CN107636152B

CN107636152B - 通过mhc细胞文库检测新免疫原性t细胞表位和分离新抗原-特异性t细胞受体的方法

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Publication number: CN107636152B
Application number: CN201680028229.3A
Authority: CN
Inventors: F.洛伦茨; W.乌克特; C.埃林格; D.申德尔
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft; Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft; Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2016-03-15
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2036-03-15
Also published as: IL254511B; JP6944876B2; HK1248736A1; CA2979493A1; EP3271382A1; US20180073013A1; CN107636152A; AU2016232280A1; US11001830B2; ES2790725T3; KR102668219B1; IL254511A0; EP3271382B1; JP2018509911A; DK3271382T3; WO2016146618A1; AU2016232280B2; US12215313B2; KR20170126500A; SG11201707540QA

Abstract

本发明涉及免疫疗法的领域，特别是过继性T细胞疗法、T细胞受体(TCR)基因疗法和接种疫苗。本发明提供一种制备编码TCR构建体的TCR α链构建体(TRA)和TCR β链构建体(TRB)的核酸的方法，所述TCR构建体对来自主要组织相容性复合物(MHC)上呈递的抗原的表位是特异性的，该方法包括使从供体分离的T细胞与人工抗原呈递细胞(APC)的文库接触，所述人工抗原呈递细胞包括表达存在于供体，优选地在K562细胞中的所有MHC I或MHC II等位基因的细胞。TCR构建体可在T细胞中表达，其对例如癌、病毒性感染或自身免疫性疾病的过继性T细胞疗法是有用的。本发明还提供一种鉴定由所述TCR识别的表位的方法。由所述TCR识别的免疫原性表位可被用来开发在患者中诱导抗原‑特异性T细胞免疫的疫苗制剂。本发明还提供两个TCR构建体和通过本发明的方法获得的各自的免疫原性表位的对，其中表位来自人乳头瘤病毒(HPV) 16(也称为α乳头瘤病毒9)癌蛋白E5和人巨细胞病毒(CMV)蛋白pp65。

Description

通过MHC细胞文库检测新免疫原性T细胞表位和分离新抗原- 特异性T细胞受体的方法

本发明涉及免疫疗法的领域，特别是过继性T细胞疗法、T细胞受体(TCR)基因疗法和接种疫苗。本发明提供一种制备编码TCR构建体的TCR α链构建体(TRA)和TCR β链构建体(TRB)的核酸的方法，所述TCR构建体对来自主要组织相容性复合物(MHC)上呈递的抗原的表位是特异性的，该方法包括使从供体分离的T细胞与人工抗原呈递细胞(APC)的文库接触，所述人工抗原呈递细胞包括表达存在于供体，优选地在K562细胞中的所有MHC I或MHCII等位基因的细胞。TCR构建体可在T细胞中表达，其对例如癌、病毒性感染或自身免疫性疾病的过继性T细胞疗法是有用的。本发明还提供一种鉴定由所述TCR识别的表位的方法。由所述TCR识别的免疫原性表位可被用来开发在患者中诱导抗原-特异性T细胞免疫的疫苗制剂。本发明还提供两个TCR构建体和通过本发明的方法获得的各自的免疫原性表位的对，其中表位来自人乳头瘤病毒(HPV) 16 (也称为α乳头瘤病毒9)癌蛋白E5和人巨细胞病毒(CMV)蛋白pp65。

T细胞受体(TCR)基因疗法是治疗各种病毒-和癌症-相关适应症的有前景的免疫治疗策略。一个重大的障碍是在临床前和临床环境中缺乏待分析的有效TCR的可用性。目前检测和分离抗原-特异性TCR的方法具有技术局限性，限制于某些MHC或需要抗原表位的先前知识。靶抗原的选择是免疫疗法成功的另一个重要的因素。靶向抗原(其在肿瘤组织中，但不在正常组织中特异性地表达)具有特别的价值。

过继性T细胞疗法基于T细胞的离体激活和扩增，以生成供再输注进入患者的抗原-特异性效应T细胞(1)。这个过程可通过用新抗原受体遗传修饰T细胞来实现。快速的离体扩增方案能够生成大量的T细胞，以打破肿瘤微环境的免疫抑制屏障来清除靶细胞。克服免疫抑制屏障可导致溶解的肿瘤细胞被APC吸收和呈递更多的抗原 – 一个称为表位扩展的过程。这可接着从新启动自身T细胞和再激活无变应性T细胞，放大抗-肿瘤免疫应答，其由过继性T细胞疗法诱导。使用遗传未修饰的以及抗原受体-工程改造的T细胞的过继性T细胞疗法已成功地用来治疗对其它治疗顽固的癌症和病毒-相关疾病(2)。

提供给患者T细胞免疫的第二个策略是疫苗的应用。疫苗提供对特定病原体或癌症的获得性免疫力，许多疫苗的市场引入已导致由许多威胁生命的疾病引起的发病率和死亡率的令人印象深刻的下降。为了开发新的预防和治疗疫苗，先决条件是鉴定抗原、表位和MHC限制成分，其诱导T细胞应答，所述T细胞应答可提供免于表达这样的抗原的病原细胞的保护和表达这样的抗原的病原细胞的清除。由病原细胞内部加工和呈递且由抗原-特异性TCR识别的抗原表位的鉴定，使诱导抗原-特异性免疫的新疫苗制剂的开发成为可能。

在下文中，对鉴定和分离抗原-特异性TCR和鉴定诱导T细胞应答的抗原表位的当前方法进行评述。

外周血单核细胞(PBMC)是用于体外分析的T细胞的主要来源。为了筛选，大量的T细胞可从患者或健康供体血的PBMC容易地分离。相比之下，从肿瘤-浸润淋巴细胞(TIL)分离的T细胞以有限的量从肿瘤活组织检查中获得。活组织检查可仅从实体瘤获得(3,4)。来自PBMC或TIL的TCR的直接序列分析可生成有关TCR序列的大量数据。从这些数据集预测TCR特异性和抗原识别仍然是不可能的(5)。为从T细胞样品以所需特异性分离TCR，在分析TCR序列之前，引入抗原-特异性富集步骤是必要的。此外，在TCR分离之前，进行功能测定以证实T细胞的抗原特异性是有用的(6)。富集T细胞的标准途径是基于抗原-特异性体外刺激，以扩增培养中的特异性T细胞。体外刺激抗原-特异性T细胞的一个策略是加入肽至T细胞培养物中，其结合于MHC I分子。在培养中的细胞彼此呈递肽，而抗原-特异性CD8⁺ T细胞长出。然而，肽刺激，其通常以非-生理浓度进行，可导致T细胞的过度刺激和激活-诱导的细胞死亡，所述T细胞包含对肽/MHC (pMHC) I的高亲和力TCR (7)。此外，表位序列、加工特性和MHC I结合限制的知识是需要的。此外，PBMC或TIL样品内肽-特异性T细胞的存在是必要的。因此，对具有低前体频率的肽-特异性T细胞的筛选可能受到限制并妨碍新的免疫原性抗原-MHC I组合的鉴定。T细胞对抗原-特异性和MHC限制的功能测试通常用单一T细胞克隆进行。扩增和富集后，单一T细胞克隆可生长至足够的量。在应用T细胞培养时必须考虑的一个因素是长期培养条件对生成T细胞的影响(8)。具有更分化表型(Tem和Teff)的T细胞的生长能力受到限制，并限制体外扩增。长期培养可能导致T细胞克隆的有效TCR的损失，所述T细胞克隆已经遭遇体内pMHC I并在供体中经历扩增和分化。因此长期T细胞培养可引入有利于未分化T细胞以高扩增能力长出的偏差。

抗原-特异性T细胞的检测和分选是分离新抗原-特异性TCR的至关重要的步骤。具有对pMHC的不同特异性的TCR的大库导致可溶性MHC多聚体的开发，其作为对已知的pMHC特异性的T细胞染色的试剂(9-11)。多聚体被用于抗原-特异性T细胞的分选。多聚体能够直接染色对所需pMHC有特异性的T细胞(12,13)。然而，需要MHC限制和肽特异性的现有知识以筛选样品中的抗原-特异性T细胞。多聚体的使用可依赖于计算机预测T细胞表位，因此包含分离对未经内源加工和呈递的表位特异性的TCR的风险。此外，根据T细胞结合多聚体的能力，但不必然根据在细胞表面结合pMHC复合物来选择T细胞。多聚体是定制的试剂，其不能容易地获得以筛选不同的pMHC组。

