CN113637630B

CN113637630B - 一种胰岛样细胞团及其制法和应用

Info

Publication number: CN113637630B
Application number: CN202010394320.5A
Authority: CN
Inventors: 程新; 肖伊妮
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2040-05-11
Also published as: CN113637630A; WO2021228104A1

Abstract

本发明提供了一种人工培养的胰岛样细胞团，其特征在于，所述细胞群由干细胞分化而得，在未经富集的情况下同时中包含：(a)胰岛β细胞占20％～90％；和(b)胰岛α细胞占5％～70％；以及由人多能干细胞培养获得所述的胰岛样细胞团的培养体系。本发明还提供了利用这种胰岛样细胞团构建胰岛微环境的模型、使用这种胰岛样细胞团制备一种人工胰腺装置以及包含种胰岛样细胞团的药物组合物。本发明提供的人工培养的胰岛样细胞团可以有效的在葡萄糖等促分泌素的刺激下释放胰岛素，在静态和动态GSIS实验中都有很好的效果；用于I型糖尿病在体模型，使I型糖尿病小鼠的血糖长期维持在正常区间。

Description

一种胰岛样细胞团及其制法和应用

技术领域

本发明属于干细胞分化领域，具体地，本发明涉及一种胰岛样细胞团的制法及应用。

背景技术

糖尿病是影响世界约4.6亿人口健康的疾病，是由胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗造成血糖调节失常而导致。全部一型糖尿病以及一部分晚期二型糖尿病患者需要胰岛素替代疗法来降低高血糖以维持生命，比如皮下注射胰岛素。该法须频繁监测血糖变化来调整胰岛素用量，但仍无法实现像胰岛一样对血糖的精密调控，因此高血糖导致的视网膜病变、肾病、神经性疾病及血管病变等并发症以及低血糖导致的昏迷甚至死亡仍无法避免。另一方面，胰岛素滥用会产生低血糖反应、胰岛素性水肿等不良副作用。

胰岛移植能够解决上述问题，但面临供体稀缺和需要长期服用抗排异药的问题。人多能干细胞由于具有无限增殖和向各个方向分化的能力，在细胞治疗领域具有巨大潜能，因此人多能干细胞是制备胰岛β细胞的良好的细胞来源。为了实现糖尿病的细胞治疗，制备细胞组成比例类似于人胰岛的胰岛样细胞团具有重大意义。但当前所有研究均不能在同一培养体系中同时产生与真实胰岛细胞类群比例类似的α细胞和β细胞。

本领域急需建立一种得率高且能诱导完整分泌功能的构建胰岛样细胞团的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种得率高且能诱导完整分泌功能的构建胰岛样细胞团的方法。

在第一方面，本发明提供一种体外分化获得的胰岛样细胞团，所述胰岛样细胞团含有以下组分：

(a)胰岛β细胞；

(b)胰岛α细胞；和；

(c)任选的其他内分泌细胞(包括但不限于表达SST或PPY等其他内分泌激素的内分泌细胞)；

其中所述所述的胰岛β细胞占细胞团中的细胞总数的20％～90％；

所述的胰岛α细胞占细胞团中的细胞总数的5％～70％。

在优选的实施方式中，所述胰岛样细胞团是未经富集的胰岛样细胞团。

在优选的实施方式中，所述胰岛样细胞团包括经分选分别得到胰岛β细胞和胰岛α细胞后，再经过重聚合得到包含相应比例，例如与真实胰岛细胞群类似比例的胰岛β细胞和胰岛α细胞的胰岛样细胞团。

在具体的实施方式中，所述胰岛样细胞团中胰岛β细胞占30％～80％；和胰岛α细胞占6％～40％；更优选地，所述胰岛样细胞团中胰岛β细胞占40％～70％；和胰岛α细胞占10％～35％。

在一优选的实施方式中，所述胰岛样细胞团表达与胰岛相当量的内分泌细胞标志NEUROD1。

在一优选的实施方式中，通过免疫荧光染色检测，所述胰岛β细胞中表达特异性标志基因PDX1、NKX6.1、INS、ABCC8、MAFB、SLC30A8；优选地，表达特异性标志基因PDX1、NKX6.1、INS、ABCC8、MAFB、SLC30A8、MAFA；更优选地，表达特异性标志基因PDX1、NKX6.1、INS、ABCC8、MAFB、SLC30A8、MAFA、IAPP；

优选地，在至少表达上述特异性标志基因的基础上，表达MAFA的β细胞比例占全部β细胞的70-85％，更优选至少占全部β细胞的80％；表达IAPP的β细胞比例占全部β细胞的30-60％，更优选至少占全部β细胞的50％；所述α细胞表达标志基因GCG、ARX、PCSK2；

在另一优选的实施方式中，通过单细胞测序检测，同时表达INS和IAPP的β细胞占所有β细胞的30-45％，优选32-40％，更优选35-38％；同时表达INS、IAPP和MAFA的β细胞占全部beta细胞的15-30％，优选18-25％，更优选20-24％。

在一优选的实施方式中，所述胰岛样细胞团能在葡萄糖刺激下分泌胰岛素；优选地，所述胰岛样细胞团在高糖刺激下的人胰岛素释放量是低糖刺激下的人胰岛素释放量的至少1.5倍，优选至少2倍，更优选至少3倍，再优选至少5倍，更优选至少10倍。

在一优选的实施方式中，所述胰岛样细胞团在低糖刺激下的人胰高血糖素释放量是高糖刺激下的人胰高血糖素释放量的至少2倍，优选至少3倍，更优选至少4倍，最优选至少5倍；所述低糖刺激是指1.5mM-3.5mM葡萄糖，优选2mM葡萄糖；所述高糖刺激是指15mM-35mM葡萄糖，优选20mM葡萄糖。

在一优选的实施方式中，所述胰岛样细胞团在葡萄糖刺激下的胰岛素分泌实验中表现出与胰岛类似的胰岛素分泌模式。

在一优选的实施方式中，所述葡萄糖刺激下的胰岛素分泌实验包括静态GSIS和动态GSIS。

在一优选的实施方式中，所述与胰岛类似的胰岛素分泌模式，包括反应：

(I)在静态GSIS实验的各个刺激循环，高糖刺激下胰岛素的分泌量都高于低糖刺激下的胰岛素分泌量，在氯化钾的刺激下胰岛素得到最大程度的释放。

(II)在动态GSIS实验的整个刺激过程，胰岛素分泌模式为：

(i)在低糖刺激下胰岛素呈较低的本底分泌模式；

(ii)在从低糖进入高糖刺激后，胰岛素分泌迅速急剧增加，并在5min内达到胰岛素分泌的高峰；

(iii)在达到胰岛素分泌峰值后的2min内胰岛素分泌剧烈下降到接近本底分泌量，之后胰岛素分泌缓慢回升并持续；

(iv)在高糖阶段进入高糖和10nM Exendin-4的刺激后，胰岛素分泌又开始显著增加，并在2～3min内下降；

(v)从高糖和10nM Exendin-4再次进入低糖刺激阶段后，胰岛素分泌维持在较低本底水平；及

(vi)在进入KCl刺激阶段后，胰岛素分泌急剧增加并在达到峰值后5min左右迅速降低。

在一优选的实施方式中，所述胰岛样细胞团在静态GSIS和动态GSIS实验中均表现出与胰岛类似的胰岛素分泌模式。

在一优选的实施方式中，所述胰岛样细胞团经由干细胞体外诱导分化得到。

在一优选的实施方式中，所述干细胞选自：人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞(hiPSC)、或其组合。

在一优选的实施方式中，所述人诱导多能干细胞包括人诱导多能干细胞、及其经基因编辑过的细胞系、或其组合。

在一优选的实施方式中，所述人诱导多能干细胞由人外周血单核细胞或人间充质干细胞或人成纤维细胞等各种体细胞重编程而来。

在一优选的实施方式中，所述人胚胎干细胞选自：Mel-1胚胎干细胞或其经基因编辑过的细胞系，HES3胚胎干细胞系或其经基因编辑过的细胞系，HUES8胚胎干细胞系或其经基因编辑过的细胞系，H1胚胎干细胞系或其经基因编辑过的细胞系，H9胚胎干细胞系或其经基因编辑过的细胞系，或其组合。

