CN103930542A - 棕色脂肪细胞组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
产生和使用用于治疗或美容用途的细胞系，如干细胞系的方法。在一个实施方式中，使用所述细胞系来治疗广泛的退行性疾病和代谢紊乱，包括但不限于肥胖、糖尿病、高血压和心气虚。还描述了使用此类细胞系来筛选化合物的方法，所述化合物在调节多种过程中发挥作用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域并且更具体地涉及干细胞的培养和应用。
相关申请
本申请要求2011年6月29日提交的美国临时申请61/502,508、2012年1月18日提交的美国临时申请61/632,122和2012年1月25日提交的美国临时申请61/632,516的优先权及权益，这些申请的每一个的整体都通过引用并入本文。
背景技术
棕色脂肪（褐色脂肪）是在人体中发现的两类脂肪组织之一。在胚胎发生过程中，棕色脂肪来源于中胚层的分化。棕色脂肪通过提供能够提供热的代谢组织而参与发育和稳态。棕色脂肪协助调节代谢和非颤抖性产热（nonshivering thermogenesis）。另外，棕色脂肪在调节代谢上比白色脂肪组织发挥更大的作用。棕色脂肪占人类新生儿体重的5%，并且少于成年人体重的1%。
棕色脂肪的代谢活性随着身体质量指数（体重指数）的增加而降低。类似地，棕色脂肪的代谢活性随着身体脂肪百分率增加而降低。
已经鉴别且分离了许多组织中的干细胞，并且已经分离、扩增了白色脂肪组织的干细胞并且证明它们具有功能性治疗特性。迄今为止，还没有在棕色脂肪组织中鉴别出干细胞群的群体。
发明内容
所描述的是产生（develop）用于治疗或美容（化妆，cosmetic）用途的细胞系的方法，例如干细胞系。例如，所述细胞系可以用来治疗广泛的退行性（变性，degenerative）疾病和代谢紊乱，包括但不限于肥胖、糖尿病、高血压和心气虚（cardiac deficiency）。还描述的是使用此类细胞系来筛选化合物和基因的方法，所述化合物在调节多种过程中发挥作用，所述过程例如但不限于甲基化作用、体内稳态，所述基因参与在体内调节代谢、产热、活化和/或维持棕色和白色脂肪水平。
在一方面，本发明的特征在于一种产生干细胞的方法。在一个实施方式中，其步骤包括：获得棕色脂肪组织；从该棕色脂肪组织中分离出干细胞；以及在不包含动物产品（animal product）的培养基中培养该干细胞，从而产生干细胞。在另一个实施方式中，所述棕色脂肪组织是来自获自受试者的样品。在另一个实施方式中，所述干细胞对于下列细胞表面标记物的一种或多种是阳性的：CD63、CD90、HLA ABC、CD105、CD73、CD166、CD9、CD44。在另一个实施方式中，所述干细胞对于下列细胞表面标记物的一种或多种是阴性的：CD34、CD19、CD86、HLA DR、Lin、CD106、CD80、CD117。在又一个实施方式中，所述干细胞是自体的（autogeneic）。在另一个实施方式中，所述干细胞是异体的（异源的，allogeneic）。在另一个实施方式中，所述培养基包括不含酚红的低葡萄糖DMEM、0.5-20%人血小板裂解液、1X NEAA、1X Glutamax、1X庆大霉素和1000单位的肝素。
在另一方面，本发明的特征在于一种产生干细胞、祖细胞或分化细胞（如活化的棕色脂肪的脂肪细胞（例如，表达UCP-1和/或PRDM16的棕色脂肪的脂肪细胞））的细胞提取物的方法以及将这种提取物给予至受试者体内的脂肪沉着体（脂肪沉积，fat deposit）从而治疗肥胖的方法。
本发明的另一方面是一种在受试者中治疗肥胖的方法。在一个实施方式中，该方法包括步骤：从受试者中取出棕色脂肪；和将该棕色脂肪给予至该受试者的脂肪沉着体中，从而在该受试者中治疗肥胖。在一个实施方式中，该脂肪沉着体是白色脂肪沉着体。在另一个实施方式中，该脂肪沉着体是棕色脂肪沉着体。
在另一方面，本发明的特征在于一种鉴别（识别）参与代谢调节、棕色脂肪活化和/或维持的化合物的方法，包括使由本文中所描述的方法产生的自体干细胞、祖细胞或分化细胞接触测试化合物；在该测试化合物的存在下，测定该干细胞、祖细胞或分化细胞的某些基因（如PRD-16myf-5UCP-1、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DI02、LHX8、COX8A、CYFIP2、CIDEA、Cox8b、Glut4）的代谢活性、产热和/或活化的水平；以及将在存在该测试化合物下的所述干细胞、祖细胞或分化细胞的代谢活性、产热和/或基因活性的水平与在不存在该测试化合物下的所述干细胞、祖细胞或分化细胞的代谢活性、产热和/或基因活性的水平进行比较，其中，在存在该测试化合物下的代谢活性、产热和/或基因活性的水平与在不存在该测试化合物下的代谢活性、产热和/或基因活性的水平不同则鉴别出：所述测试化合物为参与代谢调节或棕色脂肪活化、产热和/或维持（maintenance）的化合物。
在又一方面，本发明涉及一种在受试者中治疗代谢紊乱的方法。在一个实施方式中，该方法包括步骤：从供体中取出干细胞；在不含动物产品的培养基中将该干细胞分化为棕色脂肪细胞；以及将该棕色脂肪细胞给予至受试者中的脂肪沉着体中，从而在该受试者中治疗代谢紊乱。在另一个实施方式中，该代谢紊乱选自由肥胖（obesity）、向心性肥胖（中心型肥胖，central obesity）、糖尿病、高血压症（过度紧张，hypertension）、心气虚（cardiac deficiency）、缺血性心脏病、高血压、甘油三酯血脂异常、HDL血脂异常、胆固醇血脂异常、空腹血糖升高（elevated fasting plasmaglucose）、瘦素调节异常（瘦素失调，leptin dysregulation）和脂肪调节异常（脂肪失调，adipon dysregulation）组成的组。在又一个实施方式中，该棕色脂肪细胞是通过皮下注射来给予的。在又一个实施方式中，该棕色脂肪细胞是通过系统性注射（systemic injection）来给予的。在另一个实施方式中，该培养基含有选自由胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛组成的组的分化剂（differentiation agent）。