在1997年，Lemonnier和Pérarnau小组报告了稳定地表达融合于β-2微球蛋白(b-2m)的人HLA-A*02:01分子的单链构建体(HHD)的转基因小鼠的产生。此外，小鼠被敲除鼠MHC I基因。因此，免疫产生专门限制于HHD的抗原-特异性T细胞(14)。因此，HLA-转基因小鼠提供了抗原-特异性T细胞的一种新的来源(15)。人抗原和表位，其在它们的序列中与鼠配对物不相似，可被用于HLA-转基因小鼠的疫苗接种以在非-耐受库中引发抗原-特异性T细胞应答，因为小鼠T细胞在胸腺中未缺失并识别人抗原为异物。HLA-转基因小鼠提供一种识别自身-抗原或类似于自身-抗原的高亲和力TCR的来源，其由于胸腺选择已在人库中缺失。当基于HHD小鼠模型，产生携带人TCR库的第一转基因小鼠，同时鼠TCR基因座被敲除时，取得技术进步(16)。然而，使用MHC-转基因和/或TCR基因座-转基因小鼠的潜在问题可出现，例如，难以预测小鼠和人胸腺选择是否遵循相同的规则。转基因MHC分子是人工单链构建体，其可引入选择功能限制于单链MHC而非天然MHC I复合物的TCR的偏差。单一MHC-转基因小鼠的免疫不反映具有6个同源MHC:I复合物的选择的天然免疫应答。有可能存在不含有例如HLA-A*02:01表位的抗原。此外，携带人TCR基因座的小鼠缺乏少数TCR链，其对靶向某些pMHC I可能是至关重要的(16)。作为对比，携带鼠TCR基因座的小鼠的免疫将导致鼠TCR序列的分离，当转移至人时，其可倾向于排斥(17,18)。一个重要的经济因素是用鼠模型工作必需的基础设施，其在成本、监管要求和人力方面都是非常资源-密集型的。

成功的TCR基因疗法依赖于具有精细的特异性性质的新TCR的可用性。据此，本发明人解决了提供一种鉴定和分离新抗原-特异性TCR，和限定这些TCR的表位特异性和MHC限制的新方法的需求。为了开发诱导抗原-特异性T细胞应答的新疫苗，对定义可由T细胞靶向的新免疫原性表位存在需求。

这个问题被本发明，特别是，被权利要求书的主题解决。

本发明提供一种制备编码TCR构建体的TCR α链构建体(TRA)和TCR β链构建体(TRB)的核酸的方法，所述TCR构建体对来自在MHC上呈递的限定抗原的表位是特异性的，该方法包括：

(a) 用呈递所述限定抗原的表位的专职抗原呈递细胞(APC)，刺激从供体分离的T细胞，以富集抗原-特异性T细胞；和

(b) 使所述T细胞接触细胞文库，其中每个细胞表达单一MHC等位基因，其中文库包含表达存在于供体中的所有MHC I或MHC II等位基因的细胞，和其中所述文库的细胞呈递所述限定抗原的表位；和

(c) 选择由所述接触激活的T细胞，优选地基于由所述激活的T细胞表达的激活标记进行；和

(d) 分离编码所述T细胞的TCR的TCR α和TCR β链的核酸。

在本发明的上下文中，“a”并不专指“一个”，而是还涵盖“二个或更多个”。例如，本发明的方法可被用来制备一个或多个，例如，两个编码TCR构建体的TRA和TRB的单独的核酸。

如本文所用的术语“能够特异性地结合”或“识别”给定的抗原或对给定的抗原具有“特异性”，意指TCR构建体可特异性地结合和免疫学上识别所述表位，优选地以高亲和力识别所述表位。亲和力可通过技术人员熟知的方法，例如通过BiaCore分析。

本发明的优点之一是不需要知道来自在特异性MHC等位基因上呈递的抗原的免疫原性表位。采用本发明的方法，有可能分析对抗原的T细胞应答，其中表位经天然加工，且呈递可经由每个可能的MHC发生。因此，本发明的方法可被用来鉴定对限定抗原有特异性的TCR，无需表位的现有知识。如果在步骤a中的抗原呈递细胞和在步骤b中的文库二者均呈递所述抗原的表位，限定抗原可以甚至是多个抗原之一，例如，特定病毒的多个抗原，或特定病毒的所有抗原。

另一个优点是本发明的方法使得有可能鉴定对免疫显性肽表位有特异性的TCR，并提供所述肽表位。已观察到某些肽-MHC (pMHC)组合诱导超过源自相同抗原的其它pMHC组合的显性T细胞应答，即使两种组合被预测具有高结合亲和力。此外，如果筛选的PBMC数目有很大的增加，这个方法也可使靶向亚显性表位的TCR的分离成为可能。

因为人的疗法是最重要的，因此优选该方法在人系统中进行，即供体是人，因此，采用人MHC I或MHC II，特别是MHC I分子，和APC。使用来自鼠供体的T细胞当然也是有可能的，其被限制于人MHC分子(14,15)或表达人T细胞受体的鼠T细胞(16)。作为选择，可使用其它系统，例如完全小鼠、大鼠、山羊、兔、豚鼠系统，如果需要提供来自所述物种的TCR的话。

优选地，在步骤a中刺激的T细胞呈现PBMC的形式，即不从其它单核细胞分离。这可能是有益的，因为它提供一种更天然的环境并排除对另外的纯化步骤的要求。从供体分离的TIL也可使用。或者，可使用纯化的T细胞，或纯化的CD4⁺，或优选CD8⁺ T细胞。

专职APC优选地是自身APC，即它们从与PBMC相同的供体分离。然而，它们也可以是异源性APC，只要它们与供体分享至少一个MHC等位基因，优选地，所有MHC I或II (优选MHCI)等位基因。最优选地，专职APC是树突细胞，特别是，鼠树突细胞细胞。在抗原的内部加工后，专职APC呈递MHC上的限定抗原的表位。作为RNA、DNA、蛋白或多肽，抗原优选地被提供到专职APC的内部，以能够被APC内部加工和呈递。因此，不需要表位的现有知识。例如，转染后稳定或瞬时的表达是可能的。

步骤a中T细胞的刺激进行7-42天，最优选14-28天。PBMC与专职APC的比例优选地是约5:1-20:1，最优选约10:1。T细胞在含有有利于T细胞增殖的细胞因子；优选低浓度的IL-2 (例如，15-25 U/ml，优选地，约20 U/ml)、IL-7 (例如，2.5-7.5 U/ml，优选地，约5 U/ml)或IL-15的培养基中被刺激，以防止抗原-非特异性T细胞在特定培养环境中增殖。增殖的PBMC可以约1:2-3:4的比例分开。在内部加工后，用呈递抗原的表位的专职APC第二次刺激是可能的。

在步骤a中用于抗原-特异性T细胞富集的细胞与步骤b中的细胞文库进一步接触，其中每个细胞表达单一MHC等位基因，其中文库包含表达存在于供体中的所有MHC I或II等位基因的细胞，和其中所述文库的细胞呈递所述限定抗原的表位。

在整个本发明中，优选MHC是MHC I。由这些细胞刺激的T细胞，其表达MHC I，将是CD8⁺ T细胞，并且通常地，将呈递来自细胞内蛋白的表位。

在一个优选的实施方案中，所述文库由各自稳定地表达一个MHC I等位基因的K562细胞组成。示例性K562文库在下文描述或由Zeng等公开(19)。文库的细胞可具有并非K562细胞的其它来源，包括任何人或非-人APC，例如，成淋巴细胞样细胞系(LCL)或NIH/3T3细胞。

本文所用的MHC细胞文库通过用单一人MHC I等位基因(HLA-A、-B和-C)稳定转导人K562细胞系(20,21)生成。K562细胞具有人红白血病来源并缺乏内源性MHC I和MHC II等位基因的表达(22)。然而，它们表达β-2微球蛋白，并在MHC I α链的转基因表达时，它们具有完全功能的抗原-加工和呈递机制(19,23,24)。K562细胞表达ICAM-1和LFA-3，需要它们来形成有效的免疫突触(24)。此外，有可能遗传修饰这些细胞，例如经由逆转录病毒细胞转导，以稳定地表达单一MHC I等位基因，并引入抗原序列，例如经由用体外转录的(ivt) RNA转染。

在一个实施方案中，本发明因此还提供基于K562的MHC细胞文库，其细胞可被用于本发明的方法。所述文库包含K562细胞，每个细胞表达以下MHC I等位基因之一：

使用K562细胞作为人工APC支架具有几个优点。与LCL比较，K562细胞缺乏来自疱疹病毒像EBV的病毒序列(25,26)。这是基于K562的APC系统的一个重要特征，以避免在可天然地含有EBV-特异性T细胞的大量T细胞样品的分析期间EBV-特异性T细胞激活。与非细胞人工APC比较，在细胞APC系统中，pMHC呈递在完整细胞膜的细胞表面以生理水平发生，所述细胞表面类似于TCR结合的大多数天然环境。一个MHC的显性表达使TCR的异常识别最小化。MHC-转导的K562在细胞表面呈递pMHC的能力显示，在亲代K562中的抗原加工和MHC表达不是一般的缺陷，而是由于内源性MHC基因座的沉默。与免疫蛋白酶体-表达的DC比较，K562细胞表达组成型蛋白酶体，这类似于由典型的肿瘤细胞的抗原加工(27)。TCR-转导的T细胞与K562细胞在靶抗原的不存在下共同培养，未显示背景IFNγ释放和CD137上调，使T细胞的非特异性激活最小化。

以上讨论的K562细胞的属性使得它们为建立MHC细胞文库作为分析TCR的靶(无需表位特异性和MHC限制的现有知识)的优选的细胞人工APC系统。原则上，任何靶抗原可在K562细胞中表达，其包括病原-衍生的抗原以及肿瘤-相关的抗原(TAA)，癌症睾丸抗原(CTA)和谱系抗原。对于癌免疫疗法，肿瘤-特异性抗原(TSA)对鉴定对病毒表位或突变-衍生的表位有特异性的TCR具有特殊意义。

Latouche和Sadelain采用板附着小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞，其稳定地表达单一人MHC等位基因(28)，从而获得在人MHC复合物的情况下表位的内源性呈递。NIH/3T3细胞已成功地用来扩增用于移植后过继性T细胞疗法的CMV-特异性T细胞系(29)，并可用作本发明上下文中的可供选择的文库。

