)，IDUA，α-L-艾杜糖醛酸酶)、粘多糖贮积症II型(也称为亨特综合征(Hunter syndrome)，IDS，I2L酶)、粘多糖贮积症III型(也称为圣菲利波综合征(Sanfilippo syndrome)，GNS [N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶]，HGSNAT [乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶]，NAGLU [α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶]和/或SGSH [磺酰胺酶])、粘多糖贮积症IV型(也称为莫尔基奥综合征(Morquio syndrome)，GALNS [半乳糖胺(N-乙酰)-6-硫酸酯酶]和/或GLB1 [β-半乳糖苷酶])、粘多糖贮积症V型(也称为沙伊综合征，目前为I型的一个亚组，也为IDUA，α-L-艾杜糖醛酸酶)、粘多糖贮积症VI型(也称为马-兰综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)，ARSB，芳基硫酸酯酶B)、粘多糖贮积症VII型(也称为斯里综合征(Sly syndrome)，GUSB，β-葡萄糖醛酸酶)、粘多糖贮积症IX型(也称为Natowicz综合征，HYAL1，透明质酸酶)和/或脑白质营养不良(包括(但不限于)成人发病的常染色体显性脑白质营养不良(adult-onset autosomal dominant leukodystrophy) (ADLD；LMNB1，核纤层蛋白B1)、艾卡尔迪-古铁雷斯综合征(Aicardi-Goutieres syndrome) (TREX1、RNASEHSB、RNASEH2C和/或RNASEH2A)、亚历山大病(Alexander disease) (FRAP，神经胶质纤维酸性蛋白)、CADASIL (Notch3)、卡纳万病(Canavan disease) (ASPA，天冬氨酸酰化酶)、CARASIL (HTRA1，丝氨酸蛋白酶HTRA1)、脑腱黄瘤病(cerebrotendinousxanthomatosis) (“CTX”，CYP27A1，甾醇27-羟化酶)、儿童期共济失调(childhood ataxia)和脑髓鞘形成低下(cerebral hypomyelination) (CACH)/白质消融性疾病(vanishingwhite matter disease) (VWMD) (eIF2B，真核起始因子2B)、法布里病(Fabry disease)(GLA，α-半乳糖苷酶A)、岩藻糖苷贮积症(FUCA1，α-L-岩藻糖苷酶)、GM1神经节苷脂贮积症(GLB1，β-半乳糖苷酶)、L-2-羟基戊二酸尿症(L2HDGH，L-2-羟基戊二酸脱氢酶)、克拉伯病(Krabbe disease) (GALC，半乳糖脑苷脂酶(galactocerebrosidase))、伴皮质下囊肿的巨脑性白质脑病(megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts)(“MLC”，MLC1和/或HEPACAM)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)(ASA，芳基硫酸酯酶A)、多种硫酸酯酶缺乏症(“MSD”，SUMF1，影响所有硫酸酯酶的硫酸酯酶修饰因子1)、佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease) (也称为“X连锁痉挛性截瘫(X-linked spastic paraplegia)”、PLP1 [X连锁蛋白脂质蛋白1 (X-linked proteolipidprotein 1)]和/或GJA12 [间隙连接蛋白12 (gap junction protein 12)])、Pol III相关性脑白质营养不良(Pol III-Related Leukodystrophies) (POLR3A和/或POLR3B)、雷夫叙姆病(Refsum disease) (PHYH，[植烷酰辅酶A羟化酶]和/或Pex7 [PHYH导入到过氧化物酶体])、扎拉病(salla disease) (也称为“游离唾液酸贮积病”，SLC17A5，唾液酸转运蛋白)、舍格伦-拉松综合征(Sjogren-Larsson syndrome) (ÁLDH3A2，醛脱氢酶)、X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy) (“ALD”，ABCD1，过氧化物酶体ATP酶结合盒蛋白)、泽尔韦格综合征谱系障碍(Zellweger syndrome spectrum disorders) (也称为过氧化物酶体生物发生障碍，PEX1，PEX2，PEX3，PEX4，PEX5，PEX10，PEX11B，PEX12，PEX13， PEX14，PEX16，PEX19，PEX26)等。本发明可进一步在器官移植后用于提高移植的成功和/或降低减少器官移植或辅助疗法的负面副作用(例如通过给予免疫抑制剂或抑制性核酸来阻断细胞因子产生)。作为另一个实例，骨形态发生蛋白(包括BNP 2、7等、RANKL和/或VEGF)可与骨同种异体移植物一起给予，例如在癌症患者骨折或手术切除后。
因此，在一些实施方案中，本发明提供一种在需要它的受试者中治疗疾病的方法，其包括通过在治疗性核酸藉此在受试者中表达的条件下给予受试者本发明的病毒载体和/或组合物，将治疗性核酸引入到受试者的细胞中。
本发明还可用于产生诱导性多能干细胞(iPS)。例如，本发明的病毒载体可用于将干细胞相关核酸递送到非多能细胞(比如成人成纤维细胞、皮肤细胞、肝细胞、肾细胞、脂肪细胞、心脏细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞等)中。编码与干细胞相关的因子的核酸为本领域已知的。与干细胞和多能性相关的这种因子的非限制性实例包括Oct-3/4、SOX家族(例如SOX1、SOX2、SOX3和/或SOX15)、Klf家族(例如Klf1、Klf2、Klf4和/或Klf5)、Myc家族(例如C-myc、L-myc和/或N-myc)、NANOG和/或LIN28。
本发明还可用于治疗和/或预防代谢障碍(比如糖尿病(例如胰岛素))、血友病(例如因子IX或因子VIII)、溶酶体贮积障碍(比如粘多糖贮积障碍(例如斯里综合征(Slysyndrome) [β-葡萄糖醛酸酶]、胡尔勒综合征(Hurler syndrome) [(α-L-艾杜糖醛酸酶]、沙伊综合征(Scheie Syndrome) [α-L-艾杜糖醛酸酶]、胡尔勒-沙伊综合征(Hurler-Scheie Syndrome) [α-L-艾杜糖醛酸酶]、亨特氏综合征(Hunter's syndrome) [艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、菲利波综合征(Sanfilippo syndrome) A [乙酰肝素磺酰胺酶]、B [N-乙酰氨基葡萄糖苷酶]、C [乙酰辅酶A:α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶]、D [N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶]、莫尔基奥综合征(Morquio syndrome) A [半乳糖-6-硫酸盐硫酸酯酶]、B [β-半乳糖苷酶]、马-兰综合征(Maroteaux-Lamy syndrome) [N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶]等)、法布里病(Fabry disease) (α-半乳糖苷酶)、戈谢病(Gaucher disease) (葡糖脑苷脂酶)或糖原贮积障碍(例如庞贝病(Pompe disease)；溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶)。
基因转移在了解和提供用于疾病状态的疗法方面具有巨大的潜在用途。存在许多其中缺陷基因已知并已被克隆的遗传性疾病。通常，上述疾病状态分为两个类别：缺乏状态(通常为酶，通常以隐性方式遗传)及不平衡状态(可涉及调控或结构蛋白，并且一般地以显性方式遗传)。对于缺乏状态的疾病，基因转移可用于将正常基因带入受影响的组织中进行替代疗法以及使用反义突变为疾病建立动物模型。对于不平衡的疾病状态，基因转移可用于在模型系统中建立疾病状态，其然后可用于努力对抗疾病状态。因此，本发明的病毒载体允许治疗和/或预防遗传性疾病。
本发明的病毒载体还可用于在体外或体内提供给细胞功能性RNA。功能性RNA在细胞中的表达例如可减小细胞对特定靶蛋白的表达。相应地，可给予功能性RNA，以减少特定蛋白在需要它的受试者中的表达。功能性RNA还可在体外给予细胞，以调控基因表达和/或细胞生理学，例如以优化细胞或组织培养系统或筛选方法。
另外，本发明的病毒载体可用于诊断和筛选方法，藉此在细胞培养系统或者转基因动物模型中瞬时或稳定表达感兴趣的核酸。
本发明的病毒载体还可用于各种非治疗性目的，包括(但不限于)用于评价基因靶向、清除、转录、翻译等的方案中，如对本领域技术人员显而易见的。病毒载体还可用于评估安全性(传播、毒性、免疫原性等)的目的。这种数据例如在评估临床疗效之前由美国食品和药物管理局(United States Food and Drug Administration)视为监管审批过程的一部分。
