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CN113504371A - 基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法 - Google Patents

基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法。本发明应用环糊精包合吖啶酯类似物开发了一种灵敏度更高、特异性更强、自动化程度更高的新型免分离的化学发光免疫分析技术，应用环糊精包合吖啶酯类似物作为发光包合物，环糊精的空腔结构可以包合大量的吖啶酯，从而使发光信号值增强，因而具有信号放大的作用；该方法无需微孔板、磁珠、微球等载体，检测过程中无需洗涤步骤，操作简单用时少，并且灵敏度高、重复性好，生产工艺简单易于放大生产，并且检测过程便捷对于检测仪器要求低，易于实现全自动化。

Description

基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法。
背景技术
免疫分析技术是利用抗原抗体免疫反应，运用标记示踪技术，完成对样本中靶目标的检测分析，该分析方法具有高灵敏度、高特异性，在生物学、医学等领域发挥了重要作用，并逐渐成为疾病早期筛查、疾病辅助诊断及疗效评估等重要的临床检测手段。化学发光免疫分析技术是将发光分析与免疫分析相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术。通常需要氧化剂、发光剂和催化剂三种成分，用作标记物的可以是发光剂或者催化剂。近几年来，随着吖啶酯类、鲁米诺类发光试剂开发应用，以及超弱光检测技术的发展，化学发光免疫分析技术发展迅猛。根据检测过程是否需要洗涤步骤，可分为非免分离化学发光免疫分析和免分离化学发光免疫分析。
目前临床大量使用的板式化学发光法、磁微粒化学发光法等属于非免分离化学发光免疫分析技术，检测体系中需要固相载体(如微孔板、磁性微球等)，检测过程中需要洗涤等步骤，该检测准确，误差更小，可以实现定量检测，并且灵敏度较高。但是操作繁琐检测用时长，也增加检测的成本，并且仪器成本也相对较高。为了克服这些缺点，科研工作者开发了免分离的化学发光免疫分析技术。光激化学发光技术是一种通过感光微球和发光微球在一定距离范围内产生单线态氧能量传递，从而发出荧光信号，对待测样品进行检测的免分离化学发光检测技术。偶联抗体的感光微球和发光微球分别填充感光化合物和发光化合物，当反应体系中加入靶目标分子后，感光微球和发光微球通过免疫反应结合形成免疫复合物。当激发光照射感光微球后，释放单线态氧离子，单线态氧只能达到距离靠近的发光微球，从而产生化学反应发出高能荧光。光激化学发光具有免洗涤、灵敏度高和操作简单等特点，同时也依赖于两种微球的感光和发光，在检测仪器的设计使用上提出较高的要求。荧光共振能量转移，其反应机制最早是由
Figure BDA0003156027460000011
于1948年首次阐明的。当两个荧光基团(供体和受体)彼此靠近，距离在1～10nm时，并且供体的荧光发射光谱与受体的荧光激发光谱有一定的重叠，就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。由此机制开发的荧光共振能量转移技术或时间分辨荧光共振能量转移技术通过检测荧光共振能量转移的效率信息可以反映出两个分子团距离的远近，即可以用来分析分子间相互作用或用于免疫检测分析，也是一种免分离的化学发光免疫分析技术。
但是，现有的免分离的化学发光免疫分析技术虽然具有免洗涤的优点，但仍然存在检测限低，检测范围窄，成本较高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法应用环糊精包合吖啶酯类似物开发了一种灵敏度更高、特异性更强、自动化程度更高的新型免分离的化学发光免疫分析技术，
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，所述方法包括，抗体1与β-环糊精包合的吖啶酯类似物连接，得到发光包合物连接的抗体1，其中，吖啶酯类似物经β-环糊精包合后得到发光包合物β-CDA；抗体2连接辣根过氧化物酶，得到酶连接的抗体2；然后加入待测样本以及本底抑制剂孵育后，加入激发液，立即检测发光信号值。
优选的，所述方法具体包括以下步骤：
(1)β-环糊精包合吖啶酯类似物得到发光包合物β-CDA；
(2)抗体1连接发光包合物，得抗体1-β-CDA；
(3)抗体2连接辣根过氧化物酶，得抗体2-HRP；
(4)检测：加入检测样本、本底抑制剂、抗体1-β-CDA和抗体2-HRP，于37℃孵育15分钟后，加入激发液后，立即检测1秒钟内产生的发光信号。
优选的，所述的抗体1和抗体2为待测抗原的两个特异性抗体，所述待测抗原为常见的癌胚抗原，包括抗缪勒管激素(AMH)、C反应蛋白(CRP)和甲胎蛋白(AFP)。
优选的，所述步骤(4)的检测样本包括待测抗原的标准品、待测血清、待测尿液等。
优选的，所述步骤(4)的本底抑制剂为20mM羟基二乙胺溶液。
优选的，所述步骤(4)的激发液为含有25mM tris(pH 8.0)，15mM对羟基肉桂酸，0.5mM EDTA，0.1％吐温-20和200mM过氧化脲的混合溶液。
优选的，所述步骤(4)中先对抗体1-β-CDA和抗体2-HRP分别进行稀释，再按体积比为5：5：5：1加入稀释后的抗体1-β-CDA、稀释后的抗体2-HRP、待测样品和本底抑制剂，于37℃孵育15分钟后，加入本底抑制剂10倍体积的激发液，立即检测1秒钟内产生的发光信号。