或者，MHC可以是MHC II。在这种情况下，细胞文库优选地包含MHC II表达细胞，例如各自用一个MHC II等位基因转染的K562细胞。示例性文库由Butler等公开(30)。或者，可使用基于人RM3 (Raji) B细胞的单一MHC II-表达细胞文库，其在用乙烷甲基磺酸酯(EMS)随机诱变以敲除MHC II基因座后生成(31)。由这些细胞刺激的T细胞将是CD4⁺，并且通常地，将呈递来自分泌的蛋白的表位、不同的细胞隔室的蛋白、膜蛋白或交叉呈递蛋白。

所述文库的细胞，特别是K562细胞，还可表达共刺激分子，例如，CD40、CD40L、CD70、CD80、CD83、CD86、ICOSL、GITRL、CD137L和/或CD252，以便细胞可对T细胞子集的最适接触进行定制。共刺激分子集可以是CD80、CD86和CD137L，或CD80、CD83、CD64 (30)，或CD80、CD70和CD137L (19)。这可放大T细胞应答以清楚地检测抗原-特异性IFNγ释放和CD137表达并可导致广泛的TCR关于亲和力的检测。然而，为分离高亲和力TCR，如果所述文库的细胞，特别是K562细胞，不表达任何更多的共刺激分子则可能是优选的。此外，所述文库的细胞，特别是K562细胞，可表达增强抗原加工和呈递的分子，例如HLA-DM和CD74。

所述文库的细胞在内部加工后，在它们的MHC分子上呈递限定抗原的表位。优选地，它们稳定地表达完整的全长抗原，例如，在用抗原-编码ivtRNA转染后。瞬时表达也可使用。因此，不需要表位的现有知识。

用T细胞接触文库进行12-36小时，优选18-22小时或约20小时，以达到T细胞样品内抗原-特异性T细胞的最佳激活。优选地，在接触期间避免细胞因子的加入以防止T细胞的非特异性激活。

那些携带对由所述文库的细胞呈递的表位有特异性的TCR的T细胞被激活。因此，它们可基于激活标记(步骤c)进行选择，以致不需要T细胞表位和MHC限制成分的现有知识。在TCR与靶细胞上的同源pMHC复合物接合后，T细胞上调激活标记。TCR信号传导与共刺激信号一起诱导激活分子像CD25、CD69、CD107、CD137和/或CD154的短期表达，其可用作例如，通过FACS或MACS检测和分离抗原-特异性T细胞的标记(32)。CD137被显示是一种分离抗原-特异性CD8⁺ T细胞的特异性标记(33,34)。基于CD137表达的分选，例如通过FACS，是选择特异性T细胞的优选的方法。在一个实施方案中，这与IFNγ释放的测量，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或通过IFNγ被FACS的细胞因子捕获相结合。例如通过ELISA测量IFNγ释放是评价T细胞样品的功能活性的标准方法。

细胞因子捕获测定提供一种检测和分离功能活性T细胞(无需pMHC特异性的现有知识)的可供选择的工具(35,36)。通过同源pMHC I激活的CD8⁺ T细胞释放具有细胞因子像IFNγ和TNFα的囊泡。细胞因子分泌时各个T细胞的检测和分离已通过细胞因子捕获测定与FACS或MACS分析的组合的开发而得到促进(36,37)。细胞因子捕获测定提供一种用于分选T细胞(其被TCR信号传导激活)的T细胞激活标记的吸引人的可选方案。

选择激活的T细胞后，编码所述T细胞的T细胞受体的TCR α和TCR β链的核酸被直接分离。例如，RNA可被分离以经由TCR α和TCR β基因的cDNA末端的5’快速扩增(RACE)生成cDNA，接着经PCR扩增。PCR产物可被克隆到表达质粒以转化细菌。每个细菌菌落可被视为含有携带一个PCR TCR α或TCR β基因片段的一个测序载体。许多细菌菌落的载体DNA可被制备，接着对载体插入物(TCR α或TCR β基因片段)测序。每个细菌菌落的测序结果可，例如，通过使用IMGT/V-Quest分析。相同的TCR α或TCR β链的频率反映相同的T细胞克隆型在分选的T细胞样品内的比例。分析分选的T细胞的TCR α和TCR β基因序列的另一个策略是使用下一代测序方法。例如，TCR α和TCR β基因的PCR产物，其被连接到测序载体，可被转化至细菌并在含有选择性培养基的烧瓶中生长，接着制备载体DNA。载体DNA制备物可直接用于下一代测序分析。含有相同的TCR α或TCR β基因的载体的频率被视为分选的T细胞样品内相同克隆型的T细胞初始量的表示。T细胞样品内TCR α和TCR β链的频率匹配可被用于分析功能TCRs的配对(38)，例如，已负责抗原-MHC-特异性IFNγ释放和CD137上调的TCR。这些方法的灵敏性使得T细胞样品内TCR库的详细分析成为可能。匹配TCR α和TCR β链的频率另外地使得来自T细胞样品的丰富的TCR链对的重构成为可能，因此使得资源-密集型T细胞克隆培养为非必要的。长期培养对扩增培养物中的T细胞克隆是必要的，其可仅仅有利于具有幼稚(naïve)或中央记忆表型的T细胞的长出，因此从分析中排除具有有限的体外生长能力的T细胞。为了分析TCR库，因此一个优点是在抗原-特异性富集仅仅14-28天后，筛选和分选抗原-MHC-特异性T细胞应答。

因此，优选地，如果在分析编码选择的T细胞群的TCR α和TCR β链的核酸后，鉴定一个以上的TCR α和TCR β链，分析群体中的TCR α和TCR β链的频率，构成能够识别表位的TCR的TCR α和TCR β链基于它们的频率匹配。

或者，可进行进一步的分析，例如，生成携带不同的优势TCR α和TCR β链的组合的T细胞，并分析它们通过在步骤b中使用的文库的细胞的激活。

TCR α和β链可被修饰，产生本发明的TCR α链构建体(TRA)和TCR β链构建体(TRB)。任选地，TRA和TRB的密码子选择可被优化以提高重组T细胞中TCR的表达。此外，人可变区可与鼠恒定区(39)，或最小鼠恒定区结合，即, 人恒定区仅含有来自鼠恒定区的限定氨基酸(40)且另外地包含另外的半胱氨酸桥(41,42)，其增加转基因TCR链彼此的优先结合并减少与由受体T细胞表达的内源性TCR链的配对。

表达的进一步的优化是可能的，例如，通过生成包含TRA和TRB的可变区的单链TCR构建体，以避免内源性TCR链与引入链的配对并提高功能活性。此外，可生成含有TRA和TRB链基因的可变区和例如抗体结构域的可溶性受体分子和融合蛋白。

对来自在MHC上呈递的限定抗原的表位有特异性的T细胞可通过表达编码TRA和TRB的核酸生成。如果这样的T细胞旨在患者的治疗，则优选使用自身T细胞。或者，使用免疫抑制的同种异体的设置是可能的。

用合适的TCR构建体转染的T细胞被表达特异性MHC等位基因的文库的细胞激活的分析可容易地被用来分析TCR的MHC限制。

本发明还提供一种鉴定能够由MHC呈递的限定抗原的表位的方法，其包括进行上述本发明的方法的步骤a-d，和鉴定能够激活所述选择的T细胞，或用编码构成TCR构建体的TRA和TRB的核酸修饰的T细胞的表位。表位作图策略是本领域已知的。例如，表达相关的MHC等位基因的文库的细胞可用覆盖相关抗原的部分的微基因转染，并应答，例如IFNγ分泌，经分析以发现包含表位的部分。用外部肽的肽脉冲也可能是有用的。表位预测可用作这样一种策略的部分，但重要的是要注意，如通过下述实验所表明的，TCR特异性不必然匹配从表位预测算法预测的数据。

此外，诱导抗原-特异性T细胞应答鉴定的表位，其通过负责这个应答的抗原-特异性TCR的分离证实，可被用来开发含有表位序列的疫苗制剂。本发明描述的方法确保MHC上的表位的识别，其被内部加工并由表达限定抗原的细胞呈递。含有表位的疫苗的应用可提供给患者T细胞免疫以清除天然地表达限定抗原的细胞。

概括地说，本发明的方法相对于提供可用于例如过继性T细胞疗法的TCR构建体的常规方法具有几个优点。例如，全库的T细胞被覆盖，例如包括给定的供体的所有同源MHC I限制成分。该方法也允许检测具有所需抗原特异性的T细胞，但不需要表位的先前知识。它是以内部加工和呈递的表位的识别为基础的，而无需预先确定选择的表位。来自一个抗原的不同表位具有定义为免疫显性的表达层级。通过本发明的方法鉴定的TCR构建体识别靶抗原内的免疫显性表位，其最有效地在6个MHC I等位基因之一上呈递。该方法也允许鉴定从相同的抗原识别亚显性表位的T细胞。最后，该方法允许识别相同抗原的不同T细胞克隆型的平行检测。

本发明也提供新的TCR构建体和由这些TCR构建体识别的表位，其是通过本发明和/或以下公开的方法可获得的，以及核酸，例如，载体，例如表达载体，其编码这些TCR构建体或各自的TRA和TRB或其片段，例如TRA或TRB的可变片段或CDR3区，或表达所述核酸的转基因T细胞。