本发明的又一方面是一种鉴别参与代谢调节的化合物的方法。在一个实施方式中，该方法包括步骤：从棕色脂肪组织中分离出干细胞；在不含动物产品的培养基中培养该干细胞；使该干细胞与测试化合物接触；在该测试化合物的存在下，测定该干细胞的代谢活性水平；以及将在存在该测试化合物下的该干细胞的代谢活性水平与在不存在该测试化合物下该干细胞的代谢活性水平进行比较，其中，在存在该测试化合物下的代谢活性水平与在不存在该测试化合物下的代谢活性水平不同则鉴别出：该测试化合物为参与代谢调节的化合物。在一个实施方式中，该测定步骤包括测量脂肪形成（脂肪生成，adipogenesis）。在另一个实施方式中，该方法进一步包括检测PRDM16、BMP7、UCPl、UCP2或MYF5中的一个或多个的水平。在又一个实施方式中，该测试化合物选自由蛋白质、抗体、肽、突变型蛋白（mutein）、多核苷酸、核酸适体（nucleic acid aptamer）和小分子组成的组。
本发明的一个方面涉及将干细胞分化为棕色脂肪细胞。在一个实施方式中，该方法包括使干细胞与不含动物产品的培养基接触，从而产生棕色脂肪干细胞。在另一个实施方式中，该培养基包括选自由胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤、吲哚美辛、T3、罗格列酮、FNDC5和它们的组合所组成的组的试剂。在又一个实施方式中，该培养基包括胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛。在又一个实施方式中，该棕色脂肪干细胞表达PRDM-16、PGC-1或它们的组合。在又一个实施方式中，该棕色脂肪组织是来自获自受试者的样品。
附图说明
当与附图一起阅读时，从下列各个示例性实施方式的描述中将更加全面地理解本文所述的本发明的教导内容。应当理解的是，以下所述的附图仅用于示例性目的并且其在任何情况下都不旨在限制本发明教导的范围。
图1为描绘将棕色脂肪细胞或棕色脂肪前体细胞注射入受试者中的示例性方法的示意图。
图2为准备传代的细胞培养物的显微照片。
图3为显示白色脂肪库（white adipose depot）和棕色脂肪库（brownadipose depot）中通过RT-PCR的基因表达的图像。
图4A和图4B是使用干细胞标记物染色的细胞的荧光显微照片。
图5A-5F为显示通过各种细胞类型标记物的流式细胞仪检测的系列照片。
图6为显示细胞培养物中脂肪滴（fat droplet）的存在的显微照片。
图7A和图7B是用油红O染色的细胞的显微照片。图7A显示了大脂肪滴（200μm）而图7B显示了小脂肪滴（50μm）。
图8A和图8B是用分化标记物染色的细胞的显微照片。图8A显示了用茜素红（一种成骨（骨生成，osteogenesis）标记物）的染色。图8B显示了用骨钙素抗体和阿辛蓝的染色，以显示软骨形成（软骨发生，chondrogenesis）。
图9为从棕色脂肪细胞中分离的外来体（外泌体，exosome）的扫描电子显微照片。
图10显示了用棕色脂肪祖细胞治疗的小鼠中的葡萄糖水平和体重的时间进程。
图11显示了用棕色脂肪祖细胞治疗的小鼠中的甘油三酯水平和胆固醇水平的时间进程。
图12显示了用棕色脂肪祖细胞治疗的小鼠中的瘦素水平与脂肪水平的时间进程。
具体实施方式
本发明至少部分地是基于以下发现，即细胞（如自体或非自体棕色脂肪细胞或干细胞）可以被分离并且用于改变受试者中的代谢和/或产热、和/或用来在受试者中治疗广泛的疾病，如代谢紊乱（图1）。
如本文所述的，棕色脂肪细胞和棕色脂肪干细胞可以在治疗上用来治疗许多代谢紊乱。在一些实施方式中，该代谢紊乱选自向心性肥胖（男性40英寸以上的腰围或女性36英寸以上的腰围）；甘油三酯血脂异常（1.7mmol/L（150mg/dl）以上）；HDL血脂异常（男性小于40mg/dl，女性小于50mg/dl）；血压（130/85mmHg以上）；和空腹血糖升高（6.1mmol/L（110mg/dl）以上）。
该分离的细胞可以是来自例如自体来源或异体来源。但是，也可以使用其他来源。
可以从这些源自纵隔脂肪库的培养干细胞制得细胞产品（cellularproduct），如细胞提取物。然后，可以治疗性地使用这些细胞提取物。
本申请中所描述的从棕色脂肪库分离的细胞或干细胞也可以用来筛选化合物（包括天然存在的化合物），该化合物提高偏好（促进，favor）较高代谢活性的棕色脂肪、代谢和/或基因表达谱（profile）的水平。类似地，本文所描述的细胞或干细胞可以用来鉴别化合物（包括天然存在的化合物），该化合物降低不偏好（不促进，disfavor）较高代谢活性的棕色脂肪、代谢和/或基因表达谱的水平。在一些实施方式中，该筛选是小分子筛选。
本文中所使用的“治疗”是指其中疾病或病症的一种或多种症状得到改善或其他方式的有利改变的任何方式。本文中所使用的特定病症的症状的改善是指症状的任何减少，不论是永久地还是临时的，持久的还是短暂的，其可以归因于通过本发明的组合物或方法的治疗或者与它们相关。
本文中使用的术语“有效量”或“有效治疗”是指本文中所述的一种或多种的组合物的量或浓度在使用一段时间后（包括急性或慢性给予和定期或连续给予），在其给予范围内对于实现预定的效果或生理结果是有效的。
本文中所使用的术语“受试者”是指动物、人类或非人类，向它们提供根据本公开方法的治疗。兽医和非兽医应用被考虑在内。该术语包括但不限于哺乳动物。典型的受试者包括人类、家畜（农场动物，farm animal）、家养宠物（domestic pet）如猫和狗。在一些实施方式中，该受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，该受试者是人类受试者，例如肥胖的人类受试者。在一些实施方式中，该受试者是非人类哺乳动物，例如实验动物、伴侣动物或为了提供食物而养育的动物。
本文中所使用的“分离的”或“纯化的”细胞是基本上不含来自细胞培养物（cell culture）或者所述细胞源自的组织来源的污染组分的细胞。“基本上不含”是指选定细胞的制剂（制备品，preparation）具有少于约50%（例如少于约40%、30%、20%或10%）的非选定组分。此类非选定组分在本文中也称为“染污组分”。当该分离的细胞是经重组产生的，它们可基本上不含培养基，即培养基少于细胞制剂体积的约20%（例如少于约10%或5%）。
本文中使用的“干细胞”是能够自我更新且能够分化为多种不同细胞系的细胞（是多能的（pluripotent））。“祖细胞”是指干细胞的子集，其具有类似于干细胞表型的表型。祖细胞能够自我更新并且典型地是多潜能的（multipotent）。本文中所使用的“分化细胞”是指细胞的子集，其具有特定组织或器官系统所特有的成熟细胞类型的表型。
获得细胞的方法
一般来说，可用于本文所述方法的细胞可以获自受试者，例如通过从受试者中分离细胞，或者临床级胚胎干细胞可以从商业来源获得。在某些实施方式中，该细胞是来自受试者的组织样品的一部分，例如棕色脂肪样品。该组织样品可以直接给予至受试者中，或者可以从该组织中分离出该细胞并且如本文所述的进行处理。在其他实施方式中，该细胞是干细胞，如来自骨髓活体组织检查，并且可以如本文所述的进行处理。
