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CN113631713A - 酵母中的同时多重基因组编辑 - Google Patents

酵母中的同时多重基因组编辑 Download PDF

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CN113631713A
CN113631713A CN202080024485.1A CN202080024485A CN113631713A CN 113631713 A CN113631713 A CN 113631713A CN 202080024485 A CN202080024485 A CN 202080024485A CN 113631713 A CN113631713 A CN 113631713A
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田天
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Abstract

本公开内容提供了用于编辑活酵母细胞中的核酸的物质组合物、方法和仪器。

Description

酵母中的同时多重基因组编辑
相关案例
本国际PCT申请要求2019年3月25日提交的USSN 62/823,136；2019年7月9日提交的USSN 62/871,879；和2020年1月13日提交的USSN 62/960,291的优先权。
发明领域
本发明涉及用于活酵母细胞的核酸指导的核酸酶编辑的物质组合物、方法和仪器。
发明背景
在以下讨论中，将出于背景和简介的目的描述某些物品和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的方法不构成现有技术的权利。
对活细胞的基因组进行精确的、靶向的改变的能力一直是生物医学研究和开发的长期目标。最近已经鉴定出允许操纵基因序列并从而操纵基因功能的各种核酸酶。核酸酶包括核酸指导的核酸酶，其使研究人员能够在活细胞中产生永久性编辑。编辑效率通常与细胞中的指导RNA(gRNA)的表达水平有关。即，gRNA的表达水平越高，编辑效率越好。此外，真核生物中的编辑效率也与位于细胞核中的gRNA相关；即，为了发生有效的编辑，gRNA必须留在细胞核中以指导编辑，而不是从细胞核输出到细胞质。此外，期望使编辑轮的数量最小化，同时获得细胞基因组中的大量编辑；然而，许多现有编辑系统的架构(architecture)只允许每轮一个编辑。
因此，在核酸指导的核酸酶基因编辑领域中，对于用于增强gRNA转录和核定位的改进方法、以及用于同时组合编辑的方法和组合物存在需求。本发明满足此需求。
发明概述
提供本概述是为了以简化的形式介绍概念选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。本概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。从以下撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求书中限定的那些方面，所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将是明显的。
本公开内容涉及用于同时对酵母基因组进行若干编辑的方法和组合物，以及被配置为利用该组合物执行该方法的模块和自动化多模块细胞处理仪器。
在酵母，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae)中，gRNA表达系统可以使用RNA聚合酶III(pol III)或RNA聚合酶II(pol II)启动子来驱动转录。与polII启动子相比，酵母中pol III启动子的可用数量有限。一般来说，pol III启动子具有的表达水平比pol II启动子低，并且pol II启动子比pol III启动子更能耐受序列变异，这允许序列灵活性增加。在多重化基因编辑系统(multiplexed gene editing system)中，gRNA的表达水平是编辑效率和功效的关键因素。pol II启动子通常表达随后多腺苷酸化的gRNA，标志转录物进行核输出；然而，为了在基因编辑系统中使用pol II gRNA表达，由pol II启动子表达的gRNA必须保留在细胞核中。为了在由pol II启动子表达后完成gRNA核定位，在gRNA转录物的3’末端添加自裂解核酶。这种自裂解核酶将多A核输出标签裂解下来。在一些实施方案中，自裂解核酶也被添加到转录物的5’，以将转录后添加的5’帽裂解下来，所述5’帽在存在时也有助于介导mRNA的核输出。
因此，在一种实施方案中，提供了用于在酵母中进行RNA指导的核酸酶编辑的含核酶的编辑盒，所述编辑盒从5’至3’包含：pol II启动子、转录起始位点、gRNA的编码序列、供体DNA的编码序列、自裂解核酶的编码序列，和pol II终止子；或者pol II启动子、转录起始位点、供体DNA的编码序列、gRNA的编码序列、自裂解核酶的编码序列，和pol II终止子。即，本发明的含核酶的编辑盒关于gRNA和供体DNA编码序列在含核酶的编辑盒中的顺序是不可知的。
此外，在优选的方面，含核酶的编辑盒包含与载体骨架具有同源性的区域，用于将含核酶的编辑盒经缺口修复插入到载体骨架中。
此外，在一些方面，含核酶的编辑盒还包含转录起始位点3’的第二自裂解核酶。
在该实施方案的一些方面，含核酶的编辑盒的自裂解核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)样核酶家族中的自裂解核酶、葡糖胺-6-磷酸合酶核酶家族中的自裂解核酶、锤头核酶家族中的自裂解核酶、发夹核酶家族中的自裂解核酶、脉孢菌(Neurospora)Varkud卫星核酶家族中的自裂解核酶、twister核酶家族中的自裂解核酶、twister sister核酶家族中的自裂解核酶、hatchet核酶家族中的自裂解核酶或pistol核酶家族中的自裂解核酶。此外，在该实施方案的一些方面，存在第二自裂解核酶序列，所述第二自裂解核酶序列位于转录起始位点的3’和编辑盒的核酸指导的编辑组分(例如，gRNA或供体DNA)的第一编码序列的5’。
此外，在一些实施方案中，组合物的pol II启动子是细胞类型特异性启动子、组织特异性启动子或合成启动子。在一些方面，pol II启动子是组成型真菌启动子，并且在一些方面，组成型真菌pol II启动子选自pPGK1、pTDH3、pENO2、pADH1、pTPI1、pTEF1、pTEF2、pYEF3、pRPL3、pRPL15A、pRPL4、pRPL8B、pSSA1、pSSB1或pPDA1启动子。在又其他方面，pol II启动子可以是组成型哺乳动物启动子，诸如pCMV、pEF1a、pSV40、pPGK1、pUbc、人类β肌动蛋白启动子或pCAG启动子。可选地，pol II启动子可以是诱导型启动子，诸如PHO5启动子、MET3启动子、CUP1启动子、GAL1启动子或者GEV或LEV启动子系统。
又其他实施方案提供了一种在酵母细胞中进行RNA指导的核酸酶编辑的方法，所述方法包括以下步骤：设计和合成含核酶的编辑盒，其中所述含核酶的编辑盒从5’至3’包含：1)pol II启动子、转录起始位点、gRNA的编码序列、供体DNA的编码序列、自裂解核酶的编码序列，和pol II终止子，或2)pol II启动子、转录起始位点、供体DNA的编码序列、gRNA的编码序列、自裂解核酶的编码序列，和pol II终止子；扩增合成的含核酶的编辑盒；用含核酶的编辑盒和载体骨架转化酵母细胞；选择转化的酵母细胞；提供用于RNA指导的核酸酶编辑的条件；并在研究中使用编辑的酵母细胞。
在该方法的一些方面，在第二提供步骤(例如，提供用于RNA指导的核酸酶编辑的条件)之后，进行第二选择步骤，从而选择编辑的细胞；并且在该方法的一些方面，重复设计、扩增、第一提供、转化、第一选择、第二提供和第二选择步骤，直到对酵母细胞进行了期望数量的编辑。
在其他实施方案中，提供了用于在酵母中进行RNA指导的核酸酶编辑的含双重核酶的编辑盒，所述编辑盒从5’至3’包含：pol II启动子；转录起始位点；第一编辑盒，其中所述编辑盒包含第一gRNA的编码序列和第一供体DNA的编码序列，并且其中所述第一供体DNA包含对第一靶序列的合理的期望编辑和被配置为使第一靶序列中的前间区基序(PAM)失活的编辑；接头或间隔物(勿与前间区基序(PAM)混淆)；第二编辑盒(例如，这里是含核酶的编辑盒)，其中第二编辑盒包含第二gRNA的编码序列和第二供体DNA的编码序列，其中第二供体DNA包含对第二靶序列的合理的期望编辑和被配置为使第二靶序列中的前间区基序(PAM)失活的编辑、自裂解核酶的编码序列和pol II终止子。
在一些方面，含双重核酶的编辑盒还包含转录起始位点3’的第二自裂解核酶。在一些方面，接头或间隔物是tRNA的编码序列，而在其他方面，接头或间隔物是引物序列。在一些实施方案中，含核酶的编辑盒还包含在第二编辑盒和自裂解核酶的编码序列之间的第二接头或间隔物和第三编辑盒，其中第三编辑盒包含第三gRNA的编码序列和第三供体DNA的编码序列，并且其中第三供体DNA包括对第三靶序列的合理的期望编辑和被配置为使第三靶序列中的前间区基序(PAM)失活的编辑，从而产生含多重核酶的编辑盒。在一些方面，含多重核酶的编辑盒可以包含第四编辑盒、第五编辑盒和甚至第六编辑盒，其中第四编辑盒、第五编辑盒和第六编辑盒各自通过接头或间隔物与其他编辑盒分开。
在一些方面，第一gRNA的编码序列在第一供体DNA的编码序列的5’，而在其他方面，第一gRNA的编码序列在第一供体DNA的编码序列的3’。在一些方面，第二gRNA的编码序列在第二供体DNA的编码序列的5’，而在其他方面，第二gRNA的编码序列在第二供体DNA的编码序列的3’。同样，本发明的含核酶的编辑盒(和编辑盒)关于gRNA和供体DNA编码序列在含核酶的编辑盒中的顺序是不可知的。
在又另一种实施方案中，提供了待转化到酵母细胞中的线性载体骨架的文库和编辑盒或含核酶的编辑盒的文库，包含：第一线性载体骨架，所述第一线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第一抗生素抗性基因的编码序列和2μ复制起点；以及编辑盒或含核酶的编辑盒的文库，其中文库中不同编辑盒或含核酶的编辑盒的gRNA和供体DNA靶向酵母基因组中的不同靶区域，并且其中编辑盒或含核酶的编辑盒的文库与第一线性载体之间存在同源性。
在一些方面，还提供了待转化到酵母细胞中的线性载体骨架的文库和编辑盒或含核酶的编辑盒的文库，包含：第一线性载体骨架，所述第一线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第一抗生素基因的编码序列和2μ复制起点；第二线性载体骨架，所述第二线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第二抗生素抗性基因的编码序列和2μ复制起点；以及编辑盒或含核酶的编辑盒的文库，其中文库中不同编辑盒或含核酶的编辑盒的gRNA和供体DNA靶向酵母基因组中的不同靶区域，并且其中编辑盒或含核酶的编辑盒的文库与第一线性载体和第二线性载体之间存在同源性。
在该实施方案的一些方面，线性载体骨架的文库还包含第三线性载体骨架，所述第三线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第三抗生素抗性基因的编码序列和2μ复制起点；并且在一些方面，线性载体骨架的文库还包含第四线性载体骨架和甚至第五线性载体骨架，所述第四线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第四抗生素抗性基因的编码序列和2μ复制起点，所述第五线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第五抗生素抗性基因的编码序列和2μ复制起点。在一些方面，第一线性载体、第二线性载体、第三线性载体、第四线性载体和第五线性载体各自中的核酸酶的编码序列是相同的编码序列，然而在其他方面，第一线性载体、第二线性载体、第三线性载体、第四线性载体和第五线性载体各自中的核酸酶的编码序列可以是不同的编码序列。
在一些方面，第一抗生素抗性基因赋予对潮霉素的抗性，并且第二抗生素抗性基因赋予对G418的抗性。
在一些方面，每个编辑盒或含核酶的编辑盒包含两个gRNA和两个供体DNA或者三个gRNA和三个供体DNA。
在一些方面，每个线性载体骨架包含定位成驱动编辑盒转录的启动子，诸如polII启动子，并且在一些方面，每个线性载体骨架还包含细菌中有功能的复制起点。即，在一些方面，驱动编辑盒转录的启动子在载体骨架上，而不被包括在编辑盒或含核酶的编辑盒中。
其他实施方案提供了在酵母细胞中进行核酸指导的核酸酶编辑的方法，所述方法包括以下步骤：1)用待转化到酵母细胞中的线性载体骨架的文库和编辑盒或含核酶的编辑盒的文库转化酵母细胞，其中线性载体骨架的文库包含：第一线性载体骨架，所述第一线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第一抗生素抗性基因的编码序列和2μ复制起点；第二线性载体骨架，所述第二线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第二抗生素抗性基因的编码序列和2μ复制起点；以及编辑盒或含核酶的编辑盒的文库，其中每个编辑盒包含gRNA和供体DNA，其中不同盒的gRNA和供体DNA靶向酵母基因组中的不同靶区域，并且其中编辑盒的文库与第一线性载体和第二线性载体之间存在同源性；2)选择对第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因有抗性的酵母细胞；3)允许酵母细胞恢复并发生核酸指导的核酸酶编辑；4)使编辑的酵母细胞生长至稳定期。在酵母细胞已经生长到稳定期后，然后可以汇集细胞并使其为电感受态用于另一轮编辑。在该实施方案的一些方面，酵母细胞可以在转化步骤后被单个化。
又另一种实施方案提供了待转化到酵母细胞中的线性载体骨架的文库和编辑盒或含核酶的编辑盒的文库，包含：第一线性载体骨架，所述第一线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第一抗生素抗性基因的编码序列和2μ复制起点；和第二线性载体骨架，所述第二线性载体骨架包含核酸酶的编码序列、第二抗生素抗性基因的编码序列和2μ复制起点；以及编辑盒或含核酶的编辑盒的文库，其中每个编辑盒或含核酶的编辑盒包含gRNA和供体DNA，其中不同编辑盒或含核酶的编辑盒的gRNA和供体DNA靶向酵母基因组中的不同靶区域，并且其中编辑盒或含核酶的编辑盒的文库与线性载体骨架之间存在同源性。
下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优点。
附图简述
从以下对说明性实施方案的详细描述，结合附图，将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优点，在附图中：
图1A是通过核酸指导的核酸酶编辑来编辑活酵母细胞的示例性方法的简化框图。图1B是用于核酸指导的核酸酶编辑的含核酶的编辑盒的示例性实施方案的图解描绘。图1C是用于核酸指导的核酸酶编辑的含双重核酶的编辑盒的示例性实施方案的图解描绘。图1D是用于编辑酵母基因组的方法的简化图，该方法使用单个载体骨架和编辑盒的文库，并调整转化反应中编辑盒的浓度，以驱动每个细胞形成多于一个编辑载体，从而实现每个细胞每轮两个至多个编辑。图1E是用于使用两个不同的载体骨架、每轮编辑以两个到多个编辑来对酵母基因组进行编辑的替代系统的简化图。图1F是用于进行多重同时核酸指导的核酸酶编辑的载体骨架的示例性图谱。
图2A-图2C描绘了用于使用脱落蛋白质报告物系统(split protein reportersystem)进行核酸指导的核酸酶编辑的示例性自动化多模块细胞处理仪器的三个不同视图。
图3A描绘了用于与本文并且关于图3B-图3D描述的细胞生长模块一起使用的旋转生长瓶的一种实施方案。图3B图示了细胞生长模块壳体中旋转生长瓶的一种实施方案的透视图。图3C描绘了来自图3B的细胞生长模块的剖视图。图3D图示了与LED、检测器和温度调节组件耦合的图3B的细胞生长模块。
图4A描绘了用于切向流过滤模块(例如，细胞生长和/或浓缩模块)中的渗余物(上图)和渗透物(下图)构件，以及组装成切向流组件(下图)的渗余物和渗透物构件。图4B描绘了切向流过滤模块的储库组件的两个侧面透视图。图4C-图4E描绘了示例性的顶部，其具有流体和气动端口以及适合于图4B所示的储库组件的密封垫。
图5A描绘了可以在多模块细胞处理仪器中使用的示例性组合试剂筒和电穿孔装置(例如，转化模块)。图5B是示例性流通式电穿孔装置的一种实施方案的顶部透视图，该装置可以是试剂筒的一部分。图5C描绘了示例性流通式电穿孔装置的一种实施方案的底部透视图，该装置可以是试剂筒的一部分。图5D-图5F描绘了可用于诸如图2A-图2C中所示的多模块自动化细胞处理仪器中的FTEP装置的顶部透视图、横截面的顶部视图和横截面的侧面透视图。
图6A描绘了在固体壁装置中用于使细胞单个化(singulating)、编辑细胞和使细胞标准化的工作流程的简化图。图6B-图6D描绘了固体壁分离培养和标准化(SWIIN)模块的一种实施方案。图6E描绘了图6B-图6D中的SWIIN模块的实施方案，所述SWIIN模块还包括加热器和加热盖。
图7是示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化流程图。
图8是包括用于递归酵母细胞编辑的固体壁单个化/生长/编辑/标准化模块的示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化流程图。
图9是证明采用如关于图3A-图3D描述的细胞生长装置(其中使用了2-桨旋转生长瓶)实时监测酿酒酵母细胞培养物生长至OD600的图。
图10是绘制关于图4A-图4E描述的细胞浓缩装置/模块中处理的酵母培养物的滤液电导率对过滤处理时间的图。
图11是示出了使用如关于图5A-图5F描述的FTEP装置和比较电穿孔方法(comparator electroporation method)对酿酒酵母进行电穿孔的结果的柱状图。
图12示出了用含核酶的编辑盒观察到的多重编辑的结果。
图13示出了在酵母中测试的被靶向于通过含双重核酶的编辑盒进行的编辑的每个基因所获得的编辑率。
图14示出了来自使用单个载体骨架和编辑盒文库同时编辑酿酒酵母基因组中多个基因座的结果。
图15示出了通过跨越不同文库浓度的500成员编辑文库的NextGen测序观察到的独特质粒的数量。
应当理解，附图不必按比例绘制，并且相同的附图标记是指相同的特征。
详细描述
除非明确声明或者特征或功能与另外的实施方案不兼容，否则结合一种实施方案描述的所有功能意在适用于本文描述的另外的实施方案。例如，除非特征或功能与替代实施方案不兼容，否则在结合一种实施方案明确描述给定特征或功能但没有结合替代实施方案明确提及的情况下，应当理解，该特征或功能可以结合替代实施方案来部署、利用或实现。
