CN113588854A - 一种脂肪酸组合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脂肪酸组合物的检测方法，通过使用两个或两个以上定位物质以相对保留时间法分段定位脂肪酸组分，以完成对待测样品中的脂肪酸组分的定性分析。该方法快捷简便、检测能力稳定且耐用性良好，适用于脂肪酸样品的检测。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体地涉及一种脂肪酸产品的分析检测方法。
背景技术
脂肪酸(Fatty acid，FA)是一类具有脂肪链的羧酸类化合物。脂肪酸在生物体内起着多种关键作用，对脂肪酸组分进行逐一解析分析将对相关疾病发病机制的阐明和临床诊疗具有重大意义。脂肪酸根据其中碳链长度的不同可分为：短链脂肪酸，主要包括碳链上的碳原子数小于6的一类脂肪酸；中链脂肪酸，主要包括碳链上碳原子数为6-12的一类脂肪酸，例如辛酸(C8)和癸酸(C10)；长链脂肪酸，主要包括碳链上碳原子数大于12的一类脂肪酸。根据脂肪酸碳链中是否含碳碳双键，又能够将脂肪酸分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸又可以进一步分为单不饱和脂肪酸(碳链上有且仅有一个碳碳双键)和多不饱和脂肪酸(碳链上有一个以上碳碳双键)。其中多不饱和脂肪酸因其对于生物体具有重要的生理调节功能而受到广泛关注。其中代表性的上市鱼油药品
是由葛兰素史克制药研发的一种鱼油类脂血调节剂，主要作用是降低成年患者体内的甘油三酸酯水平，已经被美国食品药品管理局(FDA)批准为饮食辅助药物。
自于欧美上市后每年的销售额已接近10亿美元，说明了脂肪酸类物质在医药领域具有广阔的应用前景以及巨大的市场潜力。
目前脂肪酸的获取方法主要为提取法，例如从鱼、虾或藻类中提取EPA和DHA，或是从各种植物中提取植物油，如花生油、橄榄油、玉米油。由于这些原料中脂肪酸组成复杂，包含各类脂肪酸组分众多，导致提取得到的脂肪酸产品中除了目标脂肪酸组分外，还同时含有多种目标外的脂肪酸组分，然而目标外的脂肪酸是无法保证医疗获益的一类物质，所以需要加以控制。因此为了保证脂肪酸类产品质量，准确地定性或定量分析脂肪酸产品的组成成为了十分必要的工作。但现实问题在于若针对脂肪酸组分中的每一组分逐一建立分析方法，会存在分析操作量巨大、检测程序复杂、繁琐、效率低下等问题。
在已经公开的现有技术中为实现对脂肪酸组合物产品的准确分析，已经使用了如下一些检测方法：
方法一：专利文献CN103149187B提供了一种应用前表面荧光快速测定脂肪酸含量的无损检测方法。首先将油脂样品进行荧光扫描，收集得到的二维荧光光谱数据，将荧光数据与气相色谱法测得的脂肪酸数据用偏最小二乘法(PLS)作回归计算，得到回归模型分析。该方法简单快速、属于无损检测类方法。
方法二：专利文献CN111521699A提供了一种基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法，首先制备衍生化的脂肪酸混合标准品溶液，通过LC-MS/MS检测各标准曲线待测溶液，建立各脂肪酸的标准曲线后，再对待测样品进行衍生化处理并用LC-MS/MS法检测，得到待测溶液中脂肪酸的种类和含量。该方法灵敏度高、可检测短链脂肪酸、适合血浆样品的检测。
方法三：专利文献CN105044229B提供了一种检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法，首先建立五个脂肪酸棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的标准曲线及标准曲线方程，对待测样品的总脂肪酸进行气相色谱检测，根据各种标准品的保留时间对待测样品定性，并根据标准曲线定性定量分析待测样品中上述五个脂肪酸的含量。
上述专利文献使用了不同的方法检测分析产品中的脂肪酸组分，但仍然存在诸多问题：(1)方法一和方法二的检测灵敏度高，但是所使用的仪器价格昂贵且维护成本高，而在工业化大生产中需要连续检测生产出来的产品，使用这些仪器无疑会带来较高的经济成本；(2)方法一、二、三均需要针对所有待测脂肪酸组分单独建立对照品标准曲线，所以需要得到所有待测脂肪酸组分的对照品，当某些组分的对照品很难获得或价格昂贵时，会导致这些方法的应用难度加大；方法一还需要进行回归计算并做回归模型分析，数据处理过程复杂；目前公开的方法在待测脂肪酸组分增多时，均会造成分析操作量巨大、检测程序复杂、繁琐和效率低下等问题。
