CN113480659B - 人源抗结核分枝杆菌复合群lam单克隆抗体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一对特异性结合结核分枝杆菌复合群(MTBC)脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)的人源单克隆抗体的核酸序列及其重组抗体的制备方法与应用。本发明公开的单克隆抗体通过卡介苗接种的健康人scFv噬菌体抗体库筛选和鉴定得到，通过测序得到其抗体序列，进一步将抗体序列克隆至表达载体，进而转染293细胞后纯化得到。本发明所制备的重组抗体均能高灵敏度与MTBC LAM结合，基于该单克隆抗体配对进一步研制快速检测LAM抗原的免疫层析试剂卡，能特异性地检测MTBC及部分慢生长分枝杆菌裂解产物，而与快生长分枝杆菌不发生交叉反应。将本发明研制的免疫层析试剂卡可直接用于结核病人尿液样本的定性(以胶体金试剂卡为例)或定量检测(以量子点荧光微球试纸卡为例)，具有较高的检出灵敏度，特异性极高，操作简便且耗时短，在结核病快速诊断方面具有广阔的临床应用前景。

Description

人源抗结核分枝杆菌复合群LAM单克隆抗体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及一种抗结核分枝杆菌复合群LAM的单克隆抗体及其制备和应用。

背景技术

结核病是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染所致的重大呼吸道传染病，是全球十大死因之一以及单一传染病死亡首要原因[1]。快速准确的结核病实验室诊断是有效治疗、改善预后的关键，是终止结核病的首要环节。活动性结核病检测方法众多，经典的涂片镜检法简单快速但漏检率较高，Mtb培养法检测周期过长，灵敏度亦不够理想。Genexpert Mtb/RIF通过特异性扩增Mtb基因，提高检测灵敏度，可缩短检测时间至2h左右，但由于检测费用昂贵，难以大范围推广[2]。免疫学检测技术，如TST、IGRA和Mtb抗体检测，均无法区分潜伏性结核感染和活动性疾病，因而限制了其在结核病检测中的应用[3]。Mtb抗原检测可为结核病诊断提供直接证据，且操作简便、耗时较短，在结核病快速准确诊断方面具有独特优势。

脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinmannan，LAM)是Mtb细胞壁中发现的一种重要的17.5Kda耐热糖脂，约占细菌总重量的15％[4]。依据不同的末端帽状结构，LAM可分为磷脂酰肌醇LAM(phosphatidylinositol-capped LAM，PILAM)、甘露糖LAM(mannose-cappedLAM，ManLAM)和阿拉伯糖LAM(arabinose-capped LAM，AraLAM)三种形式，在结核分枝杆菌复合群(MTBC)中主要为ManLAM[5]。作为一种免疫原性毒力因子，LAM可在结核感染期间从代谢活跃或降解的细菌细胞中释放出来，进入结核病患者体液或组织中，可通过不同方法检测到。

目前基于LAM检测结核病的研究不少，但仅Alere LAM(Alere Determine TB-LAMassay)成功上市。Alere LAM是基于胶体金的LAM检测试剂盒，由于采取多克隆抗体进行检测，故灵敏度不佳，目前仅推荐用于艾滋病患者的结核病筛查[6]。然而，新发结核病患者中同时合并艾滋病病毒感染者仅占8.2％[1]，故需继续完善LAM检测技术，使其能用于非艾滋病感染的结核病患者诊断。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。由于其特异性高、亲和力强、纯度高和便于生产，在免疫学诊断中具有独特优势。利用单克隆抗体技术生产高亲和力、高特异性抗LAM单克隆抗体，有望提高LAM检测的灵敏度。

综上所述，为满足对快速准确地提供结核病实验室诊断的需求，本发明人在长期单克隆抗体研究的基础上制备了一种抗结核分枝杆菌复合群LAM分子的单克隆抗体并完成大量实验室分析和临床诊断验证，从而完成了本发明。