在一优选的实施方式中，所述人胚胎干细胞为INS^GFP/wNKX6.1^{mcherry/mcherry}Mel-1胚胎干细胞系。

在一优选的实施方式中，所述人胚胎干细胞为INS^GFP/w HES3胚胎干细胞系。

在第二方面，本发明提供了一种胰岛样细胞团的制备方法，所述方法包括：

(1)对干细胞进行贴壁细胞形式的分化处理；和

(2)对步骤(1)得到贴壁细胞进行细胞球形式的分化处理；

其中，在所述贴壁细胞形式的分化阶段，利用BMP信号通路抑制因子、烟酰胺、和表皮生长因子(EGF)；优选地，所述BMP信号通路抑制因子是Noggin、LDN-193189或Dorsomorphin或它们的组合

在一优选的实施方式中，所述培养体系根据体系中细胞的状态，在不同培养阶段使用不同的培养条件和培养基。

在一优选的实施方式中，在所述贴壁细胞形式的分化阶段，不利用PKC信号通路激活剂；优选地，所述PKC信号通路激活剂是TPB(-(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadienoylamino)benzolactam)。

在一优选的实施方式中，在所述细胞球形式的分化阶段，利用烟酰胺、表皮生长因子(EGF)或它们的组合。

在具体的实施方式中，在所述贴壁细胞形式的分化阶段结束时，进行贴壁细胞消化处理以便将贴壁细胞分散为细胞团块；优选地，利用分散酶和胰酶的组合进行贴壁细胞消化处理。

在一优选的实施方式中，所述培养阶段包括S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7七个阶段；所述各培养阶段包括：

所述S1阶段是指在所述培养体系中培养初始细胞的第0-2天；

所述S2阶段是指在所述培养体系中培养初始细胞的第3-5天；

所述S3阶段是指在所述培养体系中培养初始细胞的第6-7天；

所述S4阶段是指在所述培养体系中培养初始细胞的第8-9天；

所述S5阶段是指在所述培养体系中培养初始细胞的第10-12天；

所述S6阶段是指在所述培养体系中培养初始细胞的第13-19天；及

所述S7阶段是指在所述培养体系中培养初始细胞的第20天开始的阶段。

在一优选的实施方式中，所述S4阶段结束时进行贴壁细胞消化处理。

在一优选的实施方式中，所述的消化处理指将贴壁细胞分散为细胞团块。

在一优选的实施方式中，所述的细胞团块为均匀大小、高活率的具有成球能力的细胞团块。

在一优选的实施方式中，所述的细胞团块为表达PDX1和NKX6.1的细胞团块。

在一优选的实施方式中，所述的细胞团块含有细胞4～500个细胞；优选地，含有4～100个细胞；更优地，含有10～50个细胞；最优地，含有20个细胞。

在一优选的实施方式中，所述S4阶段结束时消化处理使用组合消化液。

在一优选的实施方式中，所述组合消化液为分散酶和胰酶的组合消化液。

在一优选的实施方式中，所述消化处理的方法，其步骤为：

1)去上清；

2)润洗；

3)加入分散酶；

4)37℃静置5～30min。

5)弃掉分散酶，再添加常温的胰酶室温消化30s；及

6)终止胰酶反应，离心。

在一优选的实施方式中，所述分散酶为用不含钙镁的DPBS现配现用。

在一优选的实施方式中，所述消化时间，当S4细胞PDX1+NKX6.1+比例越高，消化时间越短；当S4细胞中PDX1+NKX6.1+比例越低，消化时间越长。

在一优选的实施方式中，所述分散酶为1mg/ml～5mg/ml Dispase分散酶，优选地，为2mg/ml Dispase分散酶。

在一优选的实施方式中，所述胰酶为0.25％Trypsin胰酶。

在一优选的实施方式中，所述消化处理为2mg/ml Dispase分散酶处理8min再用0.25％Trypsin胰酶处理30s。

在一优选的实施方式中，所述S5阶段使用的培养基中含有MCDB131 basic、RA、SANT-1、LDN193189、ALK5iII、T3。

在一优选的实施方式中，所述S5阶段使用的培养基中添加有EGF成分。

在一优选的实施方式中，所述S5阶段使用的培养基中添加有烟酰胺成分。

在一优选的实施方式中，所述S5阶段的胰腺前体细胞表达PDX1、NKX6.1、NGN3、PAX4、ARX和INS。

在另一优选的实施方式中，所述S5阶段的60～98％，优选70～98％的胰腺前体细胞表达PDX1和NKX6.1。

在一优选的实施方式中，所述S6阶段使用的培养基中含有MCDB131 basic、LDN193189、ALK5iII、和T3。

在一优选的实施方式中，所述S6阶段使用的培养基还含有以下任一成分：GSI-XX、DAPT、Compound-E、和GSI-X。

在一优选的实施方式中，所述S6阶段使用的培养基中添加有烟酰胺成分。

在一优选的实施方式中，所述S6阶段分为S6.1和S6.2。

在一优选的实施方式中，所述S6阶段为7天，其中S6.1的时间为0～3天。

在一优选的实施方式中，所述S6.1所用培养基包含成分为：MCDB131 basic、LDN193189、ALK5iII、T3、GSI-XX、和EGF。

在一优选的实施方式中，所述S6.1阶段使用的培养基中添加有EGF成分。

在一优选的实施方式中，所述S5、S6.1阶段使用的培养基中添加有EGF成分。

在一优选的实施方式中，所述S7阶段使用的培养基中含有MCDB131 basic、ALK5iII、T3、N-乙酰-半胱氨酸、Trolox、和R428。

在一优选的实施方式中，所述S7阶段使用的培养基中添加有烟酰胺成分。

在一优选的实施方式中，所述S5、S6、S7阶段使用的培养基中添加有烟酰胺成分。

在一优选的实施方式中，S1～S6阶段的培养环境为5％氧气和5％二氧化碳，S7阶段的培养环境为21％氧气和5％二氧化碳。

在一优选的实施方式中，S1～S5阶段的培养环境为5％氧气和5％二氧化碳，S6～S7阶段的培养环境为21％氧气和5％二氧化碳。

在一优选的实施方式中，S1～S4阶段的培养环境为5％氧气和5％二氧化碳，S5～S7阶段的培养环境为21％氧气和5％二氧化碳。

在一优选的实施方式中，三维培养的容器为低吸附的培养皿。

在一优选的实施方式中，三维培养的容器为大规模转瓶。

在第三方面，本发明提供一种培养体系，在所述培养体系中，初始细胞经分化培养得到如第一方面所述的胰岛样细胞团。

在一优选的实施方式中，所述初始细胞选自：人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞(hiPSC)、或其组合。

