CN113481185B

CN113481185B - 一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113481185B
Application number: CN202110897489.7A
Authority: CN
Inventors: 许波; 范琴; 黄遵锡; 吴倩
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2041-08-05
Also published as: CN113481185A

Abstract

本发明公开了一种耐盐β‑半乳糖苷酶GalNC2‑13及其制备方法和应用，该β‑半乳糖苷酶GalNC2‑13氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，共592个氨基酸，理论分子量为67.83kDa，编码基因如SEQ ID NO.2所示。所述β‑半乳糖苷酶GalNC2‑13具有较好的NaCl稳定性，在食品工业、合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因等具有较好的应用潜力。

Description

一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)能够催化乳糖水解生成半乳糖和葡萄糖；其次该酶具有将乳糖催化形成低聚半乳糖的转糖基活性。乳糖是一种二糖，在哺乳动物的乳汁中含量丰富，对新生儿的营养至关重要；可被肠道中的乳糖酶水解成可吸收的葡萄糖和半乳糖。耐盐β-半乳糖苷酶在高盐浓度中具有较高的酶活，在高盐工艺的食品工业中消化植物多糖。此外，还可合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因。GOS由β-半乳糖苷酶通过乳糖水解过程中的转糖基化活性产生的，为食品中不可消化的益生元的成分，对人体健康至关重要，且酶法制备GOS具有简单、高效、量大、副反应较少等优势。

目前主要采取β-半乳糖苷酶水解乳糖的方法制备GOS。GOS具有促进益生菌增殖预防和治疗便秘等功能；其次，在食品工业中用作发酵乳产品、面包和饮料等低热量甜味剂；在婴幼儿配方奶粉、烘焙食品和宠物食品等诸多领域有着广泛的应用。此外，可解决乳糖不耐的问题。此外，在酸性条件下可于室温下长时间保存并应用于各种产品而不会分解，故其在乳清和牛奶加工市场应用前景非常广阔。因此开发多功能的β-半乳糖苷酶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用，同时还提供了该水解酶的构建方法，本发明耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13不仅具有良好的耐盐特性，还具有高效转糖基活性和高效水解乳糖活性。

为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术方案：

一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13，所述β-半乳糖苷酶GalNC2-13来源于动物粪便微生物宏基因组，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，共592个氨基酸，理论分子量为67.83kDa。

所述β-半乳糖苷酶GalNC2-13最适作用pH为6.5，在pH 6.0、pH 6.5下处理1h，其剩余酶活分别为130％、132％；最适作用温度为37℃，在37℃条件下耐受0.5h达到半衰期；该酶具有较好的NaCl稳定性，在NaCl浓度为0.5mol/L时酶活性达到最大(约2倍)。在0.5-1.0mol/LNaCl浓度下可达200％以上；1.5mol/L NaCl浓度下维持190％活性；在2.0-2.5mol/L浓度下均保持在130％以上；即使在3.0-5.0mol/LNaCl下也能维持在65％-95％。

在本发明的另一方面，提供了所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因大小为1779bp。

在本发明的另一方面，提供了包含所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为pEASY-E2/GalNC2-13。

在本发明的另一方面，提供了包含所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13编码基因的重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/GalNC2-13。

本发明通过PCR的方法克隆到β-半乳糖苷酶编码基因，将β-半乳糖苷酶编码基因GalNC2-13与质粒pEASY-E2连接得到重组表达载体，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。

在本发明的另一方面，提供了所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13的制备方法，包括以下步骤：

1)以西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组DNA为模板，设计引物F和R进行PCR扩增，得到β-半乳糖苷酶基因；

2)将β-半乳糖苷酶基因与表达载体重组后转化到宿主细胞，得到重组菌株，培养重组菌株并诱导重组β-半乳糖苷酶表达；

3)回收并纯化所表达的β-半乳糖苷酶，得到β-半乳糖苷酶GalNC2-13。

所述引物F和R核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。

在本发明的另一方面，所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13所具有的良好的耐盐特性，在食品工业加工中具有较好的应用潜力，具体为可用于高盐工艺来消化植物多糖、合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因。