可用于本文所述的方法中的某些细胞是单能、多潜能（multipotent）或多能（pluripotent）细胞，并且可以是中胚层来源。在一些实施方式中，该细胞是棕色脂肪祖细胞、成熟的棕色脂肪细胞或干细胞。棕色脂肪祖细胞、成熟的棕色脂肪细胞或干细胞可以通过测定一种或多种细胞表面表达标记物的存在与否来鉴别。可以用来鉴别棕色脂肪祖细胞、成熟的棕色脂肪细胞或干细胞的示例性细胞表面标记物包括但不限于MYF5、UCP-1、PRDM-16、SSEA-4、Sca-1、CD45、Mac-1、CD29（整联蛋白β1）、CD105（内皮糖蛋白（Endoglin））、CD166（ALCAM）、结蛋白、波形蛋白和c-kit。在其他方法中，该细胞是棕色脂肪细胞。
在本文所述的任何方法中，该细胞可以是自体的、同基因的（syngeneic）、异体的（allogeneic）或异基因的（xenogeneic）。
适合在本文所述的方法中使用的细胞可以在各种组织和器官中发现，包括但不限于例如骨骼肌、心肌、平滑肌、前列腺、真皮、心血管系统、乳腺、肝脏、新生儿皮肤、颅盖、骨髓、肠、脂肪组织（例如，白色脂肪组织、棕色脂肪组织）、外周血、动员外周血（mobilized peripheral blood）和脐带。可以用许多已知的方法从此类组织和器官中分离细胞，包括例如活组织检查、血浆置换（apheresis）或抽脂（吸脂）。
在一些实施方式中，从脂肪组织（例如白色或棕色脂肪组织）获得细胞。例如，棕色脂肪组织可以使用已知的方法（例如通过活组织检查）从受试者的特定解剖区域来收获，例如颈-锁骨上区域、上纵隔区域、以及胸锁乳突肌的表面或侧部区域。可以通过许多方式来鉴别棕色脂肪组织，例如通过成像（例如通过PET扫描）。该棕色脂肪组织可以经历最少处理（例如通过使用缓冲液如DPBS洗涤并且机械分离为部分）并且按本文所述给予至受试者中。
在其他方法中，细胞（如棕色脂肪细胞、单核细胞、祖细胞或干细胞）可以与组织样品的污染组分分离。例如，可以使用酶（如胶原酶（例如I、II或III型）、分散酶（dispase）、透明质酸酶或弹性蛋白酶）来处理所述组织样品，并且可以通过过滤或离心来分离细胞。可替换地，可以化学处理所述组织样品，例如使用EDTA，并且可以使用例如机械破碎（例如涡旋）来分离细胞。可以使用适合的缓冲液（例如DPBS）来洗涤该分离的细胞。
在一些方法中，细胞是从受试者的骨髓样品中分离的。例如，可以使用针穿刺（针吸，needle aspiration）或其他已知技术来获得骨髓样品。在某些情况下，可以使用Ficoll-Hypaq密度梯度来从骨髓样品中分离细胞。
在其他方法中，可以从受试者的皮肤分离细胞。例如，可以使用穿刺活检组织（punch biopsy）来获得皮肤样品。在一个示例性的方法中，使用穿刺活组织检查来获得0.5cm的皮肤片，使用DPBS将其洗涤三次，并且从活检组织中去除真皮。然后将该皮肤切成小切片（section）（约3mm）并且置于6-孔组织培养板的孔上，使用无菌盖玻片覆盖该组织并且进行细胞培养。
培养细胞的方法
在某些方法中，将按本文所述获得的细胞保持在适合的培养基中，例如不含基于动物的产品（animal-based product）（如牛血清或小牛血清）的培养基，以获得更大的细胞群。该培养方法可以包括使细胞经历足够轮的倍增，例如以产生所需大小的克隆细胞株或异质细胞株，例如足以给受试者提供治疗效果的数量，或足以建立稳定细胞系的数量。例如，在初始活组织检查后可以在37℃将细胞培养3-6周的时间。
在本文所述的方法中使用的培养基不包括基于动物的产品。适合于本文所述的方法的示例性培养基可以包括人血小板裂解液和抗凝血剂，例如肝素或酸-柠檬酸盐-葡萄糖。另一种示例性的培养基包括人类汇集AB型血清和抗凝血剂。培养基的其他实例可以包括改良的Eagle培养基（MEM）（例如Dulbecco's MEM或α-MEM），其添加有甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺和抗生素。一种示例性的培养基包括：DMEM（低葡萄糖，无酚红）；0.5-20%人血小板裂解液；1X非必需氨基酸（NEAA）；1X Glutamax；1X庆大霉素；和1000单位的肝素。
在一些实施方式中，该细胞可以保持于在标准条件下的培养基中，如在例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,third edition,Wiley-Liss,New York中所描述的。
在某些实施方式中，所述细胞培养于人血小板裂解液或人类汇集AB型血清中，该血小板裂解液或人类汇集AB型血清是从已经暴露在低温环境（例如适于在受试者中产生交感神经系统反应的温度）下的受试者中得到的。
在其他实施方式中，所述细胞可以保持在缺氧环境（例如在37℃下0～约5%O2）中。
在某些实施方式中，所培养的细胞能够表达MYF-5、BMP7和/或PRDM16、SSEA4。在其他实施方式中，从肌肉组织培养的细胞能够表达SCA1且不表达c-Kit或CD45。
分化细胞的方法
在某些实施方式中，将如本文所述获得的细胞保持在适合的分化培养基中，例如，不含基于动物的产品的培养基。例如，可以将干细胞保持在分化培养基中足够的时间以将该干细胞分化为棕色脂肪细胞祖细胞或棕色脂肪细胞。在特定的实施方式中，将细胞保持在分化培养基中足够的时间以将该干细胞分化为MYF5表达细胞（表达MYF5的细胞）。在某些情况下，将细胞保持在分化培养基中，例如1-5天、5-10天、10-14天、14-21天、21-28天或更长。
在一些实施方式中，所述分化培养基包括一种或多种的化学或激素分化诱导剂和/或噻唑烷二酮类（thiazolidinediones）（如在例如Klien et al.,J.Biol.Chem.274:34795-34802(1999);Hauner et al.,J.Clin.Invest.84:1663-1670(1989)中所描述的）。在一些情况下，该分化培养基包括胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤、以及吲哚美辛和罗格列酮。一种示例性的分化培养基包括：DMEM（低葡萄糖，无酚红）；0.5%-20%人血小板裂解液；1X NEAA；1X Glutamax；1X庆大霉素；1000单位肝素；10μg/mL胰岛素；1μM地塞米松；200μM吲哚美辛；和0.5mM异丁基甲基黄嘌呤。在另一个实施方式中，该分化培养基包括BMP7。在另一个实施方式中，该分化培养基包括DMEM（低葡萄糖，不含酚红）；0.5%-20%人血小板裂解液；1X NEAA；1X Glutamax；1X庆大霉素；1000单位肝素；0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、125nM吲哚美辛、5μM地塞米松、850nM胰岛素、1nM T3、和1μM罗格列酮。在另一个实施方式中，该分化培养基包括DMEM（低葡萄糖，不含酚红）；0.5%-20%人血小板裂解液；1X NEAA；1X Glutamax；1X庆大霉素；1000单位肝素；0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、125nM吲哚美辛、5μM地塞米松、850nM胰岛素、1nM T3和1uM罗格列酮和20nM FNDC5。