除非另外指出，否则本文描述的技术的实践可以采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和描述，这些都在本领域的技术人员的技术内。这样常规的技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、以及利用标记物的杂交检测。合适的技术的具体说明可以通过参考本文的实例获得。然而，当然，也可以使用其他等同的常规程序。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册诸如以下：Green等人,编著.(1999),Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(I-IV卷)；Weiner,Gabriel,Stephens,编著.(2007),Genetic Variation:A LaboratoryManual；Dieffenbach,Dveksler,编著.(2003),PCR Primer:A Laboratory Manual；Bowtell和Sambrook(2003),DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual；Mount(2004),Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis；Sambrook和Russell(2006),Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual；以及Sambrook和Russell(2002),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(都来自Cold Spring HarborLaboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(第4版)W.H.Freeman,New YorkN.Y.；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”1984,IRL Press,London；Nelson和Cox(2000),Lehninger,Principles of Biochemistry第3版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Berg等人.(2002)Biochemistry,第5版,W.H.FreemanPub.,New York,N.Y.；所有文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。CRISPR特异性技术可以见于以下：例如，Genome Editing and Engineering from TALENs and CRISPRsto Molecular Surgery,Appasani和Church(2018)；和CRISPR:Methods and Protocols,Lindgren和Charpentier(2015)；两篇文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
注意，除非上下文另外清楚指示，如本文和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“寡核苷酸”是指一个或更多个寡核苷酸，并且提及“自动化系统”包括提及本领域技术人员已知的用于该系统的等同步骤和方法，等等。此外，应当理解，本文可以使用的术语诸如“左”、“右”、“顶”、“底”、“前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“内部(interior)”、“外部(exterior)”、“内(inner)”、“外(outer)”等仅描述参考点，并且不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的方向或配置。此外，术语诸如“第一”、“第二”、“第三”等，仅标识如本文公开的许多部分、组件、步骤、操作、功能和/或参考点中的一个，并且同样不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的配置或方向。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。本文提及的所有出版物出于描述和公开可以与本文描述的发明结合使用的装置、方法和细胞群体的目的通过引用并入。
在提供值的范围情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值和该规定的范围内的任何其他规定的值或中间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限值和下限值可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被涵盖在本发明内，受限于规定的范围内的任何特定地排除的限值。在规定的范围包括限值中的一个或两个的情况下，将那些所包括的限值中的任一个或两个排除的范围也被包括在本发明中。
在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域普通技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下，实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，没有描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。
如本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且特别地是指彼此氢键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“互补性百分比”或“同源性百分比”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，指示序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3'-TCGA-5’与核苷酸序列5'-AGCT-3’是100％互补的；并且核苷酸序列3'-TCGA-5'与核苷酸序列5'-TAGCTG-3'的区域是100％互补的。
术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、核定位序列、增强子等，它们共同地提供编码序列在接受者细胞中的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和(对于一些组分)翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。
如本文使用的，术语“供体DNA”或“供体核酸”或“同源臂”是指被设计成通过使用核酸指导的核酸酶的同源重组将DNA序列修饰(插入、缺失、取代)引入基因座的核酸。对于同源指导的修复，供体DNA必须与基因组靶序列中的“切割位点”或待编辑位点周围的区具有足够的同源性。一条或更多条同源臂的长度将取决于，例如，所做修饰的类型和大小。在许多情况下，并且优选地，供体DNA将与基因组靶基因座具有两个序列同源性区(例如，两个同源臂)。优选地，“插入物(insert)”区或“DNA序列修饰”区(期望引入细胞中的基因组靶基因座的核酸修饰)将位于两个同源区之间。DNA序列修饰可以改变一个特定位点或多于一个特定位点处的靶基因组DNA序列的一个或更多个碱基。改变可以包括改变靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对。缺失或插入可以是靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对的缺失或插入。
术语“编辑盒”是指包含与用于转录供体DNA或同源臂的编码序列共价连接的用于转录指导核酸或gRNA的编码序列的核酸分子。术语“含核酶的编辑盒”是指包含编辑盒和至少一种自裂解核酶的核酸分子。
术语“指导核酸”或“指导RNA”或“gRNA”是指包含以下的多核苷酸：1)能够与基因组靶基因座杂交的指导序列和2)能够与核酸指导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间的序列相似性，或者在本公开内容的上下文中，更常见是指两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区”或“同源臂”是指供体DNA上与靶基因组DNA序列具有一定程度同源性的区域。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述每个序列可以出于比较的目的而被比对。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置数的函数。
“核酸指导的编辑组分”是指按需要，核酸酶、指导核酸、供体核酸和重组系统中的一种、一些或全部。
“可操作地连接”是指其中如此描述的组分被配置为执行其通常功能的元件的布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响编码序列的转录，并且在一些情况下，能够影响编码序列的翻译。只要控制序列发挥指导编码序列的表达的功能，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，不翻译但转录的间插序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必驻留于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有引起调控改变的相互作用。
“PAM突变”是指对靶序列的一个或更多个编辑，所述编辑去除靶序列中的PAM或间隔区、使靶序列中的PAM或间隔区突变或以其他方式使靶序列中的PAM或间隔区失活。
“启动子”或“启动子序列”是能够与RNA聚合酶结合并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核RNA(small nuclear RNA)或核仁小RNA(smallnucleolar RNA)、指导RNA或任何种类的RNA)的转录的DNA调控区。启动子可以是组成型或诱导型的。“pol II启动子”是被RNA聚合酶II结合以催化DNA转录的调节序列。
如本文使用的，“核酶”(核糖核酸酶)是能够催化生物化学反应的RNA分子。“自裂解核酶”是能够自我裂解的核酶。
如本文使用的术语“可选择标记(selectable marker)”是指引入细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的可选择标记为本领域普通技术人员熟知的。可以采用可药物选择的标记，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、诺尔丝菌素N-乙酰基转移酶、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418。在其他实施方案中，可选择标记包括但不限于人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第6,365,373号中描述的)；截短的人类生长因子受体(用MAb检测)；突变体人类二氢叶酸还原酶(DHFR；可得荧光MTX底物)；分泌型碱性磷酸酶(SEAP；可得荧光底物)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿苷的抗性)；人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择性烷化剂白消安缀合；CD34+细胞中的化学保护性可选择标记)；造血干细胞中的CD24细胞表面抗原；赋予对N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)的抗性的人类CAD基因；人类多耐药性-1(MDR-1；通过增加的耐药性可选择或通过FACS富集的P-糖蛋白表面蛋白)；人类CD25(IL-2α；可通过Mab-FITC检测)；甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT；可通过卡莫司汀(carmustine)选择)；鼠李糖；和胞苷脱氨酶(CD；可通过Ara-C选择)。如本文使用的“选择性培养基”是指向其中添加了选择可选择标记或针对可选择标记进行选择的化学化合物或生物部分的细胞生长培养基。
术语“靶基因组DNA序列”、“靶序列”或“基因组靶基因座”是指体外或体内，或者细胞或细胞群体的核酸(例如基因组或附加体)中的期望使用核酸指导的核酸酶编辑系统对至少一个核苷酸进行改变的任何基因座。靶序列可以是基因组基因座或染色体外基因座。
“载体”是包含待递送至细胞和/或在细胞中表达的期望的一种序列或更多种序列的多种核酸中的任一种。载体通常由DNA构成，但是RNA载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、F粘粒(fosmids)、噬菌粒、病毒基因组、BAC、YAC、PAC、合成染色体等。
酵母中改进的核酸指导的核酸酶编辑
本公开内容提供了用于活酵母细胞的核酸指导的核酸酶编辑的物质组合物、方法和仪器，并且特别是用于提高编辑率并允许在活酵母细胞中进行多重同时编辑的高通量方法。本文描述的组合物和方法改进了CRISPR编辑系统，其中使用核酸指导的核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶)来编辑酵母基因组中的特定靶区域。与适当的合成的指导核酸在酵母细胞中复合的核酸指导的核酸酶可以在期望的位置处切割细胞的基因组。指导核酸有助于核酸指导的核酸酶识别和切割特定靶序列处的DNA。通过操纵指导核酸的核苷酸序列，核酸指导的核酸酶可以被编程为靶向任何用于裂解的DNA序列，只要适当的前间区邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)在附近。
指导核酸包含指导序列，其中指导序列是与靶序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导复合的核酸指导的核酸酶与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。指导序列和对应的靶序列之间的互补性程度在使用合适的比对算法进行最佳比对时是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用用于序列比对的任何合适的算法来确定。在一些实施方案中，指导序列的长度是约或多于约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列的长度为少于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核苷酸。优选地，指导序列是10-30个或15-20个核苷酸长，或者长度是15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。指导核酸还包含能够与核酸指导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。
核酸指导的核酸酶系统的另一个组分是供体核酸或同源臂。供体核酸与指导核酸位于同一多核苷酸(例如，编辑盒或含核酶的编辑盒)上，并且通常与指导核酸受同一启动子(例如，驱动指导核酸和供体核酸二者转录的单个启动子)的控制(参见，例如，图1B、图1C和图1F)。供体核酸被设计成用作与靶序列同源重组的模板，该靶序列被作为gRNA/核酸酶复合体的一部分的核酸指导的核酸酶切口或裂解。供体核酸多核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如约或多于约20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、500个或1000个核苷酸的长度。在某些优选的方面，供体核酸可以以20-300个核苷酸之间，更优选地50-250个核苷酸之间的寡核苷酸提供。供体核酸包含与靶序列的一部分互补的区域(例如同源臂)。当最佳比对时，供体核酸与靶序列重叠(互补)例如约20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或更多个核苷酸。在许多实施方案中并且优选地，供体核酸包含位于供体核酸和靶模板之间的突变或差异的侧翼的两个同源臂(与靶序列互补的区域)。供体核酸包含与靶序列相比的至少一个突变或改变，诸如与靶序列相比的插入、缺失、修饰或其任何组合。
供体核酸与gRNA(支架和指导序列二者)一起作为编辑盒或含核酶的编辑盒中的一个组分提供，其中编辑盒或含核酶的编辑盒可以是插入载体骨架的多个编辑盒之一。即，可以有多于一个，例如两个、三个、四个、五个或更多个单个gRNA/供体DNA对插入到载体骨架中，其中多个指导核酸/供体核酸对受单个启动子控制-在一些实施方案中，受pol II启动子控制，并且在一些实施方案中，驱动gRNA转录的启动子是诱导型pol II启动子。在一些实施方案中，核酸酶的转录也是诱导型的；因此，在一些实施方案中，核酸酶和gRNA二者的转录是诱导型的。诱导型编辑的优点在于，在开始编辑之前，细胞可以生长几倍至许多细胞倍增至稳定生长期(或接近稳定生长期)，这增加了具有编辑的细胞存活的可能性。在一些方面，存在将单个gRNA/供体DNA对彼此分开的接头或间隔序列。
通过改变指导序列可以将指导核酸工程化成靶向期望的靶序列，使得指导序列与期望的靶序列互补，从而允许指导序列和靶序列之间的杂交。通常，为了在靶序列中产生编辑，gRNA/核酸酶复合体与如由指导RNA确定的靶序列结合，并且核酸酶识别与靶序列邻近的前间区邻近基序(PAM)序列。靶序列可以是对原核细胞或真核细胞而言为内源或外源的任何基因组或附加体多核苷酸，或体外的任何基因组或附加体多核苷酸。例如，靶序列可以是驻留于酵母细胞的细胞核中的多核苷酸。靶序列可以是编码基因产物(例如，蛋白)的序列或非编码序列(例如，调控多核苷酸、内含子、PAM、间隔区或“垃圾”DNA(“junk”DNA))。
靶序列与前间区邻近基序(PAM)相关，前间区邻近基序(PAM)是由gRNA/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列。用于不同的核酸指导的核酸酶的精确PAM序列和长度要求不同；然而，PAM通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以是靶序列的5’或3’。因此，编辑盒提供了供体DNA序列(例如同源臂)，除了允许靶序列的精确基因组编辑之外，还提供了靶序列的一种或更多种改变，其去除靶序列中的前间区邻近基序(PAM)、使靶序列中的前间区邻近基序(PAM)突变或失活。使靶序列处的PAM失活排除了对该靶序列处细胞基因组的另外的编辑，例如，在后续的编辑轮中随后暴露于与合成的指导核酸复合的核酸指导的核酸酶时。因此，具有期望的靶序列编辑和改变的PAM的细胞可以使用与合成的指导核酸复合的核酸指导的核酸酶来选择，所述合成的指导核酸与靶序列互补。没有经历第一编辑事件的细胞会被切割，引起双链DNA断裂，并且因此会无法继续存活。包含期望的靶序列编辑和PAM改变的细胞不会被切割，因为这些编辑的细胞不再包含必需的PAM位点，并且会继续生长和繁殖。
用于设计和合成编辑盒的方法和组合物描述于USPN 10,240,167；10,266,849；9,982,278；10,351,877；10,364,442；和10,435,715；和2019年2月14日提交的USSN 16/275,465，所有这些通过引用并入本文。同样，每个编辑盒和含核酶的编辑盒包含待转录的gRNA序列和待转录的供体DNA或同源臂序列，包括期望的编辑和PAM或间隔区突变二者。在含核酶的编辑盒的情况下，至少一个编辑盒与一种或更多种自裂解核酶的编码序列相连。注意，尽管在图1B和图1C中，gRNA显示为在供体DNA的5’，但是gRNA可以位于供体DNA的3’。
在某些本发明的方法和组合物中，编码编辑盒的多核苷酸序列与一个或更多个自裂解核酶序列连接，产生含核酶的编辑盒。核酶序列的长度可以是20-200个核苷酸，更优选地长度是50-150个核苷酸。当转录成RNA时，自裂解核酶序列介导核酶序列自身内部或附近转录物的位点特异性磷酸二酯裂解。裂解通过广义酸-广义碱催化继续进行，从易切断键5’的核苷酸的2’OH中提取质子开始。产生的2’氧攻击相邻的3′磷酸，在上游核苷酸中产生2’-3’环磷酸，并在易切断键下游产生5’-羟基产物。
核酶通过其独特的二级和三级结构介导内部磷酸二酯键的序列特异性裂解，二级和三级结构在转录成RNA后组织起来，包括多螺旋连接、非螺旋元件诸如螺旋末端环和内部凸起(internal bulges)的相互作用以及假打结(pseudoknotting)。这些三级结构将底物(待裂解的易切断键)定位在活性位点裂缝(active-site cleft)内，该裂缝被一级序列中可能远离的核苷酸包围。
核酶有若干家族，每个家族都有独特的结构和活性位点构象，但它们都完成相同的序列特异性磷酸二酯裂解反应。在本发明的方法和组合物中，自裂解核酶序列可选自丁型肝炎病毒(HDV)样、葡糖胺-6-磷酸合酶(glmS)、脉孢菌Varkud卫星(VS)、锤头、twister、twister sister、hatchet、pistol等的自裂解核酶序列。
