CN102899288B - 一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建与分化的方法，所述的胰腺干细胞系，是从人胰岛细胞团内扩增出胰腺干细胞，且具有多向分化潜能。其经过诱导后能够分化形成类神经细胞、类脂肪细胞、类骨细胞、以及功能性胰岛样细胞团。将功能性胰岛样细胞团移植到患有糖尿病裸鼠模型的体内，能降低模型裸鼠血糖浓度，在24天内能够维持正常的血糖水平。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种人胰岛来源的胰腺干细胞系构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法。
背景技术
糖尿病是继心血管疾病和癌症之后的第三大高发慢性疾病，它严重危害着人类的生命健康。目前，对糖尿病的治疗虽然有很多方法，如口服降糖药物，注射外源性胰岛素，并结合饮食限制以及体育锻炼的方法，但都不能从根本上解决问题。器官移植是一种比较好的解决方法，但该方法的应用受到供体不足和免疫排斥问题的限制。而干细胞增殖力强、数量充足、移植排斥反应相对较低。因此，人们寄希望于干细胞替代疗法能够解决供体不足和免疫排斥的问题。
干细胞的使用虽然能够解决供体细胞数量问题，但是在应用前还需要先将其诱导分化为功能性的胰岛素分泌细胞。胰腺干细胞(Pancreatic stem cells)是一类存在于胎儿和成年胰腺组织中的成体干细胞，具有自我更新，多向分化潜能，在自然分化过程中首先分化为胰腺组织内的各种细胞。由于该细胞来源于胰腺组织，因此，在向胰岛素分泌细胞分化方面具有更大的潜力。越来越多的证据表明胰腺导管、胰岛和腺泡组织内都存在着具有多向分化潜能的干细胞。目前有观点认为，由胰岛组织获得的间充质样干细胞可能来源于去分化后的β细胞(Russ，H.A.，Bar，Y.，Ravassard，P.，Efrat，S.2008 In vitroproliferation of cells derived from adult human beta-cells revealed bycell-lineage tracing.Diabetes，57：1575～1583)。并且这些细胞在体外多次传代后其胰岛素启动子仍处于活化状态，因此具有巨大的糖尿病治疗潜力。
体外分离、培养胰腺干细胞作为种子细胞，并将其定向诱导分化为功能性胰岛细胞，是解决胰岛供体短缺的有效途径。已有多个研究小组在胰腺干细胞的研究上开展了一定的基础工作。西北农林科技大学效梅(单克隆人胰腺干细胞分离培养体系的建立[J].分子细胞生物学，2008，41(6)：450-456.)、赵婷(人胰腺干细胞诱导胰岛样细胞团及其治疗大鼠糖尿病的效果[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(7)：1259-1262.)、第三军医大学姚忠祥(人胰腺干细胞的体外分离培养、鉴定和分化特性[J].第三军医大学学报，2003，25(1)：23-25.)吉林大学等先后在胰腺干细胞的分离纯化，培养基的筛选，以及细胞生物学，分子生物学鉴定方面做了大量的工作；分离到的胰腺干细胞在体内定向诱导后形成胰岛样细胞团，并检测到胰岛素和C-肽的分泌，但分化效率都很低，移植后对糖尿病的治疗效果不显著。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种人胰岛来源的胰腺干细胞系体外构建的方法，将该干细胞系体外诱导分化成胰岛样细胞团的方法，以及用上述方法得到的胰腺干细胞系和胰岛样细胞团。将所述胰岛样细胞团移植至糖尿病模型动物后能够改善其血糖水平。
本发明提供一种人胰岛来源的胰腺干细胞系体外构建的方法，该方法包括如下步骤：消化人胰腺组织，挑出胰岛细胞团，进一步消化形成单细胞悬液，传代培养后形成间充质样胰腺干细胞。