人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌、肛门生殖器癌和头和颈鳞状细胞癌发生的主要原因(43,44)。致瘤HPV型占全世界每年大约610 000例癌症病例。

最流行的致瘤型是占50%以上宫颈癌病例的HPV16。HPV16 E6和E7具有转化的潜力并被视为驱动致癌基因(45,46)。HPV16 E5由于其体外转化成纤维细胞的能力，已显示具有致瘤潜力(47,48)。此外，已发现E5在侵袭性宫颈癌的活组织检查中表达，表明E5在启动和维持恶性角质化细胞的转化表型中的重要作用(49-51)。

虽然预防接种疫苗程序与医学筛选和干预一起将在未来的世纪，在几个国家中减少HPV-相关的发病率，HPV仍将是对疗效性治疗宫颈癌和其它HPV-引起的癌症有需求的一个严重的全球健康问题。

疗效性治疗HPV-相关恶性肿瘤的尝试在许多研究中已有报道。然而，只有一个应用覆盖完全的HPV16 E6和E7序列的合成长肽的I/II期研究已显示患者的数据，其在超过50%的患者中经历高-度外阴上皮内瘤变(VIN)的消退。这个反应与HPV-特异性T细胞应答相关(52)。然而，针对CIN损害和宫颈癌的可比较的结果缺乏，提示当前针对HPV16 E6和E7的治疗接种疫苗的尝试未克服HPV的免疫逃避机制(52,53)。此外，针对E6和E7的有效的TCR缺乏，这允许验证免疫治疗剂治疗HPV-诱导的恶性肿瘤。

由于寻求进一步的治疗策略以治疗HPV-诱导的癌症，发明人的努力集中在分离HPV-衍生的抗原的抗原-特异性TCR，并使用上述方法从这些抗原鉴定免疫原性表位。HPV16E5、E6、E7和L1被用作抗原。

巨细胞病毒(CMV)，也称为人疱疹病毒5 (HHV-5)，是疱疹病毒家族的成员。CMV感染类似于其它疱疹病毒感染，因为它们被CD8⁺和CD4⁺ T细胞控制，其以非常高的前体频率出现在CMV-血清阳性个体中(54)。CMV感染在有免疫能力个体中通常是无症状的并在至多90%的群体中以潜伏期持续终身。CMV疾病可在出生后或在造血干细胞移植或实体器官移植后在一些免疫受损个体中表现，在USA每年引起总共5,600例严重疾病病例，其中560例死亡(54)。CMV已被广泛视为非-致瘤的，因为感染似乎不导致细胞转化，但可机会性感染恶性细胞。最近的研究已将CMV与成胶质细胞瘤关联，对CMV是非-致瘤病毒提出了质疑(55-58)。有鉴于此，发明人已决定也研究对CMV抗原有特异性的TCR。

对HPV16 E5与HLA-B*15:01组合的强烈的T细胞应答在用MHC细胞文库的抗原-表达K562细胞筛选后观察到。此外，CMV pp65-特异性T细胞应答在HLA-B*07:02上观察到。对应于一个抗原-MHC组合的T细胞样品被直接分选并对TCR基因序列进行分析。样品中的主要TCR基因被克隆到逆转录病毒表达载体中并通过转导不同的TCR α和β链组合进入PBMC评价测试。功能HPV16 E5-特异性TCR和功能CMV pp65-特异性TCR可被重建，其分别识别在HLA-B*15:01和B*07:02上呈递的内部加工表位。

特别是，本发明因此提供HPV E5-特异性TCR构建体，其可用于，例如，治疗HPV感染，特别是，HPV-诱导的恶性肿瘤的TCR基因疗法。本发明提供编码TCR构建体的TRA和/或TRB的核酸，所述TCR构建体对与人MHC I复合的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位有特异性。核酸从本文描述的本发明的方法可获得或可获自本文描述的本发明的方法。

发明人提供对与HLA-B*15:01复合的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位有特异性的TCR构建体，其优选地包含SEQ ID NO: 1。TCR构建体优选地也识别表位的N-末端较长版本，例如，它可由SEQ ID NO: 1、45、47、49、51、52和57组成。发明人首次表明这些肽经内部加工并可在HLA-B*15:01上呈递，因此可以是TCR识别的靶标。除了TCR基因疗法外，包含SEQ IDNO: 1、45、47、49、51、52和57的肽的疫苗也可以是在HLA-B*15:01-阳性患者中提供T细胞免疫的第二个策略。约12%的德国人群携带至少一个HLA-B*15:01等位基因。中国、南韩和日本的人群研究已发现具有甚至更高的B*15:01等位基因频率(59)。

TCR或TCR构建体的特异性主要由TCR的CDR3区限定。对在HLA-B*15:01上呈递的E5表位有特异性的本发明TCR构建体包含含有SEQ ID NO: 2的CDR3或与其具有至少84%，优选至少92%序列同一性的CDR3的TRA，即可有一个或两个取代、插入或缺失。如果有突变，保守的取代是优选的。SEQ ID NO: 2是本发明的TRA的CDR3的优选的序列。在一个实施方案中，TRA包含SEQ ID NO: 2的CDR3，SEQ ID NO: 64的CDR1和SEQ ID NO: 65的CDR2。

TRA的可变区优选地包含SEQ ID NO: 3或具有与SEQ ID NO: 3至少80%，优选至少90%或至少95%的序列同一性，其中，优选地，可变区包含SEQ ID NO: 2。可变区可由SEQ IDNO: 60的核酸编码。TRA优选地具有与SEQ ID NO: 4至少80%，优选地至少90%、至少95%或100%的序列同一性或由其组成，其中恒定区优选地是提高转基因TCR链的配对的鼠恒定区或最小鼠恒定区。或者，恒定区也可以是人，其使由受体的免疫细胞免疫识别的风险最小化。

一种优选的、密码子-优化的、编码对本发明HPV E5表位有特异性的TCR构建体的TRA的核酸是SEQ ID NO: 5。

对在HLA-B*15:01上呈递的E5表位有特异性的本发明TCR构建体包含TRB，其包含SEQ ID NO: 6的CDR3或与其具有至少84%，优选92%序列同一性的CDR3，即可能有一个或两个取代、插入或缺失。保守的取代是优选的。SEQ ID NO: 6是本发明的TRB的CDR3的优选的序列。在一个实施方案中，TRB包含SEQ ID NO: 6的CDR3，SEQ ID NO: 66的CDR1和SEQ IDNO: 67的CDR2。

TRB的可变区优选地包含SEQ ID NO: 7或与SEQ ID NO: 7具有至少80%，优选至少90%或至少95%的序列同一性，其中，优选地，可变区包含SEQ ID NO: 6。可变区可由SEQ IDNO: 61的核酸编码。TRB优选地具有与SEQ ID NO: 8至少80%，优选至少90%、至少95%或100%的序列同一性或由其组成，其中恒定区优选地是提高转基因TCR链的配对的鼠恒定区或最小鼠恒定区。或者，恒定区也可以是人，其使免疫识别的风险最小化。一种优选的、密码子-优化的编码TRB的核酸是SEQ ID NO: 9。

本发明还提供在合适的表达盒中编码对HPV E5表位有特异性的TRA和TRB二者的核酸，例如，用于TCR基因疗法以治疗HPV感染，特别是HPV-诱导的恶性肿瘤，例如，包含依据SEQ ID NO: 40的序列。

基于通过本发明的方法提供的序列，进行TCR序列的亲和力成熟是可能的(60,61)。在CDR3序列中导致氨基酸交换的非-同义核苷酸取代可导致TCR对靶抗原的亲和力提高。此外，在可变TRA和TRB区域的其它部分中的TCR序列改变可改变(优选地增加) TCR构建体对pMHC复合物的亲和力。优选从提供的特异性序列变化的TCR构建体保留对提供的靶抗原的独特特异性。因此，优选表达本发明的TCR构建体的T细胞的过继性转移对健康组织没有明显的负面效应。

本发明还提供一种CMV pp65-特异性TCR构建体，其可用于，例如，治疗CMV感染或CMV-诱导的恶性肿瘤的TCR基因疗法。本发明提供一种编码TCR构建体的TRA和/或TRB的核酸，所述构建体对与人MHC I复合的人CMV蛋白pp65的表位有特异性。核酸从本文描述的本发明的方法可获得或可获自本文描述的本发明的方法。

发明人提供一种对与HLA-B*07:02复合的人CMV蛋白pp65的表位有特异性的TCR构建体，其优选地包含SEQ ID NO: 10或由其组成。CMV pp65-特异性TCR被限制于HLA-B*07:02。HLA-B*07:02是最频繁的HLA-B等位基因之一并被发现于约23%的德国人群中(59)。由T细胞识别表位可以是开发在HLA-B*07:02-阳性患者中诱导T细胞免疫的CMV疫苗的基础。

对这个表位/MHC复合物有特异性的本发明的TCR构建体包含含有SEQ ID NO: 11的CDR3的TRA，因此其是本发明的TRA的优选CDR3。在一个实施方案中，TRA包含SEQ ID NO:11的CDR3，SEQ ID NO: 68的CDR1和SEQ ID NO: 69的CDR2。TRA的可变区优选地包含SEQ IDNO: 12或具有与SEQ ID NO: 12至少80%，优选至少90%或至少95%的序列同一性，其中可变区包含SEQ ID NO: 11。TRA的可变区可由依据SEQ ID NO: 62的核酸编码。TRA优选地包含SEQ ID NO: 13或由其组成，其中恒定区是提高转基因TCR链的配对的鼠恒定区或最小鼠恒定区。或者，恒定区也可以是人，其使免疫识别的风险最小化。优选的、密码子-优化的编码对本发明的CMV pp65表位有特异性的TCR的TRA链的核酸是SEQ ID NO: 14。