目前，美国药典(USP40)提供了一种使用气相色谱仪检测ω-3脂肪酸乙酯中EPA乙酯、DHA乙酯和总脂肪酸乙酯含量的方法，使用了DHA乙酯作为定位物质，通过相对保留时间定性其他脂肪酸，再通过面积归一化法计算各脂肪酸组分的含量。该方法使用DHA乙酯一种物质定性多个脂肪酸组分，解决了脂肪酸组合物中的部分脂肪酸的对照品获取难度大的问题。
发明内容
本发明提供了一种脂肪酸组合物的检测方法，该方法能够长期稳定使用、检测能力稳定、快捷简便、耐用性良好。
本发明提供了一种脂肪酸组合物的检测方法，包括用色谱法检测脂肪酸组合物从而得到组合物中各脂肪酸组分的保留时间，在获得各脂肪酸组分的保留时间后选取组合物中两个或两个以上的脂肪酸组分作为定位物质，得到组合物中其他脂肪酸组分相对于指定定位物质的相对保留时间，以该相对保留时间进行定性组合物中定位物质以外的脂肪酸组分。
其中，脂肪酸组合物中的脂肪酸组分至少有两种碳原子数，且作为定位物质的脂肪酸之间的碳原子数不同。
其中，指定定位物质为保留时间在脂肪酸组分之后，且保留时间最邻近的定位物质，当脂肪酸组合物中还含有保留时间之后没有定位物质的脂肪酸组分，则该脂肪酸组分选择保留时间在其之前，且保留时间最邻近的定位物质。
其中，脂肪酸组合物的检测方法还包括确定定位物质的结构。
其中，脂肪酸组合物的检测方法还包括在以相对保留时间定性组合物中其他脂肪酸组分之前，确定该相对保留时间对应的脂肪酸组分的结构。
其中，脂肪酸组合物的检测方法为气相色谱法。
其中，脂肪酸组合物为从天然鱼油、虾油或藻油中的一种中纯化得到的脂肪酸制备而得；在一些实施例中，为从天然鱼油中纯化得到的脂肪酸制备而得。
其中，脂肪酸组合物的检测方法还包括，比较其他批次的脂肪酸组合物中脂肪酸组分的相对保留时间和已定性脂肪酸组分的相对保留时间，定性其他批次中的脂肪酸组分，且其他批次中脂肪酸组分使用的定位物质与已定性脂肪酸组分使用的定位物质相同。
其中，脂肪酸组合物中含有ω-3脂肪酸；在一些实施例中，脂肪酸组合物中ω-3脂肪酸的含量为90％-100％；在一些实施例中，脂肪酸组合物中EPA的含量为42％-66％，DHA的含量为34％-58％；在一些实施例中，脂肪酸组合物中EPA的含量为42％-50％，DHA的含量为34％-41％；在一些实施例中，脂肪酸组合物中EPA和DHA的含量之和为70％-100％；在一些实施例中，脂肪酸组合物中EPA和DHA的含量之和为75％-100％；在一些实施例中，脂肪酸组合物中EPA和DHA的含量之和为76％-91％；在一些实施例中，脂肪酸组合物中EPA和DHA的含量之和为79％-89％；在一些实施例中，脂肪酸组合物还含有C18脂肪酸中的一个或多个组分，除EPA以外的C20脂肪酸中的一个或多个组分，以及除DHA以外的C22脂肪酸中的一个或多个组分。
在一些实施例中，脂肪酸组合物含有ω-3脂肪酸，定位物质为C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸中碳原子数不同的两个或三个脂肪酸组分；在一些实施例中，脂肪酸组合物含有ω-3脂肪酸，定位物质为C18:4n-3、EPA和DHA。
定位物质的数量可以根据脂肪酸组合物中脂肪酸组分的数量进行调整；在一些实施例中，定位物质的数量为五个；在一些实施例中，定位物质的数量四个；在一些实施例中，定位物质的数量为三个；在一些实施例中，定位物质的数量为两个。
本发明进一步提供了一种ω-3脂肪酸组合物的检测方法，其中色谱条件如下：
色谱柱：聚乙二醇为固定液的石英毛细管柱，或者选用与聚乙二醇极性相近的石英毛细管柱；规格为25m*0.25mm，0.2μm；
升温程序：起始温度为166-170摄氏度，维持1-3min，以每分钟2-4摄氏度的速率升温至240摄氏度，维持6-10min；
载气：氦气；
进样口温度：240-250摄氏度；
检测器温度：260-270摄氏度；
流速：1.1-1.3mL/min；
进样量：1μL；
分流比：10:1-50:1。
在一些实施例中，起始温度为166摄氏度；在一些实施例中，起始温度为167摄氏度；在一些实施例中，起始温度为168摄氏度；在一些实施例中，起始温度为169摄氏度；在一些实施例中，起始温度为170摄氏度。
在一些实施例中，起始温度的维持时间为1min；在一些实施例中，起始温度的维持时间为1.5min；在一些实施例中，起始温度的维持时间为2min；在一些实施例中，起始温度的维持时间为2.5min；在一些实施例中，起始温度的维持时间为3min。