所述的胰腺干细胞系，其细胞为成纤维样，多呈三角形和短梭状，单核细胞，有两个或两个以上的核仁，细胞间存在接触抑制。
所述的胰腺干细胞系，经诱导可分化形成胰岛样细胞团。
本发明的第一方面提供一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建方法，包括以下步骤：
1)将人胰腺细胞加入培养液A中培养2-3天；
2)挑出上述培养物中的胰岛细胞团，用蛋白酶消化成单细胞，接种于培养液A中培养；
3)待细胞生长至80-90％融合时，传代，加入培养液B培养，得 到胰岛细胞来源的人胰腺干细胞系(hPSC)；
其中所述培养液A为含有10-25％ FBS、8-12mM尼克酰胺、18-22ng/mL EGF和18-22ng/mL bFGF的RPMI1640；所述培养液B为含有10-25％FBS、18-22ng/mLbFGF的Low-DMEM。
在一个实施方案中，所述培养液A还含有0.8-1.2mM丙酮酸钠、1.8-2.2mM谷氨酰氨、0.05-0.15mM β-巯基乙醇和90-110mg/mL青霉素/链霉素；所述培养液B还含有0.05-0.15mM β-巯基乙醇、1.8-2.2mM谷氨酰胺和90-110mg/mL青霉素/链霉素。
在一个优选实施方案中，上述方法包括以下步骤：
1)向人胰腺的组织块中加入0.05-0.2％(质量/体积)胶原酶消化，终止消化后过滤、离心并清洗得到单细胞，加入所述培养液A培养2-3天；
2)在显微镜下挑出胰岛细胞团，0.25％(质量/体积)蛋白酶将其进一步消化成单细胞，接种于多孔板内，添加所述培养液A培养；
3)待细胞生长至80-90％融合时，以0.25％蛋白酶消化，以1∶3-1∶5比例传代，加入所述培养液B进行培养；培养超过50代后得到胰岛细胞来源的人胰腺干细胞系。
本发明的第二方面提供一种使人胰腺干细胞系诱导分化成胰岛样细胞团的方法，包括以下步骤：
1)将人胰腺干细胞接种于含有0.8-1.2％ BSA、0.8-1.2mM丁酸钠、80-120ng/mL ActivinA、40-60mM LY294002、8-12mM尼克酰胺、0.8-1.2×ITS的RPMI1640/B27培养液，在贴壁皿内培养3-4天；0.25％蛋白酶消化，悬浮培养形成EB(类胚体)，更换将上述培养液撤去丁酸钠、ActivinA和LY294002并添加0.8-1.2×10-6M RA(维甲酸)、18-22ng/mLEGF和18-22ng/mL bFGF的培养液，继续在常规培养条件下悬浮培养进行初步分化诱导7-9天；在一个优选实施方案中，所述接种培养液还含有1.8-2.2mM L-谷氨酰胺、0.05-0.15mM β-巯基乙醇和0.8-1.2mM丙酮酸钠；
2)将初步分化诱导后的细胞转移到含有0.8-1.2％ BSA、1.8-2.2mM谷氨酰胺、0.8-1.2mM丙酮酸钠、22-28μM醋酸锌、0.8-1.2×ITS、90-110mM烟碱、8-12ng/mL exendin-4和8-12ng/mL β-细胞素的 RPMI1640/B27培养液上，在常规培养条件下继续悬浮培养，得到胰岛样细胞团；在一个优选实施方案中，所述培养液还含有1.8-2.2mM L-谷氨酰胺、0.8-1.2mM β-巯基乙醇和0.8-1.2mM丙酮酸钠。
在一个优选实施方案中，所使用的人胰腺干细胞系是依照本发明第一方面的方法构建的人胰岛来源的胰腺干细胞系。
本发明的第三方面提供一种使依照本发明第一方面的方法建立的人胰岛来源的胰腺干细胞系体外诱导分化成类神经细胞的方法，该方法包括以下步骤：将所述人胰岛来源的胰腺干细胞系的细胞接种于培养液B培养20-30h后弃去培养液，添加神经细胞预诱导液处理20-30h后，换成神经细胞诱导液继续作用8-12h；所述神经细胞预诱导液为Low-DMEM基础培养液中加入1mmol/L β-巯基乙醇；所述神经细胞诱导液为Low-DMEM基础培养液中加入5mmol/L β-巯基乙醇。