发明内容

本发明提供一对人源抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，其具有重链可变区和轻链可变区；

其中，抗体A1的重链可变区和轻链可变区的互补决定区的氨基酸序列如下：

A1-CDR-H1：VDSLTGYY

A1-CDR-H2：ITHGGST

A1-CDR-H3：ASTLNWLTL

A1-CDR-L1：SGSIASNY

A1-CDR-L2:EDD

A1-CDR-L3:QSYDNGKAVV

其中，抗体A12的重链可变区和轻链可变区的互补决定区的氨基酸序列如下：

A12-CDR-H1：GYTFTGSY

A12-CDR-H2：INPNSGGT

A12-CDR-H3：ARVGYYDSSGYPFDY

A12-CDR-L1：QSISSY

A12-CDR-L2：AAS

A12-CDR-L3：QQSYSTPLT

所述抗体A1的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述抗体A1的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述抗体A12的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述抗体A12的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；

所述抗体的重链含有重链恒定区为人抗体的重链恒定区，所述抗体的轻链含有轻链恒定区为人抗体的轻链恒定区；所述抗体A1和抗体A12重链恒定区氨基酸序列一致，所述抗体A1和抗体A12轻链恒定区氨基酸序列一致；所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO.21所示；所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；

所述抗体A1的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述抗体A1的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；

所述抗体A12的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述抗体A12的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。

进一步地，本发明提供一种分离的核酸分子，该核酸分子可编码本发明的上述抗LAM单克隆抗体或抗原结合片段；

所述编码抗体A1重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述编码抗体A1轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述编码抗体A12重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述编码抗体A12轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

所述编码抗体A1重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述编码抗体A1轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；

所述编码抗体A12重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，所述编码抗体A12轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

要说明的是，基于本发明公开的氨基酸序列上，本领域技术人员容易获取编码这些抗体的核苷酸序列，无论其核酸分子序列如何变化，其只要是编码上述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，即属于本发明的保护范围。

进一步地，本发明提供一种表达载体，其包含上述本发明的核酸分子。

进一步地，本发明提供一种重组细胞，其包含上述本发明的表达载体。

进一步地，本发明提供一种制备上述本发明的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包含：培养上述本发明中的重组细胞，从培养物中分离纯化得到所述单克隆抗体或其抗原结合片段。

要说明的是，在本发明公开了上述LAM的单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列基础上，本领域技术人员容易利用本领域常规的技术，如基因工程技术获得上述抗LAM的单克隆抗体或其抗原结合片段，无论其以什么方式获得上述LAM的单克隆抗体或其抗原结合片段，均落入本发明的保护范围内。

进一步地，本发明实施例提供一种抗体偶联物，其包含上述任一项的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

要说明的是，本领域技术人员可以根据实际需求，在本发明公开的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段上偶联合适的分子，无论偶联何种物质，均落入本发明的保护范围内。

进一步地，本发明提供一种检测组合物，其包含上述本发明的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

要说明的是，本领域技术人员可以根据实际需求，将本发明公开的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段与合适的物质进行组合，无论组合何种物质，均落入本发明的保护范围内。

进一步地，本发明提供一种检测分枝杆菌的试剂或试剂盒，其包括前述本发明的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，或前述本发明的抗体偶联物，或者前述本发明的检测组合物。

发明作用与效果

本发明的研究显示，具有上述互补决定区的抗体或其抗原结合片段能高灵敏度地与LAM抗原结合，是一种检测结核分枝杆菌复合群(MTBC)的新抗体。将上述单克隆抗体进行配对，检测以LAM抗原作为靶点的MTBC时，具有较高的灵敏度和特异性；检测结核病患者尿液时具有较高灵敏度和特异性，为结核病的快速诊断提供了一种新的检测方案。