作为另一方面，本发明的病毒载体可用于在受试者中产生免疫反应。根据该实施方案，可将包含编码免疫原性多肽的异源核酸序列的病毒载体给予受试者，并且受试者针对免疫原性多肽启动主动免疫反应。免疫原性多肽如上文所述。在一些实施方案中，引发保护性免疫反应。
或者，可将病毒载体离体给予细胞，并将改变的细胞给予受试者。将包含异源核酸的病毒载体引入到细胞中，并将细胞给予受试者，其中可表达编码免疫原的异源核酸并在受试者中诱导针对免疫原的免疫反应。在特定的实施方案中，细胞为抗原呈递细胞(例如树突细胞)。
“主动免疫反应”或“主动免疫”的特征为“遇到免疫原之后宿主组织和细胞的参与”。其涉及淋巴网状组织中免疫活性细胞的分化和增殖，这导致抗体的合成或细胞介导的反应性的发展或两者兼而有之。” Herbert B. Herscowitz. Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation,in IMMUNOLOGY: BASICPROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985)。或者说，宿主在通过感染或通过疫苗接种暴露于免疫原之后启动主动免疫反应。主动免疫可与被动免疫形成对比，被动免疫为通过“将预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白细胞介素-2)从主动免疫的宿主转移至非免疫宿主”而获得。同上。
如本文使用的“保护性”免疫反应或“保护性”免疫表示免疫反应赋予受试者一些益处，因为其预防或降低疾病的发生率。或者，保护性免疫反应或保护性免疫可用于治疗和/或预防疾病，特别是癌症或肿瘤(例如通过预防癌症或肿瘤形成，通过引起癌症或肿瘤的消退和/或通过预防转移和/或通过预防转移性结节的生长)。保护作用可为完全的或部分的，只要治疗的益处超过其任何缺点即可。
在特定的实施方案中，包含异源核酸的病毒载体或细胞可以免疫原性有效量给予，如本文所述。
还可通过给予表达一种或多种癌细胞抗原(或免疫学上相似的分子)或产生针对癌细胞的免疫反应的任何其他免疫原的病毒载体来给予本发明的病毒载体用于癌症免疫疗法。为了举例说明，可通过给予包含编码癌细胞抗原的异源核酸的病毒载体来在受试者中产生针对癌细胞抗原的免疫反应，例如以治疗患有癌症的患者和/或预防癌症在受试者中的发展。病毒载体可在体内或通过使用离体方法给予受试者，如本文所述。或者，癌症抗原可作为病毒衣壳的一部分表达或者以其他方式与病毒衣壳相关(例如如上所述)。
作为另一个备选方案，可给予本领域已知的任何其他治疗性核酸(例如RNAi)或多肽(例如细胞因子)以治疗和/或预防癌症。
如本文使用的术语“癌症”涵盖肿瘤形成癌症。同样地，术语“癌性组织”涵盖肿瘤。“癌细胞抗原”涵盖肿瘤抗原。
术语“癌症”具有其在本领域中理解的含义，例如具有传播到身体远处部位(即转移)的潜力的不受控制的组织生长。示例性的癌症包括(但不限于)黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、 脑癌和任何其他目前已知或以后鉴定的癌症或恶性病症。在代表性的实施方案中，本发明提供一种治疗和/或预防肿瘤形成癌症的方法。
术语“肿瘤”在本领域中也理解为例如多细胞生物体内未分化细胞的异常团块。肿瘤可为恶性或良性的。在代表性的实施方案中，本文公开的方法用于预防和治疗恶性肿瘤。
术语“治疗癌症”、“癌症的治疗”和等价术语旨在降低或至少部分地消除癌症的严重程度和/或减缓和/或控制疾病的进展和/或稳定疾病。在特定的实施方案中，这些术语表示预防或减少或至少部分地消除癌症的转移和/或预防或减少或至少部分地消除转移性结节的生长。
术语“癌症的预防”或“预防癌症”和等价术语旨在该方法至少部分地消除或减少和/或延迟癌症发作的发生率和/或严重程度。或者说，受试者中癌症发作的可能性或概率可以降低和/或延迟。
在特定的实施方案中，细胞可从患有癌症的受试者中取出并与本发明表达癌细胞抗原的病毒载体接触。然后将修饰的细胞给予受试者，藉此引发针对癌细胞抗原的免疫反应。该方法可有利地用于不能在体内启动足够的免疫反应(即不能产生足够数量的增强性抗体)的免疫受损的受试者。
本领域已知免疫反应可通过免疫调节细胞因子(例如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-14、白细胞介素-18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和淋巴毒素)来增强。相应地，可将免疫调节细胞因子(优选地CTL诱导性细胞因子)与病毒载体一起给予受试者。
细胞因子可通过本领域已知的任何方法给予。可给予受试者外源性细胞因子，或者，可使用合适的载体将编码细胞因子的核酸递送至受试者，并且在体内产生细胞因子。
受试者、药用制剂和给予方式
本发明的病毒载体和衣壳可用于兽医和医学应用两者。合适的受试者包括禽类和哺乳动物两者。如本文使用的术语“禽”包括(但不限于)鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、雉鸡、鹦鹉、长尾鹦鹉等。如本文使用的术语“哺乳动物”包括(但不限于)人类、非人灵长类动物、牛、羊、山羊、马、猫、犬、兔类动物等。受试者可为完全发育的受试者(例如成人)或正在经历发育过程的受试者(例如儿童、婴儿或胎儿)。人类受试者包括子宫内(例如胚胎、胎儿)、新生儿、婴儿、青少年、成人和老年受试者。
在代表性的实施方案中，受试者“需要”本发明的方法，并且因此在一些实施方案中可为“需要它的受试者”。
在特定的实施方案中，本发明提供一种药用组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的本发明的病毒载体和/或衣壳，以及任选地其他医药物质、药用物质、稳定剂、缓冲剂、载剂、佐剂、稀释剂等。对于注射剂，载剂一般地为液体。对于其他给予方法，载剂可为固体或液体。对于吸入给予，载剂将为可吸入的，并且任选地可呈固体或液体颗粒形式。
“药学上可接受的”意指没有毒性或在其他方面不期望的材料，即可将材料给予受试者而不会引起任何不期望的生物效应。
本发明的一个方面为一种将核酸体外转移至细胞的方法。根据适合于特定靶细胞的标准转导方法，可将病毒载体以适当的感染复数引入到细胞中。待给予的病毒载体的滴度可根据靶细胞类型和数量以及特定的病毒载体而变化，并且可由本领域的技术人员无需过度实验来确定。在代表性的实施方案中，将至少约103个感染单位，任选地至少约105个感染单位引入到细胞中。
其中引入病毒载体的细胞可属于任何类型，包括(但不限于)神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞比如神经元和神经胶质细胞比如星形胶质细胞和少突胶质细胞)、肺细胞、眼睛细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮和角膜细胞)、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、肌细胞(例如骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或膈肌细胞)、树突细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等。在代表性的实施方案中，细胞可为任何祖细胞。作为另一个实施方案，细胞可为干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。作为仍然另一个实施方案，细胞可为癌症或肿瘤细胞。此外，细胞可来自任何起源的物种，如上所述。
病毒载体可在体外引入到细胞中，以用于将修饰的细胞给予受试者的目的。在特定的实施方案中，细胞已从受试者中取出，其中引入病毒载体，并然后将细胞给予回受试者中。从受试者中取出细胞用于离体操纵，然后引入回到受试者中的方法为本领域已知的(参见例如美国专利号5,399,346)。或者，可将重组病毒载体引入到来自供体受试者的细胞、培养的细胞或来自任何其他合适来源的细胞中，并将细胞给予需要它的受试者(即“受者”受试者)。
用于离体核酸递送的合适的细胞如上所述。给予受试者的细胞剂量将根据受试者的年龄、状况和物种、细胞类型、细胞表达的核酸、给予方式等而变化。一般地，每剂给予在药学上可接受的载剂中的至少约102-约108个细胞或至少约103-约106个细胞。在特定的实施方案中，以治疗有效或预防有效量将用病毒载体转导的细胞与药用载剂组合给予受试者。
在一些实施方案中，将病毒载体引入到细胞中并且可将细胞给予受试者以引发针对递送的多肽(例如表达为转基因或在衣壳中)的免疫原性反应。一般地，给予与药学上可接受的载剂组合的一定量的表达免疫原性有效量的多肽的细胞。“免疫原性有效量”为足以在给予药用制剂的受试者中引起针对多肽的主动免疫反应的所表达多肽的量。在特定的实施方案中，剂量足以产生保护性免疫反应(如上定义)。所赋予的保护程度不必为完全或永久的，只要给予免疫原性多肽的益处超过其任何缺点即可。
在一些实施方案中，与对照相比较，例如与当与另一种AAV病毒载体(例如AAV1、AAV2、AAV9、AAV2.5或表1中列出的任何AAV血清型)接触时相比较，当与本发明的病毒载体接触时，受试者可具有降低的免疫学特征(例如免疫反应，例如抗原交叉反应性)。
本发明的另一方面为一种给予受试者病毒载体和/或病毒衣壳的方法。可通过本领域已知的任何手段将本发明的病毒载体和/或衣壳给予需要它的人类受试者或动物。任选地，病毒载体和/或衣壳可以治疗有效或预防有效剂量在药学上可接受的载剂中递送。
