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CN113549580B - 一株金色链霉菌及其应用 - Google Patents

一株金色链霉菌及其应用 Download PDF

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CN113549580B CN202110899185.4A CN202110899185A CN113549580B CN 113549580 B CN113549580 B CN 113549580B CN 202110899185 A CN202110899185 A CN 202110899185A CN 113549580 B CN113549580 B CN 113549580B
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Abstract

本发明公开了金色链霉菌突变菌株及其选育方法以及优化的培养基。本发明的突变株能高效合成和积累金霉素、杂质四环素和去甲基金霉素含量显著降低，遗传稳定性良好，连续传代五代其形态、颜色、产金霉素水平以及主要杂质的含量基本稳定，能够应用于工业化发酵生产及作为进一步研究开发的生产菌株。本发明优化的培养基，有利于促进金霉素的合成与积累，进一步减少杂质四环素和去甲基金霉素的比例。本发明基于多重复合诱变和前体/产物耐受构建了高产菌株选育模型，不仅突变库的多样性更高，而且简便快捷，提高了筛选效率并减少了筛选工作量，对金霉素及其他链霉菌来源抗生素的生产成本降低和产能提高都具有一定的应用价值和指导意义。

Description

一株金色链霉菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种金霉素产量高、杂质比例低的金色链霉菌突变菌株及其应用。
背景技术
金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)作为重要的药用微生物，属于高度好氧、革兰氏染色阳性的放线菌。然而，目前发酵生产金霉素的菌株效价不高，而且生产稳定性不好，严重影响了金霉素的发酵指数和生产效益。为了建立优化、经济和具有竞争性的金霉素生物生产工艺，必须充分考虑生产水平、发酵方式、后处理精制等一系列问题。其中，获得所需特性、且合适的高效生产菌株对于金霉素的发酵生产来说是至关重要的，也是整个金霉素发酵工业的核心。因此，选育高产、稳定的金霉素菌种一直是金霉素发酵工业技术开发和发酵工程化研究的热点，并且也将一直伴随金霉素发酵产业的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种金霉素产量高、杂质比例低的金色链霉菌突变菌株，选育该突变菌株的方法，以及利用该突变菌株制备高产量的金霉素的方法。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备金色链霉菌培养物的方法，所述方法包括在培养基中培养金色链霉菌，得到金色链霉菌培养物；
所述金色链霉菌为金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)，其菌株号为FJW-507，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2021500。
上述方法中，所述培养基包括种子培养基和/或发酵培养基，所述种子培养基和发酵培养基含有氯化铵、氯化钙和氯化镁。
上述方法中，所述种子培养基的组成可为：玉米淀粉30.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，花生饼粉10.0g/L，氯化钠3.0g/L，氯化铵4.0g/L，氯化钙1.2g/L，碳酸钙1.8g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化镁0.05g/L，硫酸镁0.05g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，豆油1.0g/L，其余为水。
上述方法中，所述发酵培养基的组成可为：玉米淀粉60.0g/L，花生饼粉25.0g/L，玉米粉20.0g/L，黄豆饼粉10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，玉米浆10.0g/L，氯化钠2.0g/L，氯化铵4.0g/L，氯化钙2.0g/L，碳酸钙3.0g/L，氯化镁0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，淀粉酶1.0g/L，豆油20.0g/L，其余为水。
上述方法中，所述培养基还包括孢子培养基，所述孢子培养基由等质量的麸皮与营养液组成，所述营养液的组成可为：玉米淀粉30.0g/L，花生饼粉2.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨3.0g/L，氯化铵2.0g/L，氯化钠2.0g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，氯化镁0.15g/L，硫酸镁0.15g/L，其余为水。
