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CN113603773B - 靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7b8、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7b8、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用 Download PDF

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CN113603773B CN202110942049.9A CN202110942049A CN113603773B CN 113603773 B CN113603773 B CN 113603773B CN 202110942049 A CN202110942049 A CN 202110942049A CN 113603773 B CN113603773 B CN 113603773B
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Abstract

本发明公开了一类靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用。所述的靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8，其氨基酸序列包括轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列；所述轻链可变区，包含如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；所述重链可变区，包含如SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。通过本申请实施例的验证，所述的单克隆抗体7B8及其衍生体，在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中，或者在制备检测或诊断阿尔茨海默病产品中都有很好的临床应用前景。

Description

靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8、分泌该抗体的杂交瘤细胞 株及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一类靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)免疫治疗有主动免疫和被动免疫；关于主动免疫，如论文GILMAN S,KOLLER M,BLACK R S,et al.Clinical effects of Abeta immunization(AN1792)in patients with AD in an interrupted trial[J].Neurology,2005,64(9):1553-62.中所述，第一代主动免疫疫苗AN1792以纤维型Aβ1-42为免疫原，二期临床试验6％的病人因Aβ特异性T-细胞反应(TH1型CD4)出现脑膜脑炎而终止，第二代主动免疫疫苗避开该T-细胞反应选用短AβN-末端片段为抗原(如CAD106选用Aβ1-6)，临床研究显示尽管无脑膜脑炎发生，但仍有脑水肿、脑出血等不良反应，甚至有发生肿瘤、肺炎等趋势，且无明显临床疗效，分析该类疫苗的作用靶点，发现其共同特点是它们诱发的抗体均结合Aβ单体、寡聚体、老年斑甚至APP。被动免疫是指AD病人直接注射事先制备的人单克隆抗体，据LANNFELTL，MOLLER C，BASUN H，et al.Perspectives on future Alzheimer therapies:amyloid-beta protofibrils-a new target for immunotherapy with BAN2401 in Alzheimer'sdisease[J].Alzheimer's research&therapy，2014，6(2):16.报道，自bapineuzumab和solanezumab两个抗体最早用于治疗AD的临床试验以来，10余个不同的单克隆抗体进行了不同期的临床试验，公布结果的试验显示几乎所有研究无明显临床疗效。经分析，这些抗体其共同特征是主要结合Aβ单体或Aβ纤维体/老年斑或同时结合Aβ单体、寡聚体和老年斑甚至APP，特别是最近礼来公司的单克隆抗体solanezumab治疗AD的Ⅲ期临床试验以失败而告终，其特征就是该抗体对Aβ单体具很强的亲和性。