CN111358778A - Mcc950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用 - Google Patents
Mcc950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及MCC950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用，属于药物制备技术领域。MCC950制备得到的药物能够抑制淀粉样前体蛋白分泌酶的表达并抑制β‑淀粉样蛋白的聚集，实现阿尔茨海默病的预防或治疗。
Description
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及MCC950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)病程长，对患者本人、家庭和社会均带来巨大的经济负担。针对AD的发病机制，目前有β-淀粉样蛋白(Aβ)级联假说和Tau蛋白过度磷酸化假说等。然而，到目前为止，AD的确切病因和机制尚不十分清楚。
目前FDA已批准的AD治疗药物，包括：胆碱酯酶抑制剂，他克林(盐野义)，多奈哌齐(卫材)，卡巴拉汀(诺华)，加兰他敏(强生)；兴奋性氨基酸受体抑制剂：美金刚(麦氏)，并于2014年批准了多奈哌齐和美金刚的联合疗法。国内批准的治疗药物除以上五种，还有类似神经生长因子作用的脑活素(脑蛋白水解物)，胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲，以及扩张血管，增强神经传导作用的尼麦角林。
目前已进入临床研究的AD治疗药物，主要集中在tau蛋白抗体、β-淀粉样蛋白抗体和BACE1抑制剂三个方向上，比如礼来的Solanezumab，辉瑞及强生的单抗药物Bapineuzumab及罗氏的Gantenerumab均在Ⅲ期临床中遭遇失败，对患者认知功能障碍没有明显改善。
发明内容
本发明的目的在于提供MCC950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。MCC950及制备得到的药物能够抑制淀粉样蛋白前体蛋白分泌酶的表达并抑制β-淀粉样蛋白的聚集，实现阿尔茨海默病的预防或治疗。
本发明提供了MCC950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
本发明还提供了MCC950在制备减少β-淀粉样蛋白剪切的药物中的应用。
本发明还提供了MCC950在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物中的应用。
本发明还提供了MCC950在制备抑制淀粉样前体蛋白分泌酶的表达的药物中的应用。
优选的是，所述淀粉样前体蛋白分泌酶包括β-分泌酶和/或γ-分泌酶复合体。
本发明还提供了MCC950在制备降低淀粉样前体蛋白和/或淀粉样前体碳端片段蛋白表达水平的药物中的应用。
本发明提供了MCC950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。MCC950能够抑制β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶复合体(PS、NCT)、淀粉样前体蛋白(淀粉样蛋白前体全长蛋白，APP full length，fl-APP)、淀粉样前体碳端片段(APP C-terminal fragments，APP-CTFs)蛋白的表达水平，故MCC950能够通过特异性抑制淀粉样蛋白前体蛋白及其相关分泌酶的表达，减少Aβ的剪切；MCC950能够抑制Aβ的聚集，进而减少老年斑的形成，缓解AD的病理进程。试验结果表明，经Western Blot验证，当给予Sw细胞50nM MCC950后，β-分泌酶BACE1，γ-分泌酶复合体(PS、NCT)，淀粉样前体蛋白(fl-APP)，淀粉样前体碳端片段(APP-CTFs)蛋白表达水平显著降低。经SDD-Age验证，5μM、50μM MCC950均能显著抑制Aβ的聚集。
附图说明
图1为本发明提供的MCC950改善AD病理进程的分子机制示意图；
图2为本发明提供的AD相关靶点示意图；
图3为本发明提供的MCC950相关靶点示意图；
图4为本发明提供的MCC950靶点及存在相互作用基因网络示意图；
图5为本发明提供的MCC950与AD的共同潜在靶点文恩图；