本发明还提供了金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)，其菌株号为FJW-507，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2021500。以下简称为金色链霉菌FJW-507。
所述金色链霉菌FJW-507也在本发明保护的范围内。
本发明还提供了一种用于制备金霉素的培养物，所述培养物含有所述的金色链霉菌FJW-507。
所述培养物由金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)菌株FJW-507CCTCC NO：M 2021500在培养基中培养获得。
进一步地，所述培养物相对于金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)D29具有更高的金霉素含量和/或更低的杂质含量。
术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。所述(传代)培养物产生金霉素的能力与本发明的金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)菌株FJW-507基本上相同。
本发明所述培养为将所述的金色链霉菌FJW-507在适合培养金色链霉菌以生产金霉素的条件下进行培养。本领域技术人员熟知多种方法可用于培养本发明的菌株，分批方法或连续方法如补料分批方法或重复补料分批方法培养等，但本发明不限于此。
本发明还提供了所述金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)菌株FJW-507在制备金霉素中的应用。
进一步地，所述应用可为发酵法生产金霉素。
本发明还提供了所述培养物在制备金霉素中的应用。
本发明的金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)菌株FJW-507CCTCC NO：M2021500在液体发酵过程中能高效合成和积累金霉素、而其杂质四环素和去甲基金霉素含量显著降低、遗传稳定性好。
上述方法中，获得的优良菌株，其中之一编号为Streptomycse aureofaciensFJC-505，孢子呈浅绿色，较出发菌株的灰褐色差异显著，而且摇瓶发酵金霉素产量达到25.8g/L，较出发菌株提高12.1％，其中四环素含量占金霉素含量的比例为7.5％，较出发菌株减少11.8％，去甲基金霉素含量占金霉素含量的比例为0.28％，较出发菌株减少50.0％。金色链霉菌FJC-505，已于2021年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Centerfor Type Culture Collection，简称CCTCC；地址：中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021499，分类命名为Streptomycseaureofaciens FJC-505。
其中之二编号为Streptomycse aureofaciens FJW-507，孢子呈淡黄色，较出发菌株的灰褐色差异显著，而且摇瓶发酵金霉素产量达到25.5g/L，较出发菌株提高10.9％，其中四环素含量占金霉素含量的比例为7.1％，较出发菌株减少16.5％，去甲基金霉素含量占金霉素含量的比例为0.25％，较出发菌株减少55.4％。金色链霉菌FJW-507，已于2021年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC；地址：中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021500，分类命名为Streptomycse aureofaciens FJW-507。
本发明的另一个目的是提供一种有利于金霉素优良突变菌株积累高含量金霉素的优化培养基和液体发酵培养的方法。
金霉素生物合成关键限速酶——氯代酶的活性及与氯离子的亲和性对金霉素生物合成有中重要影响，氯离子作为金霉素合成的前体物，对氯离子耐受的突变株，获得高产金霉素的可能性更高。因此在筛选时以耐受高浓度氯化锂、氯化钠及产物金霉素为第一级筛选方法，有助于金霉素的生物合成代谢流。另外，金色链霉菌在液体发酵过程往往容易出现“老化”现象，导致菌株生长的同步性降低，金霉素的生物合成能力减弱，其它同系物的合成增加，最终影响优良菌株在发酵罐中合成与积累金霉素的表现。强化种子培养，大大减少菌株的种子“生长周期”，增强“金霉素合成周期”。
本发明方法的显著特点是通过优化的配方强化氯离子对金霉素生物合成的促进，同时强化种子培养，大大提高菌株活力，缩短发酵周期，节约成本，不仅有效的促进金霉素的合成，而且有利于减少同系物杂质的含量。