本发明的有益效果为：

本发明所述的耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13的最适pH为6.5，在pH 6.0、pH 6.5下处理1h，其剩余酶活分别为130％、132％；最适作用温度为37℃，在37℃条件下耐受0.5h达到半衰期；该酶具有较好的NaCl稳定性，在NaCl浓度为0.5mol/L时酶活性达到最大(约2倍)。在0.5-1.0mol/LNaCl浓度下可达200％以上；1.5mol/LNaCl浓度下维持190％活性；在2.0-2.5mol/L浓度下均保持在130％以上；即使在3.0-5.0mol/L NaCl下也能维持在65％-95％。该酶的Km、和Vmax分别为4.796mmol/L和1.022mmol/min；Pb²⁺、Tween80、DTT和β-巯基乙醇对其有激活作用，分别将酶活性提高25％、12％和65％、32％；Sn²⁺、Na⁺、K⁺、Fe³⁺、Mg²⁺和丙三醇对其酶活性几乎无影响。以上性质表明，本发明制备的耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13在食品工业(如乳制品行业)，其次，在合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因等具有较好的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组β-半乳糖苷酶GalNC2-13的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Mark er；1：仅含有pEASY-E2载体的大肠杆菌诱导后的粗酶；2：未纯化的重组β-半乳糖苷酶；3：纯化的重组β-半乳糖苷酶；

图2是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶的最适pH；

图3是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶的pH稳定性；

图4是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶的最适温度；

图5是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶的温度稳定性；

图6是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶NaCl的影响。

图7是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶NaCl的稳定性；

图8是本发明实施例β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的UPLC分析，其中，A为GOS标准品，B为GalNC2-13的转糖苷产物GOS；

图9是本发明实施例β-半乳糖苷酶水解乳糖的UPLC分析，其中，A为葡萄糖标准品，B为GalNC2-13的水解产物。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而费全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：菌株Escherichia coli BL21(DE3)购于擎科生物科技有限公司，E.coli表达载体pEASY-E2购于北京全式金生物技术有限公司。

2、基因工程操作酶类、试剂盒及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司，DNA纯化试剂盒为OMEGA BIO-TEK公司公司；其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在以上基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1β-半乳糖苷酶基因GalNC2-13的获得

1)β-半乳糖苷酶基因GalNC2-13的克隆

以GalNC2-13 DNA F：5’-taagaaggagatatacatatggaattgatgcttgaaattaaaaataaag-3’和GalNC2-13 DNA R：5’-gtggtggtggtggtgctcgagtcctaaatcgtgcttatcaag-3’为上下游引物，用西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：98℃变性30s,55℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环。PCR结果得到目的基因GalNC2-13。

实施例2β-半乳糖苷酶GalNC2-13的制备

将实施例1制备的β-半乳糖苷酶基因GalNC2-13与质粒pEASY-E2连接得到重组表达载体pEASY-E2/GalNC2-13，转化大E.coli BL21(DE3)获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/GalNC2-13。取含有重组表达载体pEASY-E2/GalNC2-13的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/GalNC2-13，按0.1％V/V)的量接种于LB(含100μg/mL Amp)培养液中，37℃、180rpm培养12-16h。然后将活化的菌液以1％(V/V)量接种到新鲜的LB(含100μg/mL Amp)培养液中，37℃、180rpm 37℃、180r/min摇床培养约4-5h(OD₆₀₀＝0.6-0.8)后，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG于20℃、180r/min摇床下培养16h以诱导重组蛋白产生后。4℃、5000r/min离心10min收集菌体。用适量无菌水悬浮菌体后，高压破碎细胞(35KPSI)。上述破碎细胞液经4℃、12000r/min冷冻离心10min后，取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白，得到耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13。

对所述纯化蛋白GalNC2-13进行SDS-PAGE分析，结果参见图1，图1是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组β-半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：仅含有pE ASY-E2载体的大肠杆菌诱导后的粗酶；2：未纯化的重组β-半乳糖苷酶；3：纯化的重组β-半乳糖苷酶。由图1可知，重组β-半乳糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13的性质测定

酶活性测定方法参照张文洪(张文洪，2019)：以对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPGal)测定其余重组β-半乳糖苷酶酶活性。将对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPGal)溶解于pH6.5缓冲液中，配制成终浓度为2mmol/L的底物溶液。取450μL pNPGal溶液，37℃下预热5min，加入50μL稀释适当倍数的酶液，准确反应10min后，立即加入1mL 1mol/L的Na₂CO₃终止反应并显色。取200μL上述反应液加到96孔板中，用酶标仪测定反应液的OD₄₂₀，并以加入50μL已失活的酶液作为空白对照。酶活单位定义：一个酶活单位(U)即在酶的最适反应条件下，每分钟水解pNPGal释放1μmol pNP所需的酶量。

1)耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13的最适pH和pH稳定性的测定

酶的最适pH测定：将实施例2纯化的耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13在37℃下测定pH3.0-12.0(pH3.0-7.0：0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；pH8.0-12.0：0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)缓冲液中的酶活力。