本发明的病毒载体和/或衣壳可进一步给予以引发免疫原性反应(例如作为疫苗)。一般地，本发明的免疫原性组合物包含与药学上可接受的载剂组合的免疫原性有效量的病毒载体和/或衣壳。任选地，剂量足以产生保护性免疫反应(如上定义)。
待给予受试者的病毒载体和/或衣壳的剂量取决于给予方式、待治疗和/或预防的疾病或病症、个体受试者的病症、特定病毒载体或衣壳、待递送的核酸等，并且可以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量为至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、103、1014、1015转导单位，任选地约108-1013转导单位的滴度。
在特定的实施方案中，可采用多于一次给予(例如两次、三次、四次或更多次给予)以在各种间隔的时间段内(例如每天、每周、每月、每年等)实现期望的基因表达水平。
示例性的给予方式包括口服、直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如经气溶胶)、含服(例如舌下)、阴道、鞘内、眼内、经皮、子宫内(或卵内)、胃肠外(例如静脉内、皮下、皮内、肌内[包括给予骨骼肌、膈肌和/或心肌]、皮内、胸膜内、脑内和关节内)、局部(例如对皮肤和粘膜两者表面，包括气道表面和经皮给予)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如对肝脏、骨骼肌、心肌、膈肌或脑)。也可给予肿瘤(例如在肿瘤或淋巴结中或附近)。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗和/或预防的病症的性质和严重程度以及所使用的特定载体的性质。
根据本发明给予骨骼肌包括(但不限于)给予肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背部、颈部、头部(例如舌头)、胸部、腹部、骨盆/会阴和/或手指中的骨骼肌。合适的骨骼肌包括(但不限于)小指展肌(abductor digiti minimi) (在手中)、小趾展肌(abductordigiti minimi) (在足中)、拇展肌、外展小趾肌、拇短展肌、拇长展肌、短收肌、拇收肌、长收肌、大收肌、拇内收肌、肘肌、前斜角肌、膝关节肌、肱二头肌、股二头肌、肱肌、肱桡肌、颊肌、喙肱肌、皱眉肌、三角肌、降口角肌、降下唇肌、二腹肌、背侧骨间肌（在手中）、背侧骨间肌（在足中）、桡侧腕短伸肌、桡侧腕长伸肌、尺侧腕伸肌、小指伸肌、指伸肌、趾短伸肌、趾长伸肌、短伸肌、长伸肌、食指伸肌、拇短伸肌、拇长伸肌、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、小指短屈肌（在手中）、小趾短屈肌（在足中）、趾短屈肌、趾长屈肌、指深屈肌、指浅屈肌、短屈肌、长屈肌、拇短屈肌、拇长屈肌、额肌、腓肠肌、颏舌骨肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、股薄肌、颈髂肋肌、腰髂肋肌、胸髂肋肌、骼肌、下孖肌、下斜肌、下直肌、冈下肌、棘突间肌、横突间肌、翼外肌、外直肌、背阔肌、提口角肌、提上唇肌、提上唇鼻翼肌、提上睑肌、肩胛提肌、长回旋肌、头最长肌、颈最长肌、胸最长肌、头长肌、颈长肌、蚓状肌（在手中）、蚓状肌（在足中）、咬肌、翼内肌、内直肌、中斜角肌、多裂肌、下颌舌骨肌、头下斜肌、头上斜肌、闭孔外肌、闭孔内肌、枕肌、肩胛舌骨肌、小指对掌肌、拇对掌肌、眼轮匝肌、口轮匝肌、骨间掌侧肌、掌短肌、掌长肌、耻骨肌、胸大肌、胸小肌、腓骨短肌、腓骨长肌、第三腓骨肌、梨状肌、骨间足底肌、跖肌、颈阔肌、腘肌、后斜角肌、旋前方肌、旋前圆肌、腰大肌、股方肌、跖方肌、头前直肌、头外侧直肌、头后大直肌、头后小直肌、股直肌、大菱形肌、小菱形肌、笑肌、缝匠肌、小斜角肌、半膜肌、头半棘肌、颈半棘肌、胸半棘肌、半腱肌、前锯肌、短回旋肌、比目鱼肌、头棘肌、颈棘肌、胸棘肌、头夹肌、颈夹肌、胸锁乳突肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、茎突舌骨肌、锁骨下肌、肩胛下肌、上孖肌、上斜肌、上直肌、旋后肌、冈上肌、颞肌、阔筋膜张肌、大圆肌、小圆肌、胸肌(thoracis)、甲状舌骨肌、胫骨前肌、胫骨后肌、斜方肌、肱三头肌、股中间肌、股外侧肌、股内侧肌、颧大肌和颧小肌以及如本领域已知的任何其他合适的骨骼肌。
病毒载体和/或衣壳可通过静脉内给予、动脉内给予、腹膜内给予、肢体灌注(任选地腿和/或臂的隔离肢体灌注；参见例如Arruda et al. (2005) Blood 105:3458-3464)和/或直接肌内注射递送至骨骼肌。在特定的实施方案中，病毒载体和/或衣壳通过肢体灌注，任选地隔离肢体灌注(例如通过静脉内或关节内给予)来给予受试者(例如患有肌营养不良比如DMD的受试者)的肢体(臂和/或腿)。在本发明的实施方案中，本发明的病毒载体和/或衣壳可有利地在不采用“流体动力学”技术的情况下给予。载体的组织递送(例如至肌肉)通常通过流体动力学技术(例如大容量静脉内/静脉内给予)增强，这会增加脉管系统中的压力并促进载体穿过内皮细胞屏障的能力。在特定的实施方案中，本发明的病毒载体和/或衣壳可在不存在流体动力学技术比如大容量输注和/或血管内压升高(例如大于正常收缩压，例如血管内压相对于正常收缩压增加小于或等于5%、10%、15%、20%、25%)的情况下给予。这种方法可减少或避免与流体动力学技术相关的副作用，比如水肿、神经损伤和/或筋膜室综合征。
给予心肌包括给予左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。病毒载体和/或衣壳可通过静脉内给予、动脉内给予比如主动脉内给予、心脏直接注射(例如进入左心房、右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注递送至心肌。
可通过任何合适的方法给予膈肌，包括静脉内给予、动脉内给予和/或腹膜内给予。
递送至靶组织还可通过递送包含病毒载体和/或衣壳的贮库来实现。在代表性的实施方案中，将包含病毒载体和/或衣壳的贮库植入到骨骼肌、心肌和/或膈肌组织中，或者组织可与包含病毒载体和/或衣壳的膜或其他基质接触。这种可植入基质或基材描述于例如美国专利号7,201,898中。
在特定的实施方案中，本发明的病毒载体和/或病毒衣壳给予骨骼肌、膈肌和/或心肌(例如以治疗和/或预防肌营养不良、心脏病[例如PAD或充血性心力衰竭])。
在代表性的实施方案中，本发明用于治疗和/或预防骨骼肌、心肌和/或膈肌的障碍。
在一个代表性的实施方案中，本发明提供一种在需要它的受试者中治疗和/或预防肌营养不良的方法，方法包括：给予哺乳动物受试者治疗或预防有效量的本发明病毒载体，其中病毒载体包含编码以下的异源核酸：抗肌萎缩蛋白、微型抗肌萎缩蛋白、微小抗肌萎缩蛋白、肌肉生长抑制素前肽、卵泡抑素、激活素II型可溶性受体、IGF-1、抗炎多肽(比如IκB显性突变体)、肌长蛋白、肌营养相关蛋白、微小抗肌萎缩蛋白、层粘连蛋白-α2、α-肌聚糖、β-肌聚糖、γ-肌聚糖、δ-肌聚糖、IGF-1、针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段和/或针对肌肉生长抑制素的RNAi。在特定的实施方案中，病毒载体可给予骨骼肌、膈肌和/或心肌，如本文别处所述。
或者，可实施本发明以将核酸递送至骨骼肌、心肌或膈肌，其用作产生多肽(例如酶)或功能性RNA (例如RNAi、微小RNA、反义RNA)的平台，所述多肽或功能性RNA通常在血液中循环或全身递送至其他组织以治疗和/或预防障碍(例如代谢障碍(比如糖尿病[例如胰岛素])、血友病[例如因子IX或因子VIII]、粘多糖障碍[例如斯里综合征、胡尔勒综合征、沙伊综合征、胡尔勒-沙伊综合征、亨特氏综合征、圣菲利波综合征A、B、C、D、莫尔基奥综合征、马-兰综合征等]或溶酶体贮积障碍(比如戈谢病[葡糖脑苷脂酶]或法布里病[α-半乳糖苷酶A])或糖原贮积障碍(比如庞贝病[溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶])。本文描述了用于治疗和/或预防代谢障碍的其他合适的蛋白。肌肉作为表达感兴趣的核酸的平台的用途描述于美国专利公开号20020192189中。
因此，作为一个方面，本发明进一步涵盖一种在需要它的受试者中治疗和/或预防代谢障碍的方法，方法包括：给予受试者的骨骼肌治疗或预防有效量的本发明病毒载体，其中病毒载体包含编码多肽的异源核酸，其中代谢障碍为多肽缺乏和/或缺陷的结果。本文描述说明性的代谢障碍和编码多肽的异源核酸。任选地，多肽为分泌型的(例如在其天然状态下为分泌型多肽或者已被设计改造以分泌(例如通过与本领域已知的分泌信号序列可操作地缔合)的多肽)。不受本发明任何特定理论的限制，根据该实施方案，给予骨骼肌可导致多肽分泌到全身循环中并递送至靶组织。将病毒载体递送至骨骼肌的方法在本文中更详细地描述。
还可实施本发明以产生用于全身递送的反义RNA、RNAi或其他功能性RNA (例如核酶)。