在一优选的实施方式中，所述初始细胞根据第二方面所述的方法进行分化培养。

在第四方面，本发明提供一种胰岛微环境模型，所述模型中含有第一方面所述的胰岛样细胞团。

在一优选的实施方式中，所述模型中不包含微血管结构。

在一优选的实施方式中，所述模型中添加内皮细胞、成纤维细胞或间充质干细胞等细胞构成胰岛样组织。

在第五方面，本发明提供一种第四方面所述的胰岛微环境模型的用途，其特征在于，用于模拟胰岛的正常生理功能和病理状态下胰岛细胞间的作用与联系。

在第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的胰岛样细胞团和药学上可接受的赋形剂。

在一优选例中，本发明的药物组合物还包含其它功能性细胞；所述功能性细胞包括但不限于：血管内皮细胞、间充质细胞、免疫细胞。

在第七方面，本发明提供第一方面所述的胰岛样细胞团的用途，用于制备人工胰腺装置或用于治疗糖尿病的药物。

在一优选的实施方式中，所述人工胰腺装置在葡萄糖刺激下可以分泌胰岛素。

在一优选的实施方式中，所述人工胰腺装置在促分泌剂L-精氨酸、Tolbutamide、IBMX、Exendin-4等刺激下可以分泌胰岛素。

在一优选的实施方式中，所述人工胰腺装置在静态GSIS和动态GSIS实验中，在葡萄糖刺激下分泌胰岛素。

在一优选的实施方式中，所述人工胰腺装置所需患者体内，在葡萄糖刺激下分泌胰岛素。

在一优选的实施方式中，所述糖尿病是I型糖尿病。

在第八方面，本发明提供一种人工胰腺装置，所述装置包括一容器，所述容器中含有第一方面所述的胰岛样细胞团和/或第四方面所述的胰岛微环境模型。

在一优选的实施方式中，所述容器提供胰岛样细胞团的氧气和能量供应。

在一优选的实施方式中，所述容器是包囊。

在第九方面，本发明提供一种获得胰岛素的方法，其特征在于，包括步骤：(a)使用葡萄糖刺激第一方面所述的胰岛样细胞团。

在一优选的实施方式中，所述方法还包括步骤(b)分离和浓缩获得可以直接使用的胰岛素。

在一优选的实施方式中，所述胰岛素中胰岛素的含量为50-99％wt，较佳地，75-99％wt；更佳地85-99％wt。

在一优选的实施方式中，所述胰岛素还存在一定量的胰高血糖素。

在一优选的实施方式中，所述胰高血糖素的含量为0.001-10％wt，较佳地，0.01-10％wt；更佳地0.1-10％wt。

在第十方面，本发明提供一种糖尿病的治疗方法，所述方法包括将治疗有效量的第一方面所述的胰岛样细胞团或第六方面所述的药物组合物给予有此需要的对象。

在一优选的实施方式中，所述糖尿病是胰岛素依赖型糖尿病。

在一优选的实施方式中，所述糖尿病是I型糖尿病。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了胰岛类细胞的制备方法示意图。

图2显示了在TPB或EGF+Nico的处理下的基因表达情况。

图3显示了S7胰岛样细胞和人胰岛的基因表达比较。

图4显示了胰岛样细胞的流式细胞分析。其中，图(A)为INS vs GCG(n＝5)，图(B)为INS vs NKX6.1(n＝5)。INS-GFP为INS基因后带GFP荧光蛋白；INS+GCG+细胞的最终命运是α细胞(INS-GCG+细胞)。

图5显示了(A)CPEP，PDX1，NKX6.1，GCG的表达情况(比例尺50μm)；(B)和(C)功能性转录因子，MAFA等的表达情况(比例尺：上图50μm，下图10μm)。

图6显示了电镜下β细胞的囊泡结构(比例尺：胰岛样细胞团200nm；人胰岛：500nm)。

图7显示了胰岛样细胞的静态GSIS反应。

图8显示了胰岛样细胞的动态GSIS反应。

图9比较了现有技术中其它培养方法得到的分化胰岛细胞与本发明得到的胰岛样细胞。

图10显示了本发明的人胰岛样细胞团在2mM葡萄糖刺激下的人胰高血糖素释放量显著高于20mM葡萄糖刺激下的人胰高血糖素释放量(p*＝0.0236)。

图11显示小分子药物抑制胰高血糖素受体后，本发明的胰岛样细胞团的胰岛素分泌倍数下降。

图12显示了对本发明的胰岛样细胞团进行单细胞测序后的UMAP图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用特定的分化培养基，通过特定的分化方法能够从干细胞开始得到胰岛样细胞群。胰岛样细胞群同时包含具备生理功能的胰岛α细胞和胰岛β细胞，并且胰岛α细胞和胰岛β细胞的比例与真实胰岛细胞群类似。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

胚胎干细胞

如本文所用的术语“胚胎干细胞”(embryonic stem cell，ESCs，简称ES或ESC细胞)是早期胚胎着床前的囊胚(blastocyst)中的内细胞团(ICM，inner cell mass)中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和向三个胚层分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。其中，所述“INS^GFP/wMel-1胚胎干细胞”由E.Stanley和A.Elefanty提供¹；所述“INS^GFP/w；NKX6.1^{mCherry/mCherry}Mel-1胚胎干细胞”由INS^GFP/w Mel-1胚胎干细胞经过CRISPR/CAS9介导的同源重组在NKX6.1基因后插入mcherry荧光后获得。

如本文所用的术语“多能干细胞(PSC)”指代同时具备自我更新和多向分化潜能的一类细胞，包括但不限于：(1)胚胎来源多能干细胞，(2)体细胞重编程所得多能干细胞。

如本文所用的术语“诱导多能干细胞(iPSC)”指代体细胞经由重编程过程逆向发育成为具有多分化潜能状态的一类干细胞。其多能性体现的方式为：具备分化为三个胚层以及多种细胞类型的能力。

如本文所用的术语“分化”指代干细胞在特定背景下向目标细胞类型转化的过程。

如本文所用的术语“分化效率”指代多能干细胞在特定背景下向目标细胞类型转化的频率。如：90％的分化效率指分化后的细胞群体中至少有90％为目标细胞类型。

三维细胞培养

如本文所用的术语“三维细胞培养”(three-dimensional cell culture,TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行,但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化,难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。

细胞从二维向三维的转换可以分为以下几种方式：

1)细胞分散成单细胞后再聚集为细胞团；2)细胞分散为若干个细胞在一起的细胞团，无需再聚集；3)细胞分散为若干个细胞在一起的细胞团，再聚集。本发明人在实际操作中发现：方式1)将细胞消化为单细胞需要胰酶的长时间处理，对细胞有一定损伤；方式2)和3)对细胞更温和，但需要探索消化酶的选择和消化方法。

胰岛样细胞及其制备方法

胰腺既是内分泌腺又是外分泌腺，它位于胃的后面。胰腺含有多组特异性的细胞，称为朗格汉斯岛(胰岛)。胰岛细胞包括B细胞(β细胞)，约占胰岛细胞的60％～80％，分泌胰岛素，胰岛素可以降低血糖，缺乏胰岛B细胞将导致糖尿病的发生；A细胞(α细胞)，约占胰岛细胞的24％～40％，分泌胰高血糖素，胰高血糖素作用同胰岛素相反，可增高血糖；D细胞(δ细胞-)，约占胰岛细胞总数的6％～15％，分泌生长抑素；胰岛PP细胞，约占胰岛细胞的1％，分泌胰多肽。这些细胞构成了胰腺的内分泌部分(无导管)，其功能与外分泌腺部分(有导管)截然不同，后者在消化过程中向小肠内分泌消化酶。胰腺作为内分泌腺发挥作用时直接向血流中分泌激素，其中最重要的激素是胰岛素和胰高血糖素。因此，能够获得与真实胰岛细胞类群比例类似的α细胞和β细胞有十分重要的临床意义。

本文所用的术语“胰岛样细胞”、“胰岛样细胞团”是指采用本发明的方法，由胚胎干细胞优化分化培养得到的，与真实胰岛细胞比例类似、功能相当的胰岛样细胞团。

在具体的实施方式中，本发明的体外分化获得的胰岛样细胞团中含有：(a)胰岛β细胞；和(b)胰岛α细胞；以及(c)任选的其它内分泌细胞；

所述的胰岛α细胞占细胞团中的细胞总数的5％～70％。

在优选的实施方式中，本发明的胰岛样细胞团中胰岛β细胞占30％～80％；和胰岛α细胞占6％～40％；更优选地，所述胰岛样细胞团中胰岛β细胞占40％～70％；和胰岛α细胞占10％～35％。

本发明人注意到，本发明的胰岛样细胞团中几乎均是内分泌细胞。例如除了胰岛β细胞和胰岛α细胞之外，本发明的胰岛样细胞团中还包含少量，例如1％～10％的其它内分泌细胞(例如δ细胞)，包括但不限于表达SST或PPY等其它内分泌细胞。

相比之下，现有技术方法得到的其它胰岛样细胞团中包含相当比例的未分化的非内分泌细胞。

本文所用的“重聚合”、“重聚集”或“富集”具有相同的含义；即，这些术语是指将胰岛样细胞团经过消化处理成单细胞，分选出，例如通过流式细胞术分选出带有beta细胞标志(如INS和NKX6.1)的细胞，再使分选后的单细胞聚合为细胞团。因此，在具体的实施方式中，本发明的胰岛样细胞团包括经分选分别得到胰岛β细胞和胰岛α细胞后，再经过重聚合得到包含相应比例，例如与真实胰岛细胞群类似比例的胰岛β细胞和胰岛α细胞的胰岛样细胞团。在优选的实施方式中，经重聚合得到的胰岛样细胞团能够具备与真实胰岛细胞群相同的生理功能。