在一些实施方案中，核酶序列可以位于编辑盒同源臂的3’和pol II终止子序列(下文讨论并在图1B中示出)的5’，即在同源臂和pol II终止子序列之间。在天然环境中，pol II终止子序列通常协调终止和多腺苷酸化，然后是核输出。在本公开内容的优选实施方案中，核酶序列介导多(A)尾从转录物3’末端的裂解，并防止pol II转录的gRNA转录物的核输出。在一些实施方案中，可以使用两种不同的自裂解核酶，其中一种核酶位于供体DNA或同源臂的3’末端，并且其中一种核酶位于编辑盒的5’末端、转录起始位点的3’。5’核酶去除了转录后添加的5’帽，因此进一步增加了盒转录物保留在细胞核内的可能性。
在一种实施方案中，一种核酶是HDV样，并且HDV样核酶位于gRNA/供体DNA对的一个或更多个同源臂的3’和pol II终止子序列的5’之间，即同源臂和pol II终止子序列之间。HDV样核酶介导核酶序列本身5’的裂解，使裂解的转录物上剩余的HDV样序列的量最小化。同样，在一种实施方案中，锤头核酶在编辑盒的5’和启动子的3’使用。虽然这里选择的位于转录起始位点3’和位于编辑盒3’的自裂解核酶分别是锤头和HDV样，但是也可以使用其他排列；例如，位于转录起始位点3’和编辑盒5’的自裂解核酶可以是HDV样核酶，并且位于编辑盒3’和pol II终止子序列5’的自裂解核酶可以是锤头核酶。可选地，两种自裂解核酶可以是相同的自裂解核酶，诸如两种锤头核酶，尽管由于二级结构形成和/或位点间重组的考虑，这种构型不是优选的。在又另一种替代方案中，任何自裂解核酶可以用于任一位置，包括，除了HDV样核酶和锤头核酶之外，葡糖胺-6-磷酸合酶(glmS)核酶、脉孢菌Varkud卫星(VS)核酶、twister核酶、twister sister核酶、hatchet核酶和pistol核酶。
核糖核蛋白编辑复合体在细胞核中进行其靶序列的编辑；因此，gRNA转录物必须保留在细胞核中才能发生编辑。在本发明方法和组合物的某些实施方案中，指导核酸和供体DNA作为编辑盒中的编码序列被提供，以在pol II启动子的控制下从质粒或载体中表达。以前，由RNA pol II启动子转录的RNA不能用作gRNA，因为它们经历了显著的转录后加工和核输出。因此，RNA聚合酶III启动子，例如U6、U3、U2、SNR52、RPR1等，已经在本领域中用于驱动gRNA的表达。Pol III表达的RNA不被多腺苷酸化，也不从细胞核输出。然而，pol III启动子有若干局限性。首先，例如在酵母基因组中，可得的pol III启动子相对较少，并且它们的表达通常低于pol II启动子，限制了gRNA可得的动态范围和表达水平。第二，pol III启动子不适合序列改变，例如U6启动子在其转录起始位点需要鸟嘌呤核苷酸，限制了gRNA靶序列的选择。此外，pol III启动子是限制性的，因为许多pol III启动子具有基因内调节区，使得改变要表达的序列是不可能的。此外，pol III基因通常是管家基因，并且组成性地和泛在地(ubiquitously)表达，妨碍了使用诱导型、细胞类型或组织特异性启动子进行gRNA表达。最后，因为供体DNA序列(例如同源臂序列)通常来源于基因组序列，供体DNA序列可能包含pol III终止基序，诸如五聚T或五聚T+G。诸如这些的终止基序可能阻止编辑盒的功能gRNA部分的转录。
相比之下，与有限数量的pol III启动子相比，RNA pol II启动子通常表达更高，并提供了gRNA可能表达水平的大得多的动态范围。Pol II启动子更容易进行序列改变，并且不具有pol III启动子的有限序列要求，从而扩展了靶序列的编辑空间和灵活性。用polII表达gRNA使得能够使用已经设计出的许多细胞类型特异性、组织特异性或合成的pol II启动子，包括下文讨论的诱导型启动子。
在一些实施方案中，驱动gRNA表达的pol II启动子可以选自许多组成型真菌启动子中的一种，包括但不限于pPGK1、pTDH3、pENO2、pADH1、pTPI1、pTEF1、pTEF2、pYEF3、pRPL3、pRPL15A、pRPL4、pRPL8B、pSSA1、pSSB1或pPDA1。如上文讨论的，pol II启动子具有宽动态范围的表达水平。在优选的实施方案中，gRNA表达可以由已知在酵母中驱动相对高表达水平的pol II启动子，例如pPGK1、pTDH3、pADH1、pENO2来驱动。在另一种实施方案中，gRNA表达可以由已知在酵母中驱动中等范围表达水平的pol II启动子，例如pTEF1、pTEF2、pYEF3、pRPL3、pRPL15A来驱动。在又另一种实施方案中，gRNA表达可以由已知在酵母中驱动相对低表达水平的pol II启动子，例如pRPL4、pSSB1、pSSA1、pPDA1、pCYC1来驱动。在其他实施方案中，驱动gRNA表达的pol II启动子可以选自在哺乳动物细胞中驱动表达的许多组成型启动子之一，包括但不限于pCMV、pEF1a、pSV40、pPGK1、pUbc、人类β肌动蛋白启动子、pCAG等。
至于核酸指导的核酸酶编辑系统的核酸酶组分，编码核酸指导的核酸酶的多核苷酸序列可以被密码子优化以在特定细胞，诸如古细菌、原核细胞或真核细胞中表达。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类的细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物，包括非人类灵长类动物。待采用的核酸指导的核酸酶的选择取决于许多因素，诸如在靶序列中待进行何种类型的编辑，以及适当的PAM是否位于期望的靶序列附近。本文描述的方法中使用的核酸酶包括但不限于Cas 9、Cas 12a(例如，CpfI)、MAD2或MAD7。与指导核酸一样，核酸酶可以由载体(例如，工程载体)上的DNA序列编码，并且可以处于诱导型启动子的控制下。
除了上述组分，编辑盒或含核酶的编辑盒可以包含一个或更多个引物位点。引物位点可用于扩增编辑盒或含核酶的编辑盒，并通过使用寡核苷酸引物和桥接寡核苷酸组装多重化编辑盒或含核酶的编辑盒；例如，如果引物位点位于编辑盒的一个或更多个其他组分的侧翼。
编辑盒或含核酶的编辑盒也可以包含条形码。条形码是对应于供体DNA序列的独特DNA序列，使得条形码可以鉴定对对应靶序列进行的编辑。条形码通常包含四个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，编辑盒或含核酶的编辑盒包含代表例如供体核酸的全基因或全基因组文库的供体核酸的集合。编辑盒或含核酶的编辑盒的文库被组装成至少两个gRNA/供体DNA对的多重编辑盒，并且然后被克隆到载体骨架中，其中，例如，每个不同的供体核酸与不同的条形码缔合。
此外，在一些实施方案中，编码核酸指导的核酸酶系统的组分的载体还编码包含一个或更多个细胞核定位序列(NLS)诸如约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS的核酸指导的核酸酶。在一些实施方案中，工程化核酸酶包含氨基末端处或其附近的NLS、羧基末端处或其附近的NLS，或组合。
编辑盒、含核酶的编辑盒和/或载体骨架包含可操作地连接至待转录的组分序列的控制序列。如以上陈述的，驱动核酸指导的核酸酶编辑系统的一种或更多种组分转录(例如，核酸酶和gRNA之一或二者的转录)的pol II启动子可以是诱导型的。已经开发了用于植物、微生物和动物细胞(包括哺乳动物细胞)中的基因的受控表达的许多基因调控控制系统，例如pL启动子(通过CI857阻遏物的热失活诱导)、pBAD启动子(通过将阿拉伯糖添加至细胞生长培养基中诱导)和鼠李糖诱导型启动子(通过将鼠李糖添加至细胞生长培养基中诱导)。酵母诱导型启动子可响应于营养物来源、小分子、激素响应元素、营养耗尽或合成化合物。酵母诱导型启动子系统可以包括可通过无机磷酸盐的消耗诱导的PHO5启动子(USPN4,880,734)；被甲硫氨酸的消耗抑制的MET3启动子(Mao等人,Current Microbiology,45:37-40(2002))；被铜诱导的CUP1启动子(USPN 4,940,661)；被半乳糖诱导并被葡萄糖抑制的GAL1启动子(USPN 5,139,936)；或响应雌二醇诱导的工程化启动子GEV和ZEV系统(USPN9,212,359)等。
图1A示出了用于富集编辑的细胞的示例性方法100的简化流程图。参见图1A，方法100开始于设计和合成编辑盒或含核酶的编辑盒102。如上文描述的，每个编辑盒或含核酶的编辑盒包含待转录的gRNA序列和待转录的供体DNA序列(例如同源臂序列)，包括期望的靶基因组编辑以及PAM或间隔区突变。在含核酶的编辑盒中，编辑盒与一个或更多个编码自裂解核酶的序列相连。在合成了编辑盒或含核酶的编辑盒后，各个编辑盒被扩增104。然后使用编辑盒或含核酶的编辑盒和线性载体骨架转化细胞106，从而产生转化的细胞的文库。载体骨架通常包含核酸酶的编码序列，如图1F所示。可选地，细胞可能已经表达核酸酶(例如，细胞可能已经用包含核酸酶的编码序列的载体转化，或者核酸酶的编码序列可以稳定地整合到细胞基因组中)，使得仅载体骨架不包含核酸酶的编码序列。
可以使用各种递送系统将核酸指导的核酸酶编辑系统组分引入(例如，转化或转染)宿主细胞108。这些递送系统包括酵母系统、脂质体转染系统、显微注射系统、基因枪系统、病毒微体(virosome)、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子、脂质:核酸缀合物、病毒粒子(virion)、人工病毒粒子、病毒载体、电穿孔、细胞可渗透肽、纳米粒子、纳米线、外泌体(exosome)的使用。可选地，可以使用分子特洛伊木马(trojan horse)脂质体跨越血脑屏障递送核酸指导的核酸酶组分。特别感兴趣的是，电穿孔的使用，特别地流通式电穿孔(作为独立的仪器或作为自动化多模块系统中的模块)的使用，如以下中描述的：例如2019年4月9日发布的USPN 10,253,316；2019年6月25日发布的USPN 10,329,559；2019年6月18日发布的USPN 10,323,242；2019年9月24日发布的USPN 10,421,959；2019年11月5日发布的USPN10,465,185；2019年12月31日发布的USPN 10,519,437；以及2019年10月29日提交的USSN16/666,964和2019年11月12日提交的USSN 16/680,643，所有这些通过引用以其整体并入本文。如果筛选/选择模块是自动化多模块细胞编辑系统中的一个模块，细胞可能在自动化细胞转化模块中被转化。
在转化106后，细胞可以然后经历使用选择培养基的选择108。可选择标记和选择培养基用于选择已经接受载体骨架的细胞。常用的可选择标记包括可药物选择的标记，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418。
在已正确转化的细胞被选择108后，方法100的下一步是提供用于核酸指导的核酸酶编辑的条件110。“提供条件”包括在合适的培养基中孵育细胞，并且还可以包括提供条件以诱导诱导型启动子的转录(例如，添加抗生素、提高温度)，用于gRNA/供体DNA对和核酸酶中之一或二者的转录。在编辑完成后，允许细胞恢复，并且可以经历另一轮编辑112，或者，可选地，细胞可以用于研究114。
在本发明方法和组合物的某些实施方案中，编辑盒的表达由pol II启动子驱动，并且自裂解核酶序列位于编辑盒的3’。图1B描绘了pol II启动子和自裂解核酶情况下的示例性编辑盒。pol II启动子(这里是pADH1启动子)位于转录起始位点的5’，并驱动编辑盒的表达。在转录起始位点之后，存在包含gRNA序列(47bp gRNA)的编辑盒，该gRNA序列编码与核酸酶靶序列互补的指导RNA和与核酸酶复合的gRNA支架序列二者。接下来，编辑盒中gRNA序列的3’是编码包括期望的编辑和一个或更多个PAM位点改变的用于同源重组的模板的供体DNA序列(124bp供体DNA)。尽管在该编辑盒中，gRNA序列显示为在供体DNA的5’，但gRNA序列可以是在供体DNA序列的3’，因为编辑盒和含核酶的编辑盒二者关于gRNA和供体DNA编码序列的顺序是不可知的。在供体DNA序列之后是编码HDV样自裂解核酶的HDV核酶序列，该核酶介导为pol II转录结果的多(A)尾的裂解。最后，pol II终止子(Pol II终止子)终止编辑盒的pol II转录。第二自裂解核酶序列尽管在图1B中没有显示，但可以被包括在该编辑构建体中转录起始位点的3’和编辑盒中gRNA的编码序列的5’。
图1C描绘了用于实现同时组合(例如，多重)编辑的含双重核酶的编辑盒架构。本文描述的使用含单个核酶的编辑盒架构进行单个编辑的组合物和方法适用于含多个核酶的编辑盒结构。例如，与单个编辑架构一样，使用pol II启动子转录多个编辑盒避免了会为pol III转录系统带来问题的供体DNA中可能的终止基序。此外，本发明的pol II系统使得能够使用许多合成的pol II启动子，本来这些启动子不能用于gRNA表达。此外，pol II启动子比pol III启动子对序列变化不太敏感，并使得能够使用一系列小分子诱导型启动子，包括GAL1、GEV和ZEV系统。与包含单个编辑核酶的编辑盒架构一样，含双重或多个核酶的编辑盒架构采用3’自裂解核酶(诸如HDV核酶或锤头核酶)来裂解掉转录后添加的多A尾，多A尾是核输出信号，因此增加了编辑盒转录物保留在细胞核中的可能性。然而，在图1C所示的示例性实施方案中，双重或多个盒架构也采用5’自裂解核酶(在这种情况下是锤头核酶)以去除转录后添加的5’帽，这也增加了编辑盒保留在细胞核中的可能性。
图1C所示的双重编辑盒架构包括两个gRNA/供体DNA对、一个pol II启动子和两个自裂解核酶。pol II启动子(此处为组成型pTEF1启动子)在转录起始位点的5’，并且驱动第一和第二自裂解肽、第一和第二编辑盒以及接头或间隔区序列的转录。在转录起始位点之后，存在自裂解核酶(在这种情况下是锤头核酶)的编码序列。如上文陈述的，这种在含双重核酶的编辑盒的5’末端处的自我裂解核酶的目的是去除转录后添加到双重盒转录物的5’帽，这促进了编辑盒在细胞核中的保留。第一自裂解核酶的3’是编码与核酸酶靶序列互补的指导RNA和与核酸酶复合的支架序列二者的gRNA序列。在含核酶的编辑盒中的第一gRNA序列之后，存在第一供体DNA序列(此处，编码例如CAN1或ADE2敲除)，其1)编码用于与靶序列同源重组的模板，从而指导对靶序列的合理、精确的编辑，以及2)对靶序列提供一个或更多个编辑，其去除靶中的PAM或间隔区、使靶中的PAM或间隔区突变或以其他方式使靶中的PAM或间隔区失活。
含双重核酶的编辑盒架构中的下一个元件是任选的接头或间隔区，其包含促进两个编辑盒之间裂解的序列。接头或间隔元件可以包含1)tRNA序列，所述tRNA序列通过利用tRNA中存在的内源RNA加工序列来帮助加工单独的编辑盒；2)另外的自裂解核酶(诸如丁型肝炎病毒(HDV)样核酶家族中的自裂解核酶、葡糖胺-6-磷酸合酶核酶家族中的自裂解核酶、锤头核酶家族中的自裂解核酶、发夹核酶家族中的自裂解核酶、脉孢菌Varkud卫星核酶家族中的自裂解核酶、twister核酶家族中的自裂解核酶、twister sister核酶家族中的自裂解核酶、hatchet核酶家族中的自裂解核酶或pistol核酶家族中的自裂解核酶)；或3)外源裂解因子识别序列(诸如Cys4)。
在接头或间隔区之后(例如接头的3’)是第二gRNA/供体DNA对。第二gRNA/供体DNA对包含第二gRNA序列，所述第二gRNA序列编码与核酸酶靶序列互补的指导RNA和与核酸酶复合的支架序列二者；和第二供体DNA序列(此处，也是CAN1或ADE2敲除)，所述第二供体DNA序列编码包含期望编辑和一个或更多个PAM位点改变二者的用于与靶序列同源重组的模板。第二gRNA/供体DNA对的3’是第二自裂解核酶序列，此处编码HDV自裂解核酶，其介导为pol II转录的结果的多(A)尾的裂解。最后，HDV核酶序列的3’是pol II终止子，其功能是终止双重编辑盒的pol II转录。尽管在该图1C中，gRNA显示在gRNA/供体DNA对中供体DNA的5’，但是在gRNA/供体DNA对中的任一个或二者中，gRNA可以在供体DNA的3’。此外，图1C显示了构建体中的两个编辑盒；然而，在构建体中可以存在第三、第四、第五或第六gRNA/供体DNA对，其中第三、第四、第五或第六gRNA/供体DNA对各自被接头或间隔序列彼此分开。
除了提高gRNA的转录和核定位之外，本公开内容还致力于通过多载体转化提高酵母中核酸指导的核酸酶编辑的效率。如上文详细描述的，在核酸指导的核酸酶基因组编辑中，通过用位于质粒上的gRNA/供体DNA对进行核酸酶介导的双链断裂或单链缺口的同源性指导修复来产生精确编辑。每个细胞的编辑数量受到以下事实的限制：通常，只有一个含一个编辑盒的质粒能够在由编辑池转化的每个细胞的基因组中赋予单个编辑。本公开内容证明，通过缺口修复组装过程和调节编辑盒与载体骨架的比例，单个酵母细胞可以一次被多个载体骨架转化，从而允许细胞被包含在载体骨架内的多个编辑盒同时编辑。这个过程在本文被称为多载体转化。
多载体转化作为缺口修复质粒克隆过程的结果而发生，由此线性化载体骨架的池与编辑盒的池一起共转化到酵母细胞中，其中每个载体骨架包含抗生素标记基因，该编辑盒池包含1)gRNA序列，2)DNA供体序列(优选地除了期望的编辑的序列之外还包含PAM突变)，和3)与线性化质粒骨架同源的序列。通过酵母细胞的天然同源重组机制，线性化的质粒骨架和编辑盒一起连接成编辑质粒，并且编辑质粒可以通过抗生素抗性基因进行选择。
多载体转化是缺口修复组装过程的变化形式，其中多个编辑盒(或含多个核酶的编辑盒)与线性化的骨架(例如，相同类型的线性化骨架或包含不同选择标记的线性化骨架)组合，在单个酵母细胞内产生多于一个独特的编辑质粒。由于位于编辑质粒上的2μ病毒起点的存在，多个独特的编辑质粒同时保持在单细胞内，其中2μ病毒复制起点是多拷贝起点，在任何给定的细胞中通常维持大约50个质粒(在这种情况下是编辑质粒)的拷贝数。
本文描述了可以优化多载体转化编辑的两种方式。首先，通过增加编辑盒池或含核酶的编辑盒池与线性化载体骨架的摩尔比，通过缺口修复组装并维持在每个细胞中的不同编辑载体的数量增加。在图1D中示出了这一实施方案。其次，当具有不同选择基因(例如抗生素标记)的多个线性化质粒骨架被纳入在用编辑盒或含核酶的编辑盒的池进行的转化中时，随后选择对线性化质粒骨架上包括的所有抗生素标记具有抗性的酵母细胞，多载体转化率增加。在图1E中示出了该替代实施方案。在该实施方案中，只有已经用具有每一个选择标记的线性化质粒骨架转化的细胞才能从选择中存活，从而促成多载体转化。已经确定，独特的编辑盒或含核酶的编辑盒通过缺口修复整合到质粒骨架中的概率随着编辑盒池或含核酶的编辑盒池的尺寸以及编辑盒或含核酶的编辑盒在池内的分布而变化。文库中的编辑盒或含核酶的编辑盒越多，并且编辑盒或含核酶的编辑盒的池越均匀，每个细胞中独特的盒被整合到线性化质粒骨架中的概率越高，允许每个细胞进行多个编辑。
多载体转化编辑的优点包括通过对每个细胞施加选择压力来维持多于一个编辑质粒，从而增加每个个体细胞中可能的编辑数量。此外，多载体骨架转化编辑可以用双重、三重或更多编辑盒或含核酶的编辑盒来实施；即，使用包含两个或更多个gRNA/供体DNA对的编辑盒或含核酶的编辑盒来进一步增加每轮编辑中每个细胞的编辑数量。
图1D是用于编辑酵母基因组的多载体转化系统的简化图。在图1D中，编辑盒的池(例如文库)与线性载体骨架组合，所述线性载体骨架包含1)核酸酶的编码序列，2)抗生素抗性基因，和3)2μ复制起点，并且编辑盒和线性载体骨架被转化到酵母细胞中。酵母细胞中的缺口修复通过线性载体骨架上的同源序列和编辑盒之间的同源重组将编辑盒插入线性载体骨架，从而产生编辑载体。转化后，通过抗生素选择对已被正确转化的细胞进行选择，产生包含组装的编辑载体的细胞文库。同样，独特的编辑盒或含核酶的编辑盒通过缺口修复变为整合到质粒骨架中的概率随着编辑盒池或含核酶的编辑盒池的尺寸以及编辑盒或含核酶的编辑盒在池内的分布而变化。文库中的编辑盒或含核酶的编辑盒越多，并且编辑盒或含核酶的编辑盒的池越均匀，每个细胞中独特的盒被整合到线性化质粒骨架中的概率越高，允许每个细胞进行多个编辑。因此，本发明的实施方案使用单个类型的载体骨架，但是调整编辑盒池或含核酶的编辑盒池的尺寸和均匀性允许将多个编辑盒整合到每个细胞中的载体骨架中。