酶的pH稳定性测定：将酶于37℃下在不同pH 3.0-12.0缓冲溶液中保温1h。按照酶活测定方法，在最适反应条件下测定残余的酶活力。以最高活力作为100％，计算各个pH值下该酶的相对活力。

结果参见图2和图3，图2为本发明实施例提供的耐盐β-半乳糖苷酶最适pH，图3为本发明实施例提供的耐盐β-半乳糖苷酶的pH稳定性。由图2和图3可知，本发明提供的耐盐β-半乳糖苷酶的最适pH为6.5；在pH 6.0、pH 6.5下处理1h，其剩余酶活分别为130％、132％。

2)耐盐β-半乳糖苷酶的最适温度及温度稳定性测定

酶的最适温度测定：在pH6.5下，测定不同温度(0-60℃)条件下的β-半乳糖苷酶活力，并以最高活力100％计算各个温度下该酶的相对活力。

酶的温度稳定性测定：在pH6.5条件下，测定30℃、37℃和40℃下放置1h，每隔10分钟在pH6.5及30℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。

结果参见图4、图5。图4是本发明实施例提供的耐盐β-半乳糖苷酶的最适温度，图5是本发明实施例提供的耐盐β-半乳糖苷酶的温度稳定性。结果表明：耐盐β-半乳糖苷酶的最适温度为37℃，在30℃、37℃条件下保持稳定。

3)耐盐β-半乳糖苷酶的NaCl影响及NaCl耐受性测定

酶的NaCl影响测定：在37℃、pH 6.5，0.5-5mol/L NaCl条件下进行酶促反应。

酶的NaCl稳定性测定：在酶的最适作用条件下及标准酶反应体系中加入不同浓度的NaCl，使其终浓度为0.5-5mol/L，于37℃下恒温水浴1h后，于37℃、pH 6.5条件下测定其剩余酶活力。以未处理的酶液作为对照。

结果参见图6、图7。图6是本发明实施例提供的耐盐β-半乳糖苷酶的NaCl影响，图7是本发明实施例提供的耐盐β-半乳糖苷酶的NaCl耐受。结果表明：在NaCl浓度为0.5mol/L时酶活性达到最大(约2倍)。在0.5-1.0mol/L NaCl浓度下可达200％以上；1.5mol/L Na Cl浓度下维持190％活性；在2.0-2.5mol/L浓度下均保持在130％以上；即使在3.0-5.0mol/LNaCl下也能维持在65％-95％。

4)重组β-半乳糖苷酶的动力学参数测定

动力学参数在pH 6.5、温度37℃和一级反应时间下以不同浓度的pNPGal为底物(0.2-5.2mmol/L)进行测定，根据Lineweaver-Burk法计算出Km和Vmax值。经测定，在37℃、pH 6.5条件下该酶的Km和Vmax分别为4.796mmol/L和1.022mmol/min。

5)不同金属离子及化学试剂对重组β-半乳糖苷酶活力影响测定

将各种金属离子(Na⁺、K⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ni2⁺、Al3⁺、Li⁺、Mg²⁺、Sn²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺)和化学试剂(SDS、EDTA、盐酸胍、Tween80、Triton X100、DTT、丙三醇、乙酸、乙醇、甲醇、PEG4000、乙酸乙酯、尿素、β-巯基乙醇)加入到酶促反应体系中，使其终浓度分别为10mmol/L、1％(V/V)，在酶最适作用条件下测定β-半乳糖苷酶活力。以不加金属离子和化学试剂的酶活力为参照。结果参见表1。

表1化学试剂对重组β-半乳糖苷酶的活力影响

由表1可知，Pb²⁺、Tween80、DTT和β-巯基乙醇对其有激活作用，分别将酶活性提高25％、12％和65％、32％；Sn²⁺、Na⁺、K⁺、Fe³⁺、Mg²⁺和丙三醇对其酶活性几乎无影响。Zn²⁺和Mn²⁺完全抑制其活性，其余金属离子或化学试剂对其有不同程度抑制作用。

6)重组β-半乳糖苷酶转糖基活性的UPLC测定

将重组β-半乳糖苷酶添加到25％(W/V)乳糖溶液中，于37℃、pH 6.5反应条件下反应24h，立即煮沸5min终止反应，后于12000r/min离心10min，取上清进行UPLC分析。

结果参见图8，重组β-半乳糖苷酶能在24h时将乳糖全部转化为GOS。

7)重组β-半乳糖苷酶水解乳糖产物的UPLC测定

将重组β-半乳糖苷酶添加到5％(W/V)乳糖溶液中，于37℃、pH 6.5反应条件下反应12h，立即煮沸5min终止反应，后于12000r/min离心10min，取上清进行UPLC分析。