在文献SEVIGNY J，CHIAO P，BUSSIERE T，et al.The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease[J].Nature，2016，537(7618):50-6中的研究表明单克隆抗体aducanumab在治疗轻度AD患者时有一定效果，其特征就是如文献LINSE S，SCHEIDT T，BERNFUR K，et al.Kineticfingerprints differentiate the mechanisms of action of anti-Abeta antibodies[J].Nat Struct Mol Biol，2020，27(12):1125-33.所述，该抗体选择性结合Aβ寡聚体和纤维体，此针对性的结合并清除能力可能是其发挥临床疗效的关键。Aβ单体中的Aβ42在生理浓度时具神经营养和神经保护作用，但过度产生因其有很强的聚集特性，是其发挥毒性作用的重要类型，其脑内浓度的升高聚集会对神经突触产生不可逆的损害，进而导致认知能力下降，bapineuzumab和solanezumab两个单克隆抗体无临床疗效其原因之一可能与Aβ单体的过度清除有关，而渤健和卫材联合开发的抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体Aducanumab对Aβ单体亲和性极低，不能清除过度产生的Aβ单体，这可能影响了其临床疗效。目前尚无针对阿尔茨海默病的疾病修饰治疗药物，针对这一治疗困境，急需开发可以阻断疾病进展的治疗药物，靶向Aβ的单克隆抗体药物可能是最有前途的一种治疗方法。
总之，现有技术中的靶向Aβ的单克隆抗体虽然已经显示出了一定的治疗效果，但仍需要解决的问题是其清除效果的不足，以及如何减少其不良反应的发生。因此，亟需一种新技术解决现有技术中的技术问题。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种靶向淀粉样蛋白(Aβ)的单克隆抗体7B8、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用。该单克隆抗体7B8对于Aβ寡聚体、纤维体和老年斑具有较强的结合能力，并弱结合Aβ单体；具有很好的临床应用前景。
本发明所述的靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8，其氨基酸序列包括轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列；所述轻链可变区，包括3个抗原互补决定区(CDR)，分别是CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，分别包含SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；所述重链可变区，包括3个抗原互补决定区(CDR)分别是CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，分别包含SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。
对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述轻链可变区具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID No.7所示的序列经缺失、与SEQ ID No.7所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且具有相同功能的氨基酸序列、替换或插入一个或多个氨基酸得到具有相同功能的氨基酸序列。所述“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述重链可变区具有SEQ ID No.8所示氨基酸序列或具有SEQ ID No.8所示的序列经缺失、与SEQ ID No.8所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且具有相同功能的氨基酸序列、替换或插入一个或多个氨基酸得到具有相同功能的氨基酸序列。所述“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述轻链可变区具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、或具有如SEQ ID No.9所示的序列经缺失、替换或插入一个或多个核苷酸得到具有相同功能的核苷酸序列。所述“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
对于上文所述的技术方案，进一步优选地，所述重链可变区具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列、或具有如SEQ ID No.10所示的序列经缺失、替换或插入一个或多个核苷酸得到具有相同功能的核苷酸序列。所述“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
本发明的第二方面涉及上文所述靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8的衍生体，包括具有相同功能的抗体Fab片段、单链抗体和双特异抗体等。