本发明还提供一种在需要它的受试者中治疗和/或预防先天性心力衰竭或PAD的方法，方法包括给予哺乳动物受试者治疗或预防有效量的本发明病毒载体，其中病毒载体包含编码例如以下的异源核酸：肌浆内质网(sarcoplasmic endoreticulum) Ca2+-ATP酶(SERCA2a)、血管生成因子、磷酸酶抑制剂I (I-1)及其片段(例如I1C)、针对受磷蛋白的RNAi；受磷蛋白抑制或显性失活分子(比如受磷蛋白S16E，一种调控受磷蛋白基因的锌指蛋白)、β2-肾上腺素能受体、β2-肾上腺素能受体激酶(BARK)、PI3激酶，calsarcan、β-肾上腺素能受体激酶抑制剂(βARKct)、蛋白磷酸酶1的抑制剂1及其片段(例如I1C)、S100A1、小清蛋白、腺苷酸环化酶6型、影响G蛋白偶联受体激酶2型敲低的分子比如截短的组成型活性bARKct、Pim-1、PGC-1α、SOD-1、SOD-2、EC-SOD、激肽释放酶、HIF、胸腺肽-β4、mir-1、mir-133、mir-206、mir-208和/或mir-26a。
在一些实施方案中，本发明进一步包括一种在需要它的受试者中治疗和/或预防先天性神经退行性障碍(例如单基因神经退行性障碍)的方法，方法包括：给予受试者的神经组织(例如神经元细胞)治疗或预防有效量的本发明病毒载体，其中病毒载体包含编码多肽的异源核酸，其中先天性神经退行性障碍为多肽缺乏和/或缺陷的结果。本文描述说明性的先天性神经退行性障碍和编码多肽的异源核酸。任选地，多肽为分泌型的(例如在其天然状态下为分泌型多肽或者已被设计改造以分泌(例如通过与本领域已知的分泌信号序列可操作地缔合)的多肽)。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者处于子宫内。在一些实施方案中，受试者患有先天性(例如单基因)神经退行性障碍或处于其风险下。在一些实施方案中，受试者患有粘多糖病或脑白质营养不良或者处于其风险下。
注射剂可以常规形式制备为液体溶液剂或混悬剂、适合于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式或者制备为乳剂。或者，可以局部而不是全身方式，例如以贮库或持续释放制剂给予本发明的病毒载体和/或病毒衣壳。进一步地，病毒载体和/或病毒衣壳可粘附于可手术植入的基质上进行递送(例如如美国专利公开号20040013645中所述)。
本文公开的病毒载体和/或病毒衣壳可通过任何合适的手段，任选地通过给予受试者吸入的包含病毒载体和/或病毒衣壳的可吸入颗粒的气溶胶混悬剂，给予受试者的肺部。可吸入颗粒可为液体或固体。包含病毒载体和/或病毒衣壳的液体颗粒的气溶胶可通过任何合适的手段产生，比如用压力驱动的气溶胶雾化器或超声雾化器，如本领域技术人员已知的。参见例如美国专利号4,501,729。包含病毒载体和/或衣壳的固体颗粒的气溶胶同样可通过制药领域已知的技术用任何固体颗粒药物气溶胶发生器来产生。
病毒载体和病毒衣壳可给予中枢神经系统(CNS)的组织(例如脑、眼)，并且可有利地导致病毒载体或衣壳的分布比在不存在本发明的情况下观察到的更广泛。
在特定的实施方案中，可给予本发明的递送载体以治疗CNS疾病，所述CNS疾病包括遗传性障碍、神经退行性障碍、精神障碍和肿瘤。CNS的说明性疾病包括(但不限于)阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、卡纳万病、雷氏病(Leigh’s disease)、雷夫叙姆病、图雷特综合征(Tourette syndrome)、原发性侧索硬化、肌萎缩侧索硬化、进行性肌萎缩、皮克病(Pick's disease)、肌营养不良、多发性硬化、重症肌无力、宾斯旺格病、脊髓或头部损伤引起的创伤、泰萨克斯病(Tay Sachs disease)、莱施-尼汉病(Lesch-Nyan disease)、癫痫、脑梗塞、精神障碍包括情绪障碍(例如抑郁症、双相情感障碍、持续性情感障碍、继发性情绪障碍)、精神分裂症、药物依赖(例如酗酒和其他物质依赖)、神经症(例如焦虑症、强迫性障碍、躯体形式障碍、分离性障碍、悲伤、产后抑郁症)、精神病(例如幻觉和妄想)、痴呆、偏执、注意力缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛障碍、进食或体重障碍(例如肥胖症、恶病质、神经性厌食症和贪食症)、CNS的癌症和肿瘤(例如垂体肿瘤)、以及先天性神经退行性障碍比如粘多糖病(包括(但不限于)粘多糖贮积症I型(也称为胡尔勒综合征、胡尔勒-沙伊综合征(Hurler-Scheie Syndrome)或沙伊综合征(Scheie Syndrome)，IDUA，α-L-艾杜糖醛酸酶)、粘多糖贮积症II型(也称为亨特综合征(Hunter syndrome)，IDS，I2L酶)、粘多糖贮积症III型(也称为圣菲利波综合征(Sanfilippo syndrome)，GNS [N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶]，HGSNAT [乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶]，NAGLU [α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶]和/或SGSH [磺酰胺酶])、粘多糖贮积症IV型(也称为莫尔基奥综合征(Morquiosyndrome)，GALNS [半乳糖胺(N-乙酰)-6-硫酸酯酶]和/或GLB1 [β-半乳糖苷酶])、粘多糖贮积症V型(也称为沙伊综合征，目前为I型的一个亚组，也为IDUA，α-L-艾杜糖醛酸酶)、粘多糖贮积症VI型(也称为马-兰综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)，ARSB，芳基硫酸酯酶B)、粘多糖贮积症VII型(也称为斯里综合征(Sly syndrome)，GUSB，β-葡萄糖醛酸酶)、粘多糖贮积症IX型(也称为Natowicz综合征，HYAL1，透明质酸酶)和/或脑白质营养不良(包括(但不限于)成人发病的常染色体显性脑白质营养不良(adult-onset autosomal dominantleukodystrophy) (ADLD；LMNB1，核纤层蛋白B1)、艾卡尔迪-古铁雷斯综合征(Aicardi-Goutieres syndrome) (TREX1、RNASEHSB、RNASEH2C和/或RNASEH2A)、亚历山大病(Alexander disease) (FRAP，神经胶质纤维酸性蛋白)、CADASIL (Notch3)、卡纳万病(Canavan disease) (ASPA，天冬氨酸酰化酶)、CARASIL (HTRA1，丝氨酸蛋白酶HTRA1)、脑腱黄瘤病(cerebrotendinous xanthomatosis) (“CTX”，CYP27A1，甾醇27-羟化酶)、儿童期共济失调(childhood ataxia)和脑髓鞘形成低下(cerebral hypomyelination) (CACH)/白质消融性疾病(vanishing white matter disease) (VWMD) (eIF2B，真核起始因子2B)、法布里病(Fabry disease) (GLA，α-半乳糖苷酶A)、岩藻糖苷贮积症(FUCA1，α-L-岩藻糖苷酶)、GM1神经节苷脂贮积症(GLB1，β-半乳糖苷酶)、L-2-羟基戊二酸尿症(L2HDGH，L-2-羟基戊二酸脱氢酶)、克拉伯病(Krabbe disease) (GALC，半乳糖脑苷脂酶(galactocerebrosidase))、伴皮质下囊肿的巨脑性白质脑病(megalencephalicleukoencephalopathy with subcortical cysts) (“MLC”，MLC1和/或HEPACAM)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy) (ASA，芳基硫酸酯酶A)、多种硫酸酯酶缺乏症(“MSD”，SUMF1，影响所有硫酸酯酶的硫酸酯酶修饰因子1)、佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease) (也称为“X连锁痉挛性截瘫(X-linked spastic paraplegia)”、PLP1 [X连锁蛋白脂质蛋白1 (X-linked proteolipid protein 1)]和/或GJA12 [间隙连接蛋白12 (gap junction protein 12)])、Pol III相关性脑白质营养不良(Pol III-Related Leukodystrophies) (POLR3A和/或POLR3B)、雷夫叙姆病(Refsum disease)(PHYH，[植烷酰辅酶A羟化酶]和/或Pex7 [PHYH导入到过氧化物酶体])、扎拉病(salladisease) (也称为“游离唾液酸贮积病”，SLC17A5，唾液酸转运蛋白)、舍格伦-拉松综合征(Sjogren-Larsson syndrome) (ÁLDH3A2，醛脱氢酶)、X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy) (“ALD”，ABCD1，过氧化物酶体ATP酶结合盒蛋白)、泽尔韦格综合征谱系障碍(Zellweger syndrome spectrum disorders) (也称为过氧化物酶体生物发生障碍，PEX1，PEX2，PEX3，PEX4，PEX5，PEX10，PEX11B，PEX12，PEX13，PEX14，PEX16， PEX19，PEX26)等。
CNS的障碍包括涉及视网膜、后束和视神经的眼科障碍(例如色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变及其他视网膜退行性疾病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼)。