本发明的第四方面提供一种使依照本发明第一方面的方法建立的人胰岛来源的胰腺干细胞系诱导成类脂肪细胞的方法，该方法包括以下步骤：将所述人胰岛来源的胰腺干细胞系的细胞接种于上述培养液B培养，待细胞融合度达到约80-90％，更换诱导培养基(
Adipogenesis Differentiation Kit试剂盒(GIBCO))继续培养，持续培养14～21天。
本发明的第五方面提供一种使依照本发明第一方面的方法建立的人胰岛来源的胰腺干细胞系诱导成类骨细胞的方法，该方法包括以下步骤：将所述人胰岛来源的胰腺干细胞系的细胞接种于上述培养液B培养，待细胞融合度达到约80-90％，即更换诱导培养基(
Osteogenesis Differentiation Kit试剂盒(GIBCO))继续培养，持续培养21～28天。
在一个实施方案中，通过上述方法得到的类骨细胞为茜素红染色阳性。
本发明的第六方面提供依照本发明第一方面的方法建立的人胰腺干细胞系。
本发明的第七方面提供依照本发明第二方面的方法建立的胰岛样细胞团。
本发明的第八方面提供包含本发明第六方面所述的人胰腺干细胞 系或本发明第七方面所述的胰岛样细胞团的药物、试剂、组合物、试剂盒。
本发明的第九方面提供本发明第六方面所述的人胰腺干细胞系或本发明第七方面所述的胰岛样细胞团在制备用于降低血糖或治疗糖尿病的药物、试剂、组合物、试剂盒中的用途。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1)本发明获得的人胰岛来源的胰腺干细胞系，其生长状况良好，其群体倍增时间由原来的50.48±1.56h缩短为24.75±1.34h，且细胞的存活率较之以前的大大提高，便于规模化的应用；在体外传代50代以上仍有较好的活力，仍保持分裂增殖，不易发生衰老和凋亡。
2)本发明获得的人胰岛来源的胰腺干细胞系，其营养要求较低，原始分离得到的胰岛细胞的培养需要20％的胎牛血清、EGF、bFGF、尼克酰胺等各种营养因子，而现在只要求约10％的胎牛血清和bFGF，大大降低了培养的成本。
3)本发明获得的人胰腺干细胞系来源于人胰岛β细胞的去分化，添加诱导因子后其分化形成功能性胰岛样细胞团效率显著提高，高糖刺激后能够分泌胰岛素和C-肽，将其移植到患有糖尿病的裸鼠模型的体内，能降低血糖浓度甚至可恢复至正常的血糖水平，并且在40天内能够维持较低的血糖水平。
4)由于本发明获得的胰岛样细胞团是人源的，因此可以预期其在用于治疗患有糖尿病的患者时的相容程度优于其他来源的胰岛样细胞团。
附图说明
图1为人胰岛来源的胰腺干细胞形态学特征显示图；
图2为人胰岛来源的胰腺干细胞特征性标志鉴定图；
图3Brdu检测的人胰岛来源的胰腺干细胞的细胞增殖结果图；
图4为人胰岛来源的胰腺干细胞系的细胞生长曲线图，其中横坐标为时间(天数)，纵坐标为细胞数(104)；
图5为人胰岛来源的胰腺干细胞诱导分化为类神经细胞的特征性标志鉴定图；
图6为人胰岛来源的胰腺干细胞成脂诱导的特征性标志鉴定图；
图7为人胰岛来源的胰腺干细胞成骨诱导的特征性标志鉴定图；
图8为人胰岛来源的胰腺干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的特征性标志鉴定图；
图9为胰岛样细胞团移植裸鼠糖尿病模型后的血糖浓度变化曲线，其中横坐标为时间(天数)，纵坐标为血糖浓度。
具体实施方式