本发明的第三方面涉及一种杂交瘤细胞株，其可以稳定分泌上文所述的靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8或者所述的单克隆抗体7B8的衍生体，即抗Aβ3-10的单克隆抗体。
本发明第四方面涉及上文所述的靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8或者所述的单克隆抗体7B8的衍生体，在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用，或者在制备检测或诊断阿尔茨海默病产品中的应用。经过本申请实施例的阿尔茨海默病转基因动物模型实验，证实单克隆抗体7B8可以结合并清除Aβ寡聚体、纤维体、老年斑和部分单体，避开了与炎症反应相关的T细胞反应，表现为TH2反应，改善动物认知功能避免微出血副作用，具有很好的临床应用前景。
本发明的第五方面涉及上文所述杂交瘤细胞株的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将序列如SEQ ID No.11的人工合成的多肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联，并以此作为抗原，免疫小鼠，再通过骨髓瘤细胞融合、母克隆和多轮亚克隆筛选，制备并获得稳定分泌抗Aβ3-10的单克隆抗体杂交瘤细胞株。目前杂交瘤细胞株保存在中国医科大学健康科学研究院。该杂交瘤细胞株可以分泌出1:50万倍(高滴度)结合Aβ成分的单克隆抗体。该单克隆抗体经鉴定重链恒定区为小鼠IgG1，轻链恒定区为小鼠κ链，其对于Aβ寡聚体、纤维体和老年斑具有较强的结合能力，并弱结合Aβ单体。
进一步优选地，所述制备方法中的偶联方法如下：
①制备用硼酸盐缓冲液溶解载体蛋白匙孔血蓝蛋白KLH，透析，制备KLH溶液；
②用二甲基甲酰胺溶解MBS，制备MBS溶液；
③按照KLH和MBS质量比8-12:1将KLH溶液和MBS溶液混合，孵育，获得活化好的载体蛋白-MBS树脂；
④用PBS缓冲液充分溶解人工合成多肽，获得溶解好的多肽；
⑤按照载体蛋白KLH与人工合成多肽质量比1:0.8-1.2，向步骤③获得的活化好的载体蛋白-MBS树脂中加入步骤④溶解好的多肽，振荡条件下，18-25℃反应，获得偶联的多肽抗原。
进一步优选地，所述制备方法中，将获得的偶联的多肽抗原与弗氏佐剂混合后充分乳化，腹腔注射方法免疫小鼠，免疫三次，每周一次，首次使用完全弗氏佐剂乳化，免疫抗原剂量40-60μg，之后每次使用不完全弗氏佐剂乳化，免疫抗原剂量20-30μg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所述靶向Aβ的单克隆抗体7B8主要结合Aβ寡聚体、纤维体和老年斑，同时可以弱结合单体，弥补了既往靶向Aβ单克隆抗体仅仅清除上述类型的一种或几种导致的清除不足，同时避免了过多的清除Aβ类型比如单体和APP导致的正常生理功能受损，同时避免了清除Aβ类型导致的脑内微出血和胶质细胞过度激活引发的炎症反应。结合本发明实施例的检测结果来看，对纯化后的抗体单克隆抗体7B8进行ELISA检测，确定其效价达到1:50万。经过体外和动物实验显示较好的清除了Aβ寡聚体、纤维体和老年斑并降低了脑内Aβ单体的浓度；经过水迷宫实验验证，单克隆抗体7B8组的目标象限时间和穿过平台的次数显著高于对照组，具有统计学意义，证明显著改善了动物的认知功能；具有很好的临床应用前景。
附图说明
图1是ELISA检测单克隆抗体7B8结合Aβ单体、寡聚体和纤维体结果图。其中，6E10为阳性对照抗体；7B8为待检测单克隆抗体；ctrl为对照。Aβ3-10为短肽片段，Aβ42为人源淀粉样蛋白42和AβpE3为焦谷氨酸修饰截短的淀粉样蛋白，mon、oli、fib分别为单体、寡聚体、纤维体。
图2是Dot blot检测单克隆抗体7B8结合Aβ单体、寡聚体和纤维体结果图。其中，6E10为阳性对照抗体；7B8为待检测单克隆抗体；ctrl为对照。
图3是Western检测单克隆抗体7B8结合转基因小鼠脑内的Aβ寡聚体结果图。其中，6E10为阳性对照抗体；7B8为待检测单克隆抗体；ctrl为对照组，Aβ*56为Aβ寡聚体的重要类型。
图4是免疫组化染色结果图，证明单克隆抗体7B8结合转基因小鼠脑内细胞外的老年斑和细胞内的Aβ成分。其中，6E10为阳性对照抗体；7B8为待检测单克隆抗体；9D5为识别AβpE3寡聚体的阳性对照抗体。
图5为2×Tg动物实验水迷宫结果，其中，WT为野生型小鼠组，IgG为对照组，7B8为实验组。由图所示单克隆抗体7B8组显著提高了学习和认知能力。
图6为2×Tg动物实验脑组织切片免疫组化染色结果图，单克隆抗体7B8组脑内Aβ单体、寡聚体和老年斑较对照组明显减少。图中，Aβ1-42和Aβ1-40为淀粉样蛋白的单体类型；WT为野生型小鼠组，IgG为对照组，7B8为实验组。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
下述实施例中使用的培养基，还包括：