图6为本发明提供的MCC950及AD分子靶点参与的生物过程图；
图7为本发明提供的MCC950及AD分子靶点参与的信号通路图；
图8为本发明提供的APP淀粉样代谢途径相关分泌酶及APP酶切产物的蛋白表达水平及相对蛋白表达水平统计图；
图9为本发明提供的Aβ蛋白聚集情况结果图。
具体实施方式
本发明提供了MCC950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。本发明通过对MCC950和AD的基因筛选和生物过程分析发现，与MCC950和AD相关性较高的生物过程主要为：蛋白质修饰、线粒体调控、细胞因子生成、细胞程序性死亡、DNA损伤、氧化应激反应、神经系统发育和金属离子平衡等，图1为本发明提供的MCC950改善AD病理进程的分子机制示意图。APP酶切有两种不同的途径(图1)，即非淀粉样途径和淀粉样途径。非淀粉样途径：APP经过α-分泌酶酶切产生留在膜中的83个氨基酸的C端片段(C83)和释放到胞外基质的N端胞外域(sAPPα)。C83能进一步被γ-分泌酶酶切，产生被称为“P3肽”的短片段和C端片段(CTF)。淀粉样途径：APP经过β-分泌酶(BACE1)酶切产生99个氨基酸的C端片段(C99)则留在膜中。γ-分泌酶对该片段(在残基38与43之间)继续进行酶切，释放出具有神经毒性的Aβ肽。γ-分泌酶是一种由早老素1或2(PS1和PS2)、呆蛋白、前咽缺陷蛋白(APH-1)、以及早老素增强剂2(PEN2)组成的酶复合体。
Aβ的剪切和聚集是AD的主要病理特征，MCC950能够减少Aβ的剪切，抑制其聚集，为开发MCC950作为缓解AD病理特征的药物提供了充分的理论依据。
本发明还提供了MCC950在制备减少β-淀粉样蛋白剪切的药物中的应用。
本发明还提供了MCC950在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物中的应用。
本发明还提供了MCC950在制备抑制淀粉样前体蛋白分泌酶的表达中的应用。在本发明中，所述淀粉样前体蛋白分泌酶包括β-分泌酶和/或γ-分泌酶复合体。本发明通过具体试验表明，MCC950能够抑制β-分泌酶(β位前体样蛋白裂解酶-1，Beta-site amyloidprecursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)、γ-分泌酶复合体(PS、NCT)蛋白的表达水平。故MCC950能够通过特异性抑制淀粉样蛋白前体蛋白分泌酶的表达，减少Aβ的剪切。
本发明还提供了MCC950在制备淀粉样前体蛋白和/或淀粉样前体碳端片段蛋白表达水平中的应用。本发明通过具体试验表明，MCC950能够抑制淀粉样前体蛋白(fl-APP)、淀粉样前体碳端片段(APP-CTFs)蛋白的表达水平。APP分别经过非淀粉样途径(α-分泌酶)或淀粉样途径(β-分泌酶)剪切分别产生CTF-83(C83)或CTF-99(C99)，而进一步经过γ-分泌酶分别产生P3肽或Aβ，两个CTF片段的表达水平降低，且APP表达水平也明显降低的条件下，说明APP的生产和剪切减少。
本发明选择SW细胞作为研究模型，检测MCC950对淀粉样蛋白前体蛋白及其相关分泌酶表达的影响，研究MCC950参与Aβ的剪切和聚集过程的分子机制，为确定将MCC950作为AD等神经退行性疾病的治疗药物提供充分的理论依据。
下面结合具体实施例对本发明所述的MCC950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
MCC950和AD相关靶点的生物信息学分析
(1)MCC950和AD的靶点虚拟筛选：对MCC950靶点的筛选，采用的是PharmMapper工作站，基于药物活性分子中对活性起着重要作用的“药效特征元素”及其空间排列形式，即药效团对MCC950的靶点进行虚拟筛选。对AD靶点的筛选(图2，AD相关靶点示意图)，则采用的是Therapeutic Target Database(TTD)、GeneticAssociationDatabase(GAD)、PharmGkb和DiGSeE数据库检索AD相关靶点，并进行统计分析。利用Cytoscape里的Bisogenet插件中的DIP、BIDGRID、HPRD、INTACT、MINT和BIND数据库来对与MCC950的靶点(图3，MCC950相关靶点示意图)存在相互作用的蛋白进行虚拟筛选，得到MCC950靶点相互作用蛋白网络(图4，MCC950靶点及存在相互作用基因网络示意图)，即(ProteinProtein Interaction，PPI)网络。