附图说明

图1是纯化LAM单克隆抗体SDS-PAGE鉴定图(M：Protein Marker；1：还原条件；2：非还原条件；A：A1抗体；B：A12抗体)。

图2是LAM单克隆抗体A1/A12滴度测定结果。

图3是A1/A12夹心法LAM定性检测胶体金试剂卡制备示意图(A：试纸条构造；B：检测结果判读示例；C：检测试剂卡实物示例)。

图4是A1/A12夹心法LAM定性检测胶体金试剂卡(TB-LAM)特异性测定结果。

图5是A1/A12夹心法LAM定性检测胶体金试剂卡(TB-LAM)灵敏度测定结果。

图6是A1/A12夹心法LAM定性检测胶体金试剂卡(TB-LAM)临床样本测定结果(A：HIV感染者测定结果；B：非HIV感染者检测结果)。

图7是A1/A12夹心法LAM定量检测量子点荧光微球试剂卡(QBs-LAM)的制备及其应用(A：检测示意图；B：定量标准曲线；C：特异性测定结果；D：临床样本测定结果)。

具体实施方式

本发明详细的实施方法见实施例，实施例中所述方法、所用试剂或仪器，若无特殊说明，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下实施例仅是为了说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。

本发明实施例提供了一对特异性结合LAM的人单克隆抗体，它们通过scFv噬菌体抗体库筛选而获得，命名为A1和A12。所述A1单克隆抗体重链可变区选自SEQ ID NO.7，轻链可变区选自SEQ ID NO.8；所述A12单克隆抗体重链可变区选自SEQ ID NO.17，轻链可变区选自SEQ ID NO.18。

本发明通过分离卡介苗接种的健康人外周血单个核细胞(PBMC)，抽提RNA构建scFv噬菌体抗体库，通过筛选和鉴定获得一对特异性结合LAM的单克隆抗体，其步骤为：

1)分离健康人外周血PBMC，构建scFv噬菌体抗体库；

2)利用纯化LAM对1)所述scFv噬菌体抗体库进行三轮筛选和富集，获得LAM特异性结合的单克隆抗体A1、A12，通过测序获得抗体序列。A1具有重链可变区氨基酸序列SEQ IDNO.7，具有轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.8；A12具有重链可变区氨基酸序列SEQ IDNO.17，具有轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.18。

3)将2)所述重链可变区核苷酸序列和轻链可变区核苷酸序列分别构建IgG重链和轻链全长序列，克隆到真核表达载体，共转染宿主细胞，获得抗LAM单克隆抗体的完整抗体A1和A12。

4)鉴定3)所述抗体完整性和纯度，测定抗体滴度。

5)将3)所述抗体配对，构建双抗夹心法LAM检测免疫层析试纸条，评价试纸条灵敏度、特异性以及临床价值。

具体实施例

以下结合附图和实施例详述本发明。

实施例一抗LAM scFv噬菌体抗体库构建和筛选

采集50个健康人外周血，分离单个核细胞(PBMC)，每5人混合为一组，经RNA抽提和逆转录获得cDNA。通过PCR分别扩增抗体轻链和重链的可变区(VH和VL)，并采用SOE-PCR方法将VH和VL拼接为融合的scFv片段。将scFv片段连接至表达载体上，通过电击转化至大肠杆菌中，获得抗体库，每组库容不低于10⁹。向抗体库中加入辅助噬菌体进行感染，回收获得噬菌体展示抗体库，每组滴度不低于10¹³Pfu/mL。根据噬菌体滴度，将每组噬菌体展示抗体库混合，获得50人份抗LAM scFv噬菌体展示抗体库。

将噬菌体抗体库和LAM共同孵育，逐轮提高筛选压力，进行3轮淘选，得到多个与LAM特异性结合的单克隆噬菌体。将噬菌体扩增培养，取上清进行ELISA检测，对阳性噬菌体进行抗体序列测定。

实施例二抗LAM单克隆抗体的氨基酸序列分析

通过scFv噬菌体抗体库筛选、确证获得2个抗LAM单克隆抗体，命名为A1和A12，通过测序获得轻链和重链可变区序列。

对于A1抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.9所示；

A1抗体重链可变区包含三个互补决定区，分别为A1-CDR-H1、A1-CDR-H2、A1-CDR-H3；A1-CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，A1-CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，A1-CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