2×HT培养基为2％H(Hypoxanthine，SIGMA-ALDRICH)+2％T(Thymidine，，SIGMA-ALDRICH)+20％FBS(WISENT)+DMEM(Hyclone)；2×A培养基为2％A(Aminopterin，SIGMA-ALDRICH)+DMEM(Hyclone)。
下述实施例中使用的阳性对照6E10，购自Biolegend。
下述实施例中使用的阴性对照ctrl为NeuN，购自Abcam。
下述实施例中使用的9D5，为阳性对照抗体，购自Synaptic Systems。
采用固相合成法合成多肽Aβ3-10，纯度为91.4％，多肽序列为{Glu}{Phe}{Arg}{His}{Asp}{Ser}{Gly}{Tyr}C，序列如SEQ ID No.11(EFRHDSGY)所示。
实施例1
1.应用Aβ3-10多肽片段为抗原制备单克隆抗体
1)偶联的多肽抗原的制备方法如下：
①制备用硼酸盐缓冲液(pH＝8.5)溶解载体蛋白匙孔血蓝蛋白KLH至透析袋室温下透析2小时，制备浓度为10mg/mL的KLH溶液；所述的硼酸盐缓冲液按常规方法配置。
②用二甲基甲酰胺溶解MBS，制备浓度为10mg/mL的MBS溶液；
③室温下按照KLH和MBS质量比10:1将KLH溶液和MBS溶液混合，孵育30分钟，获得活化好的载体蛋白-MBS树脂；将活化的KLH溶液添加到圆柱上去除多余的MBS和反应副产品；
④用PBS缓冲液充分溶解人工合成多肽，获得溶解好的多肽；所述的PBS缓冲液按常规方法配置。
⑤按照载体蛋白KLH与人工合成多肽质量比1:1，向步骤③获得的活化好的载体蛋白-MBS树脂中加入步骤④溶解好的多肽，振荡条件下，18-25℃反应3小时，获得偶联的多肽抗原，用于实验动物免疫。
2)将步骤1)制备的偶联的多肽抗原与弗氏佐剂按1:1的体积比混合后充分乳化，取6-8周龄的Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)5只，腹腔注射的方法免疫三次，每周一次，首次使用完全弗氏佐剂(SIGMA Cat.No.F5881)乳化，免疫抗原剂量50μg，之后每次使用不完全弗氏佐剂(SIGMA Cat.No.F5506)乳化，免疫抗原剂量25μg。收集小鼠血清进行免疫应答情况的抗体浓度检测，选择2只小鼠于细胞融合前4天相同方法剂量进行冲击免疫。
3)采集饲养细胞，用二氧化碳将ICR鼠安乐死，用注射器将5mL无菌培养基注入小鼠腹腔，反复吹打尽可能多抽出腹腔液体，将饲养细胞打入培养皿用2×HT培养基制成细胞悬液，进行细胞计数，按照104/孔，100μL/孔的量铺入96孔板，每只小鼠铺板15块。制备小鼠B细胞悬液，取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0，上海细胞所)和制备的小鼠B细胞按照1:2的数量比混合，采用电融合的方法进行细胞融合。用2×A培养基将融合后的细胞重悬于50mL的离心管制成细胞悬液，按照每孔100μL的量铺入准备好的96孔板中，置于培养箱37℃恒温培养6天。
4)融合后第6天，每孔更换150μL的新鲜HT培养基。采用ELISA法筛选阳性克隆，包被抗原Aβ3-10，包被浓度1μg/mL，以新鲜HT培养基为阴性对照，测定吸光度OD值与对照OD值比≥2.1为阳性克隆孔，经过2次培养复检筛选出阳性母克隆细胞株。采用有限稀释法按照3个/孔的细胞密度对阳性母克隆进行亚克隆，以确保这些阳性克隆分别来自于单个母克隆细胞。筛选2个效价最好的子克隆进行扩大培养，采用10％DMSO细胞冻存液冻存，细胞密度为106/mL，得到能够稳定分泌抗Aβ3-10的单克隆抗体杂交瘤细胞株，目前杂交瘤细胞株保存在中国医科大学健康科学研究院。所述制备的单克隆抗体7B8经鉴定重链恒定区为小鼠IgG1，轻链恒定区为小鼠κ链；制备单克隆抗体7B8所选择的AβN末端片段抗原可以避开特异性T-细胞反应导致的脑膜脑炎，同时该制备方法筛选出的单克隆抗体7B8经过体外结合实验验证可以高效价的结合Aβ寡聚体、纤维体和老年斑。
5)将单克隆抗体细胞株转移到装有完全培养基(Gibco&WISENT)的15mL离心管中，离心后去上清，用新鲜完全培养基重悬后转移到装有完全培养基的平皿中，放入培养箱中培养。观察细胞状态，将其离心后用新鲜FEM培养基(Gibco&WISENT)重悬，转移到125mL的摇瓶中用FEM培养基补至75mL驯化培养。2天后取细胞上清用于效价检测并计数，按接种密度0.6×105个/mL取对应的细胞悬液转入2L转瓶中，补充FEM培养基至500mL，在37℃的温度下进行培养。9天后收集细胞上清，利用Protein A柱，亲和层析方法在低内毒素条件下进行抗体纯化，并通过SDS-PAGE鉴定抗体的纯度。纯化后的抗体为单克隆抗体7B8样品，对其进行ELISA检测确定效价达到1:50万。
2.ELISA法验证单克隆抗体7B8结合Aβ情况