对这个表位/MHC复合物有特异性的本发明的TCR构建体包含含有SEQ ID NO: 15的CDR3的TRB，因此其是本发明的TRB的优选的CDR3。在一个实施方案中，TRB包含SEQ IDNO: 15的CDR3、SEQ ID NO: 70的CDR1和SEQ ID NO: 71的CDR2。TRB的可变区优选地包含SEQ ID NO: 16或具有与SEQ ID NO: 16至少80%，优选至少90%或至少95%的序列同一性，其中，可变区包含SEQ ID NO: 15。TRA的可变区可由依据SEQ ID NO: 63的核酸编码。TRB优选地包含SEQ ID NO: 17或由其组成，其中恒定区是提高转基因TCR链的配对的鼠恒定区或最小鼠恒定区。或者，恒定区也可以是人，其使免疫识别的风险最小化。编码TRB链的优选的、密码子-优化的核酸是SEQ ID NO: 18。

本发明还提供一种在合适的表达盒中编码对CMV pp65表位有特异性的TRA和TRB二者的核酸，例如，用于TCR基因疗法以治疗CMV感染，特别是CMV疾病和CMV-诱导的恶性肿瘤，例如，包含依据SEQ ID NO: 41的序列。

本发明的核酸可作为包含本发明的编码本发明的TRA和/或TRB的核酸的载体提供，例如，其中TRA和/或TRB可操作地连接于适合于在T细胞，例如人T细胞中表达的启动子的载体。优选地，所述启动子是异源性启动子，即它不连接于在天然存在的细胞，特别是人T细胞中的TCR α或β基因。启动子可以是组成型或诱导型启动子，优选骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、CMV、CAG或EF1α启动子。本发明的核酸可作为RNA，作为逆转录病毒载体，作为γ-逆转录病毒载体，作为慢病毒载体或作为基于转座子的载体提供。在一个实施方案中，载体适合于人患者的TCR基因疗法。优选地，载体是MP71。例如，编码TRA和TRB的本发明的核酸可经由基因接头，优选病毒-衍生的2A成分融合，以提供编码功能TCR构建体的两个链的单一转基因盒。

本发明还提供由本发明的核酸编码的蛋白，或其融合蛋白，特别是由本发明的核酸编码的且对公开的抗原，例如，对HPV16癌蛋白E5的表位有特异性的TRA和/或TRB。本发明的TRA和/或TRB可包含对应于其天然配对物的所有特征或结构域，但这不是必需的。优选地，TRA和TRB包含至少可变区，或可变区和恒定区，例如，具有与人可变或恒定TCR区至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的可变区和/或恒定区。对于过继性T细胞疗法，优选TCR构建体是包含含有可变、恒定和跨膜区的全长TCR α和β链的TCR。

所述构建体也可以是融合蛋白，例如，TCR链的可变区可融合于Ig结构域，例如，IgG恒定结构域，优选地，本发明的融合蛋白中的抗-CD3抗体结构域，例如，提供可溶性单克隆TCR试剂，以靶向恶性细胞，其在细胞表面表达各自的pMHC并经由例如抗-CD3靶向结构域接合T细胞，以提供对靶细胞的效应子功能(63)。

单链构建体(scTCR)以及杂二聚体TCR构建体被包含在内。scTCR可包含第一TCR链构建体(例如，α链)的可变区和完整的(全长)第二TCR链(例如，β链)，或反之亦然。此外，scTCR可任选地包含连接二个或更多个多肽在一起的一个或多个接头。接头可以是，例如，将两个如本文所述的单一链连接在一起的肽。还提供这样一种本发明的scTCR，其被融合于细胞因子，例如，人细胞因子，例如IL-2、IL-7或IL-15。

依据本发明的TCR构建体也可以以包含至少两个scTCR分子的多聚体复合物的形式提供，其中所述scTCR分子各自融合于至少一个生物素部分，和其中所述scTCRs通过生物素-链霉抗生物素相互作用互相连接，以允许所述多聚体复合物的形成。也提供包含超过2个，例如，4个本发明的scTCR的高级多聚体复合物。

本发明的TCR构建体可被修饰以包含可检测的标记，例如，放射性同位素、荧光团(如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)，和颗粒(如金粒或磁性颗粒)。

本发明还涉及一种宿主细胞，优选地，CD8⁺ T细胞，其包含编码本发明的TCR构建体的TRA和TRB，特别是对人巨细胞病毒蛋白pp65的表位，或优选地，对人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位有特异性的TCR构建体的核酸，并表达所述TCR构建体。TRA和TRB优选例如从如上所述的异源性启动子表达。T细胞优选地是人T细胞。它可从感染相关病毒的患者，特别是，罹患与所述病毒相关的恶性肿瘤，例如在HPV情况下的宫颈癌、肛门生殖器癌和头和颈癌的患者分离。患者表达限制由TCR识别的表位的MHC。T细胞可以是中央记忆T细胞或幼稚(naïve) T细胞。

本发明还涉及这样一种宿主细胞，例如，T细胞，或本发明的核酸，用于医药，例如，用于药用组合物。这样一种药用组合物可用于治疗感染以下的患者

a) 人乳头瘤病毒16，其中TCR是对人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位特异性的且其中患者是HLA-B*15:01-阳性；或

b) 人巨细胞病毒，其中TCR是对人巨细胞病毒蛋白pp65的表位特异性的且其中患者是HLA-B*07:02-阳性。

为了用于医药，包含TRA和TRB二者的TCR构建体以核酸、蛋白或者T细胞形式使用。在疗法之前筛选HPV-感染的患者的E5抗原的表达，并仅治疗那些具有E5表达的患者可能是有用的。

药用组合物还可用于预防病原例如病毒的感染或用于减轻感染，所述病毒例如，

例如，其中TCR是对人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位特异性的且其中患者是HLA-B*15:01-阳性的药用组合物可被用来在感染有HPV16的患者中预防宫颈癌，例如，如果癌变前的子宫颈的高-度损害被检测到的话。其中TCR是对人巨细胞病毒蛋白pp65的表位特异性的和其中患者是HLA-B*07:02-阳性的药用组合物可在造血干细胞转移后用于治疗患者，以在所述患者中预防CMV疾病或减少其症状。

本发明还教导一种治疗有需要的患者(例如，感染病毒例如HPV16或CMV，或罹患与所述病毒相关的恶性肿瘤)，或减轻病毒感染，或所述感染的症状的方法，其包括给予所述患者合适的重组T细胞，或本发明的核酸。用表达对CMV pp65表位有特异性的本发明TCR的T细胞或编码对CMV pp65表位有特异性的本发明TCR的核酸，移植后CMV疾病的治疗或预防(64,65)也是可能的。

本发明还涉及一种编码具有包含表位的至多40个氨基酸的长度的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5片段，或具有包含表位的至多40个氨基酸的长度的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的肽片段的核酸，其中表位能够由本发明的T细胞的TCR构建体识别。这样的E5片段可以有利地用于接种疫苗，例如，用于合成的长肽接种疫苗。优选地，核酸编码表位，或肽由表位组成，其可通过用于鉴定表位的本发明的方法鉴定。优选地，表位是能够被上述TCR构建体识别的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位。E5表位，其已首次通过本发明的方法鉴定，优选地包含SEQ ID NO: 1且选自SEQ ID NO: 1、45、47、49、51、52和57。

本发明还涉及编码所述E5肽片段或所述表位的所述核酸，或涉及用于医药的所述肽片段或表位，其优选地用于预防人乳头瘤病毒16的感染(或减轻感染)，用于在感染有HPV16的患者中预防宫颈癌(例如，如果子宫颈的癌变前高-度损害被检测到的话)，或用于治疗HPV16感染，特别是，HPV16-诱导的恶性肿瘤。提供所述表位的疫苗可给予受试者，例如，为HLA-B*15:01-阳性的患者。

本发明通过以下实施例进一步说明，其打算举例说明本发明，并且不限制其范围。本文引用的所有参考文献完全结合到本文中。本文公开的本发明的所有实施方案可被合并。

附图说明

图1 逆转录病毒HLA载体。携带不同的HLA等位基因的γ-逆转录病毒载体MP71融合于(a) IRES-GFP或(b) IRES-CFP表达标记的流程。

图2 MHC I类细胞文库。K562细胞用携带(a) MHC-IRES-GFP或(b) MHC-IRES-CFP盒的逆转录病毒载体MP71转导。显示了覆盖两个T细胞供体的所有MHC I类等位基因的10次MHC转导的FACS图的选择。GFP和CFP表达表明转导率。GFP-或CFP-阳性细胞的MHC表面表达由MHC I类抗体染色显示并以百分比表示。