大多数(如果并非全部)眼科疾病和障碍与以下3种类型适应症中的一种或多种相关：(1)血管生成，(2)炎症，和(3)变性。本发明的递送载体可用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞变性、促进细胞保留或促进细胞生长及前述组合的因子。
例如，糖尿病性视网膜病变的特征为血管生成。糖尿病性视网膜病变可通过眼内(例如玻璃体内)或眼周(例如筋膜下区中)递送一种或多种抗血管生成因子来治疗。一种或多种神经营养因子也可眼内(例如玻璃体内)或眼周共同递送。
葡萄膜炎涉及炎症。一种或多种抗炎因子可通过眼内(例如玻璃体或前房)给予本发明的递送载体来给予。
相比之下，色素性视网膜炎的特征为视网膜变性。在代表性的实施方案中，色素性视网膜炎可通过眼内给予(例如玻璃体给予)编码一种或多种神经营养因子的递送载体来治疗。
年龄相关性黄斑变性涉及血管生成和视网膜变性两者。该障碍可通过眼内(例如玻璃体)给予编码一种或多种神经营养因子和/或眼内或眼周(例如筋膜下区中)给予编码一种或多种抗血管生成因子的本发明递送载体来治疗。
青光眼的特征为眼压升高和视网膜神经节细胞丧失。用于青光眼的治疗包括使用本发明的递送载体给予一种或多种保护细胞免受兴奋性毒性损伤的神经保护剂。这种试剂包括眼内，任选地玻璃体内递送的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、细胞因子和神经营养因子。
在其他实施方案中，本发明可用于治疗癫痫发作，例如以减少癫痫发作的发病、发生率和/或严重程度。用于癫痫发作的治疗性治疗的疗效可通过行为(例如晃动、眼睛或嘴巴的轻拍)和/或电图手段(大多数癫痫发作具有特征性的电图异常)来评价。因此，本发明还可用于治疗以随着时间的推移多次癫痫发作为特征的癫痫。
在一个代表性的实施方案中，生长抑素(或其活性片段)使用本发明的递送载体给予脑以治疗垂体肿瘤。根据该实施方案，编码生长抑素(或其活性片段)的递送载体通过微量输注到垂体中给予。同样地，这种治疗可用于治疗肢端肥大症(来自垂体的异常生长激素分泌)。生长抑素的核酸序列(例如GenBank登录号J00306)和氨基酸序列(例如GenBank登录号P01166；含有经加工的活性肽生长抑素-28和生长抑素-14)为本领域已知的。
在特定的实施方案中，载体可包含如例如美国专利号7,071,172中所述的分泌信号。
在本发明的代表性实施方案中，将病毒载体和/或病毒衣壳给予CNS (例如给予脑或眼)。可将病毒载体和/或衣壳引入到脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、脑垂体、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体、大脑，包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮层、基底神经节、海马和杏仁核)、边缘系统、新皮层、纹状体、大脑和/或下丘中。病毒载体和/或衣壳也可给予不同眼区，比如视网膜、角膜和/或视神经。
可将病毒载体和/或衣壳递送到脑脊液中(例如通过腰椎穿刺)用于递送载体的更分散给予。在其中血脑屏障受到干扰的情况下(例如脑肿瘤或脑梗塞)，病毒载体和/或衣壳可进一步血管内给予至CNS。
病毒载体和/或衣壳可通过本领域已知的任何途径给予期望的CNS区域，包括(但不限于)鞘内、脑内、脑室内、静脉内(例如在存在糖比如甘露醇的情况下)、鼻内、耳内、眼内(例如玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如筋膜下区)递送以及肌内递送与逆向递送至运动神经元。
在一些实施方案中，本发明的病毒载体或组合物可经肠内、胃肠外、鞘内、脑池内、脑内、脑室内、鼻内、耳内、眼内、眼周、直肠内、肌内、腹膜内、静脉内、口服、舌下、皮下和/或经皮途径递送。在一些实施方案中，本发明的病毒载体或组合物可颅内和/或脊柱内递送。
在特定的实施方案中，病毒载体和/或衣壳以液体制剂通过直接注射(例如立体定向注射)至CNS中期望的区域或区室给予。在其他实施方案中，病毒载体和/或衣壳可通过局部施用于期望的区域或通过气溶胶制剂的鼻内给予来提供。给予眼睛可通过局部施用液滴来进行。作为另一个备选方案，病毒载体和/或衣壳可作为固体缓慢释放制剂给予(参见例如美国专利号7,201,898)。
在仍然另外的实施方案中，病毒载体可用于逆向转运以治疗和/或预防涉及运动神经元的疾病和障碍(例如肌萎缩侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。例如，病毒载体可递送至肌肉组织，从那里其可迁移到神经元中。
本发明可如以下编号段落中的任何一段所定义。
1. 一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含AAV 2.5衣壳蛋白，所述AAV 2.5衣壳蛋白包含一个或多个引入新的聚糖结合位点的氨基酸取代。
2. 段落1的AAV衣壳蛋白，其中一个或多个氨基酸取代包括：
a) A267S；
b) SQAGASDIRDQSR464-476SX1AGX2SX3X4X5X6QX7R，其中X1-7可为任何氨基酸；和
c) EYSW 500-503EX8X9W，其中X8-9可为任何氨基酸。
3. 段落2的AAV衣壳蛋白，其中：
X1为V或其保守取代；
X2为P或其保守取代；
X3为N或其保守取代；
X4为M或其保守取代；
X5为A或其保守取代；
X6为V或其保守取代；
X7为G或其保守取代；
X8为F或其保守取代；和/或
X9为A或其保守取代。
4. 段落3的AAV衣壳蛋白，其中X1为V，X为P，X3为N，X4为M，X5为A，X6为V，X7为G，X8为F，和X9为A，其中新的聚糖结合位点为半乳糖结合位点。
5. 段落1-4中任何一段的AAV衣壳蛋白，其中AAV2.5衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:1或其功能衍生物。
6. 段落1-5中任何一段的AAV衣壳蛋白，其中氨基酸序列为SEQ ID NO:2或其功能衍生物。
7. 一种病毒衣壳，其包含段落1-6中任何一段的AAV衣壳蛋白。
8. 一种病毒载体，其包含：
(a) 段落7的病毒衣壳；和
(b) 包含至少一个末端重复序列的核酸，
其中核酸被病毒衣壳壳体化。
9. 一种组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的段落1-6中任何一段的AAV衣壳蛋白、段落7的病毒衣壳和/或段落8的病毒载体。
10. 一种将核酸引入到细胞中的方法，其包括使细胞与段落8的病毒载体接触。
11. 段落10的方法，其中细胞处于神经组织中。
12. 段落11的方法，其中细胞为神经元或神经胶质细胞。
13. 段落12的方法，其中神经胶质细胞为星形胶质细胞。
14. 段落11的方法，其中与AAV1、AAV2、AAV9或AAV2.5病毒载体相比较，病毒载体具有增强的神经组织转导。
15. 段落10-14中任何一段的方法，其中细胞处于受试者中。
16. 段落15的方法，其中受试者为人类受试者。
17. 段落16的方法，其中受试者为儿童。
18. 段落17的方法，其中儿童为婴儿。
19. 段落15或16的方法，其中受试者处于子宫内。
20. 段落15-19中任何一段的方法，其中与同AAV1、AAV2、AAV9或AAV2.5病毒载体接触时相比较，受试者在同段落8的病毒载体接触时具有降低的免疫学特征。
21. 一种在需要它的受试者中治疗疾病或障碍的方法，其包括通过在治疗性核酸藉此在受试者的细胞中表达的条件下给予受试者段落8的病毒载体和/或段落9的组合物，将治疗性核酸引入到受试者的细胞中。
22. 段落21的方法，其中受试者为人类。
23. 段落21或22的方法，其中受试者处于子宫内。
24. 段落21-23中任何一段的方法，其中受试者患有CNS疾病或障碍或者处于其风险下。
25. 段落21-23中任何一段的方法，其中受试者患有先天性神经退行性障碍或者处于其风险下。
26. 段落21-23中任何一段的方法，其中受试者患有以下疾病或处于其风险下：成人发病的常染色体显性脑白质营养不良(ADLD)、艾卡尔迪-古铁雷斯综合征、亚历山大病、CADASIL、卡纳万病、CARASIL、脑腱黄瘤病、儿童期共济失调和脑髓鞘形成低下(CACH))/白质消融性疾病(VWMD)、法布里病、岩藻糖苷贮积症、GM1神经节苷脂贮积症、克拉伯病、L-2-羟基戊二酸尿症、伴皮质下囊肿的巨脑性白质脑病、异染性脑白质营养不良、多种硫酸酯酶缺乏症、佩梅病、Pol III相关性脑白质营养不良、雷夫叙姆病、扎拉病(游离唾液酸贮积病)、舍格伦-拉松综合征、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、泽尔韦格综合征谱系障碍、粘多糖贮积症I型、粘多糖贮积症II型、粘多糖贮积症III型、粘多糖贮积症IV型、粘多糖贮积症V型、粘多糖贮积症VI型、粘多糖贮积症VII型、粘多糖症贮积IX型及其任何组合。
27. 段落21或22的方法，其中受试者患有与疾病或障碍相关的疼痛或处于患有其的风险下。
28. 段落21-27中任何一段的方法，其中病毒载体或组合物经肠内、胃肠外、鞘内、脑池内、脑内、脑室内、鼻内、耳内、眼内、眼周、直肠内、肌内、腹膜内、静脉内、口服、舌下、皮下和/或经皮途径递送。
29. 段落21-27中任何一段的方法，其中病毒载体或组合物颅内和/或脊柱内递送。
本发明已得到描述，将在以下实施例中更详细地说明，这些实施例包括在本文中仅用于说明目的并且不旨在限制本发明。
实施例
实施例1：AAV2-G9和AAV2.5-G9的恒河猴子宫内处理.