本发明提供一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建及分化的方法。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不易发生衰老和凋亡，经过诱导后能够分化形成功能性胰岛样细胞团。以下通过对该细胞系的构建、细胞形态特征、标志物的基因及免疫学鉴定、诱导分化，高低糖刺激胰岛素和C-肽分泌以及移植糖尿病模型体内的血糖变化试验来做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本说明书中的FBS是指胎牛血清，关于FBS的百分数，如无特别说明，均是指体积百分数。本说明书中的BSA是指牛血清白蛋白，关于FBS的百分数，如无特别说明，均是指质量百分数。本说明书中使用的其他百分数，如无特别说明，则依从本领域惯常使用的含义。
本说明书中提及的培养液均购自Gibico公司，试剂均购自Sigma公司本。
说明书中所述的常规培养液、常规培养条件，是指本领域技术人员能够根据现有技术确定的适合培养所述细胞的培养液和培养条件。
实施例
实施例1、人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建
人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建具体包括以下步骤：
1)在患者同意的情况下，在需要进行部分胰腺切除治疗的急性胰腺炎患者的胰腺切除手术过程中无菌采集所切除的人胰腺组织，置于预冷的Hank′s中冲洗并除去外周的血液和剪去周围的脂肪、血管、组织被膜及结缔组织，然后剪成1mm3左右的组织块，加入0.1％IV型胶原酶，于37℃消化20-30min。期间不时振荡，含有10％ FBS Hank′s的终止消化后过80目筛网，离心(500r/min)3min，并清洗2次，加入含有20％ FBS、1mM丙酮酸钠、10mM尼克酰胺、0.1mM β-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF和100mg/mL青霉素/链霉素的RPMI1640培养液培养48h。
2)在显微镜下手工挑出胰岛细胞团，0.25％胰蛋白酶将其进一步消化形成单细胞悬液，终止消化后接种于12孔板内，添加含有20％FBS、1mM丙酮酸钠、10mM尼克酰胺、0.1mM β-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF和100mg/mL青霉素/链霉素的RPMI1640培养液，置于37℃、5％ CO2的培养箱中培养。
3)待细胞生长至90％融合时，以0.25％胰蛋白酶消化，以1∶3比例传代，将细胞接种于含有10％FBS、0.1mM β-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、20ng/mL bFGF和100mg/mL青霉素/链霉素的Low-DMEM培养液中培养，每两天半量换液。
实施例2、人胰岛来源的胰腺干细胞系的鉴定
2.1细胞形态学特征
在相差显微镜下观察人胰岛来源的胰腺干细胞的形态变化。具体结果如图1所示，其中，图A为原代分离的人胰岛细胞团，图B为扩大培养后的人胰岛来源的胰腺干细胞(hPSC)，与胰岛细胞相比，细胞为成纤维样，多呈三角形和短梭状，呈网络状排列，细胞间存在接触抑制，图C为对人胰腺干细胞进行吉姆萨染色，细胞为单核，核比较明显，有2个或2个以上的核仁，能够看到明显的细胞分裂相。该细胞在体外传代50代以上仍有较好的活力，仍保持分裂增殖，不易发生衰老和凋亡。
2.2胰腺干细胞相关标记的鉴定
2.2.1免疫荧光检测
将人胰岛来源的胰腺干细胞经4％多聚甲醛固定后，免疫荧光染色对胰腺干细胞特征性标志进行鉴定。
免疫荧光染色步骤为：
a.细胞经4％多聚甲醛固定10min，用PBS洗涤2-3次；
b.加入0.1％ TritionX-100室温作用10min，PBS洗2-3次，每次作用5min；
c.加入含1％BSA的PBS作用30min；
d.加入一抗，4℃过夜；
e.PBS洗2-3次，每次作用5min，加入荧光二抗，37℃作用1h；
f.PBS洗2-3次，荧光显微镜下观察。