1)取购置的淀粉样蛋白Aβ42(Bachem)和焦谷氨酸修饰截短的淀粉样蛋白AβpE3(Bachem)，按照既往文献STINE W B，JR.，DAHLGREN K N，KRAFFT G A，et al.In vitrocharacterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization andfibrillogenesis[J].The Journal of biological chemistry，2003，278(13):11612-22的方法制备单体、寡聚体和纤维体。制备完毕使用电镜观察，形态大小符合要求可以进一步使用。
2)使用包被液把Aβ(Bachem)稀释到5μg/mL，取100μL/孔加入到96孔酶标板上，盖上封板膜，4℃孵育过夜。次日弃去上清液，用PBST 300μL/孔，洗板3次。在滤纸上把酶标板中剩余液体拍干，每孔加入200μL的封闭液(PBS+1.5％BSA+0.1％Tween20)，盖上封板膜，室温孵育1小时。弃上清，用PBST 300μL/孔，洗板3次，滤纸拍干。使用封闭液稀释单克隆抗体7B8和阳性对照6E10(Biolegend)、阴性对照NeuN(Abcam)抗体，100μL/孔加入酶标板，盖封板膜室温孵育2小时。孵育结束弃上清，PBST 300μL/孔洗板三次，滤纸拍干。使用封闭液按照1:3000倍稀释结合含有辣根过氧化物酶的山羊抗鼠IgG(Abcam)，100μL/孔，室温孵育1小时。然后弃上清，PBST洗板6次，300μL/孔，滤纸拍干。
3)加入TMB显色液，100μL/孔，避光条件下孵育30分钟。每孔加入50μL 2M硫酸终止液终止反应。把酶标板放在酶标仪上，450nm条件下读取OD值。
4)结果见图1:单克隆抗体7B8弱结合Aβ42单体，对Aβ42寡聚体、纤维体及AβpE3单体、寡聚体、纤维体都有较强的结合作用。(6E10为商品化的针对所有类型Aβ的单克隆抗体，ctrl为一种对Aβ不相关的单克隆抗体NeuN(Abcam)，6E10稀释倍数为1:50万，7B8稀释倍数为1:2万)。
3.Dot blot法验证单克隆抗体7B8结合Aβ情况
1)将Aβ3-10，Aβ42和AβpE3单体、寡聚体、纤维体点在硝酸纤维素(NC)膜上，每点3μL，室温40分钟完全干燥。
2)使用含5％脱脂奶粉的TBST封闭液室温摇床封闭NC膜1小时。完毕后弃去封闭液，TBST洗膜3次。
3)按照最佳比例使用封闭液稀释并加入单克隆抗体7B8和阳性对照6E10(Biolegend)、阴性对照NeuN(Abcam)抗体，室温摇床孵育2小时。完毕后回收稀释抗体，TBST洗膜3次。
4)使用封闭液按照1:5000倍稀释结合含有辣根过氧化物酶的山羊抗鼠IgG(Abcam)，室温孵育1小时，弃去液体TBST洗膜3次。
5)配置ECL发光液(Thermo)，取适量滴到NC膜上并覆盖均匀，放入ECL发光仪暗室内适宜条件下发光并拍照记录。
6)结果见图2：单克隆抗体7B8弱结合Aβ42单体，对Aβ42寡聚体、纤维体及AβpE3单体、寡聚体、纤维体都有较强的结合作用。(6E10为阳性对照抗体，ctrl为一种与Aβ不相关的抗体，NeuN(Abcam))
4.Western法验证单克隆抗体7B8结合转基因小鼠脑内的Aβ寡聚体
1)8月龄大的APP/PS1/tau转基因鼠(购买自美国杰克逊实验室)，麻醉后经心脏灌流后取脑，分离脑组织将左半脑放入-80℃冰箱中保存。使用时取出脑组织并用剪刀剪碎，加入RIPA溶液(50mM Tris，150mM NaCl，1％Triton X-100，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS)裂解脑组织，然后4℃条件下14000g离心30分钟，取上清。BCA法测定蛋白浓度后按比例加入上样缓冲液，煮沸后-20℃下保存用于电泳。
2)配置16.5％的Tris-Tricine胶(solarbio)，上样加入处理好的脑组织匀浆蛋白，在100v条件下电泳2小时，然后70v条件下转膜2小时。电转完毕后5％的脱脂奶粉封闭液室温封闭1小时。
3)TPST洗膜3次，分别加入适宜浓度的单克隆抗体7B8和阴性对照NeuN(Abcam)及阳性对照抗体6E10(Biolegend)，4℃条件下孵育过夜。之后加入1:5000倍稀释结合含有辣根过氧化物酶的山羊抗鼠IgG，室温封闭2小时。洗膜3次后滴入适量的发光液，放入ECL发光仪暗室内适宜条件下发光并拍照记录。结果见图3:单克隆抗体7B8结合3×Tg小鼠脑内的Aβ寡聚体，包括Aβ*56。6E10为阳性对照抗体，ctrl为一种与Aβ不相关的抗体NeuN(Abcam)。
5.免疫组化染色验证单克隆抗体7B8结合转基因小鼠脑内Aβ成分
1)取14月龄的APP/PS1和APP/PS1/tau转基因鼠，按照上述实施方式4方法取脑组织，右半脑放入4％的多聚甲醛中固定24小时，30％的多聚糖溶液沉糖24小时，冰冻切片20μm厚。
2)脑片放入柠檬酸钠抗原修复液煮沸抗原修复20分钟，3％双氧水灭活内源性过氧化物酶，10％的山羊血清进行封闭30分钟，加入单克隆抗体7B8和阳性对照抗体，4℃孵育过夜。滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG孵育3小时，PBS液洗片后滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液孵育3小时，然后DAB显色液显色15分钟，苏木素染色20秒，脱水透明后封片。显微镜下观察并拍照。