优选的，所述方法还包括步骤(5)判定：以待测抗原的标准品为检测样本，配置梯度浓度的标准品溶液，进行步骤(4)的检测，绘制浓度-发光信号曲线图，得到标准品的浓度-发光信号公式。更优选的，配置所述梯度浓度所用的溶剂为PBS缓冲液或待测抗原的阴性血清。更优选的，所述步骤(5)还包括将待测的检测样本如待测血清等，进行步骤(4)检测并获得发光信号后，带入步骤(5)的浓度-发光信号公式，得到待测样本中的待测抗原的浓度。
优选的，所述步骤(1)的具体制备方法为：称取1mg吖啶酯类似物A溶于1ml DMF中，得到吖啶酯类似物溶液，将其加入1ml 1％β-环糊精β-CD水溶液中，37℃搅拌5小时，加入无水乙醇20ml，室温静置2小时后，将溶液加入截留分子量为1500的透析袋中，放于PBS缓冲液中25℃透析1天(24h)，期间更换3次PBS缓冲液，冷冻干燥制得β-CDA，全部操作过程需要避光。
优选的，所述步骤(2)的具体制备方法为：将1mg发光包合物β-CDA在2ml DMF中溶解，取溶解的β-CDA 50ul加入100ul浓度为10mg/ml的抗体1中，然后加入0.05M硼酸缓冲液800ul，1％戊二醛50ul，室温旋转反应1小时；将反应溶液1ml加入截留分子量为10000的透析袋中，放于PBS缓冲液中4℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，即可得到抗体1-β-CDA，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
优选的，所述步骤(3)的具体制备方法为：称取0.5mg HRP溶解于100ul去离子水中，加入200ul新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌30分钟；将上述反应液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜；加入0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液20ul后，立即加入100ul浓度为10mg/ml的抗体2，然后加入0.01M碳酸盐缓冲液600ul，室温避光轻轻搅拌2小时；加100ul新配的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后置于4℃2小时；将上述反应液加入SUPERDEX 200凝胶过滤柱纯化，收集纯化的抗体2-HRP，最后用保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
优选的，上述步骤中所使用的的DMF可以替换为DMSO。
环糊精是由6-12个D-葡萄糖分子以1，4-糖苷键连接的环状低聚糖化合物，中空圆筒形结构，常温常压下为水溶性非还原性白色晶体粉末，是制备包合物的最常用的装载材料之一。常用的环糊精是α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精三种以及经过修饰的环糊精衍生物。环糊精内腔可以包合一定分子量的小分子药物或发光化合物形成包合物。应用环糊精形成的包合物可以明显改善化合物的性能，具有良好的安全性、生物相容性以及存储特性等。环糊精除了包合小分子化合物以外，还可以用于制备包合物脂质体，包合物纳米微粒等，具有广泛的应用前景。
本发明应用环糊精包合吖啶酯类似物开发了一种灵敏度更高、特异性更强、自动化程度更高的新型免分离的化学发光免疫分析技术，该方法无需微孔板、磁珠、微球等载体，检测过程中无需洗涤步骤，操作简单用时少，并且灵敏度高、重复性好，对检测仪器要求更低。
本发明提供了一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，用于快速、高灵敏度的进行靶目标分子检测，与已知方法相比更简单化更高效。该技术的特征在于应用环糊精包合吖啶酯类似物作为发光包合物，环糊精的空腔结构可以包合大量的吖啶酯，从而使发光信号值增强，因而具有信号放大的作用；结合了抗体1的发光包合物可以与结合了抗体2的辣根过氧化物酶，在靶标分子存在的体系中发生免疫夹心反应形成免疫复合物。该复合物中发光底物与辣根过氧化物酶彼此靠近，再在激发液的作用下发光包合物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，其化学发光强度与靶标分子的多少成正比。未结合的过量抗体1发光包合物和抗体2过氧化氢酶无需洗涤去除，在本底抑制剂的作用下，不影响化学发光反应和检测结果。因此，该检测靶目标分子的方法不需要磁珠、微球、固相载体等支持物，免分离反应体系无需洗涤操作，使免疫反应更加充分，反应也无需提供激发光源，仪器设计更简单，操作过程更高效。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本检测方法不需要以微孔板、磁珠或微球等作为载体包被抗体，检测抗体能够与待测分析物充分进行免疫反应，没有洗涤操作，因此检测过程中无洗涤废液，是一种免分离的化学发光技术。
2.本检测方法应用环糊精与吖啶酯类似物形成发光包合物，可以很大的提高发光信号强调度。通过加入本底抑制剂消除干扰，降低背景信号值，从而提高信号噪音比，提高了检测灵敏度高，扩大了检测线性范围。