图1E是用于编辑酵母基因组的替代系统的简化图。在图1E中，编辑盒或含核酶的编辑盒的池(例如文库)与线性载体骨架组合，所述线性载体骨架包含1)核酸酶的编码序列，2)抗生素抗性基因，和3)2μ复制起点。然后将编辑盒或含核酶的编辑盒和线性载体骨架转化到酵母细胞中。图1D和图1E中的过程之间的区别在于，在图1E中使用了至少两个不同的线性载体骨架，其中两个载体骨架之间的区别在于一个载体骨架包含第一抗生素抗性基因(例如，选择标记)并且另一个载体骨架包含第二抗生素抗性基因，并且第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因不同。在图1E中，酵母细胞中的缺口修复通过线性载体骨架上的同源序列和编辑盒或含核酶的编辑盒之间的同源重组，将编辑盒或含核酶的编辑盒(例如，编辑盒或含核酶的编辑盒的文库)插入线性载体骨架中，以形成编辑载体。转化后，通过对第一抗生素和第二抗生素二者的抗性选择已被正确转化的细胞，产生包含组装的编辑载体的细胞文库。因为用第一抗生素和第二抗生素二者对细胞的选择性压力要求细胞承担和维持编辑载体，所以细胞很可能被两个或更多个不同的编辑载体转化，并因此被两个或更多个gRNA/供体DNA对(例如，编辑序列)转化。此外，2μ复制起点将酵母细胞中的每个载体或质粒维持在大约50个拷贝。注意，这里使用了具有两个不同抗生素标记的两个不同的线性载体骨架；然而，具有三个、四个或五个不同抗生素标记的三个、四个或五个不同线性载体骨架可用于本文描述的方法中。因此，这种替代方法除了调节编辑盒池或含核酶的编辑盒池的尺寸和均匀性而允许在每个细胞中将多个编辑盒整合到载体骨架之外，还增加了选择性压力的概念，以确保在每个细胞内维持多个载体。
在一些实施方案中，骨架与插入物的摩尔比大致为每个骨架三个盒，实际上相当于500ng骨架和50ng编辑盒。在本发明的方法中，盒浓度增加到高达8x，如图15所示，并且可以高达50x，或高达40x，或高达30x，或高达20x。文库尺寸的范围可以少至两个不同的编辑盒或含核酶的编辑盒到100,000个编辑盒或含核酶的编辑盒或更多。
图1F是缺口修复后的示例性编辑载体图谱，其中编辑载体图谱尤其包含编辑盒或含核酶的编辑盒(或复合编辑盒或含核酶的编辑盒)、选择标记和核酸酶MAD7的编码序列。在图1F的载体图谱中，示出了单个编辑盒。从11:55点钟开始，存在驱动gRNA/供体DNA对转录的启动子，并且在一些实施方案中，该启动子是pol II启动子，随后是终止子，诸如polII或SUP4终止子；驱动抗生素抗性基因1或2(选自至少两种不同的抗生素抗性基因)转录的启动子，随后是终止子；驱动SV40核定位序列和MAD7核酸酶编码序列转录的另一个启动子，随后是终止子；驱动氨苄青霉素抗性基因(其与其他元件的转录方向相反)的启动子；用于在细菌中繁殖编辑载体的pUC复制起点；和用于在酵母中繁殖每个编辑载体的多个拷贝的2-μ复制起点。同样，考虑到本公开内容，对于本领域普通技术人员应当明显的是，在编辑盒或含核酶的编辑盒中可以存在多于一个gRNA/供体DNA对；即，对于双编辑编辑盒或含核酶的编辑盒，可以存在驱动第一gRNA、第一供体DNA序列、随后是第二gRNA和第二供体DNA序列转录的启动子，随后是终止子。此外，在gRNA/供体DNA对之间；即在第一gRNA/供体DNA序列和第二gRNA/供体DNA序列之间可以任选地存在五聚T或五聚T+G基序。
在本文的每种不同方法和组合物中，考虑到本公开内容，对于本领域普通技术人员应当明显的是，通过在单个载体骨架中使用复合编辑盒，或者通过使用各自具有不同编辑盒的多个载体，以及使用这些方法和组合物进行多轮编辑(例如递归编辑)，这些方法和组合物为每轮每细胞提供了多个编辑。
在细胞中进行核酸指导的核酸酶编辑的自动化细胞编辑仪器和模块
自动化细胞编辑仪器
图2A描绘了例如使用本文描述的新颖组合物进行示例性新颖方法之一的示例性自动化多模块细胞处理仪器200。例如，仪器200可以并且优选地被设计为在实验室环境中使用的独立台式仪器。仪器200可以包括可重复使用组分和一次性组分的混合物，用于在细胞中进行自动化基因组裂解和/或编辑时进行各种集成的过程而无人工干预。图示了机架(gantry)202，机架202提供了自动化机械运动系统(致动器)(未示出)，该自动化机械运动系统(致动器)向例如自动化(即，机器人)液体操作系统258提供XYZ轴运动控制，该自动化液体操作系统258包括例如空气置换移液器232，这允许多个模块之间的细胞处理而无人工干预。在一些自动化多模块细胞处理仪器中，空气置换移液器232由机架202移动，并且各种模块和试剂筒保持静止；然而，在其他实施方案中，液体操作系统258可以在各种模块和试剂筒移动时保持静止。自动化多模块细胞处理仪器200中还包括试剂筒210，其包括储库212和转化模块230(例如，参照图5B-图5F详细描述的流通式电穿孔装置)，以及洗涤储库206、细胞输入储库251和细胞输出储库253。洗涤储库206可以被配置成容纳大的管，例如洗涤溶液，或者在整个迭代过程中通常使用的溶液。尽管在图2A中，两个试剂筒210包括洗涤储库206，但是洗涤储库也可以被包括在洗涤筒中，其中试剂筒和洗涤筒是分开的筒。在这样的情况下，试剂筒210和洗涤筒204可以是相同的，除了插入其中的消耗品(包含在各种插入物中的试剂或其他组分)。
在一些实施方式中，试剂筒210是用于在自动化多模块细胞处理/编辑仪器200中使用的包含试剂和细胞的一次性套件。例如，在启动细胞处理前，使用者可以在自动化多模块细胞编辑仪器200的机箱(chassis)内打开和定位每个包含各种期望的插入物和试剂的试剂筒210。此外，每个试剂筒210可以插入机箱中的插座中，该插座具有适合于容纳在其中的试剂的不同温度区。
图2A中还图示了机器人液体操作系统258，包括机架202和空气置换移液器232。在一些实例中，机器人操作系统258可以包括自动化液体操作系统，诸如由Mannedorf,Switzerland的Tecan Group Ltd.、Reno,NV的Hamilton Company(参见，例如，WO2018015544A1)或Fort Collins,CO.的Beckman Coulter,Inc.(参见，例如，US20160018427A1)制造的那些。移液器吸头可以设置在移液器转移吸头供应装置(未示出)中，用于与空气置换移液器232一起使用。
在一些实施方式中，试剂筒210的插入物或组件标记有机器可读标记(未示出)，诸如条形码，用于由机器人操作系统258识别。例如，机器人液体操作系统258可以扫描每个试剂筒210内的一个或更多个插入物以确认内容物。在其他实施方式中，机器可读标记可以标记在每个试剂筒210上，并且自动化多模块细胞编辑仪器200的处理系统(未示出，但参见图2B的元件237)可以基于机器可读标记鉴定存储材料地图。在图2A中图示的实施方案中，细胞生长模块包括细胞生长瓶218(下文结合图3A-图3D更详细描述)。另外看到的是TFF模块222(下文结合图4A-图4E进行了详细描述)。还图示了，作为图2A的自动化多模块细胞处理仪器200的一部分，在本文结合图6C-图6F描述的单个化模块240(例如，此处示出的固体壁分离、孵育和标准化装置(SWIIN装置))，由例如机器人液体处理系统258和空气置换移液管232提供服务。另外看到的是选择模块220。还注意三个散热器255的放置。
图2B是图2A中描绘的示例性多模块细胞处理仪器200的内容物的简化展示。例如，基于筒的源材料(诸如在试剂筒210中)可以被定位于仪器200的平台(deck)上的指定区域中，以供空气置换移液管232获取(access)。多模块细胞处理仪器200的平台可以包括保护槽，使得从仪器200的任何模块溢出(spilling)、滴落或溢流(overflowing)的污染物容纳在保护槽的边缘(lip)内。还看到试剂筒210，其显示为设置有热组件211，热组件211可以产生适合不同区域的温度区。注意，一个试剂筒还包括流通式电穿孔装置230(FTEP)，由FTEP接口(例如歧管臂)和致动器231供应。还看到具有相邻热组件225的TFF模块222，其中TFF模块由TFF接口(例如歧管臂(manifold arm))和致动器233提供服务。热组件225、235和245包含热电装置，诸如Peltier装置，以及散热器、风扇和冷却器。旋转生长瓶218在生长模块234内，其中生长模块由两个热组件235提供服务。在220看到选择模块。还看到SWIIN模块240，其包括SWIIN筒241，其中SWIIN模块还包括热组件245、照明243(在该实施方案中为背光)、蒸发和冷凝控制249，并且其中SWIIN模块由SWIIN接口(例如，歧管臂)和致动器247提供服务。在该视图中还看到触摸屏显示器201、显示器致动器203、照明205(多模块细胞处理仪器200两侧各一个)和照相机239(多模块细胞处理仪器200两侧各一个照明装置)。最后，元件237包括电子器件，诸如电路控制板、高压放大器、电源和电源输入；以及气动器件(pneumatics)，诸如泵、阀和传感器。
图2C图示了用作自动化多模块细胞编辑仪器200的桌面版本的多模块细胞处理仪器200的前透视图。例如，机箱290可以具有约24-48英寸的宽度、约24-48英寸的高度和约24-48英寸的深度。机箱290可以并且优选地被设计成容纳自动化细胞处理中使用的所有模块和一次性供应装置，并且在没有人工干预的情况下执行所需的所有过程；即，机箱290被配置成提供集成的、独立的自动化多模块细胞处理仪器。如图2C中图示的，机箱290包括触摸屏显示器201、冷却格栅264，冷却格栅264允许空气通过内部风扇(未示出)流动。触摸屏显示器向使用者提供关于自动化多模块细胞编辑仪器200的处理状态的信息，并接受来自使用者的输入用于进行细胞处理。在该实施方案中，机箱290由可调节的支脚270a、270b、270c和270d提升(支脚270a-270c在该图2C中示出)。例如，可调节的支脚270a-270d允许在机箱290下方的另外的气流。
在一些实施方式中，机箱290内部是关于图2A和图2B描述的大部分或全部部件，包括沿着机架布置的机器人液体处理系统、包括流通式电穿孔装置的试剂筒210、细胞生长模块234中的旋转生长瓶218、切向流过滤模块222、SWIIN模块240以及各种模块的接口和致动器。此外，机箱290容纳控制电路、液体操作管、气泵控制器、阀、传感器、热组件(例如，加热和冷却单元)和其他控制机构。有关多模块细胞编辑仪器的实例，参见2019年4月9日发布的USPN 10,253,316；2019年6月25日发布的USPN 10,329,559；2019年6月18日发布的USPN10,323,242；2019年9月24日发布的USPN 10,421,959；2019年11月5日发布的USPN 10,465,185；2019年12月31日发布的USPN 10,519,437；以及2019年11月12日提交的USSN 16/680,643；2019年10月29日提交的USSN 16/666,964；2020年1月23日提交的USSN 16/750,369，其全部通过引用全文并入本文。
旋转细胞生长模块
图3A示出了与本文描述的细胞生长装置一起使用并在自动化多模块细胞处理仪器中使用的旋转生长瓶300的一种实施方案。旋转生长瓶300是光学透明的容器，具有用于接收液体培养基和细胞的开口端304、限定用于使细胞生长的主容器的中心瓶区306、限定至少一个光路310的锥形至收缩区(tapered-to-constricted region)318、封闭端316和驱动接合机构312。旋转生长瓶300具有中心纵轴320，瓶围绕该中心纵轴320旋转，并且光路310通常垂直于瓶的纵轴。第一光路310被定位于锥形至收缩区318的下收缩部分。任选地，旋转生长瓶300的一些实施方案在锥形至收缩区318的锥形区中具有第二光路308。该实施方案中的两个光路都被定位于旋转生长瓶的区中，该区不断地填充有细胞培养物(细胞+生长培养基)并且不受生长瓶旋转速度的影响。第一光路310比第二光路308短，在瓶中细胞培养物的OD值处于高水平时(例如，在细胞生长过程的较后期)允许OD值的灵敏测量，而第二光路308在瓶中细胞培养物的OD值处于低水平时(例如，在细胞生长过程的较早期)，允许OD值的灵敏测量。
驱动接合机构312与马达(未示出)接合以使瓶旋转。在一些实施方案中，马达驱动驱动接合机构312，使得旋转生长瓶300仅在一个方向上旋转，并且在其他实施方案中，旋转生长瓶300在第一方向上旋转第一时间量或周期性，在第二方向(即，相对方向)上旋转第二时间量或周期性，并且该过程可以重复，使得旋转生长瓶300(和细胞培养物内容物)经历振荡运动。此外，使用者可以选择培养物是否经历振荡及用于其的周期性。第一时间量和第二时间量可以相同或可以不同。时间量可以是1秒、2秒、3秒、4秒、5秒或更多秒，或者可以是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或更多分钟。在另一种实施方案中，旋转生长瓶400可以在细胞生长的早期阶段以第一周期性(例如，每60秒)振荡，并且旋转生长瓶300可以然后在细胞生长的后期阶段以与第一周期性不同的第二周期性(例如，每一秒)振荡。
旋转生长瓶300可以是可重复使用的，或者优选地，旋转生长瓶是可消耗的。在一些实施方案中，旋转生长瓶是可消耗的，并且向使用者提供为预先填充有生长培养基，其中瓶在开口端304处用箔密封件密封。以这样的方式包装的填充培养基的旋转生长瓶可以是用于与独立细胞生长装置或与作为自动化多模块细胞处理系统一部分的细胞生长模块一起使用的套件的一部分。为了将细胞引入到瓶中，使用者仅需要用移液器吸出期望体积的细胞，并且使用移液器吸头刺穿瓶的箔密封件。开口端304可以任选地包括延伸边缘302，以与细胞生长装置重叠并接合。在自动化系统中，旋转生长瓶300可以用条形码或其他标识手段加标签，该条形码或其他标识手段可以被作为自动化系统的一部分的扫描仪或照相机(未示出)读取。
旋转生长瓶300的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积可以有很大变化，但是旋转生长瓶300的体积必须足够大，以产生指定总数量的细胞。在实践中，旋转生长瓶300的体积范围可以为1-250mL、2-100mL、5-80mL、10-50mL或12-35mL。同样，细胞培养物(细胞+生长培养基)的体积应适当，以允许旋转生长瓶400中适当通气和混合。适当的通气促进了生长培养基内均匀的细胞呼吸。因此，细胞培养物的体积应是生长瓶体积的约5％-85％或生长瓶体积的20％-60％。例如，对于30mL的生长瓶，细胞培养物的体积会是约1.5mL至约26mL或6mL至约18mL。
旋转生长瓶300优选由生物相容的光学透明材料制成，或者包括一条或更多条光路的瓶的至少一部分是透明的。此外，制造旋转生长瓶的材料应能够冷却至约4℃或更低，并且加热至约55℃或更高，以适应基于温度的细胞测定和在低温的长期储存。此外，用于制造瓶的材料必须能够承受高达55℃的温度，而在旋转时不会变形。合适的材料包括环烯烃共聚物(COC)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜、聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。优选的材料包括聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。在一些实施方案中，旋转生长瓶通过例如注射成型或挤压低成本地制造。
图3B是细胞生长装置330的一种实施方案的透视图。图3C描绘了来自图3B的细胞生长装置330的剖视图。在两幅图中，可见旋转生长瓶300被定位于主壳体336内，其中旋转生长瓶300的延伸边缘302在主壳体336上方延伸。此外，两幅图中都示出了端壳体352、下壳体332和凸缘334。凸缘334用于将细胞生长装置330附接至加热/冷却装置或其他结构(未示出)。图3C描绘了另外的细节。在图3C中，上轴承342和下轴承340被示出定位于主壳体336中。上轴承342和下轴承340支持旋转生长瓶300的垂直装载。下壳体332容纳驱动马达338。图3C的细胞生长装置330包括两条光路：第一光路344和第二光路350。光路344对应于定位于旋转生长瓶300的锥形至收缩部分的收缩部分中的光路310，并且光路350对应于旋转生长瓶316的锥形至收缩部分的锥形部分中的光路308。光路310和308未在图3C中示出，但是可见于图3A中。除了光路344和340之外，还存在照亮一条或更多条光路的发射板348，以及在光穿过旋转生长瓶300中的细胞培养液后检测光的检测器板346。
马达338与驱动机构312接合，并用于使旋转生长培养瓶300旋转。在一些实施方案中，马达338是具有内置驱动控制器的无刷DC型驱动马达，所述内置驱动控制器可以被设置为保持0RPM和约3000RPM之间的恒定每分钟转数(RPM)。可选地，可以使用其他马达类型，诸如步进(stepper)、伺服(servo)、刷式DC等。任选地，马达338还可以具有允许旋转方向反转的方向控制以及感测和报告实际RPM的转速计。马达由处理器(未示出)根据例如被编程到处理器中的标准方案和/或使用者输入进行控制，并且马达可以被配置成改变RPM以引起细胞培养物的轴向进动，从而增强混合，例如以防止细胞团聚、增加通气和优化细胞呼吸。
细胞生长装置330的主壳体336、端壳体352和下壳体332可以由任何合适的稳健材料制成，包括铝、不锈钢和其他导热材料，包括塑料。这些结构或其部分可以通过各种技术产生，例如金属制造、注射成型、产生熔合的结构层，等等。尽管在一些实施方案中设想旋转生长瓶300是可重复使用的，但是优选地是可消耗的，细胞生长装置330的其他组件优选地是可重复使用的，并且发挥作为独立台式装置或者多模块细胞处理系统中的模块的功能。
细胞生长装置330的处理器(未示出)可以用待用作生长细胞培养物的“空白”或对照的信息编程。“空白”或对照是仅包含细胞生长培养基的容器，产生100％的透射率和0OD，而细胞样品会将光线偏转并且会具有较低的透射率百分比和较高的OD。随着细胞在培养基中生长并且变得更稠密，透射率会降低并且OD会增加。细胞生长装置330的处理器(未示出)可以被编程为使用与细胞培养中通常使用的生长培养基相称的空白的波长值(不论，例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、动物细胞、酵母细胞等)。可选地，第二分光光度计和容器可以包括在细胞生长装置330中，其中第二分光光度计用于以指定的间隔读取空白。
图3D图示了作为组装的一部分的细胞生长装置330，包括与光源390、检测器392和热组件394耦合的图3B的细胞生长装置330。将旋转生长瓶300插入细胞生长装置中。光源390和检测器392的组件(例如，诸如，具有覆盖5-log的增益控制的光电二极管)与细胞生长设备的主壳体耦合。图示了容纳使旋转生长瓶300旋转的马达的下壳体332，以及将细胞生长装置330固定至组装的凸缘334之一。同样，图示的热组件394是Peltier装置或热电冷却器。在该实施方案中，热控制通过经由下壳体332的基部上的凸缘334将细胞生长装置330附接至热组件394并与热组件394电一体化来实现。热电冷却器能够将热量“泵”至接合处(junction)的任一侧，根据电流的方向冷却表面或加热表面。在一种实施方案中，使用热敏电阻测量主壳体的温度，并且然后通过标准的电子比例积分微分(PID)控制器回路，将旋转生长瓶300控制在约+/-0.5℃。
在使用时，通过刺穿箔密封件或膜，将细胞接种(细胞可以从例如自动化液体操作系统或由使用者移出)到旋转生长瓶300的预填充生长培养基中。细胞生长装置330的编程软件设置用于生长的控制温度，通常为30℃，然后缓慢启动旋转生长瓶300的旋转。细胞/生长培养基混合物由于离心力缓慢垂直向上移动至壁，允许旋转生长瓶300将混合物的大表面面积暴露于正常的氧气环境。生长监测系统以预设或预编程的时间间隔采取连续读取OD或OD测量。这些测量结果存储在内部存储器中，并且如果需要，软件将测量对比时间绘图，以展示生长曲线。如果需要增强混合，例如为了优化生长条件，可以改变瓶旋转的速度以引起液体的轴向进动，和/或可以以编程的间隔进行完全的方向改变。可以对生长监控编程，以在预先确定的OD时自动终止生长阶段，并且然后将混合物快速冷却至较低温度，以抑制进一步生长。
细胞生长装置330的一个应用是不断地测量生长细胞培养物的光密度。所描述的细胞生长装置的一个优点是光密度可以连续测量(动力学监测)或以特定时间间隔测量；例如每5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒或60秒，或者每1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。虽然已经在测量生长细胞培养物的光密度(OD)的背景下描述了细胞生长装置330，然而鉴于本说明书的教导，本领域技术人员应理解，除了细胞培养物OD之外或者代替细胞培养物OD，可以测量其他细胞生长参数。如同上文关于固体壁装置或模块描述的细胞生长的任选测量，使用可见光、UV或近红外(NIR)光的光谱学允许监测细胞培养物中营养物和/或废物的浓度，并且可以进行其他光谱学测量；即，可以通过例如介电阻抗光谱学、可见荧光、荧光偏振或发光来测量其他光谱特性。此外，细胞生长装置330可以包括用于测量例如溶解氧、二氧化碳、pH、电导率等的另外的传感器。有关旋转生长瓶和细胞生长装置的另外详细信息，参见2019年10月8日发布的USPN 10,435,662；2019年10月15日发布的USPN 10,443,031；以及2019年8月27日提交的USSN 16/552,981和2020年2月3日提交的USSN 16/780,640。