本发明的胰岛样细胞团不仅与真实胰岛细胞比例类似，其还表达胰岛细胞的特异性标志物，从而能够具备与真实胰岛细胞相当的功能。

例如，本发明的胰岛样细胞团表达与胰岛相当量的内分泌细胞标志NEUROD1。再例如，本发明的胰岛β细胞表达特异性标志基因PDX1、NKX6.1、INS、ABCC8、MAFB、SLC30A8；优选地，表达特异性标志基因PDX1、NKX6.1、INS、ABCC8、MAFB、SLC30A8、MAFA；优选地，表达特异性标志基因PDX1、NKX6.1、INS、ABCC8、MAFB、SLC30A8、MAFA、IAPP；所述α细胞表达标志基因GCG、ARX、PCSK2。

在具体的实施方式中，通过免疫荧光染色检测，在至少表达上述特异性标志基因的基础上，表达MAFA的β细胞比例占全部beta细胞的70-85％，更优选至少占全部β细胞的80％；表达IAPP的β细胞比例占全部β细胞的30-60％，更优选至少占全部β细胞的50％；所述α细胞表达标志基因GCG、ARX、PCSK2；

在另一优选的实施方式中，通过单细胞测序检测，同时表达INS和IAPP的β细胞占所有β细胞的30-45％，优选32-40％，更优选35-38％；同时表达INS、IAPP和MAFA的β细胞占全部β细胞的15-30％，优选18-25％，更优选20-24％。

本发明的胰岛样细胞团能在葡萄糖刺激下分泌胰岛素；优选地，所述胰岛样细胞团在高糖刺激下的人胰岛素释放量是低糖刺激下的人胰岛素释放量的至少1.5倍，优选至少2倍，更优选至少3倍，再优选至少5倍，更优选至少10倍。

本发明的胰岛样细胞团在低糖刺激下的人胰高血糖素释放量是高糖刺激下的人胰高血糖素释放量的至少2倍，优选至少3倍，更优选至少4倍，最优选至少5倍。

本发明的胰岛样细胞团在葡萄糖刺激下的胰岛素分泌实验，包括静态GSIS和动态GSIS中还表现出与胰岛类似的胰岛素分泌模式。

本发明的胰岛样细胞团通过对干细胞进行分化处理而制备获得，所述方法将干细胞的分化处理分成贴壁细胞形式的分化处理；和细胞球形式的分化处理两个阶段。

在贴壁细胞形式的分化处理阶段，本发明人采用BMP信号通路抑制因子(包括但不限于Noggin)，烟酰胺，表皮生长因子(EGF)或它们的组合得到表达PDX1、NKX6.1、NGN3、PAX4、ARX的胰腺前体细胞；

在细胞球形式的分化处理阶段，本发明人将细胞培养从二维转换到三维。细胞从二维向三维的转换可以分为以下几种方式：1)细胞分散成单细胞后再聚集为细胞团；2)细胞分散为若干个细胞在一起的细胞团，无需再聚集；3)细胞分散为若干个细胞在一起的细胞团，再聚集。方式1)-3)各有优缺点。本发明人创造性地通过联用胰酶和分散酶，最终确定了将细胞培养从二维转换到三维的最佳方式。

本文所用的“胰腺前体细胞”是指胰岛样细胞团分化培养中，胰岛α和β细胞的前体状态。本发明的“胰腺前体细胞”能够良好表达胰腺前体标志基因。在优选的实施方式中，本发明的胰腺前体细胞表达胰腺前体标志基因PDX1、NKX6.1、NGN3、PAX4、ARX和INS。在另一优选的实施方式中，有60-98％，优选70-98％的本发明胰腺前体细胞表达胰腺前体标志基因PDX1和NKX6.1。

基于本发明的胰岛样细胞团，本领域技术人员也可以理解，本发明还包括一种培养体系，在所述培养体系中，初始细胞经本发明的分化方法得到本发明的胰岛样细胞团。基于本发明的教导，本领域技术人员可以理解，所述初始细胞是指能够分化培养得到胰岛样细胞团的细胞。在具体的实施方式中，所述初始细胞选自：人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞(hiPSC)、或其组合。基于本发明的教导并结合现有技术，本领域技术人员可以理解，本发明的培养体系可以用于基因功能的研究。在具体的实施方式中，可以在本发明的培养体系的培养过程的各阶段对细胞进行基因编辑，例如对初始细胞(如人多能干细胞)进行基因编辑(例如，基因的敲除或敲减)，也可以对培养过程中的细胞进行基因编辑，或者可以对分化培养得到的胰岛样细胞团中的细胞进行基因编辑，以便研究该基因的功能。所述基因编辑的方法可以是本领域技术人员熟知的基因编辑方法，例如CRISPR/CAS9基因编辑等技术手段。

在本发明的胰岛样细胞团的基础上，本发明还提供含有所述胰岛样细胞团的胰岛微环境模型。所述模型中可以不包含微血管结构；或者，所述模型中可以添加内皮细胞、成纤维细胞或间充质干细胞等细胞构成胰岛样组织。本发明的这种胰岛微环境模型可以模拟胰岛的正常生理功能和病理状态下胰岛细胞间的作用与联系。

本发明的胰岛样细胞团可以用于制备在葡萄糖刺激下可以分泌胰岛素的人工胰腺装置或用于治疗糖尿病，例如I型糖尿病的药物。

因此，在本发明的胰岛样细胞团的基础上，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的胰岛样细胞团和药学上可接受的赋形剂；以及利用本发明的胰岛样细胞团或药物组合物治疗糖尿病，例如I型糖尿病的方法。基于本发明的教导以及本领域中已有的教导，本领域技术人员还应理解本发明的药物组合物中还可以包含其它功能性细胞，从而能够同时实现不同的功能。所述功能性细胞包括但不限于：血管内皮细胞、间充质细胞、免疫细胞。

基于本发明的教导，本领域技术人员还应理解，本发明的胰岛样细胞团在葡萄糖的刺激下会产生胰岛素。因此，本发明还提供了使用葡萄糖刺激本发明的胰岛样细胞团来获得胰岛素的方法。

基础培养基

如本文所用的术语“基础培养基”包括且不限于“基础培养基SFD”、“基础培养基MCDB131 basic”。

其中，所述“基础培养基SFD”、“serum free medium”，其配方为75％IMDM，25％Ham's F12，0.5×N2添加剂，0.5×B27添加剂(不含维生素A)，0.1％BSA(A1470)，0.5×青链霉素。

所述“基础培养基MCDB131 basic”，其配方为MCDB131，2％BSA，1:200 ITS-X，1×GlutaMax，14.5mM葡萄糖，10mM烟酰胺，10μM硫酸锌，10μg/ml肝素，0.5×青链霉素。

实验材料

1.细胞系

1.1 Mel-1胚胎干细胞或其经基因编辑过的细胞系，包括E.Stanley和A.Elefanty实验室提供的INSGFP/w Mel-1报告胚胎干细胞系和由INSGFP/w Mel-1胚胎干细胞经过CRISPR/CAS9介导的同源重组在NKX6.1基因后插入T2A和mcherry荧光基团后获得的Nkx6.1mCherry/mCherry。

1.2 HES3胚胎干细胞系或INSGFP/w HES3胚胎干细胞系或其他HES3经基因编辑过的细胞系

1.3 HUES8胚胎干细胞系或其经基因编辑过的细胞系

1.4 H1胚胎干细胞系或其经基因编辑过的细胞系

1.5 H9胚胎干细胞系或其经基因编辑过的细胞系。

1.6 INS^GFP/w Mel-1胚胎干细胞由E.Stanley和A.Elefanty提供；INS^GFP/w；NKX6.1^{mCherry/mCherry} Mel-1胚胎干细胞由INS^GFP/w Mel-1胚胎干细胞经过CRISPR/CAS9介导的同源重组在NKX6.1基因后插入mcherry荧光后获得。

2.实验试剂

3.基础培养基配方

1)基础培养基SFD(serum free medium)含75％IMDM，25％Ham's F12，0.5×N2添加剂，0.5×B27添加剂(不含维生素A)，0.1％BSA(A1470)，0.5×青链霉素。