A1抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，其编码基因序列如SEQ IDNO.10所示；

A1抗体轻链可变区包含三个互补决定区，分别为A1-CDR-L1、A1-CDR-L2、A1-CDR-L3；A1-CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，A1-CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，A1-CDR-L3氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

对于A12抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.19所示；

A12抗体重链可变区包含三个互补决定区，分别为A12-CDR-H1、A12-CDR-H2、A12-CDR-H3；A12-CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，A12-CDR-H2氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，A12-CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；

A12抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，其编码基因序列如SEQ IDNO.20所示；

A12抗体轻链可变区包含三个互补决定区，分别为A12-CDR-L1、A12-CDR-L2、A12-CDR-L3；A12-CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，A12-CDR-L2氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示，A12-CDR-L3氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；

上述A1和A12抗体轻链恒定区和重链恒定区均相同，重链恒定区氨基酸序列如SEQID NO.21所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.23所示；

轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.24所示。

通过SOE-PCR技术分别融合拼接重链可变区和恒定区全长序列以及轻链可变区和恒定区全长序列；

A1抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.27所示；A1抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.28所示；

A12抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.31所示；A12抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.32所示.

实施例三抗LAM单克隆抗体的重组表达与纯化

PCR扩增或人工合成含抗体序列A1和A12的核苷酸序列片段，将其插入表达质粒Vector-hIgG1中，分别构建IgG抗体重链和轻链表达质粒。

利用Qiagen质粒抽提试剂盒分别抽提抗体重链和轻链表达质粒，共同瞬时转染Expi293F细胞或制备其稳定转让细胞，细胞培养5-7天后取上清通过Protein G纯化，收获抗体利用透析进行纯化，利用超滤法进行浓缩，利用紫外吸收法测定抗体浓度。表达纯化的完整LAM抗体经SDS-PAGE进行鉴定，A1和A12均在还原条件(图1的1泳道)下出现约两条条带，在非还原条件下(图1的2泳道)出现一条条带，与预期相符。

实施例四LAM抗体滴度分析

采用ELISA方法分析A1、A12抗体结合LAM的滴度。实验流程如下：将LAM用10mM PBS稀释至2μg/mL，100μL/孔加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。用PBST(含0.05％Tween 20的10mM PBS)洗5次后，加入1％BSA，200μL/孔于37℃封闭1小时。PBST洗涤5次。用10mM PBS和健康人尿液将A1和A12抗体梯度稀释至如下浓度(50、25、12.5、6.25、3.12、1.56ng/mL)，100μL/孔于37℃孵育1小时。用PBST洗涤5次。加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG，100μL/孔37℃反应30分钟。用PBST洗涤5次，100μL/孔加入TMB底物，室温反应10min。加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，利用酶标仪测定OD450值。

抗体滴度分析结果(图2)：LAM抗原包被浓度为2μg/mL时，A1和A12抗体在PBS和健康人尿液中最低滴度为1.56ng/mL，说明制备的两株单克隆抗体能高灵敏度与LAM抗原结合。

实施例五双抗夹心法LAM抗原定性检测胶体金试剂卡的制备

1.金标结合物的制备：

采用柠檬酸盐包被的胶体金颗粒进行A12抗体标记。在玻璃瓶中加入胶体金溶液，使用0.2M碳酸钾溶液将胶体金溶液调至pH 8.5，加入终浓度为17.5μg/mL的A12抗体，旋转孵育1小时；加入终浓度为1％BSA溶液旋转孵育30min进行封闭。离心10min弃上清，沉淀加入1/10体积复溶缓冲液(含1％甘氨酸、0.5％精氨酸、0.5％BSA、0.1％Tween 20的pH7.4 PB缓冲液)重悬。

加入5μL金标复合物至离心管中，37℃真空干燥2h，将金标复合物固定于离心管管底。

2.双抗夹心法LAM检测胶体金试剂卡制备：

反应膜制备：使用50mM pH9.0 Tris-HCl将A1抗体稀释至3mg/mL，将山羊抗人IgG抗体稀释至0.5mg/mL，按0.74μL/cm的划膜量均匀划线于醋酸纤维素膜，分别作为检测线和质控线。将划线的醋酸纤维素膜放置于45℃烘箱干燥10h。