免疫荧光检测所使用的一抗主要有：波形蛋白(Vim)、PDX1、Ngn3、葡萄糖转录因子(Glut2)和CK19。免疫荧光染色结果分别如图2A所示，结果显示：该胰腺干细胞系呈波形蛋白(Vim)、PDX1、Ngn3和葡萄糖转录因子(Glut2)阳性，而不表达上皮细胞标记CK19。
2.2.2PCR检测胰腺干细胞标记基因的表达
根据GenBank中已发表的反转录酶基因参考序列，设计并人工合成特异性检测引物，相关引物序列、长度、及Tm值见表1。
表1.胰腺干细胞相关标志物及其相应的PCR扩增引物
细胞总RNA的提取：收集0.25％胰蛋白酶消化传代后的人胰岛来源的胰腺干细胞和诱导后的胰岛样细胞团于离心管中，PBS洗涤2-3次；然后加入1mL Trizol震荡混匀，室温下静置5min进行细胞裂解，向离心管中加入0.2mL氯仿，震荡，室温下静置15min，4℃，10000r/min 离心15min；离心后取上层部分移入另一支离心管，加入0.2mL异丙醇，上下颠倒，轻轻混匀，室温下静置30min，4℃，10000r/min离心15min；弃上清，加入1mL 75％乙醇振荡，7500r/min离心5min；将沉淀自然干燥(室温下放置10min左右)，用30μL DEPC水重悬RNA。
PCR扩增进行cDNA的合成：
PCR扩增体系为：5×PrimeScript Buffer 2μL，Random 6 mers 2μL，Oliqo(dT) Primer 0.5μL，逆转录酶(PrimeScript RT EnzymeMix)0.5μL，500ng的总RNA，RNase Free H2O补齐至10μL；混匀，37℃孵育30min，然后85℃延伸5s，得到cDNA。
PCR扩增双链DNA，反应体系如下：10×PCR Buffer1.5μL，MgCl2 1.5μL，上、下游引物各0.3μL，Taq酶0.1μL，dNTP Mixture1.2μL，cDNA 1.0μg，加双纯水补齐至15.0μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。
取5μL PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，胰腺干细胞相关标记基因的表达情况如图2B所示，该株细胞系均表达Vim、PDX1、Ngn3和Mafa基因，说明其具有胰腺干细胞的特征。
2.2.3PCR检测胰腺干细胞端粒酶活性
按照
Telomerase Detection Kit S7700(CHEMICON)试剂盒操作说明对胰腺干细胞端粒酶活性进行检测，结果显示，该细胞系有很强的端粒酶活性(图2C)，在体外有很强的扩增能力
2.3BrdU检测人胰岛来源的胰腺干细胞系的细胞增殖
将人胰岛来源的胰腺干细胞系作为待测样，将待测的细胞样本制成单细胞悬液，接种于48孔板，添加培养液B培养3d，用含30μg/mLBrdU的培养液处理4～6h后，经甲醇/丙酮固定液(甲醇∶丙酮为1∶1)室温下固定15min，PBS缓冲液清洗2～3遍，2mol/L盐酸作用45min，PBS缓冲液清洗2～3遍，加入PH8.5的硼酸钠作用15min，PBS缓冲液清洗2～3遍，加入鼠抗BrdU(1∶100，Santa Cruz)4℃作用16h以上，PBS缓冲液清洗2～3遍，加入二抗，Hochest33342作用2～5min，PBS缓冲液清洗2～3遍，荧光显微镜下观察。结果如图3所显示，经 计数，该胰腺干细胞系BrdU的阳性率为40.68±1.56％，说明该细胞系在体外有很强的扩增能力。
2.4生长曲线的测定
取传代的人胰岛来源的胰腺干细胞(第5代和15代细胞)，以1×104个/孔的细胞密度接种24孔培养板上，每天取3孔，胰蛋白酶消化悬浮细胞，基础培养液中和，细胞计数，取平均值记作当天细胞数，连续计数10天。以细胞数(104)为纵坐标，培养天数(d)为横坐标，绘制生长曲线，结果如图4所示。比较传代后的第5代和15代细胞生长曲线，其中1～3天为潜伏期，4～7天一直为对数增长期，说明细胞具有很强的增值能力。