(2)将统计分析得到的AD和MCC950的共同靶点进行生物过程的分析，绘制文恩图(图5，MCC950与AD的共同潜在靶点文恩图)。利用Cytoscape里的GO BiologicalProcessGOA分析相关的生物过程(图6，MCC950及AD分子靶点参与的生物过程图)，结果包括细胞程序性死亡，蛋白修饰，神经系统的发育，线粒体的调控，金属离子稳态等生物过程。
分析结果如图(图2～7)所示。AD的靶点基因有3238个，MCC950的靶点基因有115个，并对靶点基因分别进行了蛋白相互作用网络的预测，得到与靶点基因有相互作用的基因共计4117个，对MCC950靶点及相互作用的基因与AD靶点基因进行统计分析，绘制了文恩图，得到共有基因1105个，占基因总数的17.7％，与MCC950和AD相关性较高的信号通路(图7，MCC950及AD分子靶点参与的信号通路图)主要为蛋白质修饰、细胞程序性死亡、细胞因子生成、神经系统发育等。
实施例2
MCC950影响淀粉样蛋白前体蛋白代谢分泌酶和淀粉样蛋白前体蛋白酶切产物(酶切产物即CTF)表达水平的研究
SW细胞蛋白质的提取：
将SW以5×105个/孔的密度接种到六孔细胞培养板，培养24h待细胞贴壁后，更换新鲜无血清培养基，分别加入DMSO，MCC950，给药剂量为10nM和50nM，放入5％CO2培养箱中37℃孵育24h。
使用负压器吸去六孔培养皿中的培养，用PBS润洗细胞1次，每孔加入0.5mL细胞裂解液，反复吹打至粘稠后，加入对应编号的EP管中，98-99℃水浴加热5-10min，-80℃保存。
使用负压器吸去六孔培养皿中的培养，用PBS润洗细胞1次，用细胞刮板刮下细胞加入对应编号的EP管中，并放入100μL裂解液(1/25，V/V，MPER/PMSF)，冰浴，10min涡旋1次，持续1h，4℃，14000rpm离心15min，吸取上清至对应编号的EP管中，使用BCA法测定浓度，分装后，98-99℃水浴。加热5-10min，-80℃保存。
BCA法测定蛋白质的浓度：
在96孔板A1-A8孔中加入15μL的Nuclease-Free H2O，将15μL的BSA溶液加入96孔板A1位置，充分混匀后，吸取15μL混合液加入A2孔，依次类推，至A8孔。从A1-A8孔中取5μL分别加入B1-B8孔中。将5μL待测样品依次加入96孔板的C1-C8各孔，加入A液和B液混合液(1/49，V/V，B/A)，充分混匀后，置于37℃温箱中孵育30min，用多功能酶标仪测定570nm波长处，样品的吸光度(OD)。根据BSA标准液的浓度梯度与吸光度的关系，得出浓度标准曲线，通过计算即得待测样品的浓度，一般Westernblot样品蛋白总量4～8μg/孔。
WesternBlot：
使用1.0mm的板，注意对齐夹紧。配制下层分离胶，并根据样品蛋白的分子量调节相应的下层胶浓度，加入去离子水压平胶面，待下层胶凝固后，倒出去离子水，加上层浓缩胶，加满，并插入梳子。待上层胶凝固后，取出胶板放入电泳槽中，中间倒入1×RunningBuffer，左右晃动，小心排空气泡，要保证无渗漏，没过红线即可。平行拔出梳子，用微量注射器每个孔道中加入20μL待测样品蛋白，Marker用1:4稀释，空白孔道用LoadingBuffer补齐。样品在跑浓缩胶电泳时的电压为90V，在进入分离胶时使电压升高至110V，待蓝色的Loading线跑至凝胶的最下端时停止电泳。
转膜前，将PVDF膜放入甲醇中充分浸润，转膜装置从下至上依次按阳极碳板、1片海绵、2张滤纸、1张PVDF膜、凝胶、2张滤纸、1片海绵、阴极碳板的顺序放好对齐，放入电泳槽，接通电源，恒流90V，转膜2-3h，根据目的蛋白分子量调整转膜所需要的时间。转膜结束后，将转膜装置从电泳槽中取出，根据Marker条带的指示，选取目的蛋白分子量位置的膜，并做好标记，放于孵育盒中，置于摇床上，1×TBST洗1次，弃去1×TBST，5％脱脂牛奶室温封闭1h，弃去封闭液，1×TBST洗3次，每次5min，加入一抗(1:3000，V/V，一抗：1×TBST，与胶面紧贴的一侧PVDF膜向上放置，混合液必须完全浸没PVDF膜)，室温在摇床上孵育2h或者4℃过夜。回收一抗，用1×TBST洗5min×3次，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:3000，V/V，二抗：1×TBST，与胶面紧贴的一侧PVDF膜向上放置，混合液必须完全浸没PVDF膜)，室温孵育1h。回收二抗，用1×TBST洗5min×6次。滴加发光液，于凝胶成像分析系统进行发光。所有Westernblot实验重复至少3次，并且每次均使用不同批次但相同处理的细胞进行实验。其中β-actin作为对照组。