结果参见图9，重组β-半乳糖苷酶能在12h时将乳糖全部水解为葡萄糖。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 592

<212> PRT

<213> β-半乳糖苷(GalNC2-13)

<400> 1

Met Leu Glu Ile Lys Asn Lys Glu Phe Tyr Met Asp Gly Lys Pro Phe

1 5 10 15

Lys Ile Tyr Ser Gly Ala Met His Tyr Phe Arg Ile Leu Pro Glu Tyr

20 25 30

Trp Glu Asp Arg Leu Thr Lys Leu Lys Leu Ala Gly Phe Asn Thr Val

35 40 45

Glu Thr Tyr Val Cys Trp Asn Leu His Glu Pro Lys Pro Asn Glu Phe

50 55 60

Cys Phe Asp Gly Met Leu Asp Ile Val Arg Phe Val Glu Thr Ala Lys

65 70 75 80

Lys Val Gly Leu Tyr Cys Ile Val Arg Pro Gly Pro Tyr Ile Cys Ala

85 90 95

Glu Trp Asp Phe Gly Gly Leu Pro Ala Trp Leu Leu Lys Asp Lys Asn

100 105 110

Met Gln Ile Arg Cys Cys Tyr Pro Asp Tyr Leu Ala Cys Val Glu Arg

115 120 125

Phe Tyr Lys Ala Leu Leu Pro Arg Leu Val Ser Leu Leu Glu Thr Asn

130 135 140

Gly Gly Asn Ile Ile Ala Met Gln Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Tyr

145 150 155 160

Gly Asn Asp Lys Asp Tyr Leu Arg Phe Val Glu Lys Leu Met Met Asp

165 170 175

Cys Gly Ile Asp Val Leu Tyr Phe Thr Ser Asp Gly Asn Trp Lys Asn

180 185 190

Met Leu Ser Gly Gly Ser Leu Pro His Ile Tyr Lys Val Leu Asn Phe

195 200 205

Gly Ser Lys Ala Lys Thr Ala Phe Gly Cys Leu Lys Asp Phe Glu Asn

210 215 220

Asp Gly Pro Asn Met Cys Gly Glu Phe Trp Cys Gly Trp Phe Asp His

225 230 235 240

Trp Arg Asp Ile His His Thr Arg Asp Ala Ala Ser Val Gly Lys Glu

245 250 255

Ile Lys Asp Phe Leu Asp Ile Gly Ala Ser Phe Asn Phe Tyr Met Phe

260 265 270

His Gly Gly Thr Asn Phe Gly Phe Thr Ala Gly Ala Asn His Asn Pro

275 280 285

Gly Lys Gly Tyr Glu Pro Thr Ile Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Ala Leu

290 295 300

Leu Asn Glu Trp Gly Asp Tyr Thr Pro Ala Tyr His Glu Val Arg Lys

305 310 315 320

Ile Leu Cys Glu Asn Gln Gly Ile Glu Met Arg Gln Leu Pro Pro Ser

325 330 335

Pro Ala Leu Gln Ser Ile Gly Glu Val Lys Leu Thr Glu Phe Ala Pro

340 345 350

Leu Phe Gly Asn Leu Asp Asn Ile Ala Glu Lys His Arg Ala Ala Val

355 360 365

Pro Glu Ser Met Glu Tyr Phe Asp Gln Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Tyr