在一些实施方式，将该细胞保持在分化培养基中直到检测出棕色脂肪细胞分化的一种或多种标记物。分化的标记物的非限制性实例包括表达诱导细胞死亡的DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶（II deiodinaie）、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4。
在一些实施方式中，所述方法包括通过在4℃-25C下1小时后在标准条件下（37℃，5%CO2或缺氧（低氧）条件）培养的日循环过程中培养或分化细胞从而将细胞暴露于冷冲击（cold shock）。
在一些实施方式中，该方法包括在分化培养基中维持后评价脂肪形成的水平。可以通过测量例如脂质蓄积（例如使用油红-o（ORO）染色）、细胞形态（例如使用视觉（例如显微镜）检查细胞）、或细胞热力学（例如细胞色素氧化酶的活性、Na+-K+-ATPase酶单位、或参与棕色脂肪细胞产热的其他酶）来评价脂肪形成。另外，在一些实施方式中，可以通过脂肪酸摄取试验或耗氧率来测定分化后的功能性棕色脂肪的脂肪形成。
进一步处理方法
在一些实施方式中，如本文所述获得的细胞在给予至受试者体内之前可以经历额外的处理。在某些实施方式中，如本文所述获得的细胞可以重组修饰以表达一种或多种基因，例如参与棕色脂肪形成的基因。例如，在给予至受试者体内之前，可以使用一种或多种编码DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4或这些基因的组合的核酸来转染细胞。
在其他实施方式中，所述细胞可以是从非多能细胞人工衍生的（例如分化或部分分化的）多能干细胞。例如，皮肤细胞（如真皮成纤维细胞）可以通过使用OCT4、Nanog或SSEA-4转染而重编程为多能状态。此类细胞在本领域中被称为诱导性多能干细胞。在其他实施方式中，所述细胞在通过使用一种或多种编码DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4或这些基因的组合（即PPARG2、CEBPB、PRDM16）的核酸转染而变成多能之后，可以进一步被操作。
在进一步的实施方式中，在给予至受试者体内之前，可以有丝分裂地失活细胞。不希望受到理论的束缚，认为一旦向受试者给予，如本文所述获得和/或处理的细胞即表达可以对周围细胞和组织具有旁分泌作用的某些因子。因此，有丝分裂失活防止进一步的细胞分裂，同时使失活的细胞维持旁分泌作用。在某些实施方式中，使用化学品或伽马射线处理细胞足以有丝分裂（mitotically）失活所述细胞。
在一些实施方式中，可以由本文所述的细胞制备细胞提取物或裂解物，并且给予至受试者中。例如，细胞可以被获得并培养，可以收集约106至约1010个细胞，并且使用已知的方法将其用来制备不含细胞的提取物。在一个示例性的方法中，通过使用乙醇/干冰浴将收集的细胞经历冻融循环（例如，1、2、3、4、5或更多次的冻融循环）来制备提取物。然后将提取物离心（例如，约14,000rpm）以去除不溶性物质。然后可以将该提取物给予至受试者中。
表达方法
在某些实施方式中，本文所述的细胞可以被重组修饰以表达一种或多种基因。此类核酸可以被并入到表达载体中。包含本文所述的核酸序列的表达载体可以以任何有效的载体来给予，例如能够在体内有效地将组分基因递送到细胞的任何制剂（formulation）或组合物。途径包括将基因插入到病毒载体中，包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺-相关病毒（adeno-associated virus）、慢病毒、痘病毒、甲病毒、和单纯性疱疹病毒-1、或重组细菌或真核质粒。病毒载体直接转染细胞；质粒DNA可以祼露地递送或在例如阳离子脂质体（阳离子脂质体（lipofectamine））或衍生化的（例如，抗体结合的）、多聚赖氨酸结合物、短杆菌肽S、人工病毒包膜或其他此类细胞内载体的协助下递送，以及直接注射基因构建体或在体内进行CaPO4沉淀。
在一些实施方式中，所述表达载体是含有一种或多种核酸序列（例如，cDNA）的病毒载体。可以将逆转录病毒载体用作重组基因递送系统以在体内转移外源基因，特别是进入人体中，这是本领域技术人员已知的。（用于产生重组逆转录病毒的方案以及用于在体外或体内使用此类病毒感染细胞的方案可以在Ausubel,et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associates(1989),Sections9.10-9.14以及其他标准实验室手册中找到。可用于本方法中的另一种病毒基因递送系统使用了腺病毒衍生。可用于递送核酸的又一种病毒载体系统是本领域技术人员已知的腺-相关病毒（AAV）。
除了如上述那些病毒转移方法之外，还可以采用非病毒方法将核酸表达到本文所述的细胞内。典型地，基因转移的非病毒方法依赖于哺乳动物细胞为摄取和胞内运输大分子而使用的常态机制（normal mechanism）。在一些实施方式中，非病毒基因递送系统可以依赖靶细胞为摄取标的基因（subject gene）的内吞途径。这种类型的示例性基因递送系统包括脂质体衍生的系统、多阳离子结合物（如多胺和多聚赖氨酸）和人工病毒包膜。其他实施方式包括本领域技术人员已知的质粒注射系统。其他非病毒载体包括基于支架/基质附着区（S/MAR）的载体。在特定实施方式中，使用S/MAR-PRDM16构建体、S/MAR-BMP-7/PRDM16构建体、S/MAR-BMP-7构建体转染本文所述的细胞。在另一个实施方式中，使用含有一种或多种编码DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4或这些基因的组合或它们的组合（即PPARG2、CEBPB、PRDM16）的核酸的S/MAR构建体来转染所述细胞。