2)基础培养基MCDB131 basic含MCDB131，2％BSA，1:200ITS-X，1×GlutaMax，14.5mM葡萄糖，10mM烟酰胺，10μM硫酸锌，10μg/ml肝素，0.5×青链霉素。

4.抗体

名称	公司	货号	种属	稀释比
					PDX1	R&D	AF2419	Goat	1:50
NKX6.1	DSHB	F55A12	Mouse IgG1	1:36
					C-peptide	CST	4593S	Rabbit	1:33
Insulin	DAKO	A0564	Guinea pigs	1:200
					Glucagon(K79bB10)	Sigma	G2654	Mouse IgG1	1:1000
Somatostatin	Santa Cruz	sc-74556	Mouse IgG1	1:100
					MAFA	Abcam	ab26405	Rabbit	1:100

5.qRT-PCR引物

实验方法

1.细胞培养

多能干细胞的维持与传代与文献报道一致(Kennedy et al.,2007)

多能干细胞向胰岛类细胞分化的大体流程如图1所示，其步骤如下：

1)多能干细胞传代到matrigel(经IMDM稀释3倍)上，在1～2天内生长到密度为80％开始分化；

2)分化共分为7个阶段(S1～S7)，其中S1～S4以贴壁细胞的形式分化，每当从前一阶段转换到下一阶段时需要用下一阶段的基础培养基润洗细胞2遍，再换成新鲜配制的培养基；S5～S7以细胞球形式分化，换液采用70～90g 1～3min离心或者自然沉降，吸上清后加入新鲜培养基。S5每天换液，S6每天或每两天换液，S7每两天换液。S5以及S6.1的培养基在(Rezania et al.,2014)基础上添加了EGF，S5-S7添加Nicotinamide(烟酰胺)。每个阶段的培养基成分如下：

3)S4结束时需要经过特殊处理，使贴壁细胞在保证很好活性的条件下均一的被分散为20个细胞左右的细胞团块，以顺利进入后续的三维培养，因为三维有利于内分泌细胞的形成。具体处理方法为：S4的细胞吸去上清，用PBS润洗一遍，加入2mg/ml分散酶(Dispase，用不含钙镁的DPBS现配现用)，37℃静置5～30min。关于消化时间，当S4细胞PDX1+NKX6.1+效率越高，消化时间越短；当S4细胞中混有越多的非目的细胞，消化时间越长。判断Dispase消化完全的标志为S4的贴壁细胞与培养皿分离，或大部分分离且只残留中心一小部分，呈现出水母状。分散酶消化结束后吸掉酶，加入消化酶两倍体积的DPBS润洗，加入同体积常温或冷的0.25％Trypsin进行二次消化，控制时间为30秒以内，然后用1ml移液器吹打1～3次，使形成20个细胞左右的团块后，迅速将酶与细胞混合物转移到含10％血清的DPBS中终止消化。常温90～150g离心3min。吸干上清，轻轻弹管底沉淀使之分散，然后用S5培养基重悬，转移到低吸附6孔板(Costar，#3471)中，放置于90～100rpm的水平摇床上进行后续三维培养。

4)S1～S6细胞放置于含5％氧气、5％二氧化碳的培养箱，S7细胞放置在含21％氧气、5％二氧化碳的培养箱，目的是为了在胰岛类细胞最后成熟的过程中诱导GCG、IAPP、SLC30A8等基因的高表达。

2.定量反转录PCR(qRT-PCR)

将1～5×10⁵的细胞用天根微量总RNA抽提试剂盒进行抽提，取1μg RNA用Promega反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，cDNA以1:9进行稀释，用人多能干细胞的基因组DNA经过梯度稀释后作为标准品，用罗氏SYBR GREEN进行qRT-PCR。

3.免疫荧光

诱导得到的细胞球经过PBS两次洗涤后，用4％PFA在室温固定20min分钟，之后用PBS洗涤两次，吸干水份后用OCT进行包埋，保存于-80度。包埋块用冰切机切成5μm的薄片，贴附于载玻片上，用组化笔圈出组织，然后用封闭液(含10％FBS、0.1％Triton-100的PBS)室温封闭1小时，之后用封闭液稀释的一抗孵育4度过夜，次日用含0.1％Triton-100的PBS洗涤三次后，用封闭液稀释的二抗孵育常温1小时，之后用含0.1％Triton-100的PBS洗涤三次，滴加DAPI后用指甲油封片，用Leica SP8共聚焦荧光显微镜拍照。

4.透射电镜

S7的胰岛样细胞经DPBS润洗两遍后转移到2.5％戊二醛中保存，在上海生化与细胞所电镜实验平台经固定、包埋、切片、染色后置于FEI Tecnai G2 spirit投射电镜中拍摄。

5.流式细胞分析

细胞用0.25％Trypsin-EDTA消化成单细胞后用PBS洗两遍，用1.6％PFA在37度固定30min，然后用FACS buffer洗三遍，在FACS buffer中保存于4度。染色时用1×Saponinbuffer洗两遍，对细胞膜进行通透，然后用1×Saponin buffer稀释的一抗对细胞进行30min孵育，之后用1×Saponin buffer洗两遍，再用1×Saponin buffer稀释的二抗对细胞进行30min孵育，最后用1×Saponin buffer洗两遍，重悬在300μl FACS buffer中，在BDLSRII流式分析仪上分析，再通过Flowjo软件进行进一步分析。

6.静态GSIS

将胰岛细胞球和胰岛用KREB buffer(含129mM NaCl，5mM NaHCO3，4.8mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mM MgSO4，1.2mM KH2PO4，10mM HEPES，0.1％BSA)洗涤三遍，转移到含2mM葡萄糖的KREB buffer中饥饿1小时，然后用KREB buffer洗三遍，转移到含2mM葡萄糖的KREB buffer中，30min后收集上清，再用KREB buffer洗三遍，转移到含20mM葡萄糖的KREBbuffer中，30min后收集上清，如此循环三次。所有刺激步骤都在37度，5％二氧化碳培养箱中完成。每次收集的上清保存于-20度，用超敏C肽Elisa试剂盒检测其中C肽的含量。

7.动态GSIS(Perifusion)

采用Biorep灌流设备进行实验，首先胰岛细胞球和胰岛分别重悬在Bio-Rad Bio-Gel P4 beads中，装载在小室里，再将小室、导流管、蠕动泵、多向阀组装在一起，添加KREBbuffer以及配置在KREB buffer中的各个刺激剂，设置程序：流速为100μl/min，首先在2mM葡萄糖中饥饿1小时，之后依次2mM低糖15min，20mM高糖30min，含10nM Exendin-4的20mM高糖15min，2mM低糖15min，含30mM KCl的2mM低糖10min。流出的液体按每分钟一个孔接收到96孔板中。灌流过后回收细胞，在含1.5％盐酸的75％乙醇溶液震荡，于-20℃保存，用于测定胰岛素含量和DNA定量。胰岛素用超敏C肽Elisa试剂盒检测或胰岛素Elisa试剂盒检测。

本发明的有益效果：

1.本发明建立了一种优化的培养基配方，和BMP信号通路抑制因子Noggin、烟酰胺(Nicotinamide)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的共同作用方法，成功制备出高表达PDX1和NKX6.1的胰腺前体细胞。

2.本发明还建立了一种“Dispase-胰酶”消化酶联合消化的方法，能够在同一分化体系中不经富集同时得到与人胰岛细胞组成类似的具有三维结构的胰岛样细胞团。

3.本发明分化所得的胰岛样细胞团所需成熟时间较短，在分化起始第33天左右就能具备成熟的胰岛素功能。

4.本发明分化所得的胰岛样细胞团在葡萄糖刺激下等释放胰岛素能力强，在静态和动态GSIS实验中都有很好的效果。

5.本发明得到的胰岛样细胞团可用于Ⅰ型糖尿病在体模型，使Ⅰ型糖尿病小鼠的血糖长期维持在正常区间。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：分化方法的优化

1.1S3和S4配方优化

按照“实验方法”部分所述，在S3和S4分别添加了200nM和100nM的PKC信号通路激活剂TPB。为了制备出高分化潜力的胰腺前体细胞，优化组使用EGF和烟酰胺替代TPB。