在本发明的一个实施方案中，所述的优化的配方，主要包括种子配方和发酵配方，具体分别是采用等量的氯化铵替代硫酸铵，将碳酸钙添加量40％的替换为氯化钙，将50％添加量的硫酸镁替换为氯化镁，得到的优化的种子培养基组成为：玉米淀粉30.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，花生饼粉10.0g/L，氯化钠3.0g/L，氯化铵4.0g/L，氯化钙1.2g/L，碳酸钙1.8g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化镁0.05g/L，硫酸镁0.05g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，豆油1.0g/L，其余为水，pH自然。得到的优化的发酵培养基组成为：玉米淀粉60.0g/L，花生饼粉25.0g/L，玉米粉20.0g/L，黄豆饼粉10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，玉米浆10.0g/L，氯化钠2.0g/L，氯化铵4.0g/L，氯化钙2.0g/L，碳酸钙3.0g/L，氯化镁0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，淀粉酶1.0g/L，豆油20.0g/L，其余为水，pH自然。
所述的强化种子培养，是指将活化培养的斜面菌种(18×180mm试管斜面)，通过5.0ml无菌生理盐水洗脱下制备孢子悬液，转接于含种子强化培养基斜面的茄子瓶中，制成表面积大、通气量好且易于孢子繁殖的培养基，于培养箱中34℃培养3天，进一步提高孢子的萌发数，同时强化菌丝活力，达到菌株种子强化培养的目的。
上述的种子强化培养基的制备方法如下：称取30g麸皮，与30mL营养液混合均匀，隔水蒸30min，蒸好之后称取30g麸皮营养液培养基于茄子瓶中，按常规方法进行高温高压灭菌，121℃，20-30min。此即为制备好的麸皮种子强化培养基(又称孢子培养基)。
所述营养液的组成为：玉米淀粉30.0g/L，花生饼粉2.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨3.0g/L，氯化铵2.0g/L，氯化钠2.0g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，氯化镁0.15g/L，硫酸镁0.15g/L，其余为水。
所述的发酵培养是指采用强化种子培养基进行菌株培养，同时采用优化的种子培养基和发酵培养基组份进行发酵。菌株金色链霉菌FJC-505的摇瓶发酵金霉素产量为26.88g/L，较优化前提高4.2％，其中四环素占金霉素含量比例为6.8％，较优化前减少9.3％，去甲基金霉素占金霉素含量比例为0.22％，较优化前减少21.4％。金色链霉菌FJW-507的摇瓶发酵金霉素产量为26.52g/L，较优化前提高4.0％，其中四环素占金霉素含量比例为6.3％，较优化前减少11.3％，去甲基金霉素占金霉素含量比例为0.20％，较优化前减少20.0％。
实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明基于常压室温等离子体和紫外线复合诱变技术筛选获得金霉素产量高、杂质比例低的优良金色链霉菌突变株，其生成金霉素的产量高于出发菌株。本发明的金色链霉菌突变株在液体发酵过程中能高效合成和积累金霉素、而杂质四环素和去甲基金霉素含量显著降低，能够应用于工业化发酵生产，并且本发明金色链霉菌突变株遗传稳定性良好，连续传代五代其形态、颜色、产金霉素水平以及主要杂质的含量基本稳定，金霉素含量维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
本发明选育的金色链霉菌FJC-505菌株的摇瓶发酵金霉素产量可达到26.88g/L，较出发菌株提高16.9％，其中四环素含量占金霉素含量的比例为6.8％，较出发菌株减少20.0％，去甲基金霉素含量占金霉素含量的比例为0.22％，较出发菌株减少60.7％。
本发明选育的金色链霉菌FJW-507菌株的摇瓶发酵金霉素产量可达到26.52g/L，较出发菌株提高15.3％，其中四环素含量占金霉素含量的比例为6.3％，较出发菌株减少25.9％，去甲基金霉素含量占金霉素含量的比例为0.20％，较出发菌株减少64.3％。
实验证明本发明选育的金色链霉菌FJC-505和金色链霉菌FJW-507菌株具备较好的氯离子耐受和转化的能力，合成与积累金霉素的能力显著增强，主要杂质四环素和去甲基金霉素的含量显著降低，可极大地减少金霉素产物的后处理成本，提高产品质量，具备优异的生产金霉素预混剂及其盐酸盐的能力，是符合工业化生产的高产、高质量菌种，可降低企业成本、增加企业利润，对金霉素的工业化生产具有广泛的应用价值和重要的经济意义。
此外，本发明通过优化的配方强化氯离子对金霉素生物合成的促进，同时强化种子培养，大大提高菌株活力，缩短发酵周期，节约成本，不仅有效的促进金霉素的合成，而且有利于减少同系物杂质的含量。
保藏说明
菌种名称：金色链霉菌
拉丁名：Streptomyces aureofaciens
菌株编号：FJC-505