图3 在MHC细胞文库中稳定的抗原表达的实例。K562细胞用融合于IRES-mCherry标记的抗原(HPV16 E7)稳定地转导并通过mCherry表达的流式细胞术测量来检测。MHC I等位基因融合于IRES-GFP标记，表达通过GFP的流式细胞术检测表示。MHC-IRES-GFP/抗原-IRES-mCherry双阳性细胞的百分比在FACS图中描述。(a) MHC细胞文库的K562细胞用E7稳定地转导。(b) MHC (HLA-B*15:01) -转导的K562细胞用E5的截短的微基因构建体稳定地转导，其被用于表位作图(nt, 核苷酸)。

图4 来自ivtRNA的抗原在靶细胞中的表达。表达IRES-CFP标记的单一MHC-转导的K562细胞经由用编码GFP的ivtRNA的电穿孔转染。GFP的表达在电穿孔后5 h测量并用作转染效率的对照。

图5 在与MHC细胞文库的K562细胞共同培养后抗原-特异性T细胞应答的诱导。(a)TCR-B23和(b) TCR-S51被稳定地转导到T细胞中，其被对CD8和转基因TRB表达染色并通过流式细胞术分析。(c) 在E7co ivtRNA转染后3 h，TCR-转导的T细胞与K562-B*27:05靶细胞共同培养。CD137表达通过流式细胞术测定。H₂O-转染的K562-B*27:05靶细胞用作阴性对照。

图6 mDCs从ivtRNA表达GFP。mDCs从板-粘附单核细胞生成。(a) 流式细胞术的直方图显示与同种型对照(灰色区)比较，表达T细胞激活分子CD80、CD83和CD86的mDCs (黑线)。(b) 用15 µg抗原ivtRNA转染后4-6小时，测定GFP的表达。GFP⁺ DCs的百分比被表示。

图7 筛选病毒-特异性T细胞。T细胞，其已用自身mDCs进行抗原-特异性刺激，与MHC细胞文库的6种相应的单一MHC I-表达K562细胞共同培养。(a) 用ELISA测试共同培养物的上清液的IFNγ释放。(b) 来自相同孔的细胞通过流式细胞术分析，以确定CD8⁺ T细胞中CD137⁺的百分比。

图8 病毒-特异性T细胞的FACS-分选。(a) T细胞，其显示出对pp65的反应性(图7b)，与MHC细胞文库的pp65-转染的HLA-B*07:02-表达K562细胞共同培养。(b) E5-反应性T细胞(图7b)与MHC细胞文库的E5-转染的HLA-B*15:01-表达K562细胞共同培养。两种共同培养物的单一淋巴细胞在FSC/SSC中被门控，而CD8⁺细胞的CD137-表达细胞被FACS-分选以供随后的TCR分析。

图9 TCR α和TCR β链组合的表达和功能分析。(a) TCR α和TCR β链组合在健康供体的PBMC中经逆转录病毒表达。在T细胞中的转基因TCR表达在对CD8和鼠恒定TCR β链区段进行抗体染色后通过流式细胞术测定。未转导的(ut) T细胞用作阴性对照。结果代表使用不同的PBMC供体的两个独立的实验。(b) 用不同的TCR α和TCR β链组合转导的T细胞分别与抗原(HPV16 E5或CMV pp65)-转染的K562-B*15:01和K562-B*07:02靶细胞共同培养。TCRα / TCR β-转导的T细胞的IFNγ释放用ELISA测定。结果显示为重复的均值+/- SEM。

图10 用优化的TCR转基因盒生成TCR基因-修饰的PBMC。进行用TCR转基因盒的PBMC的逆转录病毒转导。通过鼠TRBC的抗体染色接着流式细胞术分析评价转导率。结果代表来自两个不同的供体的PBMC的实验(ut, 未转导的PBMC)。

图11 HPV16 E5的抗原序列的作图。(a) 全长E5野生型(wt) (252 nt)、E5密码子-优化的(co) (252 nt)和E5wt的3’截短的微基因版本(63-189 nt)融合于IRES-mCherry标记，克隆到MP71逆转录病毒载体中并在K562-B*15:01靶细胞中表达。指示了以ATG起始密码子的A起始的基因序列长度。(b) TCR E5-转导的T细胞与携带E5基因版本之一的K562-B*15:01靶细胞共同培养18 h。IFNγ释放用ELISA测定。结果显示为重复的均值+/- SEM。

图12 HPV16 E5-特异性TCR和CMV pp65-特异性TCR的表位作图。(a) 依据序列相似性，通过IEDB预测的作为在HLA-B*15:01上呈递的潜在表位的HPV16 E5表位被聚类。第一排(p4-p17) (SEQ ID NOs: 1、49-61)表示肽在表位预测中的排序(表2)。第二排(-聚体)表示肽长度。(b) E5 TCR-转导的PBMC与肽-脉冲的K562-B*15:01靶细胞共同培养，IFNγ释放用ELISA测量。未转导的(ut) T细胞被用作阴性对照。(c) CMV pp65肽p1 (SEQ ID NO: 10)代表先前描述的在HLA-B*07:02上呈递的pp65的表位(66,67)。(d) Pp65 TCR-转导的PMBC与pp65 p1-脉冲的K562-B*07:02靶细胞共同培养。IFNγ释放用ELISA测量。所有ELISA结果显示为重复的均值+/- SEM。

实施例

1.1 MHC载体文库的生成

普通MHC I等位基因的基因被克隆到γ-逆转录病毒载体MP71中(68–70)，以首先生成MHC载体文库，以生成单一-MHC-表达K562细胞(23)，其被用作包含MHC细胞文库的人工APC。HLA-A、-B或-C基因的等位基因版本是高度多态的。序列在IMGT/HLA数据库中被开放访问。然而，不同类型的5’和3’末端具有高序列相似性，使得它成为对从细胞的cDNA进行PCR扩增一个特异性HLA基因的挑战。为解决这个问题，cDNA从InternationalHistocompatibility Workshop获得的成淋巴细胞样细胞(LCL)生成，其对所需的HLA-A、-B和-C等位基因是纯合子的，能够通过PCR进行有效基因扩增。使扩增的HLA片段融合于IRES-GFP或IRES-CFP表达标记并克隆到逆转录病毒表达载体MP71中(图1)。

1.2 MHC细胞文库的生成

红白血病细胞系K562 (20)被用作生成MHC细胞文库的人工APC支架。K562细胞缺乏MHC I类分子的内源性表达，虽然表达β-2微球蛋白，一种功能MHC复合物的遍在组分。然而，在用MHC I类α-链等位基因转染时，细胞可显示具有含MHC表面表达的功能抗原加工机制，从而使K562成为用于生成人工APC的吸引人的支架(19,23,24)。用单一HLA等位基因的K562细胞的稳定转导使用基于MP71逆转录病毒载体的HLA文库进行。在293T包装细胞中逆转录病毒上清液的生产和转导如所述进行(72)并产生GFP-或CFP-表达群体，如通过流式细胞术分析所证实的。MHC复合物的功能装配和表面表达由GFP-或CFP-阳性细胞群体的MHC I类抗体染色指示(图2)。K562细胞中转导的所有HLA等位基因在细胞表面上表达。为了分离的TCR的后来的分析，生成多组K562细胞，其覆盖原始T细胞供体的所有6个MHC I类等位基因。

1.3 在MHC细胞文库中的抗原表达

为使用MHC细胞文库的K562细胞作为人工APC，用逆转录病毒载体MP71转导单一-MHC-表达K562细胞，以在单一MHC等位基因的背景中稳定地表达抗原构建体。逆转录病毒转导如所述进行(71)。在K562细胞中的抗原表达允许单一MHC等位基因背景中表位的内部加工和呈递。许多抗原(HPV16 E5、E6和L1、CMV pp65和IE-1)不能通过细胞内FACS染色而容易地检测到。此外，抗体对于用于表位作图的HPV16 E5的截短的抗原(微基因构建体)，以及突变的核苷酸序列，是不可用的。因此，所有抗原融合于IRES-mCherry标记，以通过流式细胞术间接证实表达(图3)。

在靶细胞中表达抗原序列的第二个策略是经由电穿孔转染ivtRNA。因此，抗原序列被克隆到表达载体以使ivtRNA的T7启动子-依赖的生成和使用得自Ambion (LifeTechnologies)的mMessage mMachine和聚(A)试剂盒的随后的聚腺苷酸化成为可能。ivtRNA电穿孔进入K562细胞用BioRad GenePulser，使用指数电穿孔方案进行。一般来说，编码GFP的ivtRNA被用作电穿孔效率的对照。图4显示HLA-转导的K562细胞在ivtRNA电穿孔后表达GFP。

1.4 由MHC细胞文库的靶细胞诱导抗原-特异性T细胞应答

在先前的实验中，已表明HLA-转导的MHC细胞文库的K562细胞在逆转录病毒转导后或在用抗原ivtRNA转染后表达限定抗原。下一步骤是测试MHC细胞文库内部加工和呈递表位以诱导抗原-特异性T细胞应答的能力。已描述T细胞经由TCR的HLA抗原-特异性刺激导致早期激活标记CD137的上调(32-34)。