在一些实施例中，升温速率为以每分钟2摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟2.2摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟2.4摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟2.6摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟2.8摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟3.2摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟3.4摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟3.6摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟3.8摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟2.5摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟3摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟3.5摄氏度的速率升温至240摄氏度；在一些实施例中，升温速率为以每分钟4摄氏度的速率升温至240摄氏度。
在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为6-9min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为6-8min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为7-10min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为7-9min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为8-10min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为6min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为6.5min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为7min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为7.5min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为8min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为8.5min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为9min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为9.5min；在一些实施例中，升温至240摄氏度后的维持时间为10min。
在一些实施例中，进样口温度为240摄氏度；在一些实施例中，进样口温度为242摄氏度；在一些实施例中，进样口温度为244摄氏度；在一些实施例中，进样口温度为246摄氏度；在一些实施例中，进样口温度为248摄氏度；在一些实施例中，进样口温度为245摄氏度；在一些实施例中，进样口温度为250摄氏度。
在一些实施例中，检测器温度为260摄氏度；在一些实施例中，检测器温度为262摄氏度；在一些实施例中，检测器温度为264摄氏度；在一些实施例中，检测器温度为266摄氏度；在一些实施例中，检测器温度为268摄氏度；在一些实施例中，检测器温度为265摄氏度；在一些实施例中，检测器温度为270摄氏度。
在一些实施例中，流速为1.1mL/min；在一些实施例中，流速为1.2mL/min；在一些实施例中，流速为1.3mL/min。