细胞浓缩模块
如上文关于旋转生长瓶和细胞生长模块描述的，为了获得足够数量的用于转化或转染的细胞，细胞通常在适合感兴趣的细胞生长的培养基中生长至特定的光密度；然而，为了有效转化或转染，期望减少细胞体积，并通过缓冲液或培养基交换使细胞为感受态。因此，在细胞处理系统中执行本文描述的方法所期望的一个子组件或模块是能够生长、进行缓冲液交换和/或浓缩细胞并使它们为感受态的模块或组件，从而可以用工程化或编辑细胞基因组所需的核酸转化或转染它们。
图4A示出了渗余物构件422(上图)、渗透物构件420(中图)和切向流组件410(下图)，切向流组件410包括渗余物构件422、膜424(未见于图4A中)和渗透物构件420(也未见于)。在图4A中，渗余物构件422包括切向流动通道402，该切向流动通道402具有蛇形构造，该蛇形构造从渗余物构件422的一个下角开始-具体地说，在渗余物端口428处-横穿并向上然后向下并横穿渗余物构件422，在第二渗余物端口428处终止于渗余物构件422的另一个下角。在渗余物构件422上还看到能量导向器491，该能量导向器491围绕膜或过滤器(未见于该图4A中)所处的区域，并且在通道402的区域之间相互交叉。在该实施方案中，能量导向器491通过渗透物/滤液构件420上的能量导向器部件491(在右侧)与渗余物构件422和渗透物/滤液构件420配合，并用于促进渗余物构件422与渗透物/滤液构件420的超声波焊接或结合。另外，可以看到埋头孔423，两个在渗余物构件422的底部，一个在渗余物构件422的顶部中间。埋头孔423用于将切向流组件410耦合到储库组件(未见于图4A中，但参见图4B)。
渗透物/滤液构件420在图4A的中部可见，并且除了能量导向器491之外，渗透物/滤液构件420还包括用于每个底角处的渗余物端口428的通孔(其与渗余物构件422的底角处的渗余物端口428的通孔配合)，以及位于渗透物构件420的顶部和中心的切向流动通道402和两个渗透物/滤液端口426。该实施方案中的切向流动通道402结构具有蛇形构造和波状几何形状，尽管也可以使用其他几何形状。渗透物构件420还包括埋头孔423，与渗余物构件420上的埋头孔423一致。
在图4A的左侧是切向流组件410，其包括在该图4A中看到的渗余物构件422和渗透物构件420。在该视图中，渗余物构件422在视图的“顶部”，膜(未见于组件的该视图中)将邻近渗余物构件422并在其下方，并且渗透物构件420(未见于组件的该视图中)邻近膜并在其下方。再次看到埋头孔423，其中渗余物构件422和渗透物构件420中的埋头孔一致并配置成与设置在储库组件(未见于图4A中，但参见图4B)上的埋头孔的螺纹或配合元件配合。
膜或过滤器设置在渗余物和渗透物构件之间，其中流体可以流过膜，但是细胞不能，并因此被保留在设置在渗余物构件中的流动通道中。适用于TFF装置/模块的过滤器或膜是耐溶剂的、在过滤期间无污染并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸的那些。例如，为了保留小细胞类型，诸如细菌细胞，孔径可以低至0.2μm，然而对于其他细胞类型，孔径可以高至20μm。事实上，可用于TFF装置/模块中的孔径包括具有以下尺寸的过滤器：0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以及更大。过滤器可以由任何合适的非反应性材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、玻璃纤维，或如在激光或电化学蚀刻的情况下的金属基材。
通道结构402的长度可以根据待生长的细胞培养物的体积和待浓缩的细胞培养物的光密度而变化。通道结构的长度通常为60mm至300mm，或70mm至200mm，或80mm至100mm。流动通道402的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或另一种具有大体上直边的形状，截面可以是约10μm至1000μm宽，或200μm至800μm宽，或300μm至700μm宽，或400μm至600μm宽；和约10μm至1000μm高，或200μm至800μm高，或300μm至700μm高，或400μm至600μm高。如果流动通道102的截面大体上是圆形、卵形或椭圆形的，则通道的半径可以是按水力半径约50μm至1000μm，或者按水力半径5μm至800μm，或者按水力半径200μm至700μm，或者按水力半径300μm至600μm宽，或者按水力半径约200μm至500μm。此外，渗余物422和渗透物420构件中的通道的体积可以根据每个构件中通道的深度而不同。
图4B示出了配置成与图4A中所见的切向流组件410一起使用的储库组件450的前透视图(右)和后透视图(左)。在前透视图中看到的(例如，“前”是储库组件450耦合到图4A中所示的切向流组件410的一侧)是渗透物储库454任一侧上的渗余物储库452。还看到渗透物端口426、渗余物端口428和用于埋头孔423的三个螺纹或配合元件425(埋头孔423未见于图4B中)。埋头孔423的螺纹或配合元件425被配置成将切向流组件410(见于图4A中)配合或耦合到储库组件450。可选地或另外，紧固件、声波焊接或热融柱(heat stakes)可用于将切向流组件410配合或耦合到储库组件450。此外，看到覆盖储库组件450顶部的密封垫445。关于图4E详细描述密封垫445。在图4B的左侧是储库组件1250的后部透视图，其中“后”是储库组件450的未耦合到切向流组件的一侧。看到渗余物储库452、渗透物储库454和密封垫445。
TFF装置可以由其中通道(和通道分支)可以被磨铣的任何稳健材料制成，包括不锈钢、硅、玻璃、铝或塑料，所述塑料包括环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜和聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。如果TFF装置/模块是一次性的，优选地它由塑料制成。在一些实施方案中，用于制造TFF装置/模块的材料是导热的，使得细胞培养物可以被加热或冷却至期望的温度。在某些实施方案中，TFF装置使用上文提及的适于这种大规模生产技术的材料通过以下形成：精密机械加工、激光加工、放电加工(用于金属装置)；湿法或干法蚀刻(用于硅装置)；干法或湿法蚀刻、粉末或喷砂、光结构化(photostructuring)(用于玻璃装置)；或热成型、注射成型、热压花、或激光加工(用于塑料装置)。
图4C描绘了图4B所示的储库组件450的俯视图。图4D描绘了用于图4B所示的储库组件450的盖444，并且图4E描绘了在操作中设置在图4B所示的储库组件450的盖444上的密封垫445。图4C是储库组件450的俯视图，示出了两个渗余物储库452的顶部，一个在渗透物储库454的一侧。还看到凹槽432和流体通道434，凹槽432与气动端口(未示出)配合，流体通道434位于渗余物储库452的底部，流体通道434通过渗透物构件420和膜424(也未示出)中的渗余物端口的通孔将渗余物储库452与渗余物端口428(未示出)流体地耦合。图4D描绘了被配置成设置在储库组件450顶部的盖444。盖444在渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的顶部具有圆形开孔。同样，在渗余物储库452的底部可以看到流体通道434，其中流体通道434将渗余物储库452与渗余物端口428(未示出)流体地耦合。还示出了用于每个渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的三个气动端口430。图4E描绘了密封垫445，该密封垫445被配置成设置在储库组件450的盖444上。可见用于每个渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的三个流体传输端口442。同样，示出了用于每个渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的三个气动端口430。
用于细胞生长的总工作流程包括将待生长的细胞培养物装载到第一渗余物储库中，任选地使空气或合适的气体鼓泡通过细胞培养物，使细胞培养物通过或流经第一渗余物端口，然后切向通过TFF通道结构，同时通过渗透物端口406之一或二者收集培养基或缓冲液，通过第二渗余物端口404将细胞培养物收集到第二渗余物储库中，任选地向细胞培养物中添加另外的或不同的培养基，并任选地使空气或气体鼓泡通过细胞培养物，然后重复所述过程，全部同时连续地或以期望的间隔测量例如渗余物储库中细胞培养物的光密度。使用600nm发光二极管(LED)以编程的时间间隔完成光密度(OD)的测量，该发光二极管(LED)已经通过光学器件(optic)成列布置(columnated)到包含生长细胞的一个或更多个渗余物储库中。光继续通过收集光学器件到达检测系统，该检测系统由(数字)增益控制硅光电二极管组成。通常，光密度显示为光衰减器的功率传输因子(power transmissionfactor)的以10为底数的对数的绝对值：OD＝-log10(断电/通电)。由于OD是光学衰减的度量，即吸收、散射和反射的总和，TFF装置OD测量记录了总的功率传输，因此随着细胞生长和群体变得稠密，OD(信号损失)也会增加。OD系统针对OD标准进行预校准，这些值存储在可由测量程序访问的板载存储器中。
在通道结构中，将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧(渗余物侧422)，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的滤液或渗透物侧(例如，渗透物构件420)。将空气或其他合适的气体鼓泡通过细胞培养物，既能通气又能混合培养物以促进细胞生长。在过程期间，在流过通道结构期间被去除的培养基通过渗透物/滤液端口406去除。可选地，细胞可以在鼓泡或搅拌下在一个储库中生长，而不使细胞从一个储库通过TFF通道到达另一个储库。
用于使用TFF装置/模块的细胞浓缩的总工作流程包括使细胞培养物或细胞样品切向流过通道结构。如同细胞生长过程，将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的渗透物/滤液侧(例如，渗透物构件420)。在过程中，培养基或缓冲液中的固定体积的细胞被驱动通过装置，直至细胞样品被收集到一个渗余物端口404中，并且已经通过膜的培养基/缓冲液通过一个或两个渗透物/滤液端口406收集。所有类型的原核细胞和真核细胞-黏附细胞和非黏附细胞二者-均可以在TFF装置中生长。黏附细胞可以在悬浮在流过TFF装置的培养基中的珠或其他细胞支架上生长。
用于将细胞悬浮在细胞浓缩装置/模块中的培养基或缓冲液可以是用于被转化或转染的细胞类型的任何合适的培养基或缓冲液，诸如LB、SOC、TPD、YPG、YPAD、MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks、PBS和林格氏溶液，其中培养基可以作为试剂盒的一部分提供在试剂筒中。对于黏附细胞的培养，细胞可以置于珠、微载体或悬浮在培养基中的其他类型的支架上。大多数正常的哺乳动物组织来源的细胞-除了那些来自造血系统的细胞-是锚定依赖性的，并且需要表面或细胞培养支持物才能正常增殖。在本文描述的旋转生长瓶中，利用了微载体技术。特殊用途的微载体通常具有100-300μm的直径，并且密度略大于培养基的密度(因此便于细胞和培养基的容易分离，例如用于培养基交换)，然而密度也必须足够低，以允许载体在最小搅拌速率完全悬浮，从而避免对细胞的流体动力损伤。有许多不同类型的微载体可用，并且不同的微载体针对不同类型的细胞进行了优化。有带正电荷的载体，诸如Cytodex 1(基于葡聚糖，GE Healthcare)、DE-52(基于纤维素，Sigma-Aldrich Labware)、DE-53(基于纤维素，Sigma-Aldrich Labware)和HLX 11-170(基于聚苯乙烯)；胶原蛋白或ECM-(细胞外基质)涂层载体，诸如Cytodex 3(基于葡聚糖，GE Healthcare)或HyQ-spherePro-F 102-4(基于聚苯乙烯，Thermo Scientific)；无电荷载体，如Hyq-sphere P 102-4(Thermo Scientific)；或基于明胶(Cultisphere，Percell Biolytica)或纤维素(Cytopore，GE Healthcare)的大孔载体。
在细胞生长和浓缩过程二者中，使细胞样品通过TFF装置并在一个渗余物端口404中收集细胞，同时在一个渗透物/滤液端口406中收集培养基，这被认为是细胞样品的“一次通过”。渗余物储库之间的转移“翻转”了培养物。对于给定的通过，分别收集细胞和培养基的渗余物端口和渗透物端口驻留于TFF装置/模块的同一端，流体连接被布置成使得渗余物和渗透物/滤液侧存在两个不同的流动层，但是如果渗余物端口404驻留于装置/模块的渗余物构件上(即，细胞被驱动通过膜上方的通道，并且滤液(培养基)通过膜下方的通道部分)，渗透物/滤液端口406会驻留于装置/模块的渗透物构件上，并且反之亦然(即，如果细胞样品被驱动通过膜下方的通道，滤液(培养基)通过膜上方的通道部分)。由于用于通过TFF装置的流动通道转移细胞培养物和流体的高压，重力的影响可以忽略不计。
在生长和浓缩过程的任一种“通过”结束时，细胞样品通过渗余物端口404并进入渗余物储库(未示出)而被收集。为了起始另一次“通过”，细胞样品再次通过TFF装置，这次的流动方向与第一次通过相反。细胞样品通过渗余物端口404并进入渗余物储库(未示出)而被收集，该储库位于装置/模块与渗余物端口404相对的一端上，渗余物端口404在第一次通过期间用于收集细胞。同样地，在第二次通过时通过膜的培养基/缓冲液通过渗透物端口406或通过两个端口收集，所述渗透物端口406位于装置/模块与渗透物端口406相对的一端上，所述渗透物端口406在第一次通过期间用于收集滤液。重复使渗余物(浓缩的细胞样品)通过装置/模块的交替过程，直至细胞已经生长至期望的光密度，和/或浓缩到期望的体积，并且两个渗透物端口(即，如果存在多于一个)可以在通过期间打开以减少操作时间。此外，缓冲液交换可以通过以下实现：将期望的缓冲液(或新鲜培养基)添加至渗余物储库中的细胞样品，然后起始另一次“通过”，并且重复该过程，直至旧的培养基或缓冲液被稀释并过滤掉并且细胞驻留在新鲜培养基或缓冲液中。注意，缓冲液交换和细胞生长可以(并且通常确实)同时发生，并且缓冲液交换和细胞浓缩可以(并且通常确实)同时发生。关于TFF的进一步信息和替代实施方案，参见例如2018年9月7日提交的USSN 62/728,365；2019年6月5日提交的USSN 62/857,599；和2019年6月27日提交的USSN 62/867,415。
细胞转化模块
图5A描绘了可与TFF模块一起用于自动化多模块细胞处理仪器中的示例性组合试剂筒和电穿孔装置500(“筒”)。此外，在某些实施方案中，用于制造筒的材料是导热的，因为在某些实施方案中，筒500接触加热或冷却试剂储库或储库504中的试剂的热装置(未示出)，诸如Peltier装置或热电冷却器。试剂储库或储库504可以是如图5A所示的单个试剂管插入其中的储库，或者试剂储库可以在没有插入管的情况下容纳试剂。此外，试剂筒中的储库可以被配置用于管、共同连接的管和试剂的直接填充的任何组合。
在一种实施方案中，试剂筒500的试剂储库或储库504被配置成容纳各种尺寸的管，包括例如250ml管、25ml管、10ml管、5ml管和Eppendorf管或微量离心管。在又另一种实施方案中，所有储库可以被配置为容纳相同尺寸的管，例如5ml管，并且储库插入物可以用于容纳试剂储库中的较小管。在又另一种实施方案中，特别是在试剂筒是一次性的实施方案中，试剂储库在没有插入管的情况下容纳试剂。在该一次性实施方案中，试剂筒可以是试剂盒的一部分，其中试剂筒预先填充有试剂，并且容器或储库用例如箔、热封丙烯酸树脂等密封，并呈现给消费者，然后试剂筒可以用于自动化多模块细胞处理仪器中。考虑到本公开内容，如本领域普通技术人员将理解的，包含在试剂筒中的试剂将根据工作流程而变化；即，试剂将根据细胞在自动化多模块细胞处理仪器中经受的过程而变化，例如蛋白质产生、细胞转化和培养、细胞编辑等。
试剂，诸如细胞样品、酶、缓冲液、核酸载体、表达盒、蛋白质或肽、反应组分(诸如例如MgCl2、dNTP、核酸组装试剂、缺口修复试剂等)、洗涤溶液、乙醇和用于核酸纯化和分离的磁珠等，可以位于试剂筒中已知的位置。在筒500的一些实施方案中，筒包括处理器(未示出)可读的用于分配试剂的脚本(未示出)。此外，作为自动化多模块细胞处理仪器中的一个组件的筒500可以包括指定要由自动化多模块细胞处理仪器执行的两个、三个、四个、五个、十个或更多个过程的脚本。在某些实施方案中，试剂筒是一次性的，并且预包装有定制为执行特定细胞处理方案(例如，基因组编辑或蛋白质产生)的试剂。因为试剂筒内容物不同，而自动化多模块细胞处理仪器或系统的组件/模块可以不同，所以与特定试剂筒相关联的脚本与所使用的试剂和所执行的细胞处理相匹配。因此，例如，试剂筒可以预包装有用于基因组编辑的试剂和指定用于在自动化多模块细胞处理仪器中执行基因组编辑的过程步骤的脚本，或者例如用于蛋白质表达的试剂和指定用于在自动化多模块细胞处理仪器中执行蛋白质表达的过程步骤的脚本。
例如，试剂筒可以包括脚本，以从储库吸移感受态细胞，将细胞转移到转化模块，从试剂筒中的另一个储库吸移包含具有表达盒的载体的核酸溶液，将核酸溶液转移到转化模块，启动转化过程特定时间，然后将转化的细胞移动到试剂筒中的又另一个储库或自动化多模块细胞处理仪器中的另一个模块，诸如细胞生长模块。在另一个实例中，试剂筒可以包括用于以下的脚本：从试剂筒中的储库转移包含载体的核酸溶液，转移试剂盒中的储库中包含编辑寡核苷酸盒的核酸溶液，以及将核酸组装混合物从另一个储库转移到核酸组装/脱盐模块(如果存在)。脚本还可以指定由自动化多模块细胞处理仪器中的其他模块执行的过程步骤。例如，脚本可以指定，将核酸组装/脱盐储库加热至50℃30分钟以产生组装的产物；以及通过基于磁珠的核酸纯化使组装的产物脱盐和重悬，包括一系列移液管转移以及磁珠、乙醇洗涤和缓冲液的混合。
如下文关于图5B和图5C描述的，用于自动化多模块细胞处理仪器的示例性试剂筒可以包括一个或更多个电穿孔装置，优选地流通式电穿孔(FTEP)装置。在又其他实施方案中，试剂筒与转化模块分离。电穿孔是一种广泛使用的细胞膜透化方法，通过用电刺激在细胞膜中暂时产生孔来实现。电穿孔的应用包括将DNA、RNA、siRNA、肽、蛋白质、抗体、药物或其他物质递送到各种细胞，诸如哺乳动物细胞(包括人类细胞)、植物细胞、古生菌、酵母、其他真核细胞、细菌和其他细胞类型。电刺激也可用于杂交瘤或其他融合细胞的产生中的细胞融合。在典型的电穿孔程序期间，将细胞悬浮在有利于细胞存活的缓冲液或培养基中。对于细菌细胞电穿孔，通常使用低电导介质诸如水、甘油溶液等降低瞬时高电流产生的热量。在传统的电穿孔装置中，细胞和待电穿孔到细胞中的材料(统称为“细胞样品”)被放置在嵌有两个用于放电的扁平电极的比色皿中。例如，Bio-Rad(Hercules,Calif.)制造了GENEPULSER XCELLTM系列产品，以对比色皿中的细胞进行电穿孔。传统上，电穿孔需要高场强；然而，包含在试剂筒中的流通式电穿孔装置实现了高效细胞电穿孔与低毒性。本公开内容的试剂筒允许特别地容易与机器人液体操作仪器成一体，该机器人液体操作仪器通常用于自动化仪器和系统，诸如空气置换移液器。这样的自动化仪器包括但不限于来自Tecan(Mannedorf,Switzerland)、Hamilton(Reno,NV)、Beckman Coulter(Fort Collins,CO)等的现成的自动化液体操作系统。