3)结果见图4：单克隆抗体7B8结合2×Tg 14月龄小鼠和3×Tg 14月龄小鼠脑内Aβ情况。2×Tg小鼠脑内大量Aβ斑块沉积，7B8与6E10类似结合Aβ斑块，同时结合致密核心和疏松的老年斑，9D5不结合老年斑。14月龄3×Tg小鼠没有明显老年斑沉积，7B8与9D5结合模式相类似，结合整个皮质和海马神经元细胞内的Aβ成分，而6E10主要结合皮质第5层和海马神经元细胞内的Aβ成分。6E10为阳性对照抗体，结合所有的Aβ成分；9D5为阳性对照抗体，结合Aβ寡聚体。
6.单克隆抗体7B8治疗2×Tg小鼠效果
1)2×Tg小鼠12只购买自广东省实验动物中心，分为2组，一组注射单克隆抗体7B8，一组注射PBS，野生组小鼠C57BL/6选自中国医科大学动物部。采用腹腔注射的方式给药，每周一次，每次250μg单克隆抗体7B8或者相同体积的PBS，共7周。
2)给药结束后进行水迷宫实验，水迷宫由一个圆形水池和一个可移动的平台组成，水池的直径为120cm，高度为40cm，平台的直径为8cm。虚拟的将水池分为东、北、西、南四个象限，并将平台置于东象限中央。可见平台期实验，实验第1-2天进行4次实验，从对向四个位置面向池壁入水，平台置于水面上1cm，观察小鼠爬上平台时间。定向航行实验，实验第3-7天，平台置于水下1cm，每天将小鼠按照逆时针的顺序分别从东、北、西、南四个象限开始入水进行4次试验。入水后小鼠开始寻找平台，若小鼠找到平台，软件自动停止计时，小鼠在平台停留5秒钟，若1min未到达，则将小鼠引导至平台并停留20秒结束，记录小鼠到达平台的时间。空间探索实验，实验第8天，撤走平台，选择西象限为首先入水象限，让小鼠自由游动1分钟后停止实验，并保存视频、导出分析数据。
3)图5为水迷宫实验结果：单克隆抗体7B8组显著提高了学习和认知能力。(A)表示小鼠的游泳轨迹图。(B)空间探索试验中小鼠在目标象限中的时间。(C)空间探索试验中小鼠穿过原平台位置的次数。图5中的B、C结果有统计学意义，7B8组的目标象限时间和穿过平台的次数显著高于对照组，具有统计学意义。
4)水迷宫实验结束后按照上述实施方式4方法麻醉取脑，脑组织匀浆提取蛋白，采用Aβ检测试剂盒(cusabio)测定脑内Aβ1-42和Aβ1-40的含量，操作步骤按照说明书进行。
5)右半脑石蜡包埋后进行切片，8μm厚，经过脱蜡后按照上述实施方式5步骤进行抗原修复、灭活内源性过氧化物酶，封闭后滴加抗体进行染色并封片镜检。
6)图6(A)为7B8组脑内Aβ1-42和Aβ1-40的含量明显的降低。(B)硫黄素S染色显示7B8组老年斑明显减少。(C)6E10染色显示7B8组总Aβ量减少。(D)A11染色显示7B8组Aβ寡聚体量减少。图6的B、C、D直观的观察可以发现明显的差异。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Figure BDA0003215454000000111
Figure BDA0003215454000000121
Figure BDA0003215454000000131
序列表
<110> 中国医科大学附属第一医院
<120> 靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> CDR-L1
<400> 1
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Thr
1 5 10 15
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> CDR-L2
<400> 2
Leu Met Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> CDR-L3
<400> 3
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> CDR-H1
<400> 4
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> CDR-H2
<400> 5
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Lys Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> CDR-H3
<400> 6
Glu Gly Arg Gly Tyr
1 5
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 未知()
<400> 7
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Gly
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Met Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 114