为此，使用两个孔-鉴定的TCR (B23, S51)，其从抗原-特异性T细胞克隆分离，识别在HLA-B*27:05上内部加工和呈递的表位。经工程改造以表达TCR的PBMC (图5a, b)被用来分析MHC细胞文库的抗原-表达K562细胞激活抗原-特异性T细胞的能力。T细胞激活通过CD137表达，经由流式细胞术测定。如在图5c中所示，所有TCR-工程改造的PBMC在与抗原ivtRNA-转染的K562-B*27:05靶细胞共同培养20 h后，表达CD137激活标记。CD8⁺/CD137⁺ T细胞的量对于TCR-B23-工程改造的T细胞是约6%，而对于TCR-S51-工程改造的T细胞是8%，这反映用于共同培养的TCR-工程改造/CD8⁺ T细胞的总量(图5a, b)。总之，K562细胞内部加工抗原表位并使它在转基因HLA-B*27:05上呈递，其导致样品中的所有抗原-特异性T细胞的刺激，如通过CD137表达测定的。此外，CD137表达与TCR-转导的T细胞的抗原-特异性IFNγ释放相关联，如经ELISA测定的。

2.1 T细胞的抗原-特异性扩增

在下文中，描述了以所需抗原特异性检测和分离TCR的筛选方法的设置。它可被转移至例如来自不同的病毒的不同抗原，或不同的肿瘤-特异性抗原。

因此，DCs使用无内毒素的培养基，从板粘附单核细胞生成并成熟(72,73)。成熟状态的成熟DCs (mDC)通过对T细胞激活标记CD80、CD83和CD86以及MHC II表达染色，接着流式细胞术证实(图6)。抗原ivtRNA从6种病毒抗原(CMV pp65和IE1、HPV16 L1、E5、E6和E7)生成，其代表全长参考HPV16和CMV野生型基因序列，如在开放存取UniProt数据库中所指示的。mDCs用抗原的ivtRNA转染，以确保天然加工和呈递的表位在细胞表面上呈递(74)。编码GFP的ivtRNA被用作转染对照。表达在转染后4-6 h测量(图6)。抗原-表达mDCs以10:1的PBMC与DC比例使用。使用DCs刺激PBMC使用含有10%人血清的培养基进行(74,75)。从刺激的第2天开始用培养基提供IL-2 (20 U/ml)和IL-7 (5 ng/ml)以有利于T细胞增殖。一周3次提供IL-2 (20 U/ml)和IL-7 (5 ng/ml)至培养物。增殖PBMC以1:2-3:4的比例分开。

2.2 筛选病毒-特异性T细胞

在使用表达6种病毒抗原之一的自身mDCs的第一轮刺激后14天，进行第二次刺激。28天后，筛选12个T细胞培养物对采用MHC细胞文库的特异性抗原-MHC组合的反应性(图2)。MHC细胞文库的细胞用抗原ivtRNA，经由电穿孔转染，并筛选针对一个抗原产生的各T细胞培养物对与一个MHC型组合的抗原的反应性。所述文库与T细胞的接触优选进行18-22 h，以达到T细胞样品内抗原-特异性T细胞的最佳激活。在接触期间避免加入细胞因子，以防止T细胞的非特异性激活。抗原-特异性T细胞的IFNγ释放用ELISA测量。此外，通过流式细胞术分析共同培养的T细胞的CD137表达(33)。

T细胞显示了分别与HLA-B*07:02和HLA-B*15:01组合的pp65和E5的特异性反应性。抗原-MHC-特异性T细胞反应性可通过T细胞表面的IFNγ的释放和CD137的上调测量。因此，T细胞激活标记的细胞因子释放ELISA和流式细胞术分析组合代表一种检测抗原-MHC-特异性T细胞应答的可靠的双-方法读出系统。

2.3 病毒-特异性T细胞的分选以分析TCR库

T细胞，其显示在两种测定中对一个抗原-MHC组合的特异性应答，被选择以供FACS分选以分析TCR库。T细胞，其用CMV pp65扩增，与pp65-转染的K562-B*07:02靶细胞共同培养，并且从培养物中对CD137⁺ T细胞分选。几乎一半的CD8⁺ T细胞在这种设置下是CD137⁺。13%的CD8⁺ T细胞在与HPV16 E5-转染的K562-B*15:01靶细胞共同培养时表达CD137。

在抗原-MHC-特异性T细胞分选后，分离RNA并使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)用于TCR α和β基因的5’-RACE PCR生成cDNA。PCR扩增生成TCR α和β基因片段，其定量地代表在FACS-分选的T细胞样品中每个T细胞克隆型的量。使用TOPO®克隆系统(Invitrogen, Life Technologies)将TCR α和β基因片段的PCR产物连接至测序载体，转化至细菌并在含有选择性培养基的板上生长。每个细菌菌落被视为含有一个带有一个PCRTCR α或β基因片段的测序载体。许多细菌菌落的载体DNA制备之后接着测序载体插入物(TCR α或β基因片段)。每个细菌菌落的测序结果使用基于网的IMGT/V-Quest分析。相同的TCR α或β链的频率反映了FACS-分选的T细胞样品内相同T细胞克隆型的比例。接着，进行TCR α和β链的频率匹配以重建功能TCR，其负责抗原-MHC-特异性IFNγ释放和CD137上调。

TCR分析揭示TRAV17和TRAV38-2链各自以在响应于HPV16 E5和HLA-B*15:01后分选的所有T细胞的接近40%存在。3个TCR β可变链被发现以T细胞的21-32%存在(表1)。推测两个TCR α链的每一个可与3个TCR β链之一组装功能E5-特异性TCR。因此，有6种可能的候选TCR α和TCR β链的组合以组装功能HPV16 E5-特异性TCR。

对CMV pp65和HLA-B*07:02反应性分选的T细胞具有一个占优势的带有TRAV17和TRBV7-9链的TCR，二者分别以约70%的TCR α和TCR β菌落存在(表1)。

总之，TCR分析显示，抗原-MHC-特异性T细胞的CD137分选伴有对较少占优势的TCRα和β链的强烈富集，其以高频率出现且其可重建功能抗原-MHC-特异性TCR。

表1 TCR分析

2.4 TCR α和TCR β链组合的功能分析

为了TCR的转基因表达，每个TCR α和TCR β链基因被克隆至γ-逆转录病毒载体MP71。TCR的细胞表面表达和功能分析在用不同的TCR α和TCR β基因组合稳定转导PBMC后进行。

占优势的TCR α和TCR β链基因的可变区(TRAV和TRBV)，其负责肽-MHC (pMHC) I结合，融合于密码子-优化的鼠恒定TCR α和TCR β基因区段(mTRAC和mTRBC)，以使转基因TCR链优先的配对在T细胞的逆转录病毒转导后成为可能(39,40,71)。用对mTRBC特异性的抗体染色转基因TCR，接着用流式细胞术分析并表明所有TRA/TRB链组合在PBMC中表达(图9a)。然而，不同的组合的转导率在6-25%之间变化。为了功能分析，测试TCR-转导的T细胞对K562-B*15:01或K562-B*07:02靶细胞的反应性，所述细胞经由电穿孔分别用HPV16 E5或CMV pp65抗原ivtRNA转染。显著地，表达与TRBV6-5 (SEQ ID NO: 7)组合的TRAV17 (SEQID NO: 3)的T细胞识别E5-转染的靶细胞，而其它5个TRA/TRB组合没有一个表现出对E5的抗原-特异性反应性(图9b)。因此，与TRBV6-5组合的TRAV17重建功能抗原-特异性TCR。CMV-反应性T细胞的唯一候选TRA/TRB组合(TRAV17 (SEQ ID NO: 12)和TRBV7-9 (SEQ ID NO:16))显示K562-B*07:02靶细胞的pp65-特异性识别。TRA/TRB-转导的T细胞未显示对H₂O-转染的靶细胞的背景反应性(图9b)，因此允许功能抗原-MHC-特异性TCR的明确鉴定。

总之，来自抗原-特异性T细胞克隆型的TCR的重建通过TRA和TRB链的组合实现，其在FACS-分选的T细胞样品中被高频率地发现。具有所需抗原特异性的TCR的筛选、检测和分离可通过该方法完成，其以MHC细胞文库的使用为基础。

2.5 在PBMC中用于转基因表达的HPV-和CMV-特异性TCR的优化

为增加转基因TCR表达的效率，应用了几个优化的TCR转基因序列(71)。TRA和TRB链序列经密码子-优化，而人TRAC和TRBC基因区段被它们的鼠配对物替代，以增加转基因TCR链的优先结合并减少与由受体T细胞表达的内源性TCR链的配对(SEQ ID NO: 5、9、14、18)。然后优化的TRB基因经由P2A成分连接于TRA基因，生成的单一TCR转基因盒(E5-特异性的：SEQ ID NO: 40，pp65-特异性的：SEQ ID NO: 41)被分子克隆到γ-逆转录病毒载体MP71中。携带优化的TCR转基因盒的逆转录病毒颗粒经由293T细胞的3-质粒转染生成，供体PBMC用编码TCR的逆转录病毒颗粒稳定地转导(70)。在PBMC样品内的TCR基因-修饰的T细胞在转基因鼠TRBC的抗体染色后，通过流式细胞术分析。对于E5-特异性TCR (TRAV17 +TRBV6-5, SEQ ID NO: 40)的45%和对于pp65-特异性TCR (TRAV17 + TRBV7-9, SEQ IDNO: 41)的37%的TCR转导率可在PBMC中实现，而对CD8和转基因TCR分别为27%和22%阳性。总之，当使用用于重建功能TCR的非-优化的TRA和TRB单链转基因盒时，转基因TCR表达可从6-7%显著地改善至当使用优化的TCR转基因盒时的约40%。