结果：如图2所示，意外地发现TPB的添加并不能很好的诱导出胰腺前体标志基因PDX1、NKX6-1，胰腺内分泌前体标志基因NGN3、ARX、PAX4，相反非目的的肠相关基因CDX2高表达。而优化组使用EGF和烟酰胺替代TPB，能够很好的诱导出PDX1、NKX6.1、NGN3、PAX4、ARX和INS。细胞得率上，优化组起始分化时0.5×10⁶个多能干细胞，能够在S4得到2.13×10⁶左右个细胞，在S5得到1.23×10⁶左右个细胞，在S6得到2.73×10⁶左右个细胞，在S7得到0.80×10⁶左右个细胞(即胰岛样细胞)。总体上，优化组胰岛样细胞的得率为起始细胞的1.6倍。而现有技术和文献报道的方案中，Kieffer实验室提供的数据结果是每个多能干细胞能最终得到1.2个S6或S7细胞(Rezania,A.et al.Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.NatureBiotechnology 32,1121-1133,doi:10.1038/nbt.3033(2014))；Melton实验室经富集的方法的结果是得率为起始细胞的1/15～1/10(Veres,A.et al.Charting cellular identityduring human in vitro beta-cell differentiation.Nature 569,368-+,doi:10.1038/s41586-019-1168-5(2019))。因此，本发明方案极大地提高了培养基刺激多能干细胞分化的水平。

1.2细胞从二维向三维的转换培养配方优化

1.2.1按照现有技术，内分泌细胞的产生需要从胰腺上皮脱落下来并迁移聚集成内分泌细胞团。为了选择合适的消化S4期细胞的方法，发明人对比现有技术中的三种常用方式Trypsin胰酶、TrypLE胰酶代替物、Dispase分散酶和本发明的优化方案的各种组合和方式，其他处理方式均一致或大体一致，然后通过检测S5期细胞的基因表达情况和S5期细胞数，评价各方案的效果。具体操作见材料与方法部分，配方和对应结果见下表：

备注：基因表达量为“相对与管家基因TBP的基因表达量”；S5细胞得率表示由起始1个多能干细胞得到的S5细胞的数目。

结果：由以上数据可知，使用Dispase处理8min再用Trypsin处理30s的消化方式，极大地提高了细胞S4期到S5期的转化阶段的细胞得率。

1.2.2为了找到促进S5期细胞形成内分泌细胞团的培养方法，发明人对比了几种培养基配方，其他处理方式均一致或大体一致，然后通过检测S5期细胞的基因表达情况和细胞球形态，评价个方案的效果。配方和对应结果见下表：

备注：基因表达量为“相对与管家基因TBP的基因表达量”

结果：将细胞从二维转换到三维培养的最适合的时间点在S4结束时。最合适的消化S4期细胞的方法，是用2mg/ml Dispase和0.25％胰酶联合消化。在S5～S7的培养基中优选添加了烟酰胺，且在S5和S6的前两天进一步添加EGF，最有利于S5期细胞形成内分泌细胞团。此时EGF可能起到了促进细胞增殖的作用。

实施例2：胰岛样细胞团的细胞组成分析

使用如实施例1中所述的优化配方培养多能干细胞，分化所得的胰岛样细胞团，进一步分析其细胞组成。

2.1胰岛样细胞的基因表达

qRT-PCR分析结果如图3所示，与人成体胰岛(包括胰岛β细胞、α细胞、δ细胞等所有内分泌细胞的完整胰岛)相比，S7阶段的胰岛样细胞团表达的内分泌细胞标志NEUROD1，表达β细胞特异标志基因PDX1、NKX6-1、INS、PCSK1、ABCC8、MAFB，以及功能性基因MAFA、SLC30A8水平均与人成体胰岛大致相当。此外，发明人意外的是，S7阶段的胰岛样细胞团还表达与人成体胰岛相当的α细胞标志基因GCG、ARX、PCSK2。

2.2胰岛样细胞团的细胞组成

经过流式细胞术分析胰岛样细胞团的细胞组成，其中INS-GFP为INS基因后带GFP荧光蛋白；INS⁺GCG⁺细胞的最终命运是α细胞(INS^-GCG⁺细胞)。

流式细胞术分析结果如图4(A)所示，在未经富集的情况下可同时获得36.0％～67.7％胰岛β细胞(INS⁺GCG^-)和6.33％～34.9％胰岛α细胞(INS^-GCG⁺)。数据证明，使用本发明提供的优化培养方案，诱导得到的胰岛样细胞团的组成与人胰岛(β细胞占28％～75％，α细胞占38％，δ细胞占7％)类似。具有分泌功能的胰岛β细胞中会表达核心转录因子NKX6.1，如图4(B)进一步显示本发明可获得36.4％～64.2％的胰岛β细胞。

2.3胰岛样细胞团的免疫荧光

结果如图5所示，在蛋白表达水平，本优化方案得到的S7胰岛样细胞团中的β细胞表达INS和转录因子PDX1、NKX6-1，大部分β细胞表达功能性转录因子MAFA。此外，S7胰岛样细胞团中的大部分内分泌细胞只表达单一激素(INS⁺GCG^-或INS^-GCG⁺)。

2.4电镜拍摄下的囊泡结构

结果如图6所示，左图为S7的胰岛样细胞团中β细胞的囊泡，右图为人胰岛中β细胞的囊泡。电镜观察到本优化方案得到的S7胰岛样细胞团，与人胰岛中β细胞结构相似，也具有典型的致密核心。提示S7胰岛样细胞团具有类似人胰岛中β细胞的分泌功能。

实施例3：通过单细胞测序分析胰岛样细胞团的细胞组成

在本实施例中，本发明人对本发明的胰岛样细胞团进行了单细胞测序。单细胞测序后的UMAP图如图12所示，图中展现了所有细胞的分群1～5。1beta-cell为胰岛样细胞团中的β细胞，其它三幅图为基因在UMAP图中的展现。其中，INS是全部β细胞的标志基因，MAFA和IAPP为成熟β细胞的标志基因，INS和IAPP都表达的β细胞占所有β细胞的36.7％；INS、IAPP和MAFA都表达的β细胞占全部β细胞的21.4％。

实施例4：葡萄糖刺激下的胰岛素分泌实验

1)静态GSIS

结果如图7所示，在静态GSIS实验中，S7胰岛样细胞表现出第一阶段(1st)的低糖(2mM葡萄糖)，高糖(20mM葡萄糖)和第二阶段(2nd)的低糖(2mM葡萄糖)，高糖(20mM葡萄糖)，以及最后阶段的氯化钾(30mM KCl)刺激反应。在每个阶段，高糖刺激下胰岛素的分泌量都高于低糖刺激下的胰岛素分泌量，在氯化钾的刺激下胰岛素得到最大程度的释放。说明S7胰岛样细胞团具有类似人胰岛中β细胞的对葡萄糖等促分泌素刺激下的分泌功能。

2)动态GSIS(perifusion)

结果如图8所示，在动态GSIS的实验中，在2mM葡萄糖刺激下胰岛素有本底的分泌量，在进入20mM葡萄糖后在1～5min内达到胰岛素分泌的高峰，此为一相(phase 1)胰岛素分泌。之后在2min内胰岛素分泌剧烈下降，直到第30min降到最低值，之后3min胰岛素分泌又有微弱的上升，此为二相(phase 2)胰岛素分泌。在进入10nM Exendin-4高糖后，胰岛素分泌又开始显著增加，并在进入2mM葡萄糖后显著降低。在最后的KCl刺激阶段，胰岛素分泌又进一步增加。

在整个刺激过程中，共4个时段(高糖phase1，高糖phase2，Ex-4，KCl)的胰岛素分泌模式均与胰岛类似。说明S7胰岛样细胞团具有类似人胰岛中β细胞的对葡萄糖等促分泌素刺激下的分泌分泌功能。

实施例5：多种胰岛细胞分化方法比较

为了比较现有技术中的主要胰岛细胞分化方法与本发明提供的胰岛细胞分化方法的效果，按照各方法进行对照实验，保证其他处理一致或大体一致。基因表达如图9所示，处理方式和结果比较如下表所示：

1.Rezania,A.et al.Reversal of diabetes with insulin-producing cellsderived in vitro from human pluripotent stem cells.Nature Biotechnology 32,1121-1133,doi:10.1038/nbt.3033(2014).