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编430072
保藏日期：2021年5月7日
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 2021499
菌种名称：金色链霉菌
拉丁名：Streptomyces aureofaciens
菌株编号：FJW-507
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编430072
保藏日期：2021年5月7日
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 2021500
附图说明
图1为诱变菌株(金色链霉菌FJC-505和金色链霉菌FJW-507)与出发菌株(金色链霉菌D29)的菌落对比。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的金色链霉菌D29菌株和金色链霉菌F3菌株(王鹏飞.金霉素生产菌种的选育及发酵工艺优化研究[D].内蒙古大学,2013.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1金色链霉菌FJC-505的选育
在出发菌株金色链霉菌D29菌株的基础上，采用原生质体复合诱变的方法提高金霉素的产量、减少杂质，选育遗传稳定的优良菌株，具体方法如下：
1、出发菌株菌丝体的收集
将出发菌株金色链霉菌D29菌株的甘油菌接种至固体斜面培养基(18×180mm试管斜面，其中斜面及固体平板培养基的制备方法如下：麸皮40.0g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二铵0.5g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1000mL；pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20-30min)，接种后菌种在34℃，湿度45％条件下培养4天，然后用5mL无菌生理盐水将固体斜面中的孢子洗脱制备孢子洗脱液，并使用无菌滤纸过滤所述孢子洗脱液，得到孢子悬液，孢子悬液中含孢子浓度为2.3×109个/mL。
吸取1mL孢子悬液至30mL/250mL三角瓶(带弹簧)的菌丝培养基S1中(菌丝培养基S1的制备方法如下：蛋白胨5.0g，酵母膏3.0g，牛肉膏1.5g，葡萄糖1.0g，氯化钠3.5g，磷酸氢二钾3.68g，磷酸二氢钾1.32g；pH 7.2,蒸馏水定容至1000mL,121℃高压蒸汽灭菌20-30min)，置于30℃，270r/min恒温振荡器中培养48h后，转接1mL至30mL/250mL三角瓶(底部放置弹簧)的菌丝培养基S2中(菌丝培养基S2的制备方法如下：蛋白胨6.0g，酵母膏3.0g，牛肉膏1.5g，葡萄糖1.0g，甘氨酸15.0g，蒸馏水定容至1000mL；pH 6.8，121℃高压蒸汽灭菌20min)，30℃，270r/min条件下继续培养24h，培养结束后，将培养液4000r/min离心15min收集菌丝体，用10.3％的蔗糖溶液重悬清洗两次，离心弃去上清，最后得到收集的出发菌株金色链霉菌D29菌株的菌丝体。
2、出发菌株原生质体悬液的制备
以步骤1制备的出发菌株金色链霉菌D29菌株菌丝体为原料，采用溶壁酶(购自于广东微生物菌种保藏中心)、溶菌酶和纤维素酶(均购自于生工生物工程(上海)股份有限公司)混合的酶解液，其中溶壁酶酶解液使用浓度为0.5％-2.5％，最佳酶解浓度为0.5％-1.0％，溶菌酶酶解液浓度0.5％-2.5％，最佳酶解浓度为0.5％-1.0％，纤维素酶的使用浓度为0.2％-1.5％，最佳浓度为0.5％-1.0％，酶解温度范围为24-35℃，最佳酶解温度为26-30℃，酶解时间为2-8h，最佳酶解时间为3-5h，酶解pH为5.0-7.0，最佳酶解pH为6.2-6.8，此即为金色链霉菌D29原生质体制备的最佳条件，制备原生质体的效率最高(显微观察显示菌丝体基本全部形成原生质体)，原生质体的再生率也较好(再生率＝再生菌落数/原生质体总数×100％)。制备的原生质体最终用1mL的10.3％的蔗糖溶液重悬细胞，得到金色链霉菌D29菌株原生质体悬液，制备的原生质体数达到2.2×107个/mL，再生率达到23.5％。
3、出发菌株原生质体的复合诱变处理
3-1 ARTP(常压室温等离子体)诱变仪处理进行预实验
将步骤2制备的金色链霉菌D29菌株原生质体首先采用ARTP诱变仪(购自于无锡源清天木生物科技有限公司)进行诱变处理，进行预实验，并对致死率进行计算。复合诱变前预实验步骤及致死率的计算方法具体如下：