先天性单基因神经退行性障碍(比如粘多糖病和脑白质营养不良)为靶向基因疗法的主要候选者，但成功的干预必须发生于疾病的身体和行为表现之前。在某些情况下，疾病开始发生于发育早期，并且因此必须考虑在出生之前治疗。本研究比较天然存在的AAV血清型(AAV9)与两种新型嵌合AAV载体(AAV2-G9和AAV2.5-G9 (衣壳的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示))在超声引导下于娠中期的早期在子宫内颅内给予到灵长类动物中后的安全性、效率和细胞向性。近期收获组织，并通过离体生物发光成像(BLI)和qPCR评价转基因表达。BLI表明，所有测试的载体在大脑半球和脊髓中均有高水平的萤火虫荧光素酶表达。qPCR与BLI研究结果高度相关。未观察到对胎儿生长或发育的不利影响。组织在正常限度内具有经免疫组织化学证实的预期的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞群体。这些研究表明嵌合AAV载体用于适合于基因置换策略的先天性神经退行性障碍的靶向基因疗法的安全性、功效和向性。
超声检查或在胎儿组织收获时未检测到不良反应。当与历史对照(N=36)相比较，组织收获时的胎儿体重和器官重量在正常限度内(平均值465.1±16.8，历史对照平均值484.1±14.2 g；图1)。脑重量(平均值53.8±1.7 g)也与同期(平均值55.5±1.9 g)和历史对照(平均值56.1±0.6 g)相当。
生物发光成像(BLI)结果. 观察到给予AAV载体的所有胎儿在大脑半球内具有高水平的萤火虫荧光素酶表达并且主要与载体给予侧相关(图2)。给予AAV9的胎儿在所有脑叶中显示出2.8x108 p/s和6.6x108 p/s的总生物发光，并且在给予AAV2-G9的胎儿中观察到7.9 x108 p/s和8.6 x109 p/s。给予AAV2.5-G9的胎儿显示出1.4 x107-5.3 x109 p/s。当与AAV9相比较时，使用嵌合载体(AAV2-G9、AAV2.5-G9)时个体脑叶中的生物发光通常更大(表3)。在脊髓中也注意到萤火虫荧光素酶表达。在中枢神经系统以外的组织中检测到非常低或没有生物发光。
载体生物分布结果. 通过在组织收获时对胎脑(大脑半球的所有叶、小脑)、脊髓和外周组织中萤火虫荧光素酶拷贝/50,000个细胞的qPCR评价载体生物分布(表4)。在所有AAV治疗的脑(9/9)和脊髓的所有区域中均检测到载体的存在。与AAV2-G9和AAAV9相比较，AAV2.5-G9在所有脑和脊髓区域中存在更多的载体。总体而言，荧光素酶拷贝数在个体动物之间有所不同(表4)。与生物发光相比较，在脊髓中观察到高载体基因组拷贝。在中枢神经系统以外的组织中，通过qPCR扩增的载体基因组非常低或没有。
该项研究解决了AAV9和两种新型嵌合AAV 载体(AAV2-G9和AAV2.5-G9)的转导效率和生物分布。颅内给予之后胎脑发育显示遵循正常发育模式，表明该方法和所研究的AAV载体的安全性。测试的嵌合载体在单位点给予的情况下于所有脑叶、小脑和脊髓中均显示出具有稳健的转导效率。
已表明子宫内的AAV给予在发育中的小鼠眼睛和耳朵方面为安全的，所述眼睛和耳朵含有处于有丝分裂期后且不会再生的感觉光感受器和感觉毛细胞。视觉和听觉功能的产后评价显示，子宫内注射编码GFP报告基因的AAV载体对感觉阈值几乎没有影响。这很重要，因为即使是一小部分这些感觉细胞的死亡或功能障碍也很易于通过功能分析检测到，因此表明具有良好的安全特性。进一步的组织学分析显示正常的感觉细胞密度和形态学。
恒河猴. 所有动物程序均符合动物福利法(Animal Welfare Act)的要求，并且在实施之前由加州大学戴维斯分校(the University of California, Davis)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准了方案。与动物护理(饮食、关养)相关的活动按照加州国家灵长类动物研究中心(California NationalPrimate Research Center)的标准操作程序进行。按照既定方法，对具有先前怀孕史的正常周期的成年雌性恒河猴(rhesus monkeys) (恒河猴(Macaca mulatta)) (N=9基因转移；3个对照)进行繁殖并鉴定为怀孕。恒河猴的孕期按55天的增量分为三期：妊娠早期(妊娠0-55天)、妊娠中期(妊娠56-110天)和妊娠晚期(妊娠111-165天)。分娩一般地发生于孕龄165± 10天时。
载体给予和胎儿监测. 对母兽进行AAV抗体筛选，以选择血清阴性雌性进行研究分配。在妊娠中期的早期(65±5天)使用脑室内方法在超声引导下给予AAV载体。载体上清液(0.1 ml体积中1x1012基因组拷贝)经颅内给予注射到右侧或左侧脑室中(N=9)。根据既定程序，在妊娠期间每10-14天对所有怀孕者进行超声检查监测。
组织收获. 根据既定方案，近期进行了子宫切开术。取出所有组织并对萤火虫荧光素酶表达进行成像。胎脑称重，然后将左右半球(额叶、顶叶、颞叶、枕叶)、小脑和中脑切片。脊髓区域(颈、胸、腰)也在BLI后进行了评价，用于分子和组织学分析。所有组织的样品均固定于福尔马林中用于组织学分析或速冻于液氮中用于分子分析。冷冻样品储存于≤-80℃下直至分析。
BLI. 在静脉内注射D-荧光素(100 mg/kg)后立即进行荧光素酶表达的BLI (具有Living Image软件的IVIS 200®成像系统, Xenogen, Alameda, CA)。通过在具有阳性发光的切片周围放置感兴趣的区域，使用半定量方法(光子/cm2；P/S)评价生物发光。
载体生物分布. 为了量化载体的生物分布，使用Gentra Puregene Tissue 试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)从速冻组织中分离基因组DNA。qPCR用萤火虫荧光素酶的引物进行以量化载体的存在，并用管家基因ε-珠蛋白(Life Technologies)作为DNA分离和PCR反应的内部对照。使用7900 ABI序列检测系统和TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)在96孔光学板中进行实时qPCR分析。相对于管家基因对基因组DNA表达进行量化，以标准化样品DNA的量。
免疫组织化学. 通过苏木精和伊红(H&E)染色评价小脑和左右额叶、顶叶、颞叶和枕叶的福尔马林固定石蜡切片，以评估组织形态学。根据既定方案，用神经元标记物(Neuro-ChromTM泛神经元标记物, EMD Millipore)、星形胶质细胞标记物(胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein), Abcam)或少突胶质细胞标记物(环核苷酸磷酸二酯酶(Cyclic-nucleotide phosphodiesterase), Abcam)进行IHC。简而言之，切片用二甲苯脱蜡，然后在分级乙醇中再水化。热介导的抗原修复在枸橼酸盐缓冲液中进行，之后与一抗一起在4℃下温育过夜。二抗在室温下施用1小时(AlexaFluor-488, LifeTechnologies)进行可视化。具有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI; LifeTechnologies)的ProLong Gold抗褪色试剂用于封固和鉴定细胞核(Molecular Probes)。
RNA原位杂交. 按照制造商描述的方案，用RNAscope® 2.5测定系统(AdvancedCell Diagnostics, Hayward, CA)可视化荧光素酶报告RNA。靶探针包括荧光素酶(luc2)以可视化载体的存在，和包括FOX3以可视化神经元。阴性对照探针针对细菌基因dapB，而阳性对照探针针对管家基因Polr2a和PPIB。切片用VectaMount (Vector Laboratories Inc,Burlingame, CA)封固并用Olympus BX61显微镜可视化。
实施例2：AAV2.5G9嵌合体保留AAV2.5的活性
初步分析表明，AAV 2.5G9嵌合体保留AAV2.5嵌合体的各种活性，比如骨骼肌的转导、肝素结合、独特的免疫学特征的获得、降低的肝脏向性和神经细胞向性(神经元和神经胶质细胞比如星形胶质细胞)。这一初步分析将通过未来的实验得到证实，以下提供其实例。
转导骨骼肌
AAV 2.5G9变体转导骨骼肌的能力将通过以下实验进行评估。将1x1010个含有基因组的病毒颗粒注射到BALB/c小鼠的腓肠肌中后，并与对照AAV血清型AAV2.5和AAV 2进行比较。每只小鼠在注射后7、14、28、42和95天时进行成像。本实验中使用的病毒使用肝素HPLC或氯化铯梯度纯化。使用CMIR_image软件计算从每只动物发出的光量。每条腿的感兴趣区域(ROI)被限定并用于计算发出的总光子。数据表示为所有6个肢体的平均值。AAV2.5G9变体与AAV2.5相比表现出可比至更大的肌肉转导，并且AAV2.5G9和AAV2.5两者表现出比AAV2高得多的肌肉转导。
肝素结合