在一些实施方式中，可以使用本领域技术人员已知的裸DNA构建体和/或基于DNA载体的构建体来表达核酸。在一些实施方式中，可以通过常规转化或转染技术来将DNA载体导入到靶细胞中。本文中使用的术语“转化”和“转染”意在指代用于将外源核酸（如DNA）导入到靶细胞中的各种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、电穿孔、基因枪、声孔效应（声致穿孔，sonoporation）或磁性转染（magnetofection）。
产生本文所述的表达构建体所需要的所有分子生物学技术都是本领域技术人员所理解的标准技术。
给予方法
本文所述的方法可以包括将组织或细胞（如本文所述而获得或分离的细胞）移植到待治疗的受试者体内。所述细胞可以是分化的棕色脂肪细胞（例如，如本文所述的生产的分离棕色脂肪细胞或分化脂肪细胞），或者可以是干细胞或未分化的细胞（这些细胞或它们的子代（如子代细胞）在移植后会分化为棕色脂肪细胞）。这些方法是有用的，例如用于改变如本文所述的受试者中的代谢。
在给予至受试者之前，在移植之前可以洗涤（例如在等渗PBS中）所述细胞以去除任何污染物，包括组织样品、培养基或分化培养基的污染组分。所需的细胞数是可变的并且依赖于各种因素，包括但不限于所使用的细胞类型、细胞的植入部位（例如，可以使用的细胞数量可受到植入的解剖部位的限制）、以及受试者的年龄、表面面积和临床状态。在一些实施方式中，向受试者中植入至少约105、106、107、108、109或约1010个细胞。
用于将细胞移植入受试者中的方法为本领域技术人员所熟知，例如使用配置以允许向受试者中导入细胞的递送系统。一般而言，所述递送系统可以包括含有细胞的储库（reservoir）和与该储库流体连通的针。此类递送系统也处于本发明的范围内。一般地，此类递送系统以无菌方式保存。可以使用各种给予途径和各种部位（例如，肾包膜下（renal sub capsular）、皮下、中枢神经系统（包括鞘内）、血管内、肝内、内脏内、腹膜内（包括网膜内）、肌内植入）。
所述细胞可以是处于药学上可接受的载体中，具有或不具有支架（scaffold）、基质或该细胞可以附着的其他可植入装置（实例包括由例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶以及它们的组合制成的载体）。起初，将1,000,000个细胞接种于多孔胞外支架上并且培养5天。通过添加DMEM（低葡萄糖，不含酚红）来引发向棕色脂肪细胞的分化，所述DMEM含有：
10%人血小板裂解液；
1X NEAA；lX Glutamax；
1X庆大霉素；
1000单位肝素；
0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、
125nM吲哚美辛、
5μM地塞米松、
850nM胰岛素、
1nM T3、
1μM罗格列酮。
并且在这种培养基中将细胞生长2天，然后在由下述组成的培养基中进一步分化额外的18天：
DMEM（低葡萄糖，不含酚红）；
10%人血小板裂解液；
1X NEAA；1X Glutamax；
1X庆大霉素；
1000单位肝素；0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、
125nM吲哚美辛、
5μM地塞米松、
850nM胰岛素、
1nM T3、
1μM罗格列酮、
20nM FNDC5。
扫描电子显微术显示使用支架植入的细胞附着到该支架上。进一步测量细胞对脂肪酸的摄取（吸收），显示该细胞是代谢活跃的。
在特定情况下，将所述细胞植入到受试者中的白色脂肪或棕色脂肪中，和/或植入到含有白色脂肪或棕色脂肪的解剖区域中或其附近。
在使用非免疫学相容细胞的情况下（例如，在向受试者给予非自体细胞时），能够以足以达到抑制细胞的排斥的剂量向受试者给予免疫抑制化合物（例如药物或抗体）。免疫抑制药物的剂量范围为本领域所已知的。剂量值可以根据因素（如个体的病状、年龄、性别和体重）而变化。
受试者
本文所描述的方法和组合物可用于治疗代谢紊乱。一般地，该方法包括向需要其的受试者给予有效量的本文所述的细胞，所述需要其的受试者包括已经被诊断为需要这种治疗的受试者。受试者可以包括哺乳动物。
在一些实施方式中，所述方法包括鉴别需要治疗的受试者（例如，患有代谢紊乱或具有产生代谢紊乱风险的受试者），和向该受试者给予有效量的本文所述的组织或细胞。在某些情况下，所述受试者被诊断为超重或肥胖的受试者（例如身体质量指数（BMI）为25-29或30或更高的受试者）或患有体重相关疾病的受试者。需要以本文所述的方法进行治疗的受试者可以基于受试者的体重或身体质量指数进行选择。在一些实施方式中，所述方法包括评价受试者如下的一种或多种：体重、脂肪组织储存、脂肪组织形态、胰岛素水平、胰岛素代谢、葡萄糖水平、产热能力以及冷敏感性。在一些实施方式中，受试者选择可以包括评价受试者中棕色脂肪组织的量或活性并且记录这些观测（结果）。
所述评价可以在给予本文所述的细胞之前、过程中和/或之后进行。例如，所述评价可以在给予本文所述的细胞之前和/或之后的至少1天、2天、4、7、14、21、30或更多天进行。
新陈代谢和代谢紊乱
新陈代谢是调节机制的化学反应的级联，通过这种机制，活有机体调节、维持和响应影响它们维持、生长和繁殖的内在和外在因素。这种代谢活性的不平衡会引起下游细胞事件，所述事件会引起许多退行性疾病。此类疾病能够带来的不仅是一系列疾病的症状，并且可能干扰雄性和雌性生殖细胞的印迹模式（imprinting pattern）的正常甲基化，从而在新一代建立了退行性疾病的遗传倾向性。
在某些实施方式中，向受试者给予本文所述的组织或细胞以改变（例如提高）受试者中的代谢活性。在某些实施方式中，所述受试者患有例如但不限于肥胖、骨关节炎、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病、中风、肾衰竭、瘤形成或心气虚（如缺血性心脏病）的疾病。在特定情况下，给予本文所述的细胞治疗所述疾病。
在其他实施方式中，可以筛选受试者的脂肪形成标记物水平，如DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4和/或BMP7，并且所述信息用作肥胖、高血压、糖尿病或缺血性心脏病的诊断工具。例如，可以从受试者获得脂肪组织样品或血液样品，并且可以测量所述样品中的DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子（PGC）-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4和/或BMP7的水平。DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4和/或BMP7的水平低于预定水平，表明该受试者患有代谢紊乱（如肥胖、高血压、糖尿病或缺血性心肌病）或者具有产生代谢紊乱（如肥胖、高血压、糖尿病或缺血性心肌病）的风险。所述预定水平可以是在来自未患有代谢紊乱的受试者的相应样品中标记物的水平。在又一个实施方式中，可以例如使用PET扫描来测量受试者中棕色脂肪和白色脂肪的水平，并且可以确定棕色脂肪与白色脂肪的比率。棕色脂肪与白色脂肪的比率小于预定水平，可能表明该受试者患有代谢紊乱（如肥胖、高血压、糖尿病或缺血性心肌病）或具有产生代谢紊乱（如肥胖、高血压、糖尿病或缺血性心肌病）的风险。