取10-20μL的步骤2制备的金色链霉菌D29菌株原生质体悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子将载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体，设置电源功率80W，照射距离4mm，等离子体的温度26-30℃，气流量10L/min，处理菌物载片，设置不同的处理组，各处理组的处理时间分别为0s(对照)、5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s。处理后将载片转移到含有1mL高渗溶液的EP管中(其中高渗溶液的配制方法如下：蔗糖103.0g，硫酸钾0.25g，氯化镁2.0g，微量元素溶液2.0mL，加蒸馏水800.0mL，灭菌后每80.0mL上述溶液加入过滤除菌的0.5％磷酸二氢钾1.0mL、3.7％氯化钙10.0mL、2.0％Tris 10.0mL。其中，微量元素的组成为(mg/L)：ZnCl2 40.0，FeCl3·6H2O 200.0，CuCl2·2H2O 10.0，MnCl2·4H2O 10.0，Na2B4O7·10H2O 10.0，(NH4)6Mo7O24·4H2O 10.0，其余为水)，震荡洗脱形成新的菌悬液，将新的菌悬液涂布至再生平板(再生培养基的制备方法如下：麸皮40.0g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二铵0.5g，蔗糖103.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1000mL,pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20-30min)，置于34℃培养箱内培养4天，进行平板菌落计数，计算致死率：
致死率％＝(未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数)/未经诱变菌落数×100％
每个处理组三个平行样，选择致死率为70-75％的照射时间进行正式的复合诱变实验，经计算统计最终确定处理时间为30s。
3-2复合诱变
出发菌株金色链霉菌D29菌株原生质体具体的复合诱变方式为：取900μL步骤2制备的金色链霉菌D29菌株原生质体悬液，加入100μL的50％浓度甘油，充分混匀后吸取10μL均匀涂在金属载片上，使原生质体悬液均匀覆盖在金属载片的表面，干燥后用无菌镊子将附有原生质体悬液的载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体，设置电源功率80W，照射距离4mm，等离子体的温度26-30℃，气流量10L/min，处理菌物载片，处理时间30s，处理结束之后，关闭载气，打开紫外灯，继续处理25s。紫外处理后将载片转移到含有1mL高渗溶液的EP管中(其中高渗溶液的配制方法如下：蔗糖103.0g，硫酸钾0.25g，氯化镁2.0g，微量元素溶液2.0mL，加蒸馏水800.0mL，灭菌后每80.0mL上述溶液加入过滤除菌的0.5％磷酸二氢钾1.0mL、3.7％氯化钙10.0mL、2.0％Tris 10.0mL。其中，微量元素的组成为(mg/L)：ZnCl2 40.0，FeCl3·6H2O 200.0，CuCl2·2H2O10.0，MnCl2·4H2O 10.0，Na2B4O7·10H2O 10.0，(NH4)6Mo7O24·4H2O 10.0,其余为水)，震荡洗脱形成复合诱变处理后的金色链霉菌D29菌株原生质体悬液。
4、突变菌株的筛选
将步骤3复合诱变处理后的金色链霉菌D29菌株原生质体悬液稀释1000倍，取100-300μL稀释液涂布于选择性平板，所述选择性平板即含终浓度1.5％氯化锂、2.5％氯化钠以及5.0g/L金霉素盐酸盐的再生培养基平板(再生培养基制备方法如下：麸皮40.0g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二铵0.5g，蔗糖103.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1000mL,pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20-30min)，取样涂布过程中轻轻摇匀，避免沉底。将选择性平板在30℃避光培养至有单克隆长出。
根据选择性平板上的菌落大小、颜色以及形态特征挑取单菌落，选取菌落较大、边缘整齐、菌落颜色不同的菌落共360个进行摇瓶发酵验证。
首先将360个突变菌株分别转接至斜面培养基(制备方法如下：麸皮40.0g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二铵0.5g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1000mL；pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20-30min)于34℃，相对湿度45％，进行斜面活化培养3天，培养好的突变菌株斜面加入5mL无菌水，制备得孢子悬液，接种1mL孢子悬液至25mL种子培养基中(制备方法如下：玉米淀粉30.0g，黄豆饼粉15.0g，花生饼粉10.0g，氯化钠3.0g，硫酸铵4.0g，碳酸钙3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉5.0g，硫酸镁0.1g，磷酸二氢钾0.1g，豆油1.0g，自来水定容至1000mL,pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20-30min)，30℃，270r/min培养22h；种子培养好之后，再以10％(体积比)的移种量移入发酵培养基中(制备方法如下：玉米淀粉60.0g，花生饼粉25.0g，玉米粉20.0g，黄豆饼粉10.