不同变体被肝素纯化的能力也将通过以下实验进行检验。将AAV2.5G9与AAV2.5和AAV2血清型进行比较。将每种AAV变体的等效颗粒施用于1型肝素琼脂糖并使得能够结合。柱子用PBS洗涤，然后用氯化钠洗脱。然后经斑点印迹杂交确定存在于流过物、洗涤物和洗脱物中的颗粒数量。数据被描绘为未结合颗粒(洗涤和流过)和结合(洗脱)的百分比。与之前的实验(美国专利 9,012,224)一样，AAV2.5变体表现出与AAV2相似的肝素结合特征。AAV2.5G9也表现出与 AAV2和AAV2.5相似的肝素结合特征，表明将Gal结合口袋移植到AAV2.5血清型上保留这种结合活性，并且也保留与细胞向性相关的受体结合。
免疫学特征
与其他非包膜病毒类似，高剂量的AAV会产生中和抗体，这防止重复给药。随着新的血清型出现，重复给予是可能的。为了探索避免对AAV1、AAV2和/或AAV9预先存在的免疫反应的能力，嵌合2.5G9载体将在暴露于来自预先暴露于不同AAV血清型(分别为1、2和2.5、9)的动物的血清之后通过以下实验测试体外转基因表达。
为了产生对AAV病毒粒子壳具有稳健的免疫反应的动物，在C57blk6小鼠中独立地肌内注射AAV血清型1、2、2.5、2.5G9和9载体的4 x1010颗粒。注射后4周，分离血液并收集血清。然后将来自这些动物的血清用于使用293细胞和表达GFP作为报告基因的AAV特异性血清型载体进行的中和抗体测定。在该测定中，血清依序稀释，并然后与已知量的血清型特异性载体(1 x 108颗粒)在4℃下混合2小时。然后在存在腺病毒辅助病毒的情况下，将这种血清和载体的混合物以感染复数为5加入到24孔板中的293细胞中。在这些条件下，绿色荧光蛋白(GFP)表达为血清型特异性载体在存在中和抗体的情况下感染细胞的能力的量度。然后将中和抗体滴度计算为最高稀释度，其中GFP表达为对照载体(没有与血清型特异性血清预混合)的50%或更低。
结果将表明预先暴露于AAV1的动物可中和AAV 1 GFP转导(例如稀释度高达1:1000)。然而，这种血清型1特异性中和抗体需要更多的小鼠血清来中和AAV嵌合2.5 (例如1:100稀释度)和AAV嵌合2.5G9。更重要的是，这一观察结果适用于从预先暴露于AAV血清型2病毒粒子壳的动物中获得的小鼠血清。在该测定中，当与AAV2对照相比较，仅在血清以1:10,000稀释之后才观察到50% GFP转导。然而，对于嵌合2.5和2.5G9，在这种小鼠血清的稀释度低得多(例如仅1:100稀释度)的情况下观察到50% GFP转导。由于在该嵌合载体中仅有0.6%的氨基酸变化与AAV2不同，因此这些改变对预先存在的AAV2中和抗体识别AAV 2.5和AAV2.5G9衣壳的能力具有深远影响。预先暴露于2.5和AAV2.5G9并然后对针对AAV 1、2和2.5、2.5G9和9的中和活性测定的动物产生预期结果，2.5和2.5G9载体需要最高稀释度(例如1:8000)，然后分别是AAV 2需要较低稀释度(例如1:1000)和AAV血清型1需要甚至更低的稀释度(例如1:100)。
类似地，预先暴露于AAV9的动物可以稀释度高达1:1000中和AAV 9 GFP转导。然而，这种血清型9特异性中和抗体将需要更多的小鼠血清来中和AAV嵌合2.5G9 (例如1:100稀释度)。更重要的是，这一观察结果适用于从预先暴露于AAV血清型9病毒粒子壳的动物中获得的小鼠血清。在该测定中，当与AAV9对照相比较，仅在血清被显著稀释(例如1:10,000)之后才观察到50% GFP转导。然而，对于嵌合2.5和2.5G9，在这种小鼠血清的稀释度低得多(例如仅1:100稀释度)的情况下观察到50% GFP转导。预先暴露于2.5和AAV2.5G9并然后对针对AAV 1、2和2.5、2.5G9和9的中和活性测定的动物产生预期结果，2.5和2.5G9载体需要最高稀释度(例如1:8000)，然后分别是AAV 2需要较低稀释度(例如1:1000)和AAV血清型1和AAV9需要甚至更低的稀释度(例如1:100)。
这些研究的预期结论为在AAV2.5中进行的产生嵌合2.5G9的氨基酸改变，尽管数量少，但足以显著影响当受到AAV2、AAv2.5和AAV9特异性中和抗体攻击时，该病毒粒子的免疫谱。
这些研究将表明2.5G9载体适合于转导预先暴露于AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV9或其组合的个体，从而在可用载体中提供更大的多功能性。例如，这种嵌合载体会允许在预先暴露于AAV1、AAV2、AAV9或AAV2.5的动物和患者中重新给予。另外，这表明可改变显著改变免疫反应的AAV2.5氨基酸衣壳序列中选定的氨基酸。
AAV2.5G9变体中也保留了脑部和肝脏的转导
细胞类型和组织向性也将通过以下实验得到证实。6-8周龄的雄性C57bl/6小鼠用于确定肝脏中AAV2和2.5载体转导的效率。使用300 uL 2.5%阿佛丁麻醉小鼠，并使携带人类因子IX (hFIX)转基因病毒的AAV2、AAV2.5、AAV2.5G9和AAV9载体的1x1011颗粒溶解于250uL PBS中且通过门静脉缓慢注射。载体为双链病毒颗粒，如国际专利公开WO 01/92551中所述。1周和6周之后，使用肝素涂覆的毛细玻璃管从尾静脉收集每只小鼠的100 uL血液。通过在4℃、8000 rpm下离心血样20分钟来收集血清。血清储存于-80℃下直至测试。通过标准ELISA方法测试血清中hFIX的表达。hFIX水平为5 ug/mL的正常人类血清的系列稀释液用作标准品。使用该测定，将发现与AAV2病毒相比较，2.5和AAV2.5G9载体各自具有降低的转导肝脏的能力(图13)。该实验将表明AAV2.5G9变体表现出2.5载体的肌肉向性，并且还保留了当与AAV2的肝脏特异性向性特征相比较2.5载体继而丧失的肝脏特异性向性的丧失。
在另一个实验中，将各自含有绿色荧光蛋白(GFP)报告转基因盒的双链AAV2.5载体、双链AAV 2.5G9载体、双链AAV9载体和双链AAV2载体分别在先前为AAV 2建立的条件下注射到小鼠脑的皮层区域中。然后测定载体的神经元特异性转导。充分确立的是，AAV1和AAV2对神经元转导具有特异性，并且AAV2.5载体转导神经元以及非神经元细胞(神经胶质细胞，比如星形胶质细胞)。
在体内测试AAV2.5G9载体的组织特异性转导时，这些实验的总和同样表明，除保留AAV2.5 (先前报道为衍生于AAV血清型1亲本)获得的组织特异性向性(例如肌肉、骨骼或心脏)和保留AAV2.5丧失的细胞类型特异性转导(例如肝脏-肝细胞特异性转导)之外，AAV2.5G9载体还保留AAV2.5新的向性(非神经元/星形胶质细胞)，其不存在于供体亲本(AAV1)或受者亲本衣壳(AAV2)中，并且为嵌合2.5载体完全独特的。
肝素结合实验. rAAV与肝素琼脂糖的分批结合如先前所述进行(Rabinowitz,(2004) J. Virology 78:4421-4432)。简而言之，将rAAV病毒粒子的等效颗粒施用于1XPBS中的1型肝素琼脂糖(H-6508, Sigma, St. Louis, Mo.)，使得能够在室温下结合1小时，在低速下离心2分钟，并然后去除上清液(流过物)。进行5个床体积的PBS 1 mM MgCl2的6次洗涤，然后进行5个床体积的PBS 1 mM MgCl的3步洗脱，所述PBS 1 mM MgCl含有0.5 MNaCl (步骤1)、1.0 M NaCl (步骤2)或1.5 M氯化钠(步骤3)。存在于洗涤物和3步洗脱物中的rAAV颗粒数通过斑点印迹杂交确定。
动物成像. 将1 x 1010含有病毒基因组的颗粒(vg)注射到6周龄雄性BALB/c小鼠的腓肠肌中。对于每种病毒类型，使用25 ul病毒注射总共6个肢体。使用Roper ScientificImaging (Princeton Instruments)在注射后的不同天数对动物进行成像。简而言之，将动物麻醉并IP注射荧光素底物。注射后10分钟，将动物置于室中并然后测定发光。使用CMIR_Image软件(Center for Molecular Imaging Research, Mass. General)确定每个感兴趣区域的平均总像素数，并随着时间的推移而绘制曲线。
实施例3- AAV2.5G9表现出双重聚糖结合
AAV2.5G9类似于AAV2G9在体外可互换地利用HS和Gal受体
竞争性抑制测定将通过以下实验提供AAV2.5G9变体使用双重聚糖受体的证据。这些测定利用细胞表面上涉及可溶性肝素和ECL的病毒结合，后者选择性地结合末端半乳糖基化聚糖。突变的CHO细胞系CHO-Lec2在将CMP-唾液酸从高尔基体区室转运至细胞表面方面存在缺陷(Deutscher S. L., et al.J. Biol. Chem. 261:96-100 (1986))。因此，CHO-Lec2表面上的大多数末端聚糖部分为半乳糖。CHO-Lec2表面上这种独特的半乳糖基化模式和野生型CHO-Pro5细胞的唾液酸化可用于研究AAV-半乳糖/AAV-唾液酸相互作用(Shenetal. J. Virol. 86:10408-10417 (2012);Shen et al. J. Biol. Chem. 286:13532-13540 (2011))。HS，但不是 ECL，显著抑制CHO-Lec2细胞中的AAV2转导(深灰色条形)，而ECL选择性地阻断AAV9转导达近两个对数单位(白色条形)。这些结果与AAV2和AAV9的预期转导谱一致(Shenet al. J. Biol. Chem. 286:13532–13540 (2011); Summerfordet al.J. Virol. 72:1438-1445 (1998); Bell et al. J. Clin. Invest. 121:2427-2435(2011))。相比之下，AAV2G9和AAV2.5G9只有通过用ECL和HS两者的组合预处理才能有效中和。可以观察到ECL的小而显著的抑制作用。