370 375 380

Glu Thr Ile Leu Ser Gly Lys Tyr Asp Ile Ser Pro Ile Glu Phe Lys

385 390 395 400

Asn Val His Asp Phe Gly Tyr Val Tyr Phe Asp Ser Lys Leu Lys Lys

405 410 415

Arg Ile Asp Arg Thr Gln Tyr Thr Glu Pro Lys Lys Gly Leu Lys Ala

420 425 430

Leu Leu Gly Leu Lys Lys Glu Asp Lys Phe Leu Met Pro Ala Leu Lys

435 440 445

Gly Glu Arg Lys Ile Gly Val Leu Val Asp Ala Met Gly Arg Val Asn

450 455 460

Tyr Gly Glu His Met Ile Asp Arg Lys Gly Met Thr Asp Ile Tyr Ile

465 470 475 480

Gly Asn Gln Arg Gln Met Gly Tyr Asp Val Tyr Thr Met Pro Leu Asp

485 490 495

Asn Leu Glu Lys Leu Val Tyr Gly Ser Ala Ser Asp Ser Leu Pro Val

500 505 510

Phe Met Lys Gly Glu Phe Thr Ala Asp Ser Lys Ala Asp Cys Phe Val

515 520 525

His Leu Asp Gly Phe Lys Lys Gly Tyr Val Trp Val Asn Gly Phe Asn

530 535 540

Leu Gly Arg Tyr Trp Ser Val Gly Pro Gln Lys Ser Leu Tyr Leu Pro

545 550 555 560

Gly Ala Leu Leu Lys Asp Glu Asn Glu Ile Ile Val Leu Glu Met Glu

565 570 575

Gly Phe Asn Lys Pro Ala Val Ser Ile Leu Asp Lys His Asp Leu Gly

580 585 590

<210> 2

<211> 1779

<212> DNA

<213> β-半乳糖苷酶编码基因(GalNC2-13)

<400> 2

atgcttgaaa ttaaaaataa agaattttat atggacggta agccctttaa aatatactca 60

ggtgctatgc actattttcg catcctgccc gaatattggg aggatagatt aacaaagctt 120

aagcttgccg gttttaatac agtagaaacc tatgtctgtt ggaatctgca cgagccaaag 180

ccgaatgaat tttgctttga cggaatgctt gatatcgtaa gatttgttga aactgcaaaa 240

aaggtcggtt tatactgtat tgtccgtccc ggtccctaca tatgtgccga gtgggatttc 300

ggaggcctgc ctgcgtggct tttaaaggac aagaatatgc agattcgctg ctgctatcct 360

gattatcttg cttgtgttga gagattttat aaggcacttc tgccaaggct tgtttcgctg 420

cttgaaacaa atggcggcaa tattattgca atgcaggttg aaaatgagta cggttcttac 480

ggcaatgata aggattatct gcgctttgtt gaaaagctga tgatggactg cggtattgat 540

gttctgtatt ttacatcaga cggcaattgg aagaatatgc tttcaggcgg ttcactcccg 600

catatttata aggtgctgaa tttcggctct aaggcgaaaa cggcttttgg ctgtctgaag 660

gattttgaaa atgacggacc gaatatgtgc ggcgaattct ggtgcggctg gtttgaccat 720

tggagagata ttcaccatac aagagatgca gcatccgttg gcaaagagat taaggatttt 780

cttgatattg gtgcaagctt taatttctat atgttccatg gcggtacgaa ttttggcttt 840

actgcaggtg caaaccataa tcccggcaag ggttatgagc ctaccattac gagctatgat 900

tattgtgcac tgcttaatga atggggtgat tatacccccg cttatcacga ggtgagaaaa 960

atactctgtg aaaatcaggg catagaaatg agacagctgc cgccgtcacc tgctttgcag 1020

tcaatcggtg aggtaaagct tactgaattt gcgccgcttt ttggtaatct tgacaatatt 1080

gccgaaaagc acagagcagc tgtgcctgag agtatggaat atttcgacca gaatttcggc 1140

ctgatttatt atgaaaccat tctgagcgga aaatatgata tttcaccgat tgaattcaag 1200

aatgttcacg atttcggtta tgtatacttc gattcaaaac tgaaaaagag aattgacaga 1260

acacaatata cggagccgaa aaaaggtctc aaggctcttt tgggtttgaa gaaagaagat 1320

aaattcctta tgcctgcact gaaaggtgaa aggaaaatcg gtgtgcttgt tgatgctatg 1380

ggcagagtga attacggtga gcatatgatt gaccgaaagg gtatgacaga tatctatatc 1440

ggcaatcaaa gacagatggg ctatgatgtt tacacaatgc cgcttgataa tcttgaaaag 1500

cttgtatatg gctcagcatc agacagcctg cctgtattta tgaagggcga atttactgct 1560

gattcaaagg cagattgctt tgttcatctt gacggcttta aaaagggcta tgtctgggtt 1620

aacggcttta atctcggcag atattggagt gtcggaccgc agaaatcttt atatcttccg 1680

ggtgcacttc tcaaggatga aaatgagatt atagttcttg aaatggaggg ctttaacaag 1740

cctgcggttt ctattcttga taagcacgat ttaggataa 1779

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taagaaggag atatacatat ggaattgatg cttgaaatta aaaataaag 49

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggtggtgg tggtgctcga gtcctaaatc gtgcttatca ag 42

Claims

1.一种耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶GalNC2-13氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13的编码基因，其特征在于，所述编码基因如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。

4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。

5.权利要求1所述的耐盐β-半乳糖苷酶GalNC2-13在食品加工中的应用。