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，玉米浆10.0g，氯化钠2.0g，硫酸铵4.0g，碳酸钙5.0g，硫酸镁0.2g，磷酸二氢钾0.1g，淀粉酶1.0g，豆油20.0g，自来水定容至1000mL,pH自然，121℃灭菌25min)，30℃，270r/min发酵培养6天。
发酵培养结束后，把草酸加到发酵液中搅拌使其完全溶解并混合均匀，调节发酵液pH至1.5-2.0，4000rpm离心15min，取上清，根据预估效价，取0.1mL上清加水定容至100ml容量瓶，经0.22μm的微孔滤膜过滤后，滤液进行高效液相色谱(HPLC)检测金霉素含量、四环素和去甲基金霉素含量(检测方法按照：GB/T21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法)。
5、优良突变菌株金色链霉菌FJC-505的获得
步骤4中选取的360个突变菌株，经摇瓶发酵检测，以出发菌株金色链霉菌D29菌株为对照，获得金霉素含量明显提高(金霉素含量提高5％以上)的正突变菌株10株，将获得的10株突变菌株再一次进行摇瓶发酵复筛，按照步骤4的方法检测金霉素、四环素和去甲基金霉素的含量。从10株正突变菌株中获得一株编号为FJC-505的突变菌株，其孢子呈浅绿色，较出发菌株D29的灰褐色差异显著，而且摇瓶发酵金霉素产量达到25.8g/L，较出发菌株提高12.1％，其中四环素含量占金霉素含量的比例为7.5％，较出发菌株减少11.8％，去甲基金霉素含量占金霉素含量的比例为0.28％，较出发菌株减少50.0％。
6、遗传稳定性的验证
将筛选得到的优质菌株金色链霉菌FJC-505进行传代培养以考察其遗传稳定性，每三天传代一次，传代五次，进行摇瓶发酵测定菌株的金霉素、四环素以及去甲基金霉素的含量，菌株金色链霉菌FJC-505传代发酵实验结果如下：
表1传代对金色链霉菌FJC-505金霉素含量和杂质的影响
传代数 1代 2代 3代 4代 5代
金霉素含量(g/L) 25.81 25.80 25.78 25.83 25.86
四环素含量(g/L) 1.94 1.93 1.93 1.94 1.94
去甲基金霉素含量(g/L) 0.072 0.072 0.068 0.072 0.073
结果显示金色链霉菌FJC-505传五代发酵水平无明显影响，传代过程中发酵液中金霉素、四环素以及去甲基金霉素含量无明显变化，金霉素含量维持在同一较高水平，具有良好的遗传稳定性。
获得的遗传稳定、金霉素产量高、主要杂质含量少的金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)FJC-505，已于2021年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021499，以下简称金色链霉菌FJC-505。
金色链霉菌FJC-505在麸皮琼脂培养基中的形态特征：培养48h，菌落呈草帽状，整体呈绿色，边缘有白色菌晕，孢子呈球形或卵圆形，表面光滑。
实施例2：金色链霉菌FJW-507的选育
在出发菌株金色链霉菌D29菌株的基础上，采用原生质体复合诱变的方法提高金霉素的产量、减少杂质，选育遗传稳定的优良菌株，具体方法如下：
步骤1、2、3、4、5、6同实施例1中金色链霉菌FJC-505的选育步骤1、2、3、4、5、6。
其中，菌株金色链霉菌FJW-507传代发酵实验结果如下：
表2传代对金色链霉菌FJW-507金霉素含量和杂质的影响
Figure BDA0003192038150000101
结果显示金色链霉菌FJW-507传五代发酵水平无明显影响，传代过程中发酵液中金霉素、四环素以及去甲基金霉素含量无明显变化，金霉素含量维持在同一较高水平，具有良好的遗传稳定性。
选育获得一株编号为FJW-507的突变菌株，孢子呈淡黄色，较出发菌株的灰褐色差异显著，而且摇瓶发酵金霉素产量达到25.5g/L，较出发菌株提高10.9％，其中四环素含量占金霉素含量的比例为7.1％，较出发菌株减少16.5％，去甲基金霉素含量占金霉素含量的比例为0.25％，较出发菌株减少55.4％。
遗传稳定、金霉素产量高、主要杂质含量少的金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)FJW-507，已于2021年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021500，以下简称金色链霉菌FJW-507。
实施例3：金色链霉菌FJC-505和金色链霉菌FJW-507发酵强化的方法