3.本检测方法抗体用量少成本低，生产工艺简单易于放大生产，并且检测过程便捷对于检测仪器要求低，易于实现全自动化。
附图说明
图1是免分离化学发光法检测靶目标分子示意图。
图2是免分离化学发光法检测AMH的标准曲线，其中AMH分别稀释在PBS缓冲液和血清中。
图3是免分离化学发光法检测CRP的标准曲线，其中CRP分别稀释在PBS缓冲液和血清中。
图4是免分离化学发光法检测AFP的标准曲线，其中AFP分别稀释在PBS缓冲液和血清中。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，室温为15-40℃，更具体为25℃；所述过夜为12h，所述1天为24h；未提及ph的PBS缓冲液，其pH为7.4。
实施例一、制备β-环糊精-吖啶酯类似物发光包合物(β-CDA)，AMH单克隆抗体1与发光包合物β-CDA偶联，AMH单克隆抗体2与辣根过氧化物酶偶联，用于免分离的化学发光免疫夹心法检测。依次进行以下步骤：
1.制备β-环糊精-吖啶酯类似物发光包合物(β-CDA)
称取1mg吖啶酯类似物(A)溶于1ml DMF中，将其加入1ml 1％β-环糊精(β-CD)溶液中，37℃搅拌5小时，加入无水乙醇20ml，室温静置2小时后，将溶液加入截留分子量为1500的透析袋中，放于PBS缓冲液中25℃透析1天(24h)，期间更换3次PBS缓冲液，冷冻干燥制得β-CDA，全部操作过程需要避光。冷冻干燥温度为0℃以下。
2.AMH单克隆抗体1偶联β-CDA
将1mg发光包合物β-CDA在2ml DMF中溶解，取溶解的β-CDA 50ul加入100ul浓度为10mg/ml的抗缪勒管激素(AMH)单克隆抗体1中，然后加入0.05M硼酸缓冲液800ul，1％戊二醛50ul，室温旋转反应1小时。将反应溶液1ml加入截留分子量为10000的透析袋中，放于PBS缓冲液中4℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，即可得到连接发光包合物的AMH单克隆抗体1(AMH-CDA)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。所述保存液(PBS+0.05％Proclin-300)的配制方法为：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加入0.5ml Proclin-300，最后加蒸馏水定容至1L即可，下同。
3.AMH单克隆抗体2与辣根过氧化物酶偶联
称取0.5mg HRP溶解于100ul去离子水中，加入200ul新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌30分钟。将上述反应液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜。加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液20ul后，立即加入100ul浓度为10mg/ml的AMH单克隆抗体2，然后加入0.01M碳酸盐缓冲液600ul，室温避光轻轻搅拌2小时。加100ul新配的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后置于4℃静置2小时。将上述反应液加入SUPERDEX 200凝胶过滤柱纯化，收集纯化的AMH单克隆抗体2与辣根过氧化物酶偶联产物(AMH-HRP)，最后用保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
4.检测
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，15mM对羟基肉桂酸，0.5mM EDTA，0.1％吐温-20和200mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：20mM羟基二乙胺溶液于去离子水中。
AMH样品：取AMH标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值50ng/ml，5ng/ml，1ng/ml，0.15ng/ml，0.01ng/ml，0.002ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取AMH标准品用AMH阴性血清稀释至50ng/ml，5ng/ml，1ng/ml，0.15ng/ml，0.01ng/ml，0.002ng/ml。
加样检测：采用双抗夹心法，用PBS缓冲液将上述制备的AMH-CDA和AMH-HRP分别稀释3000倍和13000倍，检测时AMH-CDA，AMH-HRP，待测样品分别加50ul，另外加入10ul本底抑制剂于透明反应管中。37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测。
检测结果：
如图2，AMH直线回归方程公式：y＝3.72925+0.64652x，r^2＝0.99475，其中y表示发光信号值以10为底的对数，x表示标准品的浓度以10为底的对数。应用免分离化学发光法检测AMH，PBS梯度稀释的AMH最低检测限为0.002ng/ml，与在血清中检测的灵敏度基本相同。线性范围为4个数量级。现有技术检测限一般是0.02ng/ml，线性检测范围一般是3个数量级，本发明在检测灵敏度和检测线性范围方面均提高了一个数量级。