群体倍增时间(PDT)的计算：计算公式为PDT＝(T-T0)lg2/(lgNt-lgN0)。其中T0：细胞培养的起始时间；T：细胞到达平台期的时间；N0：培养开始时细胞的数量；Nt：到达平台期期时细胞的数量。结果显示：人胰岛来源的胰腺干细胞的群体倍增时间为24.75±1.34h。
实施例3、人胰岛来源的胰腺干细胞系的功能学特征
胰腺干细胞是存在于胰腺组织，具有自我更新，多向分化潜能的发育早期细胞。体外分离、克隆胰腺干细胞，并定向诱导其分化为功能性胰岛移植治疗糖尿病，是解决胰岛供体短缺的有效途径。
本发明将人胰岛来源的胰腺干细胞系进行诱导，使其定向分化成为胰岛样细胞团，用来治疗裸鼠糖尿病模型，通过相关分子和免疫荧光检测、高糖刺激胰岛素释放试验及移植裸鼠糖尿病模型检测其血糖水平。
3.1类神经细胞的诱导分化和鉴定
以0.25％胰蛋白酶消化，将细胞接种于48孔板内，加入培养液培养24h后弃去培养液，添加神经细胞预诱导液(Low-DMEM基础培养液中加入1mmol/L β-巯基乙醇)处理24h后，换成神经细胞诱导液(Low-DMEM基础培养液中加入5mmol/L β-巯基乙醇)继续作用8h。
按照SP-9000通用型SP kit的操作说明对诱导后的细胞进行免疫组织化学染色。检测所使用的一抗主要有：巢蛋白(Nestin)、神经元 特异性烯醇化酶(NSE)和神经元特异性烯醇化酶(GFAP)。免疫荧光染色结果如图5所示，结果显示：细胞经诱导后形态发生明显的改变，细胞向外伸出了多个突触，与神经细胞的轴突相似。染色结果显示，诱导后的类神经细胞呈神经细胞标志Nestin、NSE、GFAP阳性。
3.2类脂肪细胞的诱导分化和鉴定
将细胞接种于12孔板，加入培养液培养，待细胞融合度达到约80-90％，即更换诱导培养基(
Adipogenesis DifferentiationKit(GIBCO)试剂盒)继续培养，每2～3天更换培养基，持续培养14-21天。
诱导14-21天后，弃去培养基，PBS洗涤一次，加4％多聚甲醛固定约1小时，吸弃固定液，PBS洗涤一遍，每孔加入适量约1ml油红O染色液(配制，储存液：异丙醇配置成0.5％的溶液，工作液∶储存液与PBS以3∶2稀释，过滤即可使用)，染色十五分钟，吸弃染色液，PBS洗涤两遍，镜检。染色结果如图6所示。结果显示：细胞内出现大量的脂滴，油红O染色呈红色。
3.3类骨细胞的诱导分化和鉴定
将细胞接种于12孔板，加入培养液培养，待细胞融合度达到约80-90％，即更换诱导培养基(Osteogenesis DifferentiationKit试剂盒(GIBCO))继续培养，每2～3天更换培养基，持续培养21～28天。
诱导约21～28天后，弃去培养基，PBS洗涤一次，加4％多聚甲醛固定约1小时，吸弃固定液，生理盐水洗涤一遍，每孔加入适量约1ml1％茜素红染色液油红O染色液(pH4.1～4.3)，避光染色十五分钟，吸弃染色液，蒸馏水洗涤两遍，镜检。染色结果如图7所示。结果显示：可见阳性诱导样品被染成红色，并见有红黑色的钙结节。
3.4胰岛样细胞团的诱导分化和鉴定
3.4.1胰岛样细胞团的诱导分化
1)0.25％胰蛋白酶消化胰腺干细胞，接种于含有1％ BSA、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇、1mM丁酸钠、100ng/mL ActivinA、50mM LY294002、10mM尼克酰胺、1mM丙酮酸钠、1×ITS的RPMI1640/B27培养液的贴壁皿内培养3-4天；0.25％胰蛋白酶消化， 悬浮培养形成EB，更换将上述培养液撤去丁酸钠、ActivinA和LY294002并添加1.0×10-6M RA、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF的培养液，继续在37℃、5％CO2的条件下悬浮培养进行初步分化诱导7-9天；