图5B和图5C分别是示例性FTEP装置550的顶部透视图和底部透视图，该装置可以是图5A中的试剂筒500的一部分(例如，其中的部件)，或者可以是独立的模块；即，不是试剂筒或其他模块的一部分。图5B描绘了FTEP装置550。FTEP装置550具有限定细胞样品入口552和细胞样品出口554的孔。图5C是图5B的FTEP装置550的底部透视图。在该视图中可以看到入口孔552和出口孔554。在图5C中还看到对应于孔552的入口562的底部、对应于出口孔554的出口564的底部、限定的流动通道566的底部以及流动通道566两侧上的两个电极568的底部。FTEP装置可以包括推拉气动装置，以允许多道电穿孔程序；即，对于一次电穿孔，待电穿孔的细胞可以从入口被“拉”向出口，然后从FTEP装置的出口端被“推”向入口端，以再次在电极之间通过，用于另一次电穿孔。此外，该过程可以重复一次至许多次。有关FTEP装置的更多信息，参见，例如，2019年10月8日发布的USPN 10,435,713；2019年10月15日发布的USPN 10,443,074；2019年6月18日发布的USPN 10,323,258；2019年12月17日发布的USPN10,508,288；2019年9月17日发布的USPN 10,415,058；以及2019年8月26日提交的USSN 16/550,790；和2019年9月14日提交的USSN 16/571,080。此外，试剂筒的其他实施方案可以提供或容纳未被配置为FTEP装置的电穿孔装置，诸如在2018年8月22日提交的USSN 16/109,156中描述的那些。对于在本发明的自动化多模块细胞处理仪器中有用的试剂筒，参见例如2019年8月13日发布的USPN 10,376,889；2019年9月10日发布的10,406,525；2019年11月19日发布的10,478,822；2020年2月3日发布的10,576,474；和2020年1月22日提交的USSN 16/749,757。
FTEP装置的另外细节在图5D-图5F中示出。注意，在图5D-图5F的FTEP装置中，电极被放置成使得第一电极被放置在流动通道的入口和狭窄区域之间，并且第二电极被放置在流动通道的狭窄区域和出口之间。图5D示出了FTEP装置550的俯视平面图，该装置具有用于将含有细胞和外源物质的流体引入FTEP装置550的入口552和用于在电穿孔后从FTEP取出转化的细胞的出口554。电极568通过装置中的通道(未示出)引入。图5E示出了从FTEP装置550的顶部的剖视图，其中入口552、出口554和电极568相对于流动通道566定位。图5F示出了具有入口552和入口通道572以及出口554和出口通道574的FTEP装置550的侧面剖视图。电极568位于电极通道576中，使得它们与流动通道566流体连通，但不直接位于细胞穿过流动通道566的路径中。注意，第一电极放置在流动通道的入口和狭窄区域之间，并且第二电极放置在流动通道的狭窄区域和出口之间。在该装置的这一方面中，电极568位于电极通道576中，电极通道576通常垂直于流动通道566，使得包含细胞和外源物质的流体从入口通道572通过流动通道566流到出口通道574，并且在该过程中，流体流入电极通道576以与电极568接触。在这方面，入口通道、出口通道和电极通道都源自装置的同一平面侧。然而，在某些方面，电极可以从与入口通道和出口通道不同的FTEP装置的平面侧引入。
在本公开内容的FTEP装置中，转化的毒性水平产生电穿孔后大于30％的存活细胞，优选地转化后大于35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至99％的存活细胞，这取决于细胞类型和引入细胞的核酸。
FTEP装置的壳体可以由许多材料制成，这取决于FTEP装置是要重复使用、高压灭菌还是一次性使用，包括不锈钢、硅、玻璃、树脂、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其他聚合物的共聚物。类似地，装置中通道的壁可以由任何合适的材料制成，包括硅酮、树脂、玻璃、玻璃纤维、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其他聚合物的共聚物。优选的材料包括结晶苯乙烯、环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)，这允许除了电极和例如底部密封膜(如果存在)之外，该装置可以通过注射成型整体形成。
本文描述的FTEP装置(或FTEP装置的部分)可以通过各种技术产生或制造，例如作为整个装置或通过产生熔合或以其他方式耦合的结构层。例如，对于金属FTEP装置，制造可以包括精密机械加工或激光加工；对于硅FTEP装置，制造可以包括干法或湿法蚀刻；对于玻璃FTEP装置，制造可以包括干法或湿法蚀刻、喷粉(powderblasting)、喷砂或光结构化；以及对于塑料FTEP装置，制造可以包括热成型、注射成型、热压花或激光加工。FTEP装置的部件可以单独制造并且然后组装，或者FTEP装置的某些部件(或者甚至除了电极之外的整个FTEP装置)可以作为单个实体制造(例如，使用3D打印)或模制(例如，使用注射成型)，在模制之后添加其他部件。例如，壳体和通道可以被制造或模制成单个实体，电极随后被添加以形成FTEP单元。可选地，FTEP装置也可以形成为两个或更多个平行层，例如，具有水平通道和过滤器的层、具有垂直通道的层以及具有入口端口和出口端口的层，这些层被单独制造和/或模制并在制造之后组装。
在特定方面，可以使用电路板作为基底来制造FTEP装置，其中电极、过滤器和/或流动通道以期望的配置形成在电路板上，并且包含例如一个或更多个入口和出口通道和/或流动通道的装置的剩余壳体作为单独的层形成，然后密封到电路板上。将壳体的顶部密封到电路板上提供了本公开内容的FTEP装置的不同元件的期望配置。此外，可以在单个基底上制造两个到许多个FTEP装置，然后彼此其后分离或者并行使用。在某些实施方案中，FTEP装置是可重复使用的，并且在某些实施方案中，FTEP装置是一次性的。在另外的实施方案中，FTEP装置可以是可高压灭菌的。
电极508可以由任何合适的金属形成，诸如铜、不锈钢、钛、铝、黄铜、银、铑、金或铂或石墨。一种优选的电极材料是合金303(UNS330300)奥氏体不锈钢。施加的电场可以破坏由金属(如铝)制成的电极。如果期望多次使用(即，非一次性)流通式FTEP装置，不同于一次性的一次使用流通式FTEP装置，电极板可以涂有对电化学腐蚀耐受的金属。导电涂层，如贵金属，例如金，可用于保护电极板。
如提及的，FTEP装置可以包括推拉气动装置，以允许多次(multi-pass)电穿孔程序；即，对于一次电穿孔，待电穿孔的细胞可以从入口被“拉”向出口，然后从流通式FTEP装置的出口端被“推”向入口端，以再次在电极之间通过，进行另一次电穿孔。这个过程可以重复一次到许多次。
根据待电穿孔的细胞类型(例如细菌、酵母、哺乳动物)和电极的配置，流动通道中电极之间的距离可以变化很大。例如，在流动通道宽度减小的情况下，流动通道可以变窄到10μm和5mm之间，或者25μm和3mm之间，或者50μm和2mm之间，或者75μm和1mm之间。流动通道中电极之间的距离可以在1mm和10mm之间，或者2mm和8mm之间，或者3mm和7mm之间，或者4mm和6mm之间。FTEP装置的总尺寸可以是3cm到15cm长，或4cm到12cm长，或4.5cm到10cm长。FTEP装置的总宽度可以是0.5cm到5cm，或者0.75cm到3cm，或者1cm到2.5cm，或者1cm到1.5cm。
流动通道变窄的区域足够宽，使得至少两个细胞可以适于并排在变窄的部分中。例如，典型的细菌细胞直径为1μm；因此，用于转化这样的细菌细胞的FTEP装置的流动通道的变窄部分为至少2μm宽。在另一个实例中，如果哺乳动物细胞直径为约50μm，用于转化这样的哺乳动物细胞的FTEP装置的流动通道的变窄部分为至少100μm宽。即，FTEP装置的变窄部分不会物理扭曲或“挤压”被转化的细胞。
在FTEP装置的实施方案中，其中储库用于将细胞和外源物质引入FTEP装置，储库的体积范围为100μL至10mL，或500μL至75mL，或1mL至5mL。FTEP中的流速范围为每分钟0.1mL至5mL，或每分钟0.5mL至3mL，或每分钟1.0mL至2.5mL。FTEP装置中的压力范围为1-30psi，或2-10psi，或3-5psi。
为了避免电极之间的场强不同，电极应当平行排列。此外，电极的表面应当尽可能光滑，而无针孔或峰。具有1μm至10μm的粗糙度Rz的电极是优选的。在本发明的另一种实施方案中，流通式电穿孔装置包括至少一个另外的电极，该电极向FTEP装置施加地电位。
细胞单个化和富集装置
图6A描绘了固体壁装置6050和用于在固体壁装置中的微孔中使细胞单个化的工作流程。在图的(i)的左上方，描绘了具有微孔6052的固体壁装置6050。基底6050的部分6054在(ii)示出，还描绘了微孔6052。在(iii)，示出了固体壁装置6050的侧截面，并且已经装载了微孔6052，其中在该实施方案中已经发生了泊松装载(Poisson loading)或大致上泊松装载；即，每个微孔具有一个细胞或不具有细胞，并且任何一个微孔具有多于一个细胞的可能性低。在(iv)，图示出了工作流程6040，其中具有微孔6052的基底6050显示出每个微孔具有一个细胞的微孔6056、微孔中没有细胞的微孔6057以及微孔中具有两个细胞的一个微孔6060。在步骤6051，允许微孔中的细胞倍增大约2-150倍以形成克隆集落(v)，然后允许进行编辑6053。
在编辑6053后，已经被编辑的细胞集落中的许多细胞由于由有效编辑引起的双链切割而死亡，并且对于确实存活但必须在编辑后修复和恢复的编辑的细胞存在生长延滞(微孔6058)，其中不经历编辑的细胞茁壮成长(微孔6059)(vi)。允许所有细胞继续生长以建立集落并且标准化，其中微孔6058中编辑的细胞的集落在尺寸和/或细胞数方面赶上没有经历编辑的微孔6059中的细胞(vii)。在细胞集落被标准化后，微孔中所有细胞的任一汇集6060就可以发生，在这种情况下，通过消除来自非编辑细胞和来自编辑的适应度效应的偏倚，针对编辑的细胞富集细胞；可选地，在编辑后监测微孔中的集落生长，并且鉴定和选择6061(例如“择优选取(cherry picked)”)生长缓慢的集落(例如微孔6058中的细胞)，产生甚至更为富集的编辑的细胞。
在使细胞生长时，所使用的培养基当然取决于被编辑的细胞类型例如细菌、酵母或哺乳动物。例如，用于酵母细胞生长的培养基包括LB、SOC、TPD、YPG、YPAD、MEM和DMEM。
可用于执行图6A中描绘的方法的模块是固体壁分离、孵育和标准化(SWIIN)模块。图6B从分解顶部透视图描绘了SWIIN模块650的实施方案。在SWIIN模块650中，渗余物构件形成在SWIIN模块组件顶部的底端，并且渗透物构件形成在SWIIN模块组件底部的顶端。
图6B中的SWIIN模块650自上而下包括储库密封垫或盖658、渗余物构件604(其中渗余物流动通道不可见于该图6B中)、与过滤器(过滤器未见于图6B中)锻造的穿孔构件601、包括集成储库(渗透物储库652和渗余物储库654)的渗透物构件608、以及密封渗透物储库652和渗余物储库654底部的两个储库密封件662。可以看到渗透物通道660a设置在渗透物构件608的顶部，由蛇形通道660a的凸起部分676限定，还可以看到超声波突出部(ultrasonic tabs)664设置在渗透物构件608的顶部。在该图6B中看不到在穿孔构件601上形成孔的穿孔；然而，看到容纳超声波突出部664的通孔666。此外，支持物670设置在SWIIN模块650的任一端，以支持SWIIN模块650，并将渗透物构件608和渗余物构件604提升到储库652和654上方，以使进入从渗透物储库到蛇形通道660a的流体路径或从渗余物储库到蛇形通道660b的流体路径(在该图6B中看不到这两个流体路径)的气泡或空气最小化。
在该图6B中，可以看出，设置在渗透物构件608顶部的蛇形通道660a在渗透物构件608的大部分长度以及渗透物构件608的大部分宽度上横穿渗透物构件608，除了不横穿渗透物构件608的包括渗透物储库652和渗余物储库654的部分之外。如本文中关于渗余物构件或渗透物构件中的分配通道所使用的，“大部分长度”意指渗余物构件或渗透物构件长度的约95％，或渗余物构件或渗透物构件长度的约90％、85％、80％、75％或70％。如本文中关于渗余物构件或渗透物构件中的分配通道所使用的，“大部分宽度”意指渗余物构件或渗透物构件宽度的约95％，或渗余物构件或渗透物构件宽度的约90％、85％、80％、75％或70％。
在SWIIN模块的该实施方案中，穿孔构件包括通孔，以容纳设置在渗透物构件上的超声波突出部。因此，在该实施方案中，穿孔构件由316不锈钢制成，并且穿孔形成微孔的壁，而过滤器或膜用于形成微孔的底部。通常，穿孔(微孔)直径为约150μm-200μm，并且穿孔构件为约125μm深，导致微孔具有约2.5nl的体积，总共大约200,000个微孔。微孔之间的距离是中心至中心约279μm。虽然此处微孔具有约2.5nl的体积，但微孔的体积可以是1nl至25nl，或优选地2nl至10nl，并且甚至更优选地2nl至4nl。至于过滤器或膜，像前面描述的过滤器一样，适合使用的过滤器是耐溶剂的、在过滤期间无污染，并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸。例如，为了保留小细胞类型，诸如细菌细胞，孔径可以低至0.10μm，然而对于其他细胞类型(例如，诸如对于哺乳动物细胞)，孔径可以高至10.0μm-20.0μm或更大。事实上，可用于细胞浓缩装置/模块中的孔径包括具有以下尺寸的过滤器：0.10μm、0.11μm、0.12μm、0.13μm、0.14μm、0.15μm、0.16μm、0.17μm、0.18μm、0.19μm、0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以及更大。过滤器可以由任何合适的材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙或玻璃纤维。
配合的蛇形通道的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或具有大致直边的另一种形状，截面可以是约2mm到15mm宽，或者3mm到12mm宽，或者5mm到10mm宽。如果配合的蛇形通道的截面通常是圆形、卵形或椭圆形，通道的半径可以是以水力半径约3mm到20mm，或者以水力半径5mm到15mm，或者以水力半径8mm到12mm。
蛇形通道660a和660b可以具有大致相同的体积或不同的体积。例如，蛇形通道的每个“侧面”或部分660a、660b可以具有例如2mL的体积，或者渗透物构件608的蛇形通道660a可以具有2mL的体积，并且渗余物构件604的蛇形通道660b可以具有例如3mL的体积。蛇形通道中的流体体积范围可以是约2mL至约80mL、或约4mL至60mL、或5mL至40mL、或6mL至20mL(注意，这些体积适用于包括例如50-500K穿孔构件的SWIIN模块)。储库的体积范围可以是5mL至50mL、或7mL至40mL、或8mL至30mL或10mL至20mL，并且所有储库的体积可以相同或储库的体积可以不同(例如，渗透物储库的体积大于渗余物储库的体积)。
渗透物构件608和渗余物构件604的蛇形通道部分660a和660b分别为约200mm长、130mm宽和4mm厚，尽管在其他实施方案中，渗余物构件和渗透物构件的长度可为75mm至400mm，或长度为100mm至300mm，或长度为150mm至250mm；宽度为50mm至250mm，或宽度为75mm至200mm，或宽度为100mm至150mm；以及厚度为2mm至15mm，或厚度为4mm至10mm，或厚度为5mm至8mm。实施方案渗余物(和渗透物)构件可以由PMMA(聚(甲基丙烯酸甲酯))制成，或者可以使用其他材料，包括聚碳酸酯、环烯烃共聚物(COC)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚砜、聚氨酯以及这些和其他聚合物的共聚物。优选地，至少渗余物构件由透明材料制成，使得细胞可以被可视化(例如，参见图6E及其描述)。例如，通过例如基于具有相差的空孔图像的密度变化测量，或者如果例如使用发色标记，诸如发色蛋白，来给细胞增加可区分的颜色，摄像机可以用于监测细胞生长。尽管也可以使用荧光细胞标记、荧光蛋白和化学发光细胞标记，但发色标记诸如blitzen blue、dreidel teal、virginia violet、vixen purple、prancer purple、tinsel purple、maccabee purple、donner magenta、cupid pink、seraphina pink、scrooge orange和leor orange(Chromogenic ProteinPaintbox，均可从ATUM(Newark,CA)获得)避免了使用荧光的需要。
因为渗余物构件优选地是透明的，所以SWIIN模块中的集落生长可以通过自动化装置，诸如JoVE(ScanLagTM system,Cambridge,MA)销售的装置进行监测(也参见Levin-Reisman等人,Nature Methods,7:737-39(2010))。例如哺乳动物细胞的细胞生长可以通过例如由IncuCyte(Ann Arbor,MI)销售的生长监测器来监测(也参见，Choudhry,PLos One,11(2):e0148469(2016))。此外，可以使用自动化集落选取仪，诸如由例如TECAN(PickoloTMsystem,Mannedorf,Switzerland)；Hudson Inc.(RapidPickTM,Springfield,NJ)；Molecular Devices(QPix 400TM system,San Jose,CA)；以及Singer Instruments(PIXLTMsystem,Somerset,UK)销售的那些。
由于SWIIN模块的加热和冷却，冷凝物可能积聚在渗余物构件上，这可能干扰正在生长的细胞集落的精确可视化。SWIIN模块650的冷凝可以通过例如在SWIIN模块650的顶部(例如渗余物构件)上移动加热的空气，或者通过在渗余物构件604的至少蛇形通道部分660b上应用透明加热盖来控制。参见例如图6E及下文对其的描述。
在SWIIN模块650中，细胞和培养基-在适于穿孔构件的微孔中细胞的泊松或大致泊松分布的稀释度-从渗余物构件604中的端口流入蛇形通道660b，并且细胞在微孔中沉淀，同时培养基穿过过滤器进入渗透物构件608中的蛇形通道660a。由于细胞不能穿过过滤器603，细胞被保留在穿孔构件601的微孔中。合适的培养基可以通过渗透物端口611引入渗透物构件608。培养基向上流过过滤器603，以滋养穿孔构件601的微孔(穿孔)中的细胞。此外，缓冲液交换可以通过循环培养基通过渗余物和渗透物构件来实现。在操作中，细胞被沉积到微孔中，生长初始的例如2-100倍增，编辑通过例如将SWIIN的温度升高到42℃以诱导温度诱导型启动子来诱导，或者通过从渗透物构件中去除生长培养基并用包含诱导诱导型启动子的化学组分的培养基替换生长培养基来诱导。
在编辑已经发生后，可以降低SWIIN的温度，或者可以去除诱导培养基并用缺乏化学组分的新鲜培养基代替，从而使诱导型启动子失活。然后，细胞在SWIIN模块650中继续生长，直到微孔中细胞集落的生长被标准化。对于标准化方案，在集落被标准化后，通过向渗透物构件蛇形通道660a施加并从而向过滤器603施加流体或空气压力(或二者)，将集落从微孔中冲洗出来并汇集。可选地，如果期望择优选取，监测微孔中细胞集落的生长，并直接选择生长缓慢的集落；或者，快速生长的集落被消除。
图6C是具有渗余物和穿孔构件的SWIIN模块的部分横截面的顶部透视图。在该图6C中，可以看到，蛇形通道660a设置在渗透物构件608的顶部，由凸起部分676限定，并且在渗透物构件608的大部分长度和宽度上横穿渗透物构件608，除了不横穿渗透物构件608的包括渗透物和渗余物储库的部分之外(注意，只能看到一个渗余物储库652)。从左向右移动，储库密封垫658设置在渗余物构件604的集成储库盖678(盖未见于该图6C中)上。密封垫658包括储库进入孔632a、632b、632c和632d，以及气动端口633a、633b、633c和633d。在最左端还有支持物670。可以看到设置在渗透物储库652下方的两个储库密封件662中的一个。除了渗余物构件在横截面中，穿孔构件601和过滤器603(过滤器603未见于该图6C中)也是横截面。注意，在SWIIN模块650的右端和限定蛇形通道660a的通道转弯的凸起部分676上设置有多个超声波突出部664，包括延伸穿过穿孔构件601的通孔666的超声波突出部664。在渗透物构件608的末端远端储库652、654处也有支持物670。