实施例二、制备β-环糊精-吖啶酯类似物发光包合物(β-CDA)，CRP单克隆抗体1与发光包合物β-CDA偶联，CRP单克隆抗体2与辣根过氧化物酶偶联，用于免分离的化学发光免疫夹心法检测。依次进行以下步骤：
1.制备β-环糊精-吖啶酯类似物发光包合物(β-CDA)
称取1mg吖啶酯类似物(A)溶于1ml DMF中，将其加入1ml 1％β-环糊精(β-CD)溶液中，37℃搅拌5小时，加入无水乙醇20ml，室温静置2小时后，将溶液加入截留分子量为1500的透析袋中，放于PBS缓冲液中25℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，冷冻干燥制得β-CDA，全部操作过程需要避光。
2.CRP单克隆抗体1偶联β-CDA
将1mg发光包合物β-CDA在2ml DMF中溶解，取溶解的β-CDA 50ul加入100ul浓度为10mg/ml的C反应蛋白(CRP)单克隆抗体1中，然后加入0.05M硼酸缓冲液800ul，1％戊二醛50ul，室温旋转反应1小时。将反应溶液1ml加入截留分子量为10000的透析袋中，放于PBS缓冲液中4℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，即可得到连接发光包合物的CRP单克隆抗体1(CRP-CDA)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3.CRP单克隆抗体2与辣根过氧化物酶偶联
称取0.5mg HRP溶解于100ul去离子水中加入200ul新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌30分钟。将上述反应液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜。加入0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液20ul后，立即加入100ul浓度为10mg/ml的CRP单克隆抗体2，然后加入0.01M碳酸盐缓冲液600ul，室温避光轻轻搅拌2小时。加100ul新配的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后置于4℃2小时。将上述反应液加入SUPERDEX200凝胶过滤柱纯化，收集纯化的CRP单克隆抗体2与辣根过氧化物酶偶联
产物(CRP-HRP)，最后用保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
4.检测
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，15mM对羟基肉桂酸，0.5mM EDTA，0.1％吐温-20和200mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：20mM羟基二乙胺溶液于去离子水中。
CRP样品：取CRP标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值2000ng/ml，500ng/ml，100ng/ml，20ng/ml，5ng/ml，2ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取CRP标准品用CRP阴性血清稀释至2000ng/ml，500ng/ml，100ng/ml，20ng/ml，5ng/ml，2ng/ml。
加样检测：采用双抗夹心法，用PBS缓冲液将上述制备的CRP-CDA和CRP-HRP分别稀释5000倍和23000倍，检测时CRP-CDA，CRP-HRP，待测样品分别加50ul，另外加入10ul本底抑制剂于透明反应管中。37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测。
检测结果：
如图3，CRP直线回归方程公式：y＝1.94203+0.86444x，r^2＝0.99241，其中y表示发光信号值以10为底的对数，x表示标准品的浓度以10为底的对数。应用免分离化学发光法检测CRP，PBS梯度稀释的CRP最低检测限为2ng/ml，与在血清中检测的灵敏度基本相同。线性范围为3个数量级。
实施例三、制备β-环糊精-吖啶酯类似物发光包合物(β-CDA)，AFP单克隆抗体1与发光包合物β-CDA偶联，AFP单克隆抗体2与辣根过氧化物酶偶联，用于免分离的化学发光免疫夹心法检测。依次进行以下步骤：
1.制备β-环糊精-吖啶酯类似物发光包合物(β-CDA)
称取1mg吖啶酯类似物(A)溶于1ml DMF中，将其加入1ml 1％β-环糊精(β-CD)溶液中，37℃搅拌5小时，加入无水乙醇20ml，室温静置2小时后，将溶液加入截留分子量为1500的透析袋中，放于PBS缓冲液中25℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，冷冻干燥制得β-CDA，全部操作过程需要避光。
2.AFP单克隆抗体1偶联β-CDA