2.6 HPV16 E5-特异性TCR的表位作图

在识别免疫原性抗原-MHC组合的T细胞克隆型的检测后(无免疫原性表位的现有知识)，进行表位作图以揭示被E5-特异性TCR识别的抗原HPV16 E5蛋白内的精确的肽序列。由TRAV17和TRBV6-5序列组成的HPV16 E5-特异性TCR是一种独特的TCR，其在以前未有描述。为了绘制由TCR识别的抗原序列图谱，HPV16 E5的3’-截短的微基因版本用扩增各自的感兴趣的基因区域的引物通过PCR生成。E5微基因被克隆到逆转录病毒载体MP71中并稳定地转导到K562-B*15:01靶细胞(图11a)。用优化的E5-特异性TCR基因盒转导的T细胞识别携带全长E5和189 nt E5微基因序列，但不携带126和63 nt E5微基因的靶细胞，如由IFNγ释放所指示的(图11b)。此外，E5 TCR-转导的T细胞释放IFNγ，不管靶细胞是否包含E5wt或E5co基因序列(图11b)。总之，HPV16 E5 TCR对氨基酸42-63之间的E5蛋白区内的表位是特异性的。

为缩小可以是E5-特异性TCR识别的靶的候选表位，使用基于网的IEDB T细胞表位结合预测器，进行计算机表位预测，该预测器整合了蛋白酶体裂解、TAP转运、ER加工和MHCI类结合的预测。进行在一个分析中包括8-14-聚体肽的整合表位预测。表位预测结果被计算为总分，其可被解释为在细胞表面的MHC分子上被加工和呈递的给定肽的概率。表2包括使用组成型蛋白酶体预测以正总分预测的所有表位(p1-p17)。与DCs形成对比，K562细胞表达组成型蛋白酶体，其类似于在肿瘤细胞中表达的蛋白酶体(76)。所有表位，其不从HPV16E5的氨基酸序列42-63中表达，从进一步的分析中排除。令人惊奇地，前3个预测的表位(p1-p3)必须弃去。

表2 HPV16 E5的表位预测

HPV16 E5的整合表位预测的结果列于表2。最好的预测的表位是排序第一。在氨基酸序列42-63内编码的肽以粗体打印显示。这10个候选表位依据序列相似性聚类(图12a)和肽被外部装载在K562-B*15:01靶细胞上。E5 TCR-转导的PBMC特异性地识别HPV16 E5表位p4 (SAFRCFIVY, SEQ ID NO: 1)。另外地，TCR清楚地识别SAFRCFIVY (SEQ ID NO: 1)的所有N-末端伸长的衍生物，包括赋予MHC I的非常规肽长度的12-、13-和14-聚体(图12b)。HLA-B*15:01可耐受在N-末端伸出的肽的结合。相比之下，没有其它肽被识别，虽然肽p6和p13被预测具有对HLA-B*15:01比对p4更高的结合亲和力。

总之，整合表位预测有利于由E5-特异性TCR识别的精确表位的作图。然而，该算法不能预测免疫原性表位，和具有E5的截短的微基因的抗原序列的作图在表位预测之前是必要的。

分离的TRAV17和TRBV7-9序列类似于CMV-特异性TCR。对CMV pp65特异性的并限制于HLA-B*07:02的TCR序列(在CDR3区域具有1-5个氨基酸差异)已被公开(66,67) (表1)。已报道这些TCR当在HLA-B*07:02上呈递时，识别CMV pp65的TPRVTGGGAM (SEQ ID NO: 10)10-聚体表位。在此，使pp65 TCR-转导的PBMC与用CMV pp65-衍生的表位p1 (TPRVTGGGAM,SEQ ID NO: 10)装载的K562-B*07:02靶细胞共同培养(图12a)。事实上，TCR-转导的T细胞识别p1-脉冲的靶细胞并释放IFNγ (图12b)。pp65 TCR-转导的PBMC是对p1特异性的，尽管与先前公布的pp65-B*07:02-特异性TCR比较在CDR3区中的序列差别。

概括地说，这个方法能够鉴定新的免疫原性HPV16 E5表位及其相应的TCR和免疫显性CMV pp65表位及其相应的TCR。两种TCR对内部加工的表位是特异性的并反映了在基于初始MHC细胞文库的筛选中仅由一个T细胞克隆型引起的T细胞应答。因此，采用本发明的方法(无表位的现有知识)，天然T细胞应答的无偏筛选和在抗原-特异性体外刺激后TCR快速鉴定是可能的，从而避免预测对限定抗原的功能T细胞应答的表位预测程序的限制，并避免资源-密集型和不利的T细胞克隆培养。该方法也可应用于TILs或组织-定居T细胞，且筛选可扩大至其它病原-衍生的和肿瘤-特异性抗原以及由TCR靶向的任何抗原。

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Claims

1.一种制备编码T细胞受体(TCR)构建体的TCR α链构建体(TRA)和TCR β链构建体(TRB)的核酸的方法，所述TCR构建体对来自在MHC上呈递的限定抗原的表位是特异性的，该方法包括

(a) 用呈递所述限定抗原的表位的专职抗原呈递细胞刺激从供体分离的T细胞，以富集抗原-特异性T细胞；和

(c) 选择由所述接触激活的T细胞；和

(d) 分离编码所述T细胞的TCR的TCR α和TCR β链的核酸。

2.权利要求1的方法，其中MHC是MHC I，其中细胞文库包含MHC I-表达的K562细胞。

3.权利要求1或2的方法，其中所述方法还包括优化序列和/或修饰TCR α和β链。

4.一种制备编码TCR构建体的TRA和TRB的核酸的方法，所述TCR构建体对来自在MHC上呈递的限定抗原的表位是特异性的，该方法包括制备从权利要求1-3中任一项的方法可获得的具有优化序列的核酸，其中所述优化包括

-优化TRA和TRB的密码子选择，和/或

-使人可变区与鼠恒定区或最小的鼠恒定区合并，和/或

-TCR序列的亲和力成熟，和/或

-产生包含TRA和TRB链基因的可变区的可溶性受体分子，和/或

-经由基因接头融合TRA和TRB以提供编码功能TCR构建体的两个链的单一转基因盒或制备单链TCR构建体。

5.权利要求1的方法，其中所述核酸是包含可操作地连接于适合于在T细胞中表达的启动子的TRA和TRB的载体，其中所述载体选自γ-逆转录病毒载体、慢病毒载体或基于转座子的载体。

6.一种制备表达TCR构建体的宿主细胞的方法，所述构建体对来自在MHC上呈递的限定抗原的表位是特异性的，该方法包括进行权利要求1-5的任一项的方法，并在宿主细胞中表达编码TRA和TRB的所述核酸。

7.一种鉴定在限定抗原中能够由MHC呈递的表位的方法，该方法包括进行权利要求1的步骤(a)-(d)和鉴定能够激活用核酸转染的T细胞的表位，所述核酸编码构成TCR构建体的分离的TRA和TRB，其中表位任选地以肽或核酸形式制备。

8.编码TCR构建体的TRA和/或TRB的核酸，所述TCR构建体对与人MHC I复合的表位是特异性的，其中所述表位是限制于HLA-B*15:01的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位，其中所述表位选自SEQ ID NO: 1, 45, 47, 49, 51和52。

9.权利要求8的核酸，其中TRA包含与SEQ ID NO: 2具有100%序列同一性的CDR3，

和/或其中TRB包含与SEQ ID NO: 6具有100%序列同一性的CDR3。

10.权利要求9的核酸，其中TRA的可变区包含SEQ ID NO:3；和/或其中TRB的可变区包含SEQ ID NO:7。

11.权利要求9的核酸，其中TRA包含SEQ ID NO:4；和/或其中TRB包含SEQ ID NO:8。

12.包含权利要求8-11中任一项的核酸的宿主细胞，所述核酸编码对人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位特异性的TCR构建体的TRA和TRB，并表达所述TCR。

13.权利要求12的宿主细胞，其中宿主细胞是CD8+ T细胞。

14.由权利要求8-11的任一项的核酸编码的蛋白。

15.权利要求14的蛋白，其包含TRA和TRB。

16.一种药用组合物，其包含权利要求15的蛋白、权利要求13的宿主细胞或权利要求8-11中任一项的核酸，其中所述TCR构建体包含TRA和TRB。

17.权利要求16的药用组合物在制备用于治疗感染人乳头瘤病毒16的患者的药物中的用途，其中TCR构建体对与HLA-B*15:01复合的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的表位是特异性的，且其中患者是HLA-B*15:01-阳性的。

18.一种核酸，其编码具有包含表位的至多40个氨基酸长度的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的片段，或具有包含表位的至多40个氨基酸长度的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的肽片段，其中所述表位能够被权利要求13中描述的T细胞的TCR构建体识别，其中E5表位选自SEQ IDNO: 47、51和52。

19.一种药用组合物，其包含权利要求18的核酸或权利要求18中描述的肽。

20.药用组合物在制备用于预防受试者中人乳头瘤病毒16的感染或用于治疗感染人乳头瘤病毒16的患者的药物中的用途，其中所述受试者或患者是HLA-B*15:01-阳性的；

所述药用组合物包含

a）编码具有包含表位的至多40个氨基酸长度的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的片段的核酸，或

b）具有包含表位的至多40个氨基酸长度的人乳头瘤病毒16癌蛋白E5的肽片段，

其中所述表位能够被权利要求13中描述的T细胞的TCR构建体识别，并且其中所述E5表位选自SEQ ID NO：1、45、47、49、51和52。