2.Pagliuca,F.W.,Millman,J.R.,Gurtler,M.,Segel,M.,Van Dervort,A.,Ryu,J.H.,Peterson,Q.P.,Greiner,D.,and Melton,D.A.(2014).Generation of functionalhuman pancreatic beta cells in vitro.Cell 159,428-439.

3.Velazco-Cruz,L.,Song,J.,Maxwell,K.G.,Goedegebuure,M.M.,Augsornworawat,P.,Hogrebe,N.J.,and Millman,J.R.(2019).Acquisition of DynamicFunction in Human Stem Cell-Derived beta Cells.Stem Cell Rep 12,351-365.

4.Nair,G.G.,Liu,J.S.,Russ,H.A.,Tran,S.,Saxton,M.S.,Chen,R.,Juang,C.,Li,M.L.,Nguyen,V.Q.,Giacometti,S.,et al.(2019).Recapitulating endocrine cellclustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived betacells.Nat Cell Biol 21,263-274.

5.Veres,A.,Faust,A.L.,Bushnell,H.L.,Engquist,E.N.,Kenty,J.H.,Harb,G.,Poh,Y.C.,Sintov,E.,Gurtler,M.,Pagliuca,F.W.,et al.(2019).Charting cellularidentity during human in vitro beta-cell differentiation.Nature 569,368-373.

6.Rezania,A.,Riedel,M.J.,Wideman,R.D.,Karanu,F.,Ao,Z.,Warnock,G.L.,and Kieffer,T.J.(2011).Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.Diabetes 60,239-247.

实施例6：胰岛样细胞团在葡萄糖刺激下的人胰高血糖素释放

本发明人进一步验证了本发明的胰岛样细胞团在低浓度和高浓度葡萄糖刺激下的人胰高血糖素释放情况。具体如下所述：

将实施例1得到的人胰岛样细胞团(50个)置于500μl低浓度葡萄糖(2mM)的KREB溶液中刺激30分钟，收集细胞上清液，Elisa检测其中的人胰高血糖素浓度(横坐标2mM表示，单位pmol/L)；润洗人胰岛样细胞团，再用500μl高浓度葡萄糖(20mM)的KREB溶液中刺激30分钟，收集细胞上清液，Elisa检测其中的人胰高血糖素浓度(横坐标20mM表示，单位pmol/L)；最后置于含30mM氯化钾(KCl)的低糖KREB溶液30min，收集细胞上清液，Elisa检测其中的人胰高血糖素浓度(横坐标KCl表示，单位pmol/L)。

结果(如图10所示)：人胰岛样细胞团在2mM葡萄糖刺激下的人胰高血糖素释放量显著高于20mM葡萄糖刺激下的人胰高血糖素释放量(p*＝0.0236)。表示本发明的人胰岛样细胞团中的alpha细胞能够在低糖刺激下分泌胰高血糖素。

实施例7：alpha细胞在胰岛样细胞团中的功能的验证

人胰岛样细胞团中的胰岛alpha细胞分泌胰高血糖素(Glucagon，GCG)，为了证明胰岛血糖素会对胰岛beta细胞的胰岛素分泌产生影响，本发明人采用浓度为1μM的小分子药物L168,049，(4-[3-(5-Bromo-2-propoxyphenyl)-5-(4-chlorophenyl)-1H-pyrrol-2-yl]pyridine)来处理实施例1得到的胰岛样细胞团。该小分子能够抑制GCG的受体GCGR，而beta细胞表达GCGR。胰岛素分泌的刺激倍数(Stimulation index)是胰岛素在高糖刺激下与低糖刺激下的分泌比例，该倍数越高表明beta细胞功能越好。

结果如图11所示，表明该小分子药物抑制GCG的受体后，胰岛样细胞的胰岛素分泌倍数下降。因此本发明胰岛样细胞团中alpha细胞的存在对于胰岛样细胞团的功能是必要的。

讨论：

人多能干细胞来源的胰岛β细胞的体外诱导分化主要在近20年内有所进展。然而，最初使用拟胚体的方法在人胚胎干细胞(hESCs)的自发分化过程中获得分泌胰岛素的细胞的效率不高，而且缺少功能验证。此后，人们利用模拟体内发育过程的思路在体外以人多能干细胞为起点，经过定型内胚层、后端前肠、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞、尚未成熟的β细胞以及成熟的β细胞这几步向胰岛β细胞分化，该方法对分化每个步骤的细胞组成和基因表达都进行了描述，但最明显的缺点是全程为二维培养，且最终β细胞效率只有12％。

目前所有的胰岛细胞分化的研究都集中在专一诱导出β细胞或α细胞，虽然部分研究已经得到了基因表达类似于人胰岛的β细胞，但这两项研究均利用了β细胞标志物的富集，使得最后的细胞组分中α细胞的比例与真实的胰岛相较很低。而Rodriguez-Diaz,R.etal.(Paracrine Interactions within the Pancreatic Islet Determine the GlycemicSet Point.Cell Metab 27,549-+,doi:10.1016/j.cmet.2018.01.015(2018))的研究表明胰岛中各种内分泌细胞的相互作用共同影响了胰岛素分泌和对血糖的调控，移植到一型糖尿病宿主体内的胰岛细胞团中α细胞的占比会影响糖尿病治疗后的血糖设定值，当α细胞比例越高血糖设定值越低。因此，为了实现糖尿病的细胞治疗，制备细胞组成比例类似于人胰岛的胰岛样细胞团具有重大意义。而当前所有研究均不能在同一培养体系中同时产生与真实胰岛细胞类群比例类似的α细胞和β细胞。

本发明通过对培养基成分进行优化，发明了两种消化酶联合消化的方法，能够在同一分化体系中同时得到与人胰岛细胞组成类似的胰岛样细胞，历时30～33天，得率高，在静态和动态GSIS下都有反应，其功能与目前其他方法相比具有很好的优势。目前初步结果表明，本发明得到的胰岛样细胞团能够挽救I型糖尿病小鼠的血糖，将计划在大动物体内进行试验，以为今后的临床前研究奠定基础。

在发育过程中，胰岛内分泌细胞类群β细胞和α细胞的命运决定是重要的科学问题，目前发现转录因子PAX4和ARX通过相互拮抗共同控制β细胞和α细胞的发生，但该转录调控网络的上游调控机制仍不清楚，本分化系统可以作为很好的体外模型有助于β细胞和α细胞的命运决定机制研究。

目前，胰岛样细胞分化的研究主要关注在其中的β细胞，在众多研究中只有Kieffer的方法能够实现功能性基因MAFA的表达，在没有经过富集和重聚集(resize)等操作的前提下所有研究得到的β细胞均不能在动态GSIS的Perifusion实验中对葡萄糖的刺激产生反应。对α细胞分化的研究只有一项，而且过程很长。因此，构建与真实胰岛细胞比例类似、功能相当的胰岛样细胞团具有重大意义。

虽然目前糖尿病治疗基本都被商品化胰岛素垄断，且人工胰腺细胞分泌的胰岛素面临着半衰期短，浓缩后制药人体内快速降解，胰高血糖素在治病上用得也还不多等问题。但本发明提供了一种治疗思路，可以通过体外培养获得具有分泌功能的胰岛样细胞团，胰岛样细胞团能同时分泌胰岛素和少量胰高血糖素，将这样的胰岛样细胞团移植入患者体内，能有效改善胰岛细胞功能不全，且避免胰岛素使用不当导致的不良反应。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心

<120> 一种胰岛样细胞团及其制法和应用

<130> P2019-1003

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgctgagaa gagtgtgctg gagatg 26

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtaaggtgg caggctgttg tt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaacgccaca cagtgccaaa tc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacgcgcatg ggtccttgta aa 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acacactgct gtgcaactaa ag 22

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acttctagtc agtgtaactc acgatt 26

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctggtctg ggaagggaag agaaa 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggaagccaa aggcagctaa gatag 25

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tactcccaat caggtccggg attt 24