将1mg发光包合物β-CDA在2ml DMF中溶解，取溶解的β-CDA 50ul加入100ul浓度为10mg/ml的甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体1中，然后加入0.05M硼酸缓冲液800ul，1％戊二醛50ul，室温旋转反应1小时。将反应溶液1ml加入截留分子量为10000的透析袋中，放于PBS缓冲液中4℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，即可得到连接发光包合物的AFP单克隆抗体1(AFP-CDA)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3.AFP单克隆抗体2与辣根过氧化物酶偶联
称取0.5mg HRP溶解于100ul去离子水中加入200ul新配的0.1M过碘酸钠溶液，室温下避光搅拌30分钟。将上述反应液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜。加入0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液20ul后，立即加入100ul浓度为10mg/ml的AFP单克隆抗体2，然后加入0.01M碳酸盐缓冲液600ul，室温避光轻轻搅拌2小时。加100ul新配的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后置于4℃2小时。将上述反应液加入SUPERDEX200凝胶过滤柱纯化，收集纯化的AFP单克隆抗体2与辣根过氧化物酶偶联
产物(AFP-HRP)，最后用保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
4.检测
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，15mM对羟基肉桂酸，0.5mM EDTA，0.1％吐温-20和200mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：20mM羟基二乙胺溶液于去离子水中。
AFP样品：取AFP标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值500ng/ml，200ng/ml，50ng/ml，10ng/ml，2ng/ml，1ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取AFP标准品用AFP阴性血清稀释至500ng/ml，200ng/ml，50ng/ml，10ng/ml，2ng/ml，1ng/ml。
加样检测：采用双抗夹心法，用PBS缓冲液将上述制备的AFP-CDA和AFP-HRP分别稀释6000倍和15000倍，检测时AFP-CDA，AFP-HRP，待测样品分别加50ul，另外加入10ul本底抑制剂于透明反应管中。37℃孵育15min后，加入100ul激发液立即启动检测。
检测结果：
如图4，AFP直线回归方程公式：y＝1.90769+1.01736x，r^2＝0.97145，其中y表示发光信号值以10为底的对数，x表示标准品的浓度以10为底的对数。应用免分离的化学发光免疫夹心法检测AFP，PBS梯度稀释的AFP最低检测限为1ng/ml，与在血清中检测的灵敏度基本相同。线性范围为1～500ng/ml。
实验例一、以下述5种血清作为待测样本，分别按照上述实施例一、对比例一所述方法进行检测，所得结果如下表1所述。
血清样品A：事先经化学发光免疫分析法检测为AMH阴性血清；
血清样品B：在事先经化学发光免疫分析法检测为AMH阴性血清中加入AMH至浓度为0.008ng/ml；
血清样品C：在事先经化学发光免疫分析法检测为AMH阴性血清中加入AMH至浓度为0.15ng/ml；
血清样品D：事先经化学发光免疫分析法检测为AMH浓度为12.22ng/ml的血清；
血清样品E：事先经化学发光免疫分析法检测为AMH浓度为32.44ng/ml的血清；
对比例一、将实施例一中的吖啶酯类似物直接偶联到AMH单克隆抗体1，不经过β-环糊精包合；其余等同于实施例一(获得相应的检测标准曲线后进行检测判定)。
表1
Figure BDA0003156027460000111
实验例二、以下述5种血清作为待测样本，分别按照上述实施例二、对比例二所述方法进行检测，所得结果如下表2所述。
血清样品F：事先经化学发光免疫分析法检测为CRP阴性血清；
血清样品G：在事先经化学发光免疫分析法检测为CRP阴性血清中加入CRP至浓度为2.21ng/ml；
血清样品H：在事先经化学发光免疫分析法检测为CRP阴性血清中加入CRP至浓度为20.15ng/ml；
血清样品I：事先经化学发光免疫分析法检测为CRP浓度为124.43ng/ml的血清；
血清样品J：事先经化学发光免疫分析法检测为CRP浓度为632.37ng/ml的血清；
对比例二、将实施例二中的吖啶酯类似物直接偶联到CRP单克隆抗体1，不经过β-环糊精包合；其余等同于实施例二(获得相应的检测标准曲线后进行检测判定)。
表2
Figure BDA0003156027460000121
实验例三、以下述5种血清作为待测样本，分别按照上述实施例三、对比例三所述方法进行检测，所得结果如下表3所述。
血清样品K：事先经化学发光免疫分析法检测为AFP阴性血清；
血清样品L：在事先经化学发光免疫分析法检测为AFP阴性血清中加入CRP至浓度为1.75ng/ml；
血清样品M：在事先经化学发光免疫分析法检测为AFP阴性血清中加入CRP至浓度为15.32ng/ml；
血清样品N：事先经化学发光免疫分析法检测为AFP浓度为87.99ng/ml的血清；