样品垫处理：配制样品垫处理液(含1％BSA、1％Tween 20、1％Triton X-100的50mM pH 8.0Tris-HCl)，将玻纤没入样品垫处理液中，充分浸湿，室温自然晾干；

试剂卡组装：将吸水纸和样品垫分别裁成17mm×30cm和22mm×30cm的长条。按图3A的示意图的构造在胶板上依次贴好反应膜、吸水纸及样品垫，吸水纸和样品垫分别与反应膜有2mm的重叠；将组装后的胶板裁成4mm宽的试纸条；将试纸条组装于卡槽即为双抗夹心法LAM检测胶体金试剂卡。

3.样本检测：

尿液标本于100℃加热5分钟，12000g离心3分钟，吸取90μL上清加入检测孔，膜面开始有液体流动开始计时，室温反应20min读取结果。按图3B示意图所示判断检测结果，具体为：

阳性：质控线和检测线处各出现一条红色条带，即判断为阳性，即LAM检测阳性；阴性：仅质控线处出现一条红色条带，检测线处无条带，即判断为阴性，即LAM检测阴性；无效：质控线处无红色条带出现，无论检测线是否有红色条带均判断为无效结果。

实施例六双抗夹心法LAM检测胶体金试剂卡的特异性和灵敏度测定

使用Middlebrook 7H9完全培养基于37℃培养快生长分枝杆菌、慢分枝杆菌至OD600nm为1.0。其中，慢生长分枝杆菌包括：卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌标准株H37Rv、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、次要分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、副瘰疬分枝杆菌；快生长分枝杆菌包括：龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、外来分枝杆菌、脓毒分枝杆菌、粘液分枝杆菌。收获菌液80℃灭活30min。灭活菌液12000g/min离心5min，弃上清，加入等量10mM PBS重悬，超声破碎菌体，12000g/min离心5min，收获上清即为细菌全菌体裂解液。

用健康人尿液将细菌全菌体裂解液至OD600为0.001(相当于1×10⁵CFU/mL菌)，按上述样本检测方法进行特异性检测。根据图4检测结果可知，LAM检测胶体金试剂卡检测以下慢培养分枝杆菌为阳性，分别是H37Rv、BCG、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、副瘰疬分枝杆菌；其他慢培养分枝杆菌以及所有快培养分枝杆菌检测结果均为阴性。说明基于该抗体对制备的LAM检测胶体金试剂卡具有较好的特异性。

用健康人的尿液将H37Rv和BCG的细菌全菌体裂解液分别稀释至1×10⁶、1×10⁵、3×10⁴、1×10⁴CFU/mL，用健康人的尿液将LAM稀释至44.8、11.2、2.8、0.7、0.35ng/mL，按上述样本检测方法进行灵敏度检测。根据图5检测结果可知，LAM检测胶体金试剂卡可检测3×10⁴菌液，最低能检测到0.7ng/mL LAM，说明制备的LAM检测胶体金试剂卡具有较高的灵敏度。

实施例七双抗夹心法LAM检测胶体金试剂卡检测临床样本分析

收集以下几组病例的尿液，包括：合并人艾滋病病毒(HIV)感染的结核病患者(HIV⁺TB⁺)、合并HIV感染的非结核分枝杆菌(NTM)感染患者(HIV⁺NTM⁺)、排除结核病以及NTM的HIV感染者(HIV⁺TB^-NTM^-)；以及排除HIV感染的结核病患者(HIV^-TB⁺)、排除感染的健康对照(HC)，所有结核病和NTM感染患者均在抗结核治疗前收集尿液；按上述样本检测方法进行临床样本分析。HIV感染者样本用商品化进口试剂Alere LAM(Alere Determine TB-LAMassay)同步进行测定，检测方法按说明书进行。根据图6结果可知，我们所制备的LAM检测胶体金试剂卡用于HIV感染者检测时，灵敏度和特异性均较进口试剂Alere LAM更高；当用于非HIV感染的结核患者检测时，灵敏度为33.3％(16/48)，但特异性高达95.4％(63/66)，说明该试剂卡可用于结核病人的快速诊断，特别是在欠发达地区对结核病人的筛查中具有巨大的应用潜力。