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttcccagtt cacagcctgg tctt 24

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctactgctgc aaagtgcaaa tac 23

<210> 12

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aggtgaacag gaactttgat cc 22

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaagcccttc agcacaaagc tgg 23

<210> 14

<211> 24

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ttactaccgc acaggtgtct tgga 24

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tggtactgat tgctcatggc tgg 23

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aagggaggca gaaaggcaca aag 23

<210> 17

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttgtgaacc aacacctgtg cgg 23

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcgggtcttg ggtgtgtaga agaa 24

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttcccagaag aggtcgccat tgtt 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caaccagttt ataaagtccc tggcgg 26

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<212> DNA

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gagcggagaa cggtgattt 19

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gaaggtggga acggagaac 19

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gagcggagaa cggtgattt 19

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gaaggtggga acggagaac 19

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtgagaaggg atcgcagttt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cttgctgcca cgttctctat 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcattgtgac ggatgctatt g 21

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<212> DNA

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cccagcttgc actgtaaata tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gaccagccat tcatgacaga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ctggcgctgt agatgtcaat 20

Claims

1.一种胰岛样细胞团的制备方法，其特征在于，所述方法通过7个阶段（S1-S7）诱导干细胞分化为胰岛样细胞团，其包括以下步骤：

(1) S1-S4阶段对干细胞进行贴壁细胞形式的分化处理；和

(2) S5-S7阶段对步骤(1)得到贴壁细胞进行细胞球形式的分化处理；

其中，在所述贴壁细胞形式的S3-S4分化阶段，不添加PKC 信号通路激活剂；

在所述贴壁细胞形式的S4分化阶段，添加Noggin、烟酰胺和表皮生长因子(EGF)；

在所述细胞球形式的S5分化阶段，添加烟酰胺和表皮生长因子(EGF)；

在所述细胞球形式的S6分化阶段，添加烟酰胺；

在所述细胞球形式的S7分化阶段，添加烟酰胺；

在所述贴壁细胞形式的分化阶段结束时，利用分散酶和胰酶的组合进行贴壁细胞消化处理以便将贴壁细胞分散为细胞团块；

所述消化处理过程为：先用2mg/mL的分散酶处理8min，再用0.25%的胰酶处理30s。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞选自：人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞(hiPSC)、或其组合。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述PKC信号通路激活剂是TPB (-(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadienoylamino)benzolactam)。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述细胞球形式的分化阶段，利用烟酰胺、表皮生长因子 (EGF)或它们的组合。

5.权利要求1-4任一项所述制备方法体外分化获得的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团含有以下组分：

(a) 胰岛β细胞；

(b) 胰岛α细胞；和；

(c)任选的其他内分泌细胞，包括但不限于表达SST或PPY等其他内分泌激素的内分泌细胞；

其中所述的胰岛β细胞占细胞团中的细胞总数的36.0%~67.7%；

所述的胰岛α细胞占细胞团中的细胞总数的6.33%~34.9%；

所述胰岛β细胞中表达特异性标志基因 PDX1、NKX6.1、INS、ABCC8、MAFB、SLC30A8、MAFA、IAPP；

在至少表达上述特异性标志基因的基础上，表达MAFA的β细胞比例占全部β细胞的70-85%；表达IAPP的β细胞比例占全部β细胞的30-60%。

6.如权利要求5所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛β细胞中表达特异性标志基因PDX1、NKX6.1、INS、ABCC8、MAFB、SLC30A8、MAFA、IAPP，在至少表达上述特异性标志基因的基础上，表达MAFA的β细胞比例占全部β细胞的80%，表达IAPP的β细胞比例占全部β细胞的50%。

7.如权利要求5所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团中胰岛β细胞占30%~80%；和胰岛α细胞占 6%~40%。

8.如权利要求7所述的胰岛样细胞团，所述胰岛样细胞团中胰岛β细胞占40%~70%；和胰岛α细胞占10%~35%。

9.如权利要求5所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团表达与胰岛相当量的内分泌细胞标志NEUROD1。

10.如权利要求5所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述α细胞表达标志基因GCG、ARX、PCSK2。

11.如权利要求5所述的胰岛样细胞团，其特征在于，通过单细胞测序检测，同时表达INS和IAPP的β细胞占所有β细胞的30-45%；同时表达INS、IAPP和MAFA的β细胞占全部β细胞的15-30%。

12.如权利要求5述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团能在葡萄糖刺激下分泌胰岛素，所述胰岛样细胞团在高糖刺激下的人胰岛素释放量是低糖刺激下的人胰岛素释放量的至少1.5倍。

13.如权利要求12所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团在高糖刺激下的人胰岛素释放量是低糖刺激下的人胰岛素释放量的至少2倍。

14.如权利要求12所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团在高糖刺激下的人胰岛素释放量是低糖刺激下的人胰岛素释放量的至少3倍。

15.如权利要求12所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团在高糖刺激下的人胰岛素释放量是低糖刺激下的人胰岛素释放量的至少5倍。

16.如权利要求12所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团在高糖刺激下的人胰岛素释放量是低糖刺激下的人胰岛素释放量的至少10倍。

17.如权利要求5所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团在低糖刺激下的人胰高血糖素释放量是高糖刺激下的人胰高血糖素释放量的至少2倍；所述低糖刺激是指1.5mM-3.5 mM葡萄糖；所述高糖刺激是指15 mM-35 mM葡萄糖。

18.如权利要求17所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团在低糖刺激下的人胰高血糖素释放量是高糖刺激下的人胰高血糖素释放量的至少3倍。

19.如权利要求17所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团在低糖刺激下的人胰高血糖素释放量是高糖刺激下的人胰高血糖素释放量的至少4倍。

20.如权利要求17所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团在低糖刺激下的人胰高血糖素释放量是高糖刺激下的人胰高血糖素释放量的至少5倍。

21.如权利要求17所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述低糖刺激是指2 mM葡萄糖。

22.如权利要求17所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述低糖刺激是指20 mM葡萄糖。

23.如权利要求5所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述胰岛样细胞团经由干细胞体外诱导分化得到。

24.如权利要求23所述的胰岛样细胞团，其特征在于，所述干细胞选自：人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞(hiPSC)、或其组合。

25.一种培养体系，其特征在于，在所述培养体系中，初始细胞经分化培养得到如权利要求5-24中任一项所述的胰岛样细胞团。

26.如权利要求25所述的培养体系，其特征在于，所述初始细胞选自：人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞 (hiPSC)、或其组合。

27.如权利要求25或26所述的培养体系，其特征在于，所述初始细胞根据权利要求1所述的方法进行分化培养。

28.一种胰岛微环境模型，其特征在于，所述模型中含有如权利要求5-24中任一项所述的胰岛样细胞团。

29.一种如权利要求28所述的胰岛微环境模型的用途，其特征在于，用于模拟胰岛的正常生理功能和病理状态下胰岛细胞间的作用与联系。

30.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求5-24中任一项所述的胰岛样细胞团和药学上可接受的赋形剂。

31.一种如权利要求5-24中任一项所述的胰岛样细胞团的用途，其特征在于，用于制备人工胰腺装置或用于治疗糖尿病的药物。

32.如权利要求31所述的用途，其特征在于，所述糖尿病是I型糖尿病。

33.一种人工胰腺装置，其特征在于，所述装置包括一容器，所述容器中含有如权利要求5-24中任一项所述的胰岛样细胞团和/或如权利要求28所述的胰岛微环境模型。

34.一种获得含胰岛素的产品的方法，其特征在于，包括步骤：(a) 使用葡萄糖刺激权利要求5-24中任一项所述的胰岛样细胞团。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(b) 分离和浓缩获得可以直接使用的含胰岛素的产品。

36.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述方法制备的含胰岛素的产品中胰岛素的含量为50-99%wt。

37.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述方法制备的含胰岛素的产品中胰岛素的含量为75-99%wt。

38.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述方法制备的含胰岛素的产品中胰岛素的含量为85-99%wt。

39.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述方法制备的含胰岛素的产品中还存在一定量的胰高血糖素。

40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述胰高血糖素的含量为0.001-10%wt。

41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述胰高血糖素的含量为0.01-10%wt。

42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述胰高血糖素的含量为0.1-10%wt。