血清样品O：事先经化学发光免疫分析法检测为AFP浓度为274.55ng/ml的血清；
对比例三、将实施例三中的吖啶酯类似物直接偶联到AFP单克隆抗体1，不经过β-环糊精包合；其余等同于实施例一(获得相应的检测标准曲线后进行检测判定)。
表3
Figure BDA0003156027460000122
Figure BDA0003156027460000131
以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述方法包括，抗体1与β-环糊精包合的吖啶酯类似物连接，得到发光包合物连接的抗体1；抗体2连接辣根过氧化物酶，得到酶连接的抗体2；将发光包合物连接的抗体1、酶连接的抗体2、待测样本以及本底抑制剂混合并孵育后，加入激发液，检测发光信号值。
2.根据权利要求1所述一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)β-环糊精包合吖啶酯类似物得到发光包合物；
(2)抗体1连接发光包合物，得抗体1-β-CDA；
(3)抗体2连接辣根过氧化物酶，得抗体2-HRP；
(4)检测：将检测样本、本底抑制剂、抗体1-β-CDA和抗体2-HRP混合，于37℃孵育15分钟，加入激发液后，检测1秒钟内产生的发光信号。
3.根据权利要求2所述一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述步骤(4)的本底抑制剂为20mM羟基二乙胺溶液。
4.根据权利要求2所述一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述步骤(4)的激发液为含有25mM tris，15mM对羟基肉桂酸，0.5mM EDTA，0.1％吐温-20和200mM过氧化脲的混合溶液。
5.根据权利要求2所述一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述步骤(4)中先对抗体1-β-CDA和抗体2-HRP分别进行稀释，再按体积比为5：5：5：1加入稀释后的抗体1-β-CDA、稀释后的抗体2-HRP、待测样品和本底抑制剂，于37℃孵育15分钟后，加入本底抑制剂10倍体积的激发液，检测1秒钟内产生的发光信号。
6.根据权利要求2所述一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(5)判定：以待测抗原的标准品为检测样本，配置梯度浓度的标准品溶液，进行步骤(4)的检测，绘制浓度-发光信号曲线图，得到标准品的浓度-发光信号公式。
7.根据权利要求6所述一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述步骤(5)还包括将待测的检测样本进行步骤(4)检测并获得发光信号后，带入步骤(5)的浓度-发光信号公式，得到待测的检测样本中的待测抗原的浓度。
8.根据权利要求2所述一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体制备方法为：称取1mg吖啶酯类似物A溶于1ml DMF中，得到吖啶酯类似物溶液，将其加入1ml 1％β-环糊精β-CD水溶液中，37℃搅拌5小时，加入无水乙醇20ml，静置2小时后，将溶液加入截留分子量为1500的透析袋中，放于PBS缓冲液中25℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，冷冻干燥制得β-CDA；所述步骤(1)的操作过程避光。
9.根据权利要求2所述一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体制备方法为：将1mg发光包合物β-CDA在2ml DMF中溶解，取溶解的β-CDA 50ul加入100ul浓度为10mg/ml的抗体1中，然后加入0.05M硼酸缓冲液800ul，1％戊二醛50ul，反应1小时；将反应溶液1ml加入截留分子量为10000的透析袋中，放于PBS缓冲液中4℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，即可得到抗体1-β-CDA，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
10.根据权利要求2所述一种基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体制备方法为：称取0.5mg HRP溶解于100ul去离子水中，加入200ul新配的0.1M过碘酸钠溶液，避光搅拌30分钟；将上述反应液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃透析过夜；加入0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液20ul后，加入100ul浓度为10mg/ml的抗体2，然后加入0.01M碳酸盐缓冲液600ul，避光搅拌2小时；加100ul 4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后置于4℃2小时；将上述反应液加入SUPERDEX200凝胶过滤柱纯化，收集纯化的抗体2-HRP，最后用保存液置于-20℃保存。
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