在一些实施例中，分流比为15:1-50:1；在一些实施例中，分流比为20:1-50:1；在一些实施例中，分流比为25:1-50:1；在一些实施例中，分流比为30:1-50:1；在一些实施例中，分流比为35:1-50:1；在一些实施例中，分流比为40:1-50:1；在一些实施例中，分流比为45:1-50:1；在一些实施例中，分流比为10:1；在一些实施例中，分流比为15:1；在一些实施例中，分流比为20:1；在一些实施例中，分流比为25:1；在一些实施例中，分流比为30:1；在一些实施例中，分流比为35:1；在一些实施例中，分流比为40:1；在一些实施例中，分流比为45:1；在一些实施例中，分流比为50:1。
在一些实施例中，色谱条件如下：
色谱柱：聚乙二醇为固定液的石英毛细管柱(25m*0.25mm，0.2μm)；
升温程序：起始温度为168摄氏度，维持3min，以每分钟4摄氏度的速率升温至24
0摄氏度，维持10min；
载气：氦气；
进样口温度：245摄氏度；
检测器温度：265摄氏度；
流速：1.2mL/min；
进样量：1μL；
分流比：30:1。
在建立脂肪酸组合物检测方法的过程中，申请人首先参考了USP40中的相关方法：通过气相色谱法测定待测样品，以DHA乙酯为定位物质，记录各脂肪酸乙酯组分与DHA乙酯的相对保留时间，再将该相对保留时间分别与各组分的标准相对保留时间比较，达到定性脂肪酸组分的目的。在研究过程中，为了研究色谱柱的种类、色谱仪的变化对方法的影响，申请人对方法中使用的色谱柱型号和色谱仪型号进行了考察，并根据试验结果确定了方法所使用的色谱柱的型号和仪器的型号。接着开展了针对色谱柱和仪器的耐用性试验，试验结果显示，更换型号相同的不同色谱柱及型号相同的不同仪器后，各脂肪酸乙酯组分的相对保留时间值漂移在可接受范围内。
但是，申请人发现，将该方法应用于产品的长期检测时，检测得到的脂肪酸组分的相对保留时间值发生了明显的漂移，并且检测得到的脂肪酸组分色谱峰离DHA色谱峰越远，漂移越明显，相对保留时间值的稳定性越差，导致在长期检测时定位脂肪酸组分的难度增加，进而直接影响方法的定性检测能力。
可见，美国药典中记载的相对保留时间法在长期应用中未能达到理想的检测稳定性要求。基于上述长期检测时遇到的问题，申请人开发出一种使用两个或两个以上定位物质通过相对保留时间分段定位脂肪酸组分的检测方法。该方法能够长期使用、检测能力更稳定、耐用性良好、可以同时定性脂肪酸组合物中的多个脂肪酸组分。此外，该方法的操作简便，便于方法的转移；应用时产生的经济成本较低，适于在工业化生产中的应用。
本发明所述的“脂肪酸”包括游离脂肪酸或其烷基酯；在一些实施例中包括游离脂肪酸；在一些实施例中包括脂肪酸甲酯；在一些实施例中包括脂肪酸乙酯。
本发明所述的一种具体的脂肪酸，例如C18:4n-3、C20:4n-3、EPA或DHA等，是指其游离脂肪酸或其烷基酯；在一些实施例中，烷基酯为甲酯；在一些实施例中，烷基酯为乙酯。
本发明所述的“定性”，是指确定物质的结构或组成。
本发明所述的“碳原子数”，是指脂肪酸组分的碳链上的碳原子个数。
本发明所述的“最邻近的定位物质”，是指相对于一个具体脂肪酸组分而言，保留时间在该脂肪酸组分之后，且两者之间保留时间的差值最小的一个定位物质。
本发明所述的“C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸”，是指一类脂肪酸的统称，为碳链上碳原子个数分别为18、20、22个的脂肪酸，例如，C18脂肪酸为碳链上碳原子个数为18个的一类脂肪酸。
本发明所述的“含量”是指通过面积归一化法计算得到的面积百分含量(A/A)。
本发明的有益效果在于：
(1)提供了一种新的脂肪酸组合物的定位方法，为脂肪酸组合物的检测和质量控制提供了保障；
(2)建立了能够同时定位脂肪酸组合物中多个脂肪酸组分的分段定位方法，该方法在减少了对照品使用的同时保证了定性定量检测结果的可靠性；
(3)建立了分段定位方法中定位物质的选择标准，该选择标准对于不同组成的脂肪酸组合物都具有适用性；
(4)提供了一种脂肪酸组合物长期检测时使用的检测方法，该方法能够保证长期使用的稳定性、耐用性良好，更适用于产品的长期检测。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，并便于理解本发明，仅提供部分实施例并做详细说明。本领域技术人员可以理解，以下实施例并非是对本发明保护范围的限制。
对比例1