首先，制备种子强化培养基(孢子培养基)：称取30g麸皮，与30ml营养液混合均匀，隔水蒸30min，得到麸皮营养液培养基。称取30g麸皮营养液培养基于茄子瓶中，按常规方法进行高温高压灭菌，121℃，20-30min。其中营养液配制方法为：玉米淀粉30.0g，花生饼粉2.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨3.0g，氯化铵2.0g，氯化钠2.0g，磷酸二氢钾0.1g，氯化镁0.15g，硫酸镁0.15g，蒸馏水定容至1000ml。此即为麸皮种子强化培养基(孢子培养基)。
然后，制备金色链霉菌FJC-505和金色链霉菌FJW-507孢子悬液，并分别取2.5mL孢子悬液转接于含麸皮种子强化培养基(孢子培养基)的茄子瓶中(即转接到表面积大、通气量好且易于孢子繁殖的培养基)于培养箱中34℃培养3天，进一步提高孢子的萌发数，同时强化菌丝活力，达到菌株种子强化培养的目的。接着，根据突变株的氯离子的耐受特性，进行种子配方和发酵配方的优化，具体的分别是在种子培养基和发酵培养基中分别采用等量的氯化铵替代硫酸铵，将碳酸钙添加量40％的替换为氯化钙，将50％添加量的硫酸镁替换为氯化镁，得到的优化的种子培养基的组成为：玉米淀粉30.0g/L，黄豆饼粉15.0g/L，花生饼粉10.0g/L，氯化钠3.0g/L，氯化铵4.0g/L，氯化钙1.2g/L，碳酸钙1.8g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化镁0.05g/L，硫酸镁0.05g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，豆油1.0g/L，其余为水,pH自然。得到的优化的发酵培养基的组成为：玉米淀粉60.0g/L，花生饼粉25.0g/L，玉米粉20.0g/L，黄豆饼粉10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，玉米浆10.0g/L，氯化钠2.0g/L，氯化铵4.0g/L，氯化钙2.0g/L，碳酸钙3.0g/L，氯化镁0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，淀粉酶1.0g/L，豆油20.0g/L，其余为水,pH自然。
具体的种子培养基和发酵培养基的优化方法如下：
根据选育的突变株的耐氯特性，出发菌株的发酵配方中以硫酸铵作为无机氮源，硫酸镁、碳酸钙作为金属镁、钙的提供者，而氯离子又作为金霉素合成的前体物，一定浓度的氯离子不仅有利于四环素向金霉素的转化，提高金霉素的产量，同时还会减少产物中四环素的含量。但过高的氯离子浓度对菌株的生长也会带来不利影响。因此考虑采用氯化铵替代硫酸铵、氯化钙替代碳酸钙以及氯化镁替代硫酸镁的可能性。首先分别进行硫酸铵、碳酸钙、硫酸镁其中一个、两个或三个配方成分替代后对金霉素合成的影响和每一种氯源对金霉素发酵影响的显著性差别。随后针对影响显著因子，以原添加量为基准，设计梯度水平，采用均匀设计方法进行六因素九水平的多因素的均匀优化实验设计，进行整体的发酵培养基配方的氯离子优化，以金霉素、四环素和去甲基金霉素的含量为指标，每个水平三个重复，每次实验重复三次，试验结果运用DPS18.10数据处理系统进行回归分析和拟合验证，最终获得优化的种子和发酵配方。
最后，采用强化种子培养基进行菌株培养，利用优化的种子培养基和发酵培养基进行金色链霉菌D29菌株、金色链霉菌F3菌株、金色链霉菌FJW-507和金色链霉菌FJC-505的发酵验证。
具体方法如下：实验设4个处理，分别为金色链霉菌D29菌株处理、金色链霉菌F3菌株处理、金色链霉菌FJW-507处理和金色链霉菌FJC-505处理。
金色链霉菌FJC-505处理(简称FJC-505)：将金色链霉菌FJC-505接种到装有上述种子强化培养基的茄子瓶中，于培养箱中34℃培养3天，用5mL无菌生理盐水将孢子洗脱制备孢子洗脱液，并使用无菌滤纸过滤所述孢子洗脱液，得到孢子悬液。将孢子悬液接种到上述优化的种子培养基中，30℃，270r/min培养22h,得到种子液。将种子液接种到装有上述优化的发酵培养基的250mL三角瓶中，接种量为20％(体积比)，使上述优化的发酵培养基中菌体含量为2.0×108cfu/mL。30℃，270r/min发酵培养6天，收集发酵液，把草酸加到发酵液中搅拌使其完全溶解并混合均匀，调节发酵液pH至1.5-2.0，4000rpm离心15min，取上清液，取0.1mL上清液加水定容至100ml容量瓶，经0.22μm的微孔滤膜过滤后，滤液进行高效液相色谱(HPLC)检测金霉素含量、四环素和去甲基金霉素含量(检测方法按照：GB/T21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法)。设三次重复，每次重复接种3个三角瓶。
金色链霉菌FJW-507处理(简称FJW-507)：除将金色链霉菌FJC-505处理中的金色链霉菌FJC-505替换为金色链霉菌FJW-507，其它操作均相同。
金色链霉菌D29菌株处理(简称D29)：除将金色链霉菌FJC-505处理中的金色链霉菌FJC-505替换为金色链霉菌D29菌株，其它操作均相同。