筛选脂肪形成化合物的方法
如本文所述的分离的或培养的细胞可以用来筛选改变（例如增加或降低）代谢活性的化合物。在一些实施方式中，可以使细胞（例如棕色脂肪细胞祖细胞、分化细胞或干细胞）与测试化合物接触，并且可以测量脂肪形成的标记物，例如本文所述的标记物（例如，PRDM16、BMP7、UCP1或MYF5）的水平。相对于未与该测试化合物接触的细胞，该测试化合物增加了脂肪形成标记物的水平，则该测试化合物被鉴别为提高代谢活性的化合物，而减少脂肪形成标记物的测试化合物则被鉴别为降低代谢活性的化合物。在另一个实施方式中，所述细胞是白色脂肪细胞，并且在DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4或它们的组合的控制下，使用表达报告基因（即GFP、荧光素酶）的构建体对所述细胞进行转染。相对于未与该测试化合物接触的细胞，将提高了脂肪形成标记物的水平的测试化合物鉴别为提高代谢活性的化合物，而将减少了脂肪形成标记物的测试化合物鉴别为降低代谢活性的化合物。
在一个示例性方法中，在诱导型启动子的控制下，使用包含编码DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4、BMP7、MYF5或它们的组合的核酸的表达载体转染本文所述的细胞。此类启动子的非限制性实例包括化学调节的启动子（即四环素、类固醇和金属）、或在允许的温度下（例如低于受试者的正常体温）会激活并启动表达的温度特异性启动子。
在一个实例中，将温度特异性启动子置于病毒或非病毒载体中编码DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4或它们的组合、MYF5和/或BMP7的核酸的上游。用所述载体转染从脂肪组织（白色或棕色）、骨髓、皮肤、肌肉或脐带分离的细胞。然后在存在或不存在测试化合物下在允许的温度（其允许从启动子的基因表达）下培养所述细胞，并且测定该测试化合物对脂肪形成的影响。
测试化合物包括例如蛋白质（包括抗体）、突变型蛋白、多核苷酸、核酸适体、激素（即鸢尾素（Irisin））以及肽和非肽小有机分子。测试化合物可以自天然来源分离、合成制备或重组制备、或它们的任意组合。测试化合物的特定非限制性实例包括2,4-二硝基苯酚、麻黄碱、西布曲明、FGF21、胆汁酸、和β-3肾上腺素能受体激动剂。
本文所提及的所有公开出版物、专利申请、专利以及其他参考文献都通过引用整体并入本文。另外，所述材料、方法和实例都仅是示例性的，并不旨在限制。除非另有定义，本文所所使用的所有技术和科学术语都具有相同于本发明所属技领域的普通技术人员通常所理解的含义。本文描述了适合的方法和材料，但是类似于或等同于本文所述的方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用。
通过下列实施例进一步说明了本公开内容。所述实施例仅以例示性目的而提供。它们不应以任何方式解释为限制本公开的范围或内容。
实施例
实施例1-棕色脂肪分离处理
在一个实施例中，患者首先经历18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)PET-CT扫描以鉴别棕色脂肪沉着体。在经历该PET-CT扫描之前，每天将该患者暴露在1℃-25℃的温度范围（以增加对18F-FDG的摄取）下1-2个小时，经历一个月的时间。使用针，对在颈-锁骨上和纵隔区域中识别的沉着体进行活组织检查。将棕色脂肪活检组织在DPBS(-)中洗涤三次，并且在37℃下使用0.075%-0.2%1A型胶原蛋白酶剧烈震荡30-60分钟进行处理或者使用EDTA处理30分钟并且经受5-30分钟的机械组织破坏。使用DPBS(-)将组织/细胞洗涤三次，并且将1x106～1x1010个细胞注射到该患者的白色脂肪沉着体中。可选地，在酶法或机械组织/细胞分离后，在注射之前将该组织/细胞暴露到冷温（0℃-4℃）下1～48小时。
实施例2-棕色脂肪培养
在该实施例中，在注射到患者体内之前，对细胞进行培养。将从实施例1获得的细胞以1000细胞/cm2的浓度接种（plate）到超级烧瓶（hyperflask）的培养基中，在本实施方式中，该培养基包含：
DMEM，低葡萄糖，不含酚红；
0.5-20%人血小板裂解液；
1X NEAA；
1X Glutamax；
1X庆大霉素；
1000单位肝素。
将所述细胞培养3～6周。然后使用流式细胞仪对所述细胞进行表征，并且分析其对一种或多种下列标记物的表达：SCA-1、CD34、SSEA1、SSEA4、OCT4、CD31、Wnt5a、端粒酶（telomerase）活性、α-SMA、STRO-1、MYF5、PRDM16或UCP1。然后将所述细胞扩增到1x106～1x1010的浓度以植入到患者的白色脂肪沉着体中。
实施例3-细胞向棕色脂肪细胞的分化
在本实施例中，使获自于患者的棕色脂肪沉着体的细胞（如干细胞或前体棕色脂肪细胞）分化，然后注射到患者体内。将从实施例1获得的细胞以1000细胞/cm2接种于含有分化培养基的超级烧瓶中，在本实施方式中，该分化培养基包含：
DMEM，低葡萄糖，不含酚红；
0.5-20%人血小板裂解液；
1X NEAA；
1X Glutamax；
1X庆大霉素；
1000单位肝素；
10μg/mL胰岛素；
1μM地塞米松；
200μM吲哚美辛；
0.5mM异丁基甲基黄嘌呤；
在可替换的实施方式中，所述分化培养基包括：
DMEM（低葡萄糖，不含酚红）；
0.5%-20%人血小板裂解液；
1X NEAA；1X Glutamax；
1X庆大霉素；
1000单位肝素；
0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、
125nM吲哚美辛、
5μM地塞米松、
850nM胰岛素、
1nM T3、
1μM罗格列酮。
并且使所述细胞在这种培养基中生长2-6天，随后在由下列组成的培养基中进一步分化额外的6-21天：
DMEM（低葡萄糖，不含酚红）；
0.5%-20%人血小板裂解液；
1X NEAA；1X Glutamax；
1X庆大霉素；