2)将初步分化诱导后的细胞转移到含有质量分数1％的BSA、2mM谷氨酰胺、1mM β-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠、25μM醋酸锌、1×ITS、100mM烟碱、10ng/mL exendin-4和10ng/mL β-细胞素的RPMI1640/B27培养液上，在37℃、5％CO2的条件下继续悬浮培养，得到胰岛样细胞团。
3.4.2胰岛细胞团的鉴定
将诱导分化形成的胰岛样细胞团接种于48孔板内或6孔板内进行贴壁培养。48孔板内的胰岛样细胞团用于免疫荧光的检测，而6孔板内的细胞团则分析高低糖刺激后的胰岛素的分泌情况。
48孔板培养24h后的免疫荧光检测的结果，如图8所示，DTZ阳性(图8B)，且PDX1、C-肽、胰岛素阳性(图8C)。
分别以5.6和25mmol/L的葡萄糖刺激胰岛素释放液刺激诱导后的胰岛样细胞团，对释放的胰岛素和C-肽量进行分析。6孔板培养24h后吸出诱导培养液，PBS(-)冲洗3遍后，加入0.4mL/孔无血清、含5.6mmol/L(低糖)和25mmol/L(高糖)葡萄糖浓度的刺激液刺激胰岛素释放。2小时后收集刺激后培养液，-20℃冷冻储存待测。试验结束后，送仁济医院化验科用放射免疫测定法，测定刺激液中胰岛素与C-肽含量，结果如见表2所示。可以看出胰岛样细胞在受到葡萄糖刺激液的刺激后，在体外能够释放胰岛素和C-肽，并且诱导2周的效果要明显好于诱导1周的效果。
表2.葡萄糖刺激胰岛样细胞团的释放试验
a：与对照组相比，刺激组胰岛素和C-肽的释放量差并极显著(P＜0.01)
c：与低糖刺激组相比，高糖刺激组胰岛素和C-肽的释放量差异极显著(P＜0.01)
3.4.3被诱导分化的胰岛样细胞团移植小鼠糖尿病模型后的血糖体内检测
24只6～10周龄雄性裸鼠中随机选取18只，通过注射0.2％链脲菌素(STZ)建立糖尿病动物模型，剩余6只注射柠檬酸盐缓冲液作为阴性对照。裸鼠在制模前禁食12h，以100mg/kg(体重)剂量腹腔注射STZ，每天1次，连续注射2d，3d后空腹测定制模裸鼠的血糖值，隔2d测定一次，连续2次测定模型裸鼠的空腹血糖值高于16.7mmol/L，则判定糖尿病裸鼠制备成功。以正常的裸鼠作为对照，将模型分为移植培养液组、未诱导的细胞组和诱导的胰岛样细胞团组，每组各6只。腹腔注射移植后正常饲喂裸鼠，移植后每3天检测裸鼠体内的血糖浓度，根据检测结果绘制的血糖浓度变化曲线如图9所示，其中，横坐标为移植后的时间(天数，d)，纵坐标为裸鼠的血糖浓度(mmol/L)。由图9所示的血糖浓度变化曲线可以看出，在移植胰岛样细胞团后裸鼠的血糖浓度即开始下降，到移植后10天血糖浓度即可达到正常裸鼠的水平，在此后的24天内能够维持正常的血糖浓度，随后血糖的浓度又开始上升，到第46天后血糖浓度与移植培养液的模型裸鼠血糖浓度相当。而未诱导的细胞移植组，裸鼠的血糖浓度3w后开始降至10mmol/L以下，并一直维持有40天左右，而后模型裸鼠的血糖又持续上升。这表明诱导的胰岛样细胞团具有确切的生理功能，能够在体内降低糖尿病模型血糖的浓度。而移植的胰腺干细胞系在裸鼠体内高糖条件下可以自发分化为胰岛β细胞，起到控制血糖的效果，但它的降血糖的短期效果要稍差于诱导后的胰岛样细胞团。
Claims (12)
1.一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建方法，该方法包括以下步骤：
1）将人胰腺细胞加入培养液A中培养2-3天；
2）挑出上述培养物中的胰岛细胞团，用蛋白酶消化成单细胞，接种于培养液A中培养；
3）待细胞生长至80-90%融合时，传代，加入培养液B培养，得到胰岛细胞来源的人胰腺干细胞系（hPSC）；