图6D是组装的SWIIIN模块650的侧面透视图，从右至左包括设置在渗余物构件604的集成储库盖678(未示出)上的储库密封垫658。密封垫658可以由橡胶、硅酮、丁腈橡胶、聚四氟乙烯、诸如聚三氟氯乙烯的塑料聚合物或其他柔性可压缩材料制成。密封垫658包括储库进入孔632a、632b、632c和632d，以及气动端口633a、633b、633c和633d。渗透物构件608的支持物670也在最左端。此外，可以看到渗透物储库652以及一个储库密封件662。在最右端是第二支持物670。
在大多数实施方式中，期望对生长在SWIIN的孔中的细胞集落进行成像，例如，以监测细胞生长和装置性能二者，并且成像对于择优选取实施方式是必要的。实时监测SWIIN中的细胞生长需要背光、渗余物板(顶板)冷凝管理和系统级温度控制、气流和热管理方法。在一些实施方式中，成像采用具有足够分辨率的照相机或CCD器件，以能够对单个孔成像。例如，在一些配置中，使用具有9像素间距的相机(即，每个孔的中心到中心有9个像素)。在一些实施方式中，处理图像可以利用灰度读取图像，从低到高对每个像素进行评级，其中没有细胞的孔会是最亮的(由于来自背光的完全或接近完全的光透射)，并且具有细胞的孔会是暗的(由于细胞阻挡来自背光的光透射)。在处理图像之后，进行阈值处理(thresholding)以确定哪些像素会被识别为(called)“亮”或“暗”，进行斑点寻找以找到亮像素并将它们排列成块，并且然后将斑点排列在对应于斑点的六边形像素网格上。在布置后，通过例如观察斑点中间的一个或更多个像素、在随机或预设位置观察若干个至许多像素、或者对斑点中的X个像素取平均值来提取每个孔的强度度量。此外，可以减去背景强度。阈值处理再次用于将每个孔识别为阳性(例如，含有细胞)或阴性(例如，孔中没有细胞)。成像信息可以若干方式使用，包括在监测细胞生长的时间点拍摄图像。监测细胞生长可用于，例如，去除快速生长细胞的“松饼顶部(muffin tops)”，然后去除所有细胞或如上文描述地以“轮”去除细胞，或从特定孔中回收细胞(例如，缓慢生长的细胞集落)；可选地，可以鉴定包含快速生长细胞的孔，并且可以将覆盖快速生长细胞集落的UV区域投射(或用快门光栅化)到SWIIN上，以照射或抑制这些细胞的生长。成像也可用于确保蛇形通道660中的适当流体流动。
图6E描绘了图6B-图6D中的SWIIN模块的实施方案，所述SWIIN模块还包括热管理系统，该热管理系统包括加热器和加热盖。加热器盖促进成像所需的冷凝管理。组件698包括截面中纵向可见的SWIIN模块650，其中可以看到一个渗透物储库652。盖694紧邻SWIIN模块650上方设置，并且背光680紧邻SWIIN模块650下方设置，这允许成像。在背光和SWIIN模块的下方和附近是绝缘体682，其设置在散热器684上。在该图6E中，散热器的散热片在页面的外面。此外，还有轴流风扇686和散热器688，以及两个热电冷却器692，和控制气动器件、热电冷却器、风扇、电磁阀等的控制器690。箭头表示进入单元的冷空气和从单元移除的热空气。应注意，加热控制允许许多不同类型的细胞(原核和真核)以及例如对温度敏感的细胞株的生长，并且允许使用温度敏感的启动子。温度控制允许调整方案以解决转化效率、细胞生长和生存力的差异。关于固体壁分离孵育和标准化装置的更多细节，参见2019年4月30日提交的USSN 16/399,988；2019年6月26日提交的USSN 16/454,865；和2019年8月14日提交的USSN 16/540,606。关于替代的分离、培养和标准化模块，参见2019年8月8日提交的USSN 16/536,049。
自动化多模块细胞处理仪器的使用
图7是包括用于诱导的编辑和富集编辑的细胞的主体液体生长模块(bulk liquidgrowth module)的示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化框图。细胞处理仪器700可以包括壳体744、待转化或转染的细胞的储库502和生长模块(细胞生长装置)704。将待转化的细胞从储库转移至生长模块进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者细胞可以转移至过滤/浓缩模块730，在过滤/浓缩模块730处细胞被赋予电感受态并浓缩至细胞转化的最佳体积。在浓缩后，然后将细胞转移至电穿孔装置708(例如，转化/转染模块)。
除了用于储存细胞的储库之外，系统700可以包括用于储存编辑盒或含核酶的编辑盒716和载体骨架718的储库。将编辑盒或含核酶的编辑盒和载体骨架二者均从试剂筒转移至例如电穿孔装置708，该电穿孔装置708已经包含生长至靶OD并且经由过滤模块730被赋予电感受态的细胞培养物。在电穿孔装置708中，组装的核酸被引入细胞。电穿孔后，细胞被转移到合二为一的恢复/选择模块710。有关多模块细胞编辑仪器的实例，参见2019年4月9日发布的USPN10,253,316；2019年6月25日发布的USPN 10,329,559；2019年6月18日发布的USPN 10,323,242；2019年9月24日发布的USPN 10,421,959；2019年11月5日发布的USPN10,465,185；2019年12月31日发布的USPN 10,519,437；以及2019年11月12日提交的USSN16/680,643；2019年10月29日提交的USSN 16/666,964；2020年1月23日提交的USSN 16/750,369，其全部通过引用以其整体并入本文。
在恢复和任选地选择710后，细胞被转移至生长和编辑模块740。允许细胞生长和发生编辑。在一些实施方案中，通过处于诱导型启动子控制下的核酸酶和gRNA之一或二者的转录诱导编辑。在一些实施方案中，诱导型启动子是pL启动子，其中启动子通过温度升高而被激活，并通过温度降低而“失活”。
恢复、选择、生长、编辑和储存模块可以全部是分开的，可以如图2A中示出地排列和组合，或者可以以其他配置排列或组合。在某些实施方案中，恢复和选择在一个模块中进行，并且生长和编辑在分开的模块中进行。可选地，恢复、选择、生长、编辑和再生长在单个模块中进行。
在细胞被编辑和再生长(例如，从编辑中恢复)后，细胞可以被储存在例如储存模块712中，在储存模块712中细胞可以保持在例如4℃，直至细胞被取回用于进一步研究。可选地，细胞可以用于另一轮编辑。多模块细胞处理仪器由处理器742控制，处理器742被配置成基于使用者输入、如由一个或更多个脚本指导或作为使用者输入或脚本的组合来操作仪器。处理器742可以控制系统700的各个模块的定时、持续时间、温度和操作以及试剂的分配。例如，处理器742可以在转化后使细胞冷却，直至编辑是期望的，此时温度可以升高至有利于基因组编辑和细胞生长的温度。处理器可以用使用者可以从中选择的标准协议参数来编程，使用者可以手动指定一个或更多个参数，或者与试剂筒相关的一个或更多个脚本可以指定一个或更多个操作和/或反应参数。此外，处理器可以通知使用者(例如，经由智能电话或其他装置的应用)细胞已经达到靶OD，以及向使用者更新多模块系统中的各个模块中的细胞的进展。
自动化多模块细胞处理仪器700是核酸酶指导的基因组编辑系统，并且可以用于单个编辑系统(其中，例如，使用单个编辑过程经由多重编辑盒将两个或更多个编辑引入细胞基因组)。系统可以被配置成进行顺序编辑，例如，在两轮或更多轮编辑的每一轮中依次使用不同的核酸酶指导的系统在细胞中提供两个或更多个基因组编辑；和/或递归编辑，例如在两轮或更多轮编辑的每一轮中利用单个核酸酶指导的系统在细胞中依次引入两个或更多个基因组编辑。
图8图示了多模块细胞处理仪器的另一种实施方案。该实施方案描绘了对酵母细胞群体进行递归基因编辑的示例性系统。细胞处理仪器800可以包括壳体826、用于存储待转化或转染的细胞的储库812和细胞生长模块(包括例如旋转生长瓶)804。将待转化的细胞从储库转移至细胞生长模块进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者将细胞转移至细胞浓缩模块806，在细胞浓缩模块806处细胞经历缓冲液交换并被赋予电感受态，并且细胞的体积可以显著减低。在将细胞浓缩至适当的体积后，细胞被转移至电穿孔装置808。除了用于储存细胞的储库812之外，多模块细胞处理仪器还包括用于储存载体骨架和编辑盒或含核酶的编辑盒的储库822。将载体骨架和编辑盒或含核酶的编辑盒转移到电穿孔装置808，该电穿孔装置808已经包含生长至靶OD的细胞培养物。在电穿孔装置808中，将核酸电穿孔到细胞中。电穿孔后，将细胞转移到任选的恢复和稀释模块810中，在恢复和稀释模块810处细胞在转化后短暂恢复。
在恢复后，可以将细胞转移至储存模块812，在储存模块812处可以将细胞储存在例如4℃以供后续处理，或者可以将细胞稀释并转移至选择/单个化/生长/诱导/编辑/标准化(SWIIN)模块820。在SWIIN 820中，排列细胞使得每个微孔平均存在一个细胞。排列的细胞可以在选择培养基中，以选择已经用一个或更多个编辑载体转化或转染的细胞。在单个化后，细胞通过2-50倍倍增生长并建立集落。在集落建立后，通过提供诱导编辑的条件(例如温度、添加诱导或阻遏化学物质)诱导编辑。然后启动编辑并允许继续进行，允许细胞在微孔中生长至终末尺寸(例如集落的标准化)，并且然后处理至处治来自该轮编辑的载体的条件。在处治后，细胞可以从微孔中冲洗出来并汇集，然后转移到储存(或恢复)单元812，或者可以转移回生长模块804进行另一轮编辑。在汇集和转移到生长模块之间，通常存在一个或更多个另外的步骤，诸如细胞恢复、培养基交换(使细胞为电感受态)、细胞浓缩(通常通过例如过滤与培养基交换同时进行)。注意，选择/单个化/生长/诱导/编辑/标准化和处治模块可以是相同的模块，其中所有过程都在例如固体壁装置中进行，或者选择和/或稀释可以在分开的容器中发生，然后将细胞转移至固体壁单个化/生长/诱导/编辑/标准化/编辑模块(SWIIN)。类似地，细胞可以在标准化后汇集，转移到单独的容器中，并在单独的容器中处治。作为在例如固体壁装置中单个化的替代方案，可以使转化的细胞在主体液体中生长并且编辑可以在主体液体中诱导。在推定编辑的细胞被汇集后，它们可以经历另一轮编辑，另一轮编辑开始于生长、细胞浓缩和处理以赋予电感受态，以及经由电穿孔模块808通过另一编辑盒中的另一供体核酸转化。
在电穿孔装置808中，选自第一轮编辑的酵母细胞被第二组编辑盒或含核酶的编辑盒和载体骨架转化，并且重复该循环，直至细胞已经被期望数量的例如编辑盒转化和编辑。图8中例示的多模块细胞处理仪器由处理器824控制(处理器824被配置成基于使用者输入来操作仪器)或者由包括与试剂筒相关的至少一个脚本在内的一个或更多个脚本来控制。处理器824可以控制各个过程的定时、持续时间和温度，试剂的分配以及仪器800的各个模块的其他操作。例如，脚本或处理器可以控制细胞、试剂、载体和编辑寡核苷酸的分配；哪些编辑寡核苷酸用于细胞编辑且按什么顺序；恢复和表达模块中使用的时间、温度和其他条件，细胞生长模块中读取OD的波长，细胞生长到的靶OD，以及细胞达到靶OD的靶时间。此外，处理器可以被编程为通知使用者(例如，经由应用)自动化多模块细胞处理仪器中细胞的进展。
鉴于本公开内容，对于本领域普通技术人员来说明显的是，所描述的过程可以是递归和多重化的；即，细胞可以经历关于图7或图8描述的工作流程，然后所得到的编辑的培养物可以经历另一轮(或若干轮或许多轮)使用不同编辑盒(或含核酶的编辑盒)的另外的编辑(例如递归编辑)。例如，来自第一轮编辑的细胞可以被稀释，并且由编辑盒A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑盒B组合，由编辑盒A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑盒C组合，由编辑盒A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑盒D组合，等等，用于第二轮编辑。在第二轮后，可以使每个双重编辑的细胞的等分试样经历第三轮编辑，其中，例如，将AB编辑的、AC编辑的、AD编辑的细胞各自的等分试样与另外的编辑盒(诸如编辑盒X、Y和Z)组合。即，双重编辑的细胞AB可以与编辑盒X、Y和Z组合并且由编辑盒X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的编辑细胞ABX、ABY和ABZ；双重编辑的细胞AC可以与编辑盒X、Y和Z组合并且由编辑盒X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ACX、ACY和ACZ；并且双重编辑细胞AD可以与编辑盒X、Y和Z组合并且由编辑盒X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ADX、ADY和ADZ，等等。在该过程中，可以执行许多编辑的排列和组合，产生非常多样的细胞群体和细胞文库。即，本文公开的方法和组合物允许用以下进行多载体转化：1)具有相同选择标记的骨架文库或具有多于一个选择标记的骨架文库；和2)具有单个gRNA/供体DNA对的编辑盒或含核酶的编辑盒的文库，或具有两个或更多个gRNA/供体DNA对的编辑盒或含核酶的编辑盒的文库。然后，这些多载体转化可以依次执行任意次数，以在每个细胞中引入许多编辑。
在任何递归过程中，有利的是“处治”编辑载体(例如，缺口修复载体骨架+编辑盒或含核酶的编辑盒)。“处治”是一个过程，其中将在先前一轮编辑中使用的一个或更多个编辑载体从转化的细胞消除。处治可以通过以下完成：例如使用处治质粒裂解一个或更多个编辑载体从而使编辑载体无功能；经由细胞生长稀释细胞群体中的一个或更多个编辑载体(即细胞经历的生长周期越多，保留一个或更多个编辑载体的子细胞就越少)，或者通过例如利用编辑载体上的热敏感复制起点。用于处治的条件取决于用于处治的机制；即，在这个实例中，处治质粒如何裂解编辑质粒。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且以下实施例并不意在限制本发明人视作其发明的范围，它们也不意在代表或隐含下文的实验是进行的所有实验或仅有实验。本领域的技术人员应理解，可以对具体方面中所示的本发明作出许多变化和/或修饰而不脱离本发明所广泛描述的精神或范畴。因此，本文的方面在所有方面中被认为是说明性的而非限制性的。
实施例1：编辑盒和骨架扩增与组装
编辑盒制备：在50μL体积中使用Q5聚合酶扩增芯片上合成的5nM寡核苷酸。PCR反应为95℃1分钟；8轮的95℃30秒/60℃30秒/72℃2.5分钟；最后在72℃保持5分钟。扩增后，PCR产物经历SPRI清理，其中将30μL SPRI混合物添加到50μL PCR反应中并孵育2分钟。使管经历磁场2分钟，去除液体，并且用80％乙醇洗涤珠2x，允许洗涤间隔1分钟。最后一次洗涤后，允许珠干燥2分钟，将50μL 0.5x TE pH 8.0添加到管中，并且然后将珠涡旋以混合。使浆料在室温孵育2分钟，然后经历磁场2分钟。取出洗脱液，并且对DNA进行定量。
在定量之后，使用来自SPRI清理的洗脱液的稀释液进行第二次扩增程序。PCR在以下条件下进行：95℃1分钟；18轮的95℃30秒/72℃2.5分钟；最后在72℃保持5分钟。在2％琼脂糖凝胶上检查扩增子，并且鉴定出具有一个或更多个最干净输出的池。不使用看起来具有异二聚体或嵌合体的扩增产物。
骨架制备：对纯化的骨架进行一系列的10倍系列稀释，并且稀释的骨架系列中的每一个在以下条件下扩增：95℃1分钟；然后30轮的95℃30秒/60℃1.5分钟/72℃2.5分钟；最后在72℃保持5分钟。扩增后，扩增的骨架经历SPRI清理，如上文关于盒描述的。将骨架洗脱到100μL的ddH2O中，并在等温组装前定量。
Gibson组装：150ng骨架DNA与100ng盒DNA组合。添加等体积的2x Gibson主混合物，并使反应在50℃孵育45分钟。组装后，组装的骨架和盒经历SPRI清理，如上文描述的。
实施例2：细胞生长模块中的生长
本文描述的细胞生长装置的一种实施方案用于使酵母细胞培养物生长，所述酵母细胞培养物使用本文描述的细胞生长装置的实施方案进行实时监测。使用旋转的生长瓶/细胞生长装置实时测量YPAD培养基中的酵母s288c细胞的OD600。使用振荡旋转和采用2桨旋转生长瓶使细胞在30℃生长。图9是示出了结果的图。注意在14小时达到OD600 6.0。
实施例3：细胞浓缩
如上文关于图4A-图4E描述的TFF模块已经成功地用于处理酵母培养物和对它们进行缓冲液交换。首先，使酵母培养物以相对方向通过TFF装置两次，浓缩至约5ml。将细胞用50ml 1M山梨醇洗涤三次，每次洗涤后通过TFF装置三次。在最后一次用1M山梨醇洗涤后使细胞第三次通过之后，使细胞通过TFF装置两次，其中将酵母细胞培养物浓缩至约525μl。图10展示了通过测量滤液电导率和过滤器处理时间确定的酵母细胞的过滤器缓冲液交换性能。在约23分钟内，利用三次50ml 1M山梨醇洗涤并且每次洗涤通过TFF装置三次，实现靶电导率(～10μS/cm)。将细胞体积从20ml减少至525μl。实现了约90％的细胞回收。
实施例4：电感受态酿酒酵母的产生和转化
为了测试FTEP装置在酵母中的转化，使用如Bergkessel和Guthrie，MethodsEnzymol.，529:311-20(2013)中阐述的方法产生酿酒酵母细胞。简言之，用3ml接种物对YPAD培养基接种，进行过夜生长产生100ml细胞。每处理100ml培养物产生约1ml感受态细胞。将细胞在摇动培养箱中在30℃孵育，直至它们达到OD600为1.5+/-0.1。
使用100mM乙酸锂、10mM二硫苏糖醇和50mL缓冲液制备调节缓冲液(conditioningbuffer)，用于生长并保持在室温的每100mL细胞。在250ml瓶中以4300rpm收获细胞3分钟，并且去除上清液。将细胞沉淀物悬浮在100ml冷的1M山梨醇中，以4300rpm旋转3分钟，并且再次去除上清液。将细胞悬浮在调节缓冲液中，然后将悬液转移到适当的烧瓶中，并且以200RPM和在30℃摇动30分钟。将悬液转移到50ml锥形瓶中，并以4300rpm的速度旋转3分钟。去除上清液，并且将沉淀重悬在冷的1M山梨醇中。将这些步骤重复三次，总计三个洗涤-旋转-倾析步骤。将沉淀物悬浮在山梨醇中，至最终OD为150+/-20。
使用FTEP装置进行比较电穿孔实验，以确定电感受态酿酒酵母的转化效率。流速用注射泵(Harvard apparatus PHD ULTRATM 4400)控制。将具有DNA的细胞悬液装载到1mL玻璃注射器(Hamilton 81320Syringe,PTFE Luer Lock)中然后安装到泵上。在流动开始后立即开启来自函数发生器的输出。处理的细胞直接流入具有1M山梨醇和羧苄青霉素的管中。收集细胞，直至处理完NEPAGENETM中电穿孔的相同体积，此时停止流动和来自函数发生器的输出。在培养箱振荡器中在30℃且以250rpm恢复3小时后，将细胞铺板，以确定电穿孔后存活但未能摄取质粒的集落形成单位(CFU)和电穿孔后存活且摄取质粒的CFU。将板在30℃孵育。48-76小时后对酵母集落计数。
使用体外高压电穿孔仪(NEPAGENETM ELEPO21)将流通式电穿孔实验针对2mm电穿孔比色皿(Bull dog Bio)基准化。制备具有DNA的细胞悬液的储备管，并且用于使用NEPAGENETM和流通式电穿孔的侧对侧实验。结果在图11中示出。装置显示出与NEPAGENETM方法相比在2.5kV电压的电感受态酿酒酵母的更好的转化和存活。输入是处理的细胞总数。
实施例5：固体壁装置中酵母集落的单个化
用克隆的文库、等温组装的文库或过程控制sgRNA质粒(逃逸替代物(escapeesurrogate))转化电感受态酵母细胞。如下制备电感受态酿酒酵母细胞：在将要发生转化的前一天下午，用选择的酿酒酵母菌株接种10mL YPAD。将培养物在250RPM和30℃摇动过夜。第二天，将100mL YPAD添加到250mL带挡板的烧瓶中，并用过夜培养物(约2mL过夜培养物)接种，直到OD600读数达到0.3+/-0.05。将培养物置于30℃的培养箱中，以250RPM摇动，并允许生长4-5小时，每小时检查OD。当培养物达到约1.5的OD600时，将50mL体积倒入两个50mL的锥形瓶中，然后在室温以4300RPM离心2分钟。从所有50mL锥形管中去除上清液，同时避免干扰细胞沉淀。向每个锥形管中添加50mL乙酸锂/二硫苏糖醇溶液，并使沉淀轻轻地重悬。将两种悬浮液转移到250mL烧瓶中，并置于振荡器中；然后在30℃和200RPM摇动30分钟。