AAV2、Aav2.5G9、AAV9和AAV2G9的转导谱通过使用ECL或HS抑制每个毒株的细胞表面结合得到进一步证实。嵌合AAV毒株独特的细胞表面附着进一步得到了AAV2.5G9的细胞表面附着仅被ECL和HS的组合而不是单独的试剂竞争性抑制的支持。这与AAV2G9相似，并且将表明AAV2.5G9与AAV2G9相似可互换地结合两种不同聚糖的能力。
双重聚糖结合AAV2.5G9嵌合体的体外表征. 用 FITC-ECL和可溶性肝素对CHOLec2细胞上的AAV2、AAV2.5G9、AAV2G9和AAV9转导的抑制进行测定。CHO Lec2细胞在4℃下预先冷却，并与FITC-ECL、可溶性肝素或两者一起温育，之后用包装CBA-荧光素酶报告转基因盒的AAV2、Av2.5G9、AAV2G9或AAV9感染。在感染后24小时作为以相对光单位表示的荧光素酶活性测量转导效率。通过将转导效率标准化为对照的相对光单位来计算转基因表达的百分比。用FITC-ECL和可溶性肝素，在CHO Lec2细胞上使用AAV2、AAV2.5G、AAV2G9和AAV9对细胞表面结合的抑制进行测定。不同的AAV颗粒与在4℃下预先冷却的细胞结合，并且未结合的病毒粒子通过用冷的PBS洗涤去除。在病毒基因组提取之后使用qPCR对结合的病毒粒子进行量化。结合的病毒粒子的百分比为通过将结合的病毒粒子数量针对相应的对照的数量标准化来确定。
体外结合和转导测定. CHO-Pro5和CHO-Lec2细胞在补充有10% FBS、100单位/ml青霉素(Cellgro)、100 μg/ml链霉素(Cellgro)和2.5 μg/ml两性霉素B (Sigma)的α最小Eagle培养基(Thermo Scientific)中进行培养。细胞以1 × 105个细胞/孔的密度接种于24孔板中。
竞争性抑制测定. CHO-Lec2细胞在4℃下预先冷却30分钟，并与100 μg/ml FITC标记的鸡冠刺桐凝集素(FITC-ECL, Vector Laboratories)一起在α最小Eagle培养基中于4℃下温育1小时。或者，不同的病毒衣壳与100 μg/ml的可溶性肝素(Sigma) 或1x PBS (对照)一起在室温下温育1小时。然后以1000 vg拷贝/细胞的MOI用包装CBA-Luc转基因盒的HS结合或模拟处理的AAV2、AAV2.5G9、AAV2G9或AAV9衣壳感染模拟处理或FITC-ECL处理的细胞。在冷室中温育1小时后，通过用冰冷的1× PBS洗涤3次去除未结合的病毒粒子。对于细胞表面结合测定，结合的病毒粒子数量通过使用定量PCR量化每个孔中的载体基因组拷贝数/细胞来测量。对于转导测定，将感染的Lec2细胞移至37℃并温育24小时，之后对来自细胞裂解物的荧光素酶转基因表达进行定量。
前述内容为对本发明的说明，而不应解释为对其的限制。
表1. AAV基因组
Figure DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE010
表2. 示例性AAV基因组和衣壳登录号.
Figure DEST_PATH_IMAGE012
*不完整的序列
表3. 中枢神经系统中生物发光的定量评价.
Figure DEST_PATH_IMAGE014
表4. 通过实时qPCR评估中枢神经系统中的载体生物分布.
Figure DEST_PATH_IMAGE016
Figure IDA0003319566170000011
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Figure IDA0003319566170000071
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Claims (29)

1.一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含AAV 2.5衣壳蛋白，所述AAV 2.5衣壳蛋白包含一个或多个引入新的聚糖结合位点的氨基酸取代。
2.权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括：
a) A267S；
b) SQAGASDIRDQSR464-476SX1AGX2SX3X4X5X6QX7R，其中X1-7可为任何氨基酸；和
c) EYSW 500-503EX8X9W，其中X8-9可为任何氨基酸。
3.权利要求2的AAV衣壳蛋白，其中：
X1为V或其保守取代；
X2为P或其保守取代；
X3为N或其保守取代；
X4为M或其保守取代；
X5为A或其保守取代；
X6为V或其保守取代；
X7为G或其保守取代；
X8为F或其保守取代；和/或
X9为A或其保守取代。
4.权利要求3的AAV衣壳蛋白，其中X1为V，X为P，X3为N，X4为M，X5为A，X6为V，X7为G，X8为F，和X9为A，其中所述新的聚糖结合位点为半乳糖结合位点。
5.权利要求1-4中任何一项的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV2.5衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或其功能衍生物。
6.权利要求1-5中任何一项的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸序列为SEQ ID NO:2或其功能衍生物。
7.一种病毒衣壳，其包含权利要求1-6中任何一项的AAV衣壳蛋白。
8.一种病毒载体，其包含：
(a) 权利要求7的病毒衣壳；和
(b) 包含至少一个末端重复序列的核酸，
其中所述核酸被所述病毒衣壳壳体化。
9.一种组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的权利要求1-6中任何一项的AAV衣壳蛋白、权利要求7的病毒衣壳和/或权利要求8的病毒载体。
10.一种将核酸引入到细胞中的方法，其包括使所述细胞与权利要求8的病毒载体接触。
11.权利要求10的方法，其中所述细胞处于神经组织中。
12.权利要求11的方法，其中所述细胞为神经元或神经胶质细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述神经胶质细胞为星形胶质细胞。
14.权利要求11的方法，其中与AAV1、AAV2、AAV9或AAV2.5病毒载体相比较，所述病毒载体具有增强的神经组织转导。
15.权利要求10-14中任何一项的方法，其中所述细胞处于受试者中。
16.权利要求15的方法，其中所述受试者为人类受试者。
17.权利要求16的方法，其中所述受试者为儿童。
18.权利要求17的方法，其中所述儿童为婴儿。
19.权利要求15或16的方法，其中所述受试者处于子宫内。
20.权利要求15-19中任何一项的方法，其中与同AAV1、AAV2、AAV9或AAV2.5病毒载体接触时相比较，所述受试者在与权利要求8的病毒载体接触时具有降低的免疫学特征。
21.一种在需要它的受试者中治疗疾病或障碍的方法，其包括通过在治疗性核酸藉此在所述受试者的细胞中表达的条件下给予所述受试者权利要求8的病毒载体和/或权利要求9的组合物，将所述治疗性核酸引入到所述受试者的细胞中。
22.权利要求21的方法，其中所述受试者为人类。
23.权利要求21或22的方法，其中所述受试者处于子宫内。
24.权利要求21-23中任何一项的方法，其中所述受试者患有中枢神经系统(CNS)疾病或障碍或者处于其风险下。
25.权利要求21-23中任何一项的方法，其中所述受试者患有先天性神经退行性障碍或者处于其风险下。
26.权利要求21-23中任何一项的方法，其中所述受试者患有以下疾病或处于其风险下：成人发病的常染色体显性脑白质营养不良(ADLD)、艾卡尔迪-古铁雷斯综合征、亚历山大病、CADASIL、卡纳万病、CARASIL、脑腱黄瘤病、儿童期共济失调和脑髓鞘形成低下(CACH))/白质消融性疾病(VWMD)、法布里病、岩藻糖苷贮积症、GM1神经节苷脂贮积症、克拉伯病、L-2-羟基戊二酸尿症、伴皮质下囊肿的巨脑性白质脑病、异染性脑白质营养不良、多种硫酸酯酶缺乏症、佩梅病、Pol III相关性脑白质营养不良、雷夫叙姆病、扎拉病(游离唾液酸贮积病)、舍格伦-拉松综合征、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、泽尔韦格综合征谱系障碍、粘多糖贮积症I型、粘多糖贮积症II型、粘多糖贮积症III型、粘多糖贮积症IV型、粘多糖贮积症V型、粘多糖贮积症VI型、粘多糖贮积症VII型、粘多糖症贮积IX型及其任何组合。
27.权利要求21或22的方法，其中所述受试者患有与疾病或障碍相关的疼痛或处于患有其的风险下。
28.权利要求21-27中任何一项的方法，其中所述病毒载体或组合物经肠内、胃肠外、鞘内、脑池内、脑内、脑室内、鼻内、耳内、眼内、眼周、直肠内、肌内、腹膜内、静脉内、口服、舌下、皮下和/或经皮途径递送。
29.权利要求21-27中任何一项的方法，其中颅内和/或脊柱内递送所述病毒载体或组合物。
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