(1)样品制备
样品制备：按照市售产品
的产品组成，制备得到样品。
(2)样品检测
按照气相色谱法(中国药典2015版四部通则0512)检测样品中的脂肪酸组分。
抗氧化溶液：取2,6-二叔丁基对甲酚适量，精密称定，用异辛烷溶解并制成每mL中约含0.05mg的2,6-二叔丁基对甲酚的溶液；
供试品溶液：取样品适量，精密称取适量，用抗氧化溶液溶解并制成每mL中约含2.5mg样品的溶液；
色谱条件如下：
色谱柱：聚乙二醇为固定液的石英毛细管柱(25m*0.25mm，0.2μm)；
升温程序：起始温度为168摄氏度，维持3min，以每分钟4摄氏度的速率升温至24
0摄氏度，维持10min；
载气：氦气；
进样口温度：245摄氏度；
检测器温度：265摄氏度；
流速：1.2mL/min；
进样量：1μL；
分流比：30:1；
测定法：精密量取供试品溶液，注入气相色谱仪，记录色谱图。
(3)定位物质选择
通过质谱仪鉴定待测脂肪酸组分的结构，并从待测脂肪酸组分中选择DHA乙酯作为定位物质。
(4)耐用性考察
耐用性考察条件：起始温度±2℃；进样口温度±5℃；流速±0.1mL/min。
计算样品中各脂肪酸组分的相对保留时间标准值与不同色谱条件下相对保留时间检测值之间的差值，再取其中最大值的绝对值作为最大漂移值，以考察方法的耐用性。试验结果见下表：
表1以DHA乙酯为定位物质的耐用性试验结果
对比例2
(1)样品制备
取对比例1的第(1)步“样品制备”步骤中制备得到的同批次样品，置于长期储存条件(温度25℃，湿度60％)下储存，并于储存3个月后取出样品待测。
(2)样品检测
按照对比例1中的第(2)步“样品检测”步骤操作。
(3)定位物质选择
按照对比例1中的第(3)步“定位物质选择”步骤，选择与对比例1中相同的定位物质DHA乙酯作为定位物质。
(4)长期样品检测结果
计算样品中各脂肪酸组分相对保留时间标准值与相对保留时间检测值之间的差值，再取其绝对值作为漂移值，以考察长期检测时的相对保留时间漂移值，试验结果见下表：
表2以DHA乙酯定位的长期检测相对保留时间漂移数据
| 脂肪酸组分 | 0天 | 3个月 |
| 植烷酸乙酯 | 0.002 | 0.008 |
| C18:3 n-6乙酯 | 0.001 | 0.007 |
| C18:3 n-4乙酯 | 0.001 | 0.007 |
| C18:4 n-3乙酯 | 0.000 | 0.006 |
| C18:4 n-1乙酯 | 0.001 | 0.007 |
| 呋喃酸5乙酯 | 0.001 | 0.005 |
| C19:5 n-3乙酯 | 0.001 | 0.005 |
| C20:3 n-6乙酯 | 0.001 | 0.005 |
| 呋喃酸7乙酯 | 0.001 | 0.005 |
| 呋喃酸8乙酯 | 0.000 | 0.004 |
| EPA乙酯 | 0.000 | 0.004 |
| 呋喃酸9乙酯 | 0.000 | 0.002 |
| C22:4 n-6乙酯 | 0.000 | 0.001 |
| 呋喃酸10乙酯 | 0.000 | 0.001 |
| C22:5 n-6乙酯 | 0.000 | 0.001 |
| 呋喃酸11乙酯 | 0.000 | 0.000 |
| DHA乙酯 | — | — |
| C24:6乙酯 | 0.000 | 0.003 |
如上表可知，在以DHA乙酯为定位物质时，长期储存3个月时检测得到的脂肪酸组分的相对保留时间值发生了漂移。其中，样品中的脂肪酸组分色谱峰离DHA乙酯色谱峰越远则该漂移越大，多个组分的相对保留时间漂移值大于0.005，植烷酸乙酯、C18:3 n-6乙酯、C18:3 n-4乙酯的相对保留时间漂移值大于等于0.007。
实施例1
(1)样品制备
取对比例1的第(1)步“样品制备”步骤中制备得到的同批次样品，作为待测样品。
(2)样品检测
按照对比例1中的第(2)步“样品检测”步骤操作。
(3)定位物质选择
通过质谱仪鉴定待测脂肪酸组分的结构，并从待测脂肪酸组分中的C18脂肪酸乙酯组分中选择C18:4 n-3乙酯，C20脂肪酸乙酯组分中选择EPA乙酯，C22脂肪酸乙酯组分中选择DHA乙酯，将这三个脂肪酸乙酯组分作为定位物质。
(4)确定各组分的相对保留时间
根据定位物质，确定各待测脂肪酸组分的相对保留时间，结果见下表：
表3各组分相对保留时间标准表
实施例2
(1)样品制备
取对比例1的第(1)步“样品制备”步骤中制备得到的同批次样品，作为待测样品。
(2)样品检测