<212> PRT
<213> 未知()
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Lys Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 9
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatggtgatg gaaagacata tttgacttgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctgatgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 10
<211> 342
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 10
caggtccaac tacagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaaga cttctgacta ctccttcact agttactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaacggtcg taaaaagtac 180
aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtggaca catcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagaggga 300
cggggctact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 11
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
1 5

Claims (7)

1. 一种靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8，其特征在于：其氨基酸序列包括轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列；所述轻链可变区，包括3个抗原互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示；所述重链可变区，包括3个抗原互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6所示。
2. 根据权利要求1所述的靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8，其特征在于：所述轻链可变区具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列、与SEQ ID No.7所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且具有相同功能的氨基酸序列、或具有如SEQ ID No.7所示的序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到具有相同功能的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8，其特征在于：所述重链可变区具有SEQ ID No.8所示氨基酸序列、与SEQ ID No.8所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且具有相同功能的氨基酸序列、或具有SEQ ID No.8所示的序列经缺失、替换或插入一个或多个氨基酸得到具有相同功能的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8，其特征在于：所述轻链可变区具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、或具有如SEQ ID No.9所示的序列经缺失、替换或插入一个或多个核苷酸得到具有相同功能的核苷酸序列。
5. 根据权利要求1所述的靶向淀粉样蛋白的单克隆抗体7B8，其特征在于：所述重链可变区具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列、或具有如SEQ ID No.10所示的序列经缺失、替换或插入一个或多个核苷酸得到具有相同功能的核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的单克隆抗体7B8在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物中的应用，或者在制备检测或诊断阿尔茨海默病产品中的应用。
7.一种杂交瘤细胞株，稳定分泌如权利要求1所述的单克隆抗体7B8。
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