实施例八双抗夹心法LAM抗原定量检测荧光量子点试剂卡的制备及其应用

通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化量子点荧光微球QBs表面携带的羧基功能团，与A12抗体上的赖氨酸残基反应，从而将抗体固定至QBs微球表面形成荧光探针，探针上的抗体通过特异性反应识别LAM抗原表位而形成复合结构，将孵育后的样本滴加至样本垫上，通过毛细管作用在膜上移动并流经T线时与膜上固定的捕获抗体A1发生特异性结合，形成三明治夹心结构并不断富集，从而在该区带上显示出荧光信号；而未结合的探针则继续向前涌动被C线上的抗抗体捕获(图7A)。层析15min后，通过荧光读取仪读取T、C线的荧光信号(FI_T、FI_C)，使用FI_T/FI_C比率型信号对样本进行定量检测。将20个健康人阴性样本的FI_T/FI_C值加上三倍标准偏差定义为最低检测限(Cut off值)，FI_T/FI_C值大于这个值的样本则定义为阳性样本。计算得出LOD为0.05ng/mL，线性范围为0.05-12.5ng/mL(图7B)；对不同分枝杆菌全菌体裂解物的特异性检测发现，QBs-LAM荧光试剂卡对结核菌标准株H37Rv、卡介苗BCG、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌，瘰疬分枝杆菌、副瘰疬分枝杆菌等慢生长分枝杆菌的检测为阳性，对其他慢生长分枝杆菌和所有快生长分枝杆菌检测均为阴性(图7C)，结果与胶体金试纸卡完全一致(图5A)；对临床样本的检测，97份阳性结核病人尿液中通过荧光试纸条检出51份，检出率为52.5％；94份阴性尿液样本只检出3例阳性，特异性为96.8％(图7D)，提示荧光QBs-LAM定量检测较之胶体金定性检测的敏感性有显著提高，且依然保持了极高的特异性。

A1重链可变区和轻链可变区互补决定区氨基酸序列

SEQ ID NO.1：A1-CDR-H1

VDSLTGYY

SEQ ID NO.2：A1-CDR-H2

ITHGGST

SEQ ID NO.3：A1-CDR-H3

ASTLNWLTL

SEQ ID NO.4：A1-CDR-L1

SGSIASNY

SEQ ID NO.5：A1-CDR-L2

EDD

SEQ ID NO.6：A1-CDR-L3

QSYDNGKAVV

A1重链可变区和轻链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO.7：A1-VH

QVQLQQWGAGLLKPAETLSLTCAVSVDSLTGYYGTWIRQPPGKGLEWIGEITHGGSTIYNPSLKSRVTISEDMSKNQFSLTLKSVTAADTAVYYCASTLNWLTLWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.8：A1-VL

QAVLTQPHSVSESPGKTATISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDNGKAVVFGGGTQLTVL

A1重链可变区和轻链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO.9：A1-VH

CAGGTGCAGCTACAACAGTGGGGCGCAGGACTCTTGAAGCCCGCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGTTGATTCCCTCACTGGTTACTACGGGACCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGGGAAATCACTCATGGAGGAAGTACCATCTACAACCCGTCCCTCAAAAGTCGAGTCACCATTTCAGAAGACATGTCCAAGAATCAGTTCTCCCTGACACTAAAGTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTCTACTACTGTGCCAGTACGCTTAACTGGCTTACTCTTTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO.10：A1-VL

CAGGCTGTGCTGACTCAGCCACACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGCAACCATCTCCTGCACCCGCAGTAGTGGCAGCATTGCCAGCAACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGTGCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATGACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAACGGCAAGGCCGTTGTATTCGGCGGAGGGACCCAGCTGACCGTCCTC