Marker：10kDa，15kDa，25kDa，35kDa，40kDa，55kDa，70kDa，100kDa，130kDa，170kDa。
目的蛋白：β-actin，β-分泌酶BACE1，γ-分泌酶复合体(PS、NCT)，淀粉样前体蛋白(fl-APP)，淀粉样前体碳端片段(APP-CTFs)蛋白。
图8为APP淀粉样代谢途径相关分泌酶及APP酶切产物的蛋白表达水平及相对蛋白表达水平统计图，其中A为蛋白表达Western Blot结果图，B为相对蛋白表达统计图。Western Blot结果显示，当给予SW细胞50nM MCC950后，β-分泌酶BACE1，γ-分泌酶复合体(早老素(Presenilin，PS)、呆蛋白(nicastrin，NCT))，淀粉样前体全长蛋白(fl-APP)，淀粉样前体碳端片段(APP-CTFs)蛋白表达水平显著降低。Aβ是由淀粉样蛋白前体蛋白经淀粉样途径剪切而成，其中相关的β-分泌酶BACE1，γ-分泌酶复合体(PS、NCT)，淀粉样前体蛋白(fl-APP)，淀粉样前体碳端片段(APP-CTFs)蛋白表达水平显著降低，进而减少Aβ的剪切。
实施例4
MCC950能够抑制Aβ的聚集
Aβ聚集的体外考察：
取Aβ(0.02μmol)加入100μL灭菌去离子水溶解后，分别加入100μL HCl(10mM)、MCC950(50μM)、MCC950(5μM)，涡旋30s，并用封口膜密封，于37℃培养8d。
样品缓冲液(Loading Buffer)的配制：
取1×TAE 10mL，加入溴酚蓝10mg，SDS 0.4g，10％甘油1mL，混合均匀即可。
SDD-Age：
配制SDD-Age分离胶(1.5％Agarose+1×TAE+0.1％SDS)，插入梳子，待分离胶凝固后，取出胶板放入电泳槽中，中间倒入1×TAE+0.1％SDS，左右晃动，小心排空气泡，要保证无渗漏，并将电泳槽放置于冰浴中。平行拔出梳子，用微量注射器每个孔道中加入20μL待测样品蛋白。样品在进入分离胶时，调节电流至60mA，待蓝色的Loading线跑至凝胶的最下端时停止电泳。
转膜前，将PVDF膜放入甲醇中充分浸润，转膜装置从下至上依次按24张干滤纸、1张湿滤纸、1张PVDF膜、凝胶、3张湿滤纸的顺序放好对齐，压平，转膜4-5h，根据目的蛋白分子量调整转膜所需要的时间。转膜结束后，将PVDF膜取出，根据Marker条带的指示，选取目的蛋白分子量位置的膜，并做好标记，放于孵育盒中，置于摇床上，1×TBST洗1次，5min，弃去1×TBST，加入一抗(1:3000，V/V，Aβ：1×TBST，与胶面紧贴的一侧PVDF膜向上放置，混合液必须完全浸没PVDF膜)，4℃在摇床上孵育过夜。回收一抗，用1×TBST洗5min×3次，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:3000，V/V，二抗：1×TBST，与胶面紧贴的一侧PVDF膜向上放置，混合液必须完全浸没PVDF膜)，室温孵育1h。回收二抗，用1×TBST洗5min×6次。滴加发光液，于凝胶成像分析系统进行发光。所有SDD-Age实验重复至少3次，并且每次均使用不同批次但相同处理的Aβ进行实验。其中Aβ纤维体作为对照组。
目的蛋白：Aβ
图9为Aβ蛋白聚集情况结果图，结果表明：MCC950能够抑制Aβ的聚集。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.MCC950在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
2.MCC950在制备减少β-淀粉样蛋白剪切的药物中的应用。
3.MCC950在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物中的应用。
4.MCC950在制备抑制淀粉样前体蛋白分泌酶的表达的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述淀粉样前体蛋白分泌酶包括β-分泌酶和/或γ-分泌酶复合体。
6.MCC950在制备降低淀粉样前体蛋白和/或淀粉样前体碳端片段蛋白表达水平的药物中的应用。
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