按照对比例1中的第(2)步“样品检测”步骤操作。
(3)定位物质选择
通过质谱仪鉴定待测脂肪酸组分的结构，并从待测脂肪酸组分中的C18脂肪酸乙酯组分中选择C18:4n-3乙酯，C20脂肪酸乙酯组分中选择EPA乙酯，C22脂肪酸乙酯组分中选择DHA乙酯，将这三个脂肪酸乙酯组分作为定位物质。
(4)耐用性考察
按照对比例1中的第(4)步“耐用性考察”步骤操作。
试验结果见下表：
表4分段定位耐用性试验结果
由表中数据可知，使用C18:4 n-3乙酯、EPA乙酯和DHA乙酯作为分段定位的定位物质时，随着检测条件的细微调整，样品中各脂肪酸组分的相对保留时间值发生了漂移，结合对比例1中以DHA乙酯为定位物质的耐用性结果可知，两种定位方式在色谱条件微调时的结果差别不大。
实施例3
(1)样品制备
取对比例2的第(1)步“样品制备”步骤中的样品，作为待测样品。
(2)样品检测
按照对比例2中的第(2)步“样品检测”步骤操作。
(3)定位物质选择
通过质谱仪鉴定待测脂肪酸组分的结构，并从待测脂肪酸组分中的C18脂肪酸乙酯组分中选择C18:4 n-3乙酯，C20脂肪酸乙酯组分中选择EPA乙酯，C22脂肪酸乙酯组分中选择DHA乙酯，将这三个脂肪酸乙酯组分作为定位物质。
(4)长期样品检测结果
按照对比例2中的第(4)步“长期样品检测结果”步骤操作。
试验结果见下表：
表5分段定位的长期检测相对保留时间漂移数据
| 脂肪酸组分 | 0天 | 3个月 |
| 植烷酸乙酯 | 0.000 | 0.003 |
| C18:3 n-6乙酯 | 0.001 | 0.002 |
| C18:3 n-4乙酯 | 0.001 | 0.001 |
| C18:4 n-3乙酯 | — | — |
| C18:4 n-1乙酯 | 0.000 | 0.003 |
| 呋喃酸5乙酯 | 0.000 | 0.002 |
| C19:5 n-3乙酯 | 0.000 | 0.001 |
| C20:3 n-6乙酯 | 0.000 | 0.001 |
| 呋喃酸7乙酯 | 0.000 | 0.001 |
| 呋喃酸8乙酯 | 0.000 | 0.000 |
| EPA乙酯 | — | — |
| 呋喃酸9乙酯 | 0.000 | 0.002 |
| C22:4 n-6乙酯 | 0.000 | 0.001 |
| 呋喃酸10乙酯 | 0.000 | 0.001 |
| C22:5 n-6乙酯 | 0.000 | 0.001 |
| 呋喃酸11乙酯 | 0.000 | 0.000 |
| DHA乙酯 | — | — |
| C24:6乙酯 | 0.000 | 0.003 |
如上表可知，使用分段定位时，3个月时检测得到的脂肪酸组分的相对保留时间漂移值均不超过0.003；即使是植烷酸乙酯、C18:3 n-6乙酯、C18:3 n-4乙酯这类色谱峰远离DH A乙酯组分的脂肪酸组分，在3个月时的相对保留时间漂移值也均不超过0.003。该结果表明，在检测方法长期的应用中，使用本方法的检测得到的脂肪酸组分相对保留时间漂移明显减小，能够更好的定位待测脂肪酸组分，本方法的定性检测能力比单独使用DHA乙酯作为定位物质更稳定，并且更适用于产品的长期检测。
实施例4
(1)样品制备
取对比例1的第(1)步“样品制备”步骤中制备得到的同批次样品，作为待测样品。
(2)样品检测
按照对比例1中的第(2)步“样品检测”步骤操作。
(3)定位物质选择
通过质谱仪鉴定待测脂肪酸组分的结构，并从待测脂肪酸组分中的C18脂肪酸乙酯组分中选择C18:4 n-1乙酯，C20脂肪酸乙酯组分中选择C20:3 n-6乙酯，C22脂肪酸乙酯组分中选择C22:5 n-6乙酯，将这三个脂肪酸乙酯组分作为定位物质。
(4)确定各组分的相对保留时间
根据定位物质，确定各待测脂肪酸组分的相对保留时间，结果见下表：
表6各组分相对保留时间标准表
使用该方法检测对比例2中的长期3个月样品，检测结果显示，3个月时检测得到的脂肪酸组分的相对保留时间漂移值均不超过0.005；即使是植烷酸乙酯、C18:3 n-6乙酯、C18:3 n-4乙酯这类色谱峰远离DHA乙酯组分的脂肪酸组分，在3个月时的相对保留时间漂移值也均不超过0.004。该结果表明，在检测方法长期的应用中，本方法的定性检测能力比单独使用DHA乙酯作为定位物质更稳定，并且更适用于产品的长期检测。
实施例5
(1)样品制备
取对比例1的第(1)步“样品制备”步骤中制备得到的同批次样品，作为待测样品。
(2)样品检测