A12重链可变区和轻链可变区互补决定区氨基酸序列

SEQ ID NO.11：A12-CDR-H1

GYTFTGSY

SEQ ID NO.12：A12-CDR-H2

INPNSGGT

SEQ ID NO.13：A12-CDR-H3

ARVGYYDSSGYPFDY

SEQ ID NO.14：A12-CDR-L1

QSISSY

SEQ ID NO.15：A12-CDR-L2

AAS

SEQ ID NO.16：A12-CDR-L3

QQSYSTPLT

A12重链可变区和轻链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO.17：A12-VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGSYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRYDDTAVYYCARVGYYDSSGYPFDYWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO.18：A12-VL

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPEDVATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK

A12重链可变区和轻链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO.19：A12-VH

CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGACTTCTGGATACACCTTCACCGGCTCCTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATATGACGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGTTGGGTACTATGATAGTAGTGGTTATCCCTTTGACTATTGGGGCCGGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO.20：A12-VL

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

重链和轻链恒定区氨基酸序列

SEQ ID NO.21：CH

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.22：CL

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC*

重链和轻链恒定区核苷酸序列

SEQ ID NO.23：CH

GCTTCCACAAAGGGCCCTAGCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGAGCACAAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGATAAGACACACACCTGCCCCCCTTGTCCCGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCATCTGTGTTCCTGTTTCCCCCTAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCAGCAGAACACCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAATTCCACATACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGCCCTGCCCGCCCCTATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCTTCCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCGTGCTGGATAGCGATGGCTCCTTTTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAG

SEQ ID NO.24：CL

AGAACCGTGGCCGCCCCTAGCGTGTTCATCTTTCCTCCTAGCGATGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGTCCGTGACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACATACAGCCTGTCCTCCACCCTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGTTGA

A1重链和轻链氨基酸序列

SEQ ID NO.25：A1 Heavy Chain

QVQLQQWGAGLLKPAETLSLTCAVSVDSLTGYYGTWIRQPPGKGLEWIGEITHGGSTIYNPSLKSRVTISEDMSKNQFSLTLKSVTAADTAVYYCASTLNWLTLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.26：A1 Light Chain

QAVLTQPHSVSESPGKTATISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDNGKAVVFGGGTQLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*

A1重链和轻链核苷酸序列

SEQ ID NO.27：A1 Heavy Chain

CAGGTGCAGCTACAACAGTGGGGCGCAGGACTCTTGAAGCCCGCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGTTGATTCCCTCACTGGTTACTACGGGACCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGGGAAATCACTCATGGAGGAAGTACCATCTACAACCCGTCCCTCAAAAGTCGAGTCACCATTTCAGAAGACATGTCCAAGAATCAGTTCTCCCTGACACTAAAGTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTCTACTACTGTGCCAGTACGCTTAACTGGCTTACTCTTTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACAAAGGGCCCTAGCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGAGCACAAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGATAAGACACACACCTGCCCCCCTTGTCCCGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCATCTGTGTTCCTGTTTCCCCCTAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCAGCAGAACACCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAATTCCACATACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGCCCTGCCCGCCCCTATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCTTCCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCGTGCTGGATAGCGATGGCTCCTTTTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAG

SEQ ID NO.28：A1 Light Chain

CAGGCTGTGCTGACTCAGCCACACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGCAACCATCTCCTGCACCCGCAGTAGTGGCAGCATTGCCAGCAACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGTGCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATGACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAACGGCAAGGCCGTTGTATTCGGCGGAGGGACCCAGCTGACCGTCCTCAGAACCGTGGCCGCCCCTAGCGTGTTCATCTTTCCTCCTAGCGATGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGTCCGTGACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACATACAGCCTGTCCTCCACCCTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGTTGA

A12重链和轻链氨基酸序列

SEQ ID NO.29：A12 Heavy Chain

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGSYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRYDDTAVYYCARVGYYDSSGYPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.30：A12 Light Chain

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPEDVATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*