其中所述培养液A为含有10-25%FBS、8-12mM尼克酰胺、18-22ng/mLEGF和18-22ng/mL bFGF的RPMI1640；所述培养液B为含有10-25%FBS、18-22ng/mLbFGF的Low-DMEM。
2.权利要求1的方法，其中所述培养液A还含有0.8-1.2mM丙酮酸钠、1.8-2.2mM谷氨酰氨、0.05-0.15mMβ-巯基乙醇和90-110mg/mL青霉素/链霉素；所述培养液B还含有0.05-0.15mMβ-巯基乙醇、1.8-2.2mM谷氨酰胺和90-110mg/mL青霉素/链霉素。
3.权利要求1或2的方法，该方法包括以下步骤：
1）向人胰腺的组织块中加入0.05-0.2%(质量/体积)胶原酶消化，终止消化后过滤、离心并清洗得到单细胞，加入所述培养液A培养2-3天；
2）在显微镜下挑出胰岛细胞团，0.25%(质量/体积)蛋白酶将其进一步消化成单细胞，接种于多孔板内，添加所述培养液A培养；
3）待细胞生长至80-90%融合时，以0.25%蛋白酶消化，以1:3-1:5比例传代，加入所述培养液B进行培养；培养超过50代后得到胰岛细胞来源的人胰腺干细胞系。
4.一种使人胰腺干细胞系体外诱导分化成胰岛样细胞团的方法，该方法包括以下步骤：
1）将人胰腺干细胞接种于含有0.8-1.2%BSA、0.8-1.2mM丁酸钠、80-120ng/mL ActivinA、40-60mM LY294002、8-12mM尼克酰胺、0.8-1.2×ITS的RPMI1640/B27培养液，在贴壁皿内培养3-4天；0.25%蛋白酶消化，悬浮培养形成EB，更换将上述培养液撤去丁酸钠、ActivinA和LY294002并添加0.8-1.2×10-6M RA、18-22ng/mL EGF和18-22ng/mL bFGF的培养液，继续在常规培养条件下悬浮培养进行初步分化诱导7-9天；
2）将初步分化诱导后的细胞转移到含有0.8-1.2%BSA、1.8-2.2mM谷氨酰胺、0.8-1.2mM丙酮酸钠、22-28μM醋酸锌、0.8-1.2×ITS、90-110mM烟碱、8-12ng/mL exendin-4和8-12ng/mLβ-细胞素的RPMI1640/B27培养液上，在常规培养条件下继续悬浮培养，得到胰岛样细胞团。
5.权利要求4的方法，其中步骤1）中所述的接种培养液还含有1.8-2.2mM L-谷氨酰胺、0.05-0.15mMβ-巯基乙醇和0.8-1.2mM丙酮酸钠。
6.权利要求4的方法，其中步骤2）中所述的培养液还含有1.8-2.2mM L-谷氨酰胺、0.8-1.2mMβ-巯基乙醇和0.8-1.2mM丙酮酸钠。
7.权利要求4的方法，其中所述人胰腺干细胞系是依照权利要求1-3任一项的方法建立的人胰岛来源的胰腺干细胞系。
8.一种使依照权利要求1-3任一项的方法建立的人胰岛来源的胰腺干细胞系诱导分化成类神经细胞的方法，该方法包括以下步骤：将所述人胰岛来源的胰腺干细胞系的细胞接种于所述培养液B培养20-30h后弃去培养液，添加神经细胞预诱导液处理20-30h后，换成神经细胞诱导液继续作用8-12h；所述神经细胞预诱导液为Low-DMEM基础培养液中加入1mmol/Lβ-巯基乙醇；所述神经细胞诱导液为Low-DMEM基础培养液中加入5mmol/Lβ-巯基乙醇。
9.依照权利要求1-3任一项的方法建立的人胰腺干细胞系。
10.依照权利要求4-7任一项的方法建立的胰岛样细胞团。
11.包含权利要求9所述的人胰腺干细胞系或权利要求10所述的胰岛样细胞团的药物、试剂、组合物或试剂盒。
12.权利要求9所述的人胰腺干细胞系或权利要求10所述的胰岛样细胞团在制备用于降低血糖或治疗糖尿病的药物、试剂、组合物或试剂盒中的用途。
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