1000单位肝素；0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、
125nM吲哚美辛、
5μM地塞米松、
850nM胰岛素、
1nM T3、
1μM罗格列酮、
20nM FNDC5。
在所述分化培养基中保持10-30天后，通过DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4的表达来对细胞进行表征。然后制备1x106～1x l010个细胞以用于注射到患者体内。
实施例4-培养和分化胚胎干细胞
在本实施例中，首先生长并扩增临床级胚胎干细胞。在一个实施方式中，然后通过使所述细胞暴露于下列培养基而将所述细胞分化为棕色脂肪前脂肪细胞（pre-adipocyte）或完全分化的棕色脂肪的脂肪细胞：
DMEM，低葡萄糖，不含酚红；
0.5-20%人血小板裂解液
1X NEAA；
1X Glutamax；
1X庆大霉素；
1000单位肝素；
10μg/mL胰岛素；
1μM地塞米松；
200μM吲哚美辛；
0.5mM异丁基甲基黄嘌呤。
在另一个实施方式中，所述细胞在培养基中生长2-6天，该培养基包含：
DMEM（低葡萄糖，不含酚红）；
0.5%-20%人血小板裂解液；
1X NEAA；
1X Glutamax；
1X庆大霉素；
1000单位肝素；
0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、
125nM吲哚美辛、
5μM地塞米松、
850nM胰岛素、
1nM T3、
1μM罗格列酮。
然后，将其在由以下组成的培养基中进一步分化额外的6-21天：
DMEM（低葡萄糖，不含酚红）；
0.5%-20%人血小板裂解液；
1X NEAA；
1X Glutamax；
1X庆大霉素；
1000单位肝素；
0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、
125nM吲哚美辛、
5μM地塞米松、850nM胰岛素、
1nM T3、
1μM罗格列酮、
20nM FNDC5。
可选地，在分化之前或在分化之后，使用非病毒载体（支架/基质附着区（S/MAR））转染所述细胞，该非病毒载体具有单独PRDM-16基因或者还级联（in tandem）有BMP-7或MYF-5或DFF45-样效应子A（CIDEA）、II型脱碘酶、PPARγ共激活子(PGC)-lα、PGC-1β、解偶联蛋白（例如UCP1）、PRDM16或CIG30、PRDM-16、CYC1、NDUFA11、NDUFA13、CMT1A、ELOVL3、DIO2、LHX8、COX8A、CYFIP2、Cox8b、Glut4或它们的组合，其由强启动子（如CAGGS或PGK）驱动。然后使用基于化学的方法（例如丝裂霉素C）或γ辐射将所述细胞灭活，并且以lxl06～1xl010个细胞的浓度植入到患者体内。
实施例5-人类棕色脂肪库活组织检查
在本实施例中，患者经历l8F-PET-CT扫描以鉴别具有代谢活性的组织。在患者的人纵隔区中鉴别出具有高代谢活性的区域。此外，该患者将接受常规心胸外科手术。在外科手术时，暴露出所述区域，并且在该区域中解剖出5x5cm棕色脂肪库并且将其置于无菌盐水中。
在纵隔中发现了含有干细胞群的棕色脂肪库，所述干细胞表达独特的标记物，这种标记物不同于在其他干细胞（包括从白色脂肪库中分离的干细胞）中发现的标记物。从所述纵隔棕色脂肪库中分离这些新鉴别的干细胞并且进行多于20次传代培养，它们仍然保留正常核型。这些细胞也能够进行脂肪形成（白色或棕色）、成骨作用和软骨形成。
实施例6–来自人类棕色脂肪库活组织检查的细胞的分离
在无菌盐水中将在实施例5中分离的人类棕色脂肪库洗涤5～10次。使用剪刀将该活检组织切碎，直到碎片的尺寸为约0.1～0.5cm。通过在1200RPM下离心5分钟以将所述材料洗涤3次。然后，在设置为37℃的振荡水浴中使用胶原酶或分散酶消化所述材料不超过一个小时。在完成消化后，通过添加等体积的完全培养基终止该酶促反应。然后使用100μM的过滤器（filter）过滤该材料，并且使用完全培养基将单细胞悬浮液洗涤3次。
实施例7-分离人类自棕色脂肪库活组织检查的细胞的培养
以5,000-10,000细胞/cm2的浓度将实施例6中描述的单细胞悬浮液（single cell suspension）接种在细胞培养烧瓶中。在约3-6天之后，所述细胞即准备传代（图2）。在经历大于10次传代后，所述细胞显示正常核型。该培养的棕色脂肪细胞的RT-PCR分析表明，它们对CEBPB、UCP-1、UCP-2、PPARG、PGC-1、PRDM-16呈阳性。重要的是要注意到分离自白色脂肪库的细胞对PRDM-16和PGC-1呈阴性（图3）。相应地，可以使用PRDM-16和/或PGC-1的表达来区分白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞。另外，CEBPB、UCP-1、UCP-2、PPARG、PGC-1、PRDM-16可以用作鉴别棕色脂肪细胞的标记物。
所述细胞的染色显示它们对于干细胞标记物HCAM和CD90是阳性的（图4A和图4B）。所扩增的细胞也表达外来体（exosome）（图9）。该细胞群的流式细胞术表明所述细胞对于下列细胞表达标记物是阴性的：CD34、CD19、CD86、HLA DR、Lin、CD106、CD80、CD117。该细胞群对于SSEA4和Stro-1也较低。该细胞对CD63、CD90、HLA ABC、CD105、CD73、CD166、CD9、CD44是阳性的（图5A-5F），它们是未分化的棕色脂肪干细胞的标记物。
实施例8-细胞向脂肪（白色和棕色）的分化
将扩增的细胞接种到细胞培养板（cell culture plate）上，并且补充有成脂分化培养基（成脂诱导分化培养基，adipogenic differentiation medium）（Life Technologies）。每3天换一次培养基，并且使分化连续进行14天。在诱导培养基中7天后，在培养物中可见到脂肪滴（图6），表明所述细胞已经开始分化为脂肪细胞。
使用油红O的染色显示积极分化（positive differentiation）成脂肪细胞（图7）。
通过小脂肪滴的堆积（图7B）观察了分化中阳性棕色脂肪滴的鉴别，与在源自白色脂肪库的细胞所分化的细胞中发现的堆积相比，其产生更大的脂肪滴（图7A）。
在另一个实施方式中，以50,000细胞/孔的密度将干细胞接种于6-孔皿中。加入白色或棕色脂肪形成分化培养基。对于棕色脂肪形成，如先前所述的，在诱导后6天加入FNDC5。使用0.3%油红O（Sigma Aldrich）进行染色以检测细胞内脂质积聚。
实施例9-细胞的软骨形成诱导和成骨诱导