孵育完成后，将悬浮液转移至两个50mL锥形瓶中。然后将悬液以4300RPM离心3分钟，然后弃去上清液。在乙酸锂/二硫苏糖醇处理步骤之后，使用冷液体并将细胞保持在冰上，直到电穿孔。添加50mL的1M山梨醇，并且使沉淀重悬，然后以4300RPM、4℃离心3分钟，之后弃去上清液。将1M山梨醇洗涤重复两次，总共三次洗涤。将50uL的1M山梨醇添加到一个沉淀中，使细胞重悬，然后转移到另一支管中以使第二个沉淀悬浮。测量细胞悬液的体积，并用冷的1M山梨醇使其达到1mL。此时，细胞是电感受态的，并且可以用克隆的文库、等温组装的文库或过程控制sgRNA质粒转化。
简而言之，通过标记比色皿并且然后在冰上冷却来制备所需数量的2mm间隙电穿孔比色皿。将合适的质粒-或DNA混合物-添加到每个相应的比色皿中，并放回冰上。将100uL的电感受态细胞转移到每个标记的比色皿中，并使用合适的电穿孔条件对每个样品进行电穿孔。然后将900uL室温YPAD山梨醇培养基添加到每个比色皿中。将细胞悬液转移到14ml培养管中，并且然后在30℃、250RPM摇动3小时。恢复3小时后，添加9ml含有适当抗生素(例如遗传霉素或潮霉素B)的YPAD。此时，在固体壁装置和标准铺板方案中并行处理转化的细胞，以将固体壁装置中的“标准化”与标准台式工艺进行比较。就在细胞被引入可渗透底部固体壁装置之前，用0.1％吐温TM(聚山梨醇酯20)溶液处理形成微孔底部的0.45μM过滤器，以实现细胞在固体壁装置的微孔中的适当铺展/分布。将过滤器放入Swinnex过滤器支架(47mm,
Figure BDA0003279236180000631
SX0004700)中，并使用真空将3ml的具有0.85％NaCl和0.1％吐温TM的溶液拉动通过固体壁装置和过滤器。评价了不同的吐温TM浓度，并确定对于47mm直径的固体壁装置(其中0.45μM过滤器形成微孔底部)，用0.1％吐温TM预处理固体壁装置+过滤器是优选的(数据未显示)。
在YPAD中恢复3小时后，稀释转化的细胞，并再次使用真空将3ml体积的经稀释的细胞处理通过经吐温处理的固体壁装置和过滤器。成功转化的细胞数量预计为约1.0E+06至1.0E+08，目标是将约10,000个转化的细胞装载到目前的47mm可渗透底部固体壁装置(具有～30,000个孔)中。制备10-1、10-2和10-3的系列稀释液，然后将每种这些稀释液的100μL体积与3ml 0.85％NaCl组合，并将样品装载到固体壁装置上。然后将每一个底部可渗透固体壁装置从Swinnex过滤器支架取出，并转移到含有羧苄青霉素(100μg/ml)、氯霉素(25μg/ml)和阿拉伯糖(1％最终浓度)的LB琼脂板。将固体壁装置放置为金属侧“向上”，这样可渗透底膜接触琼脂的表面，使得来自板的营养物可以向上通过孔的过滤器“底部”。使YPD琼脂板上的固体壁装置在30℃孵育2-3天。
在孵育结束时，从支持营养物来源(在这种情况下是琼脂板)取出穿孔圆盘和过滤器(仍然组装的)，并用聚焦的“透照”光源拍摄照片，使得可以评估固体壁装置上装载的微孔的数量和分布(数据未显示)。为了从可渗透底部固体壁装置取回细胞，将过滤器转移到含有15ml无菌0.85％NaCl的经标记的无菌100mm培养皿中，然后将培养皿置于设定为30℃/80RPM的摇动培养箱中，以从过滤器轻轻取出细胞并使细胞重悬在0.85％NaCl中。允许细胞摇动15分钟，然后转移到无菌管，例如50ml锥形离心管。测量细胞悬液的OD600；此时，细胞可以根据研究的目的以不同的方式进行处理。例如，如果使用ADE2终止密码子诱变文库，则当重悬的细胞铺在YPD琼脂板上并允许生长4-7天时，成功编辑的细胞应产生具有红色表型的集落。这种表型差异允许定量编辑的细胞的百分比以及编辑的和未编辑的细胞的标准化程度。
实施例6：酵母的多重编辑
图12示出了使用RNA pol II gRNA表达系统对酵母进行多重编辑的结果。编辑盒的500成员文库被设计成在酵母基因组的各种CDS中产生沉默交换突变(silent swapmutations)，该文库连同包含RNA pol II gRNA表达机制MAD7表达机制和可药物选择的标记KanMX的盒骨架一起被转化到酵母中。通过含有抗生素的琼脂选择转化的细胞。将来自琼脂的单个集落挑入生长过夜的选择性液体培养基中。然后从过夜培养物提取DNA，并在NextSeq上进行鸟枪测序。将来自提取的基因组DNA与包含在单个集落中的盒的预期编辑的序列进行比对。板上的星形表示在单个集落中发现了正确的预期编辑。板上的圆圈表示在基因组DNA中没有发现预期编辑。
图13是示出了在酵母中测试的双重盒架构的编辑率的图，其中对CAN1和ADE2基因中的每一个进行敲除编辑。这里，使用了表型读出(phenotypic readout)。ADE2敲除导致细胞集落呈红色表型，并且CAN1敲除允许在刀豆氨酸琼脂培养基上生长。第一组三个柱示出了ADE2基因的95％编辑率，CAN1基因的85％编辑率，以及CAN1和ADE2基因二者的85％编辑率。这些结果对应于双重盒架构pTEF1-HH-ADE2-P2-CAN1-HDV，其中“pTEF1”表示Pol II启动子，“HH”表示锤头核酶，“ADE2”表示包含gRNA和供体DNA二者的ADE2编辑盒，“P2”表示引物序列，“CAN1”表示包含gRNA和供体DNA二者的CAN1编辑盒，并且“HDV”表示HDV核酶。第二组三个柱示出了ADE2基因的95％编辑率，CAN1基因的50％编辑率，以及CAN1和ADE2基因二者的50％编辑率。这些结果对应于双重盒架构pTEF1-HH-ADE2-tRNA(ala)-CAN1-HDV，其中“tRNA(ala)”表示用于丙氨酸的tRNA。第三组三个柱示出了ADE2基因的90％编辑率，CAN1基因的55％编辑率，以及CAN1和ADE2基因二者的50％编辑率。第三组三个柱对应于双重盒架构pTEF1-HH-ADE2-tRNA(gly)-CAN1-HDV，其中“tRNA(Gly)”表示用于甘氨酸的tRNA。第四组三个柱示出了ADE2基因的90％编辑率，CAN1基因的75％编辑率，以及CAN1和ADE2基因二者的70％编辑率。第四组三个柱对应于双重盒架构pTEF1-HH-ADE2-tRNA(thr)-CAN1-HDV，其中“tRNA(thr)”表示用于苏氨酸的tRNA。最后一组三个柱示出了CAN1基因的95％编辑率、ADE2基因的50％编辑率以及CAN1和ADE2基因二者的50％编辑率。最后一组三个柱对应于双重盒架构pTEF1-HH-CAN1-tRNA(gly)-ADE2-HDV，其中“tRNA(Gly)”表示用于甘氨酸的tRNA。因此，本文描述的双重编辑盒架构导致至少50％的编辑的细胞包含ADE2和CAN1编辑二者。
实施例7：酵母中的多重同时编辑
在本文使用的方法中，用线性载体骨架和编辑盒文库转化电感受态酿酒酵母细胞。如下制备电感受态酿酒酵母细胞：在将要发生转化的前一天下午，用选择的酿酒酵母菌株接种10mL YPAD。将培养物在250RPM和30℃摇动过夜。第二天，将100mL YPAD添加到250mL带挡板的烧瓶中，并用过夜培养物(约2mL过夜培养物)接种，直到OD600读数达到0.3+/-0.05。将培养物置于30℃的培养箱中，以250RPM摇动，并允许生长4-5小时，每小时检查OD。当培养物达到约1.5的OD600时，将50mL体积倒入两个50mL的锥形瓶中，然后在室温以4300RPM离心2分钟。从所有50mL锥形管中去除上清液，同时避免干扰细胞沉淀。向每个锥形管中添加50mL乙酸锂/二硫苏糖醇溶液，并使沉淀轻轻地重悬。将两种悬浮液转移到250mL烧瓶中，并置于振荡器中；然后在30℃和200RPM摇动30分钟。
孵育完成后，将悬浮液转移至两个50mL锥形瓶中。然后将悬液以4300RPM离心3分钟，然后弃去上清液。在乙酸锂/二硫苏糖醇处理步骤之后，使用冷液体并将细胞保持在冰上，直到电穿孔。添加50mL 1M山梨醇，并且使沉淀重悬，然后以4300RPM、4℃离心3分钟，之后弃去上清液。将1M山梨醇洗涤重复两次，总共三次洗涤。将50uL的1M山梨醇添加到一个沉淀中，使细胞重悬，然后转移到另一支管中以使第二个沉淀重悬。测量细胞悬液的体积，并用冷的1M山梨醇使其达到1mL。
将500ng线性载体骨架和50ng编辑盒文库添加到电穿孔比色皿中并置于冰上。将100μL的电感受态细胞添加到比色皿中，并在以下条件下电穿孔：穿孔脉冲：1800V，5.0msec脉冲长度，50.0msec脉冲间隔，1个脉冲；转移脉冲：100V、50.0msec脉冲长度、50.0msec脉冲间隔和3个脉冲。电穿孔后，将细胞转移到15mL管，并在30℃和250rpm摇动3小时。将9mLYPAD和10μL G418 1000x储备液添加到管中。将10μL每种转化稀释液铺在2XYPD+Kan板上，并在30℃孵育3天。
图14示出了使用上文公开的方法编辑酿酒酵母基因组中各种基因座的结果。在为图14生成的数据中，将500个不同编辑盒的文库与单个线性载体骨架组合，并挑选9个随机集落进行分析。八个样品包含两个不同的编辑，并且一个样品包含三个不同的编辑。注意，包含多于一个编辑的细胞的比例的范围为7％到80％。
图15示出了通过跨越不同编辑盒文库DNA浓度的500成员编辑文库的NextGen测序观察到的独特质粒。注意，在1x(例如50ng的编辑盒文库)，每个孔鉴定出平均0.9375个独特质粒，但是在50x，每个孔鉴定出平均1.6875个独特质粒。
实施例8：全自动化单重RGN指导的编辑运行
用本公开内容的自动化多模块仪器成功地进行了使用MAD7核酸酶的单重自动化基因组编辑。参见美国专利第9,982,279号。
经由Gibson
Figure BDA0003279236180000671
将ampR质粒骨架和lacZ_F172*编辑盒组装成包括在自动化仪器中的等温核酸组装模块中的“编辑载体”。lacZ_F172功能性敲除lacZ基因。“lacZ_F172*”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的第172个残基处。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。将组装的编辑载体和重组工程化就绪(recombineering-ready)的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中进行电穿孔。转化模块包含ADP-EPC比色皿。参见，例如，美国专利第62/551069号。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，并且允许在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且允许细胞恢复另外2小时。恢复后，将细胞保持在4℃，直至由使用者取回。
在自动化处理和恢复后，将细胞的等分试样铺板在补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和羧苄青霉素的MacConkey琼脂基上，并且生长直至出现集落。白色集落代表功能性编辑的细胞，紫色集落代表未编辑的细胞。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理仪器的自动化液体处理装置进行。
自动化处理的结果是约1.0E-03个总细胞被转化(与常规台式的结果相当)，并且编辑效率是83.5％。通过对细胞基因组的编辑的区域测序确认白色集落中的lacZ_172编辑。此外，通过网络摄像头远程观察自动化细胞处理的步骤，并且发送文本消息来更新自动化处理程序的状态。
实施例9：全自动化递归编辑运行
使用自动化多模块细胞处理系统成功地实现了递归编辑。经由Gibson
Figure BDA0003279236180000681
将ampR质粒骨架和lacZ_V10*编辑盒组装成包括在自动化系统中的等温核酸组装模块中的“编辑载体”。与lacZ_F172编辑类似，lacZ_V10编辑功能性敲除lacZ基因。“lacZ_V10”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的氨基酸位置10处。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。将第一组装的编辑载体和重组工程化就绪的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中进行电穿孔。转化模块包含ADP-EPC比色皿。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且使细胞生长另外2小时。然后将细胞转移至离心模块中，并且然后进行培养基交换。将细胞重悬在包含氯霉素和羧苄青霉素的TB中，其中使细胞生长至2.7的OD600，然后浓缩并且赋予电感受态。
在细胞生长期间，在等温核酸组装模块中制备第二编辑载体。第二编辑载体包含卡那霉素抗性基因，并且编辑盒包含galK Y145*编辑。如果成功，galK Y145*编辑赋予细胞摄取和代谢半乳糖的能力。由galK Y154*盒产生的编辑在第154个氨基酸残基处引入终止密码子，将酪氨酸氨基酸改变为终止密码子。该编辑使galK基因产物为非功能性的，并且抑制细胞代谢半乳糖的能力。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使第二编辑载体产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。使用与以上详述的相同参数，将组装的第二编辑载体和电感受态大肠杆菌细胞(用第一编辑载体转化并且针对第一编辑载体选择)转移到转化模块进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许在包含羧苄青霉素的SOC培养基中恢复。恢复后，将细胞保持在4℃直至取回，之后将细胞的等分试样铺板在补充有氯霉素和卡那霉素的LB琼脂上。为了定量lacZ和galK编辑二者，在两种培养基类型上产生复制斑块板(replica patch plate)：1)补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基，和2)补充有半乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理系统的自动化液体处理装置进行。
在该递归编辑实验中，筛选的集落中的41％具有lacZ和galK编辑二者，其结果与使用“台式”或手动方法获得的双重编辑效率可比较。
虽然本发明通过许多不同形式的实施方案来满足，如结合本发明的优选实施方案详细描述的，但是应理解本公开内容应被认为是对本发明的原理的示例而不意在将本发明局限于本文说明和描述的具体实施方案。本领域技术人员可以作出不脱离本发明的精神的许多变化。本发明的范围将由所附权利要求书及其等同物判断。摘要和标题不应被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的机构以及一般公众能够迅速确定本发明的一般性质。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则其中列举的特征或要素都不应被解释为根据35 U.S.C.§112,
Figure BDA0003279236180000691
的手段加功能的限定。

Claims (20)

1.一种物质组合物，所述物质组合物用于在酵母中进行RNA指导的核酸酶编辑，所述物质组合物从5’至3’包含：
pol II启动子；转录起始位点；gRNA的编码序列；供体DNA的编码序列，其中所述供体DNA包含对靶序列的合理的期望编辑和被配置为使所述靶序列中的前间区基序(PAM)失活的编辑；自裂解核酶的编码序列，和pol II终止子；或者
pol II启动子；转录起始位点；供体DNA的编码序列，其中所述供体DNA包含对靶序列的合理的期望编辑和被配置为使所述靶序列中的前间区基序(PAM)失活的编辑；gRNA的编码序列；自裂解核酶的编码序列；和pol II终止子。
2.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述自裂解核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)样核酶家族中的自裂解核酶、葡糖胺-6-磷酸合酶核酶家族中的自裂解核酶、锤头核酶家族中的自裂解核酶、发夹核酶家族中的自裂解核酶、脉孢菌(Neurospora)Varkud卫星核酶家族中的自裂解核酶、twister核酶家族中的自裂解核酶、twister sister核酶家族中的自裂解核酶、hatchet核酶家族中的自裂解核酶或pistol核酶家族中的自裂解核酶。
3.根据权利要求2所述的物质组合物，其中所述自裂解核酶是丁型肝炎病毒(HDV)样核酶家族中的自裂解核酶。
4.根据权利要求2所述的物质组合物，其中所述自裂解核酶是葡糖胺-6-磷酸合酶核酶家族中的自裂解核酶。
5.根据权利要求2所述的物质组合物，其中所述自裂解核酶是脉孢菌Varkud卫星核酶家族中的自裂解核酶。
6.根据权利要求2所述的物质组合物，其中所述自裂解核酶是twister核酶家族中的自裂解核酶。
7.根据权利要求2所述的物质组合物，其中所述自裂解核酶是twister sister核酶家族中的自裂解核酶。
8.根据权利要求1所述的物质组合物，所述物质组合物包含所述转录起始位点3’的第二自裂解核酶。
9.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述pol II启动子是细胞类型特异性启动子、组织特异性启动子或合成启动子。
10.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述pol II启动子是组成型真菌启动子。
11.根据权利要求10所述的物质组合物，其中所述组成型真菌pol II启动子选自pPGK1、pTDH3、pENO2、pADH1、pTPI1、pTEF1、pTEF2、pYEF3、pRPL3、pRPL15A、pRPL4、pRPL8B、pSSA1、pSSB1或pPDA1启动子。
12.根据权利要求11所述的物质组合物，其中所述组成型真菌pol II启动子选自pPGK1、pTDH3、pADH1或pENO2启动子。
13.根据权利要求10所述的物质组合物，其中所述组成型真菌pol II启动子选自pTEF1、pTEF2、pYEF3、pRPL3或pRPL15A启动子。
14.根据权利要求10所述的物质组合物，其中所述组成型真菌pol II启动子选自pRPL4、pSSB1、pSSA1、pPDA1或pCYC1启动子。
15.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述pol II启动子是组成型哺乳动物启动子。
16.根据权利要求15所述的物质组合物，其中所述pol II启动子选自pCMV、pEF1a、pSV40、pPGK1、pUbc、人类β肌动蛋白启动子或pCAG启动子。
17.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述pol II启动子是诱导型启动子。
18.根据权利要求17所述的物质组合物，其中所述诱导型启动子选自PHO5启动子、MET3启动子、CUP1启动子、GAL1启动子或者GEV或LEV启动子系统。
19.一种物质组合物，所述物质组合物用于在酵母中进行RNA指导的核酸酶编辑，所述物质组合物从5’至3’包含：
pol II启动子；转录起始位点；第一gRNA的编码序列；第一供体DNA的编码序列，其中所述第一供体DNA包含对第一靶序列的合理的期望编辑和被配置为使所述第一靶序列中的前间区基序(PAM)失活的编辑；接头；第二gRNA的编码序列；第二供体DNA的编码序列，其中所述第二供体DNA包含对第二靶序列的合理的期望编辑和被配置为使所述第二靶序列中的前间区基序(PAM)失活的编辑；自裂解核酶的序列和pol II终止子；或者
pol II启动子；转录起始位点；第一供体DNA的编码序列，其中所述第一供体DNA包含对第一靶序列的合理的期望编辑和被配置为使所述第一靶序列中的前间区基序(PAM)失活的编辑；第一gRNA的编码序列；接头；第二供体DNA的编码序列，其中所述第二供体DNA包含对第二靶序列的合理的期望编辑和被配置为使所述第二靶序列中的前间区基序(PAM)失活的编辑；第一gRNA的编码序列；自裂解核酶的编码序列；和pol II终止子。
20.根据权利要求19所述的用于在酵母中进行RNA指导的核酸酶编辑的物质组合物，其中所述接头选自tRNA序列、引物序列或自裂解核酶序列。
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