按照对比例1中的第(2)步“样品检测”步骤操作。
(3)定位物质选择
通过质谱仪鉴定待测脂肪酸组分的结构，并从待测脂肪酸组分中的C20脂肪酸乙酯组分中选择C20:3 n-6乙酯，C22脂肪酸乙酯组分中选择DHA乙酯，将这两个脂肪酸乙酯组分作为定位物质。
(4)确定各组分的相对保留时间
根据定位物质，确定各待测脂肪酸组分的相对保留时间，结果见下表：
表7各组分相对保留时间标准表
使用该方法检测对比例2中的长期3个月样品，检测结果显示，3个月时检测得到的脂肪酸组分的相对保留时间漂移值均不超过0.005；即使是植烷酸乙酯、C18:3 n-6乙酯、C18:3 n-4乙酯这类色谱峰远离DHA乙酯组分的脂肪酸组分，在3个月时的相对保留时间漂移值也均不超过0.005。该结果表明，在检测方法长期的应用中，本方法的定性检测能力比单独使用DHA乙酯作为定位物质更稳定，并且更适用于产品的长期检测。
综上所述，在产品的长期检测过程中，采用本发明的技术方案，对样品中的脂肪酸组分进行分段定位，测得的样品中各脂肪酸组分的相对保留时间值漂移小，并且均明显小于以DHA乙酯定位时的漂移值，提高了检测的稳定性，降低了定性脂肪酸组分的难度。
Claims (9)
1.一种脂肪酸组合物的检测方法，包括用色谱法检测脂肪酸组合物从而得到组合物中各脂肪酸组分的保留时间，其特征在于，在获得各脂肪酸组分的保留时间后选取组合物中两个或两个以上的脂肪酸组分作为定位物质，得到组合物中其他脂肪酸组分相对于指定定位物质的相对保留时间，以该相对保留时间进行定性组合物中定位物质以外的脂肪酸组分。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述脂肪酸组合物中的脂肪酸组分至少有两种碳原子数，且所述作为定位物质的脂肪酸之间的碳原子数不同。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述指定定位物质为保留时间在脂肪酸组分之后，且保留时间最邻近的定位物质，当脂肪酸组合物中还含有保留时间之后没有定位物质的脂肪酸组分，则该脂肪酸组分选择保留时间在其之前，且保留时间最邻近的定位物质。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括确定定位物质的结构和/或在以相对保留时间定性组合物中其他脂肪酸组分之前，确定该相对保留时间对应的脂肪酸组分的结构。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述脂肪酸组合物为从天然鱼油中纯化得到的脂肪酸制备而得。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述脂肪酸组合物中含有ω-3脂肪酸；优选为脂肪酸组合物中ω-3脂肪酸的含量为90％-100％；更优选为脂肪酸组合物中EPA的含量为42％-66％，DHA的含量为34％-58％；进一步优选为脂肪酸组合物中EPA的含量为42％-50％，DHA的含量为34％-41％。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述脂肪酸组合物还含有C18脂肪酸中的一个或多个组分，除EPA以外的C20脂肪酸中的一个或多个组分，以及除DHA以外的C22脂肪酸中的一个或多个组分。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述定位物质为C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸中碳原子数不同的两个或三个脂肪酸组分；优选定位物质为C18:4n-3、EPA和DHA。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，色谱条件如下：
色谱柱：聚乙二醇为固定液的石英毛细管柱，或者选用与聚乙二醇极性相近的石英毛细管柱；规格为25m*0.25mm，0.2μm；
升温程序：起始温度为166-170摄氏度，维持1-3min，以每分钟2-4摄氏度的速率升温至240摄氏度，维持6-10min；
载气：氦气；
进样口温度：240-250摄氏度；
检测器温度：260-270摄氏度；
流速：1.1-1.3mL/min；
进样量：1μL；
分流比：10:1-50:1。
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