将扩增的细胞接种到细胞培养板上，并且补充成骨和软骨形成培养基（Life Technologies）。每3天换一次培养基并且使分化连续进行21天。通过使用茜素红（alizarian red）或骨钙素（osteocalcin）抗体和阿辛蓝对细胞染色来观察确认向软骨细胞和成骨细胞的分化（图8A和图8B）。这些数据表明，除了分化为白色脂肪或棕色脂肪之外，从棕色脂肪库中分离的祖细胞还保持了分化为多种细胞类型的能力。
实施例10-棕色脂肪祖细胞的治疗用途
NOD-SCID小鼠有严重免疫缺陷，将其用作测试以人类细胞为基础的治疗的模型体系。在整个测试期间，以高脂肪/高糖饲料喂养小鼠。将小鼠分为两组：10只未治疗的小鼠用作对照，以及10只小鼠在背部皮肤下部接受单次皮下注射约1百万个如实施例5-9中所述培养的人类棕色脂肪祖细胞。在注射后，对下列分析物进行为期四个月的测量：血浆葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、瘦素和脂肪（adipon）。并且还监测了体重。基线在对照组中为23+/-5g，在治疗组中为23+/-7g。对照组接受不具有细胞的载体溶液（DPBS）的假注射（sham injection）。
与接受不具有细胞而仅为载体溶液（DPBS）的假注射的对照组相比，接受了1,000,000个细胞剂量的实验群组显示，在四个月的监测期，降低了血浆葡萄糖、甘油三酯、胆固醇和体重增加。脂联素（adiponectin）和瘦素水平也与由于已经接受到所述细胞剂量所带来的改善水平相关。这与接受假载体溶液的未治疗对照小鼠相比，形成了鲜明的对比（图10-12）。
等同物
应当理解的是，虽然已经结合本发明的详细说明对本公开内容进行了描述，但是以上描述旨在例示，而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求的范围来界定。其他方面、优点和变型都在以下权利要求的范围内。
Claims (21)
1.一种产生干细胞的方法，包括：
获得棕色脂肪组织；
从所述棕色脂肪组织中分离干细胞；以及
在不含动物产品的培养基中培养所述干细胞，
从而产生干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述棕色脂肪组织来自于从受试者获得的样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞对于下列细胞表面标记物中的一种或多种是阳性的：CD63、CD90、HLA ABC、CD105、CD73、CD166、CD9、CD44。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞对于下列细胞表面标记物中的一种或多种是阴性的：CD34、CD19、CD86、HLA DR、Lin、CD106、CD80、CD117。
5.一种在受试者中治疗代谢紊乱的方法，包括：
从供体中取出干细胞；
在不含动物产品的培养基中将所述干细胞分化为棕色脂肪细胞；以及
将所述棕色脂肪细胞给予至所述受试者体内的脂肪沉着体，
从而在所述受试者中治疗所述代谢紊乱。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述代谢紊乱选自由肥胖、向心性肥胖、糖尿病、高血压症、心气虚、缺血性心脏病、高血压、甘油三酯血脂异常、HDL血脂异常、胆固醇血脂异常、空腹血糖升高、瘦素调节异常和脂肪调节异常组成的组。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述棕色脂肪细胞是通过皮下注射来给予的。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述棕色脂肪细胞是通过系统性注射来给予的。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述培养基含有选自由胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛组成的组的分化剂。
10.一种在受试者中治疗肥胖的方法，包括：
从受试者中取出棕色脂肪；以及
将所述棕色脂肪给予至所述受试者体内的脂肪沉着体，
从而在所述受试者中治疗肥胖。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述脂肪沉着体是白色脂肪沉着体。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述脂肪沉着体是棕色脂肪沉着体。
13.一种鉴别参与代谢调节的化合物的方法，包括：
从棕色脂肪组织中分离干细胞；
在不含动物产品的培养基中培养所述干细胞；
使所述干细胞与测试化合物接触；
测定存在所述测试化合物的情况下所述干细胞的代谢活性水平；以及
将存在所述测试化合物的情况下所述干细胞的代谢活性水平与不存在所述测试化合物的情况下所述干细胞的代谢活性水平进行比较，
其中，存在所述测试化合物的情况下代谢活性水平不同于不存在所述测试化合物的情况下代谢活性水平，这鉴别出所述测试化合物为参与代谢调节的化合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述测定包括测量脂肪形成。
15.根据权利要求14所述的方法，包括检测PRDM16、BMP7、UCP1、UCP2或MYF5中的一种或多种的水平。
16.根据权利要求13所述的方法，其中，所述测试化合物选自由蛋白质、抗体、肽、突变型蛋白、多核苷酸、核酸适体和小分子组成的组。
17.一种将干细胞分化为棕色脂肪细胞的方法，所述方法包括：
使干细胞与不含动物产品的培养基接触，从而产生棕色脂肪干细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述培养基包含选自由胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤、吲哚美辛、T3、罗格列酮、FNDC5和它们的组合所组成的组的试剂。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述培养基包含胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述棕色脂肪干细胞表达PRDM-16、PGC-1或它们的组合。
21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述棕色脂肪组织来自于从受试者获得的样品。
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