金色链霉菌F3菌株处理(简称F3)：除将金色链霉菌FJC-505处理中的金色链霉菌FJC-505替换为金色链霉菌F3菌株，其它操作均相同。
结果显示，出发菌株D29和F3菌株虽然能够在优化的培养基中生长和代谢，但其与原始培养基相比，金霉素产量分别下降8.7％和7.8％，杂质四环素分别增加了13.2％和7.2％，去甲基金霉素含量变化不大。但对于突变株金色链霉菌FJC-505和金色链霉菌FJW-507来说，具备更好的氯离子耐受能力，展现了更好的金霉素发酵水平，其中：
菌株金色链霉菌FJC-505的摇瓶发酵金霉素产量为26.88g/L，较优化前提高4.2％，其中四环素占金霉素含量比例为6.8％，较优化前减少9.3％，去甲基金霉素占金霉素含量比例为0.22％，较优化前减少21.4％。金色链霉菌FJW-507的摇瓶发酵金霉素产量为26.52g/L，较优化前提高4.0％，其中四环素占金霉素含量比例为6.3％，较优化前减少11.3％，去甲基金霉素占金霉素含量比例为0.20％，较优化前减少20.0％。突变株金色链霉菌FJC-505和金色链霉菌FJW-507发酵生产金霉素的产量及杂质测定结果见表3：
表3金色链霉菌FJC-505和金色链霉菌FJW-507发酵生产金霉素的产量及杂质
处理 金霉素(g/L) 四环素(g/L) 去甲基金霉(g/L)
D29 21.00±0.11 2.58±0.02 0.150±0.001
F3 23.50±0.16 2.78±0.05 0.161±0.001
FJC-505 26.88±0.14 1.83±0.01 0.059±0.0003
FJW-507 26.52±0.12 1.67±0.01 0.053±0.0002
结果表明：本发明选育的金色链霉菌FJC-505和金色链霉菌FJW-507菌株，在本发明强化培养的基础上，具备较好的氯离子耐受和转化的能力，合成与积累金霉素的能力显著增强，主要杂质四环素和去甲基金霉素的含量显著降低，减少金霉素产物的后处理成本，提高产品质量，具备优异的生产金霉素预混剂及其盐酸盐的能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.一种制备金色链霉菌培养物的方法，其特征在于，所述方法包括在培养基中培养金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens），得到金色链霉菌培养物；
所述金色链霉菌的菌株号为FJW-507，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2021500。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包括种子培养基和/或发酵培养基，所述种子培养基和发酵培养基含有氯化铵、氯化钙和氯化镁。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的组成为：玉米淀粉30.0g/L，黄豆饼粉15.0 g/L，花生饼粉10.0 g/L，氯化钠3.0 g/L，氯化铵4.0 g/L，氯化钙1.2g/L，碳酸钙1.8 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化镁0.05 g/L，硫酸镁0.05 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L，豆油1.0 g/L，其余为水。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：玉米淀粉60.0 g/L，花生饼粉25.0 g/L，玉米粉20.0 g/L，黄豆饼粉10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，玉米浆10.0 g/L，氯化钠2.0 g/L，氯化铵4.0 g/L，氯化钙2.0 g/L，碳酸钙3.0g/L，氯化镁0.1 g/L，硫酸镁0.1 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L，淀粉酶1.0 g/L，豆油20.0 g/L，其余为水。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基还包括孢子培养基，所述孢子培养基由等质量的麸皮与营养液组成，所述营养液的组成为：玉米淀粉30.0 g/L，花生饼粉2.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，蛋白胨3.0 g/L，氯化铵2.0 g/L，氯化钠2.0 g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，氯化镁0.15 g/L，硫酸镁0.15 g/L，其余为水。
6.权利要求1中所述的金色链霉菌。
7.一种用于制备金霉素的培养物，其特征在于，所述培养物含有权利要求1中所述的金色链霉菌。
8.权利要求1中所述的金色链霉菌在制备金霉素中的应用。
9.权利要求7所述的培养物在制备金霉素中的应用。
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