A12重链和轻链核苷酸序列

SEQ ID NO.31：A12 Heavy Chain

CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGACTTCTGGATACACCTTCACCGGCTCCTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATATGACGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGTTGGGTACTATGATAGTAGTGGTTATCCCTTTGACTATTGGGGCCGGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACAAAGGGCCCTAGCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGAGCACAAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGATAAGACACACACCTGCCCCCCTTGTCCCGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCATCTGTGTTCCTGTTTCCCCCTAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCAGCAGAACACCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAATTCCACATACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGCCCTGCCCGCCCCTATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCTTCCAGAGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCGTGCTGGATAGCGATGGCTCCTTTTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAG

SEQ ID NO.32：A12 Light Chain

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAAGAACCGTGGCCGCCCCTAGCGTGTTCATCTTTCCTCCTAGCGATGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGTCCGTGACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACATACAGCCTGTCCTCCACCCTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGTTGA

序列表

<110> 迪比康（上海）生物科技有限公司

<120> 人源抗结核分枝杆菌复合群LAM单克隆抗体及其制备和应用

<141> 2021-06-30

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Val Asp Ser Leu Thr Gly Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Ile Thr His Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Ala Cys Asp Arg Leu

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 5

Glu Asp Asp

1

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 6

Gln Ser Tyr Asp Asn Gly Lys Ala Val Val

1 5 10

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ala Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Val Asp Ser Leu Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Gly Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr His Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Met Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Thr Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Thr Leu Asn Trp Leu Thr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 8

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn

85 90 95

Gly Lys Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 9

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

caggtgcagc tacaacagtg gggcgcagga ctcttgaagc ccgcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctctgttga ttccctcact ggttactacg ggacctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gatcggggaa atcactcatg gaggaagtac catctacaac 180

ccgtccctca aaagtcgagt caccatttca gaagacatgt ccaagaatca gttctccctg 240

acactaaagt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtctact actgtgccag tacgcttaac 300

tggcttactc tttggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctca 345

<210> 10

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

caggctgtgc tgactcagcc acactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggcaaccatc 60

tcctgcaccc gcagtagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120

ccgggcagtg cccccaccac tgtgatctat gaggatgacc aaagaccctc tggggtccct 180

gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240

ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataacgg caaggccgtt 300

gtattcggcg gagggaccca gctgaccgtc ctc 333

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 11

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser Tyr

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 12

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 13

Ala Arg Val Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 14

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 15

Ala Ala Ser

1

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 16

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 17

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

caggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtaaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaaga cttctggata caccttcacc ggctcctata tacactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180

gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240

atggagctga gcaggctgag atatgacgac acggccgtgt attattgtgc gagagttggg 300

tactatgata gtagtggtta tccctttgac tattggggcc gggggaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 20

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaccag tctgcaacct 240

gaagatgttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 21

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 21

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 22

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 23

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

gcttccacaa agggccctag cgtgtttcct ctggcccctt ccagcaagag cacaagcggc 60

ggcacagccg ccctgggatg tctggtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgagc 120

tggaacagcg gcgccctgac aagcggcgtg cacacattcc ctgccgtgct gcagtcctcc 180

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgccctcct ccagcctggg cacacagaca 240

tacatctgca acgtgaatca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagcct 300

aagtcctgcg ataagacaca cacctgcccc ccttgtcccg cccctgagct gctgggaggc 360

ccatctgtgt tcctgtttcc ccctaagcct aaggataccc tgatgatcag cagaacaccc 420

gaggtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaggtgaa gttcaattgg 480

tacgtggatg gcgtggaggt gcacaatgcc aagacaaagc ctagggagga gcagtacaat 540

tccacataca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtgag caataaggcc ctgcccgccc ctatcgagaa gaccatcagc 660

aaggccaagg gccagcccag ggagcctcag gtgtacacac tgcctccttc cagagacgag 720

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc ctccgacatc 780

gccgtggagt gggagtccaa tggccagcct gagaacaact acaagaccac acctcccgtg 840

ctggatagcg atggctcctt tttcctgtac agcaagctga cagtggacaa gtccaggtgg 900

cagcagggca atgtgtttag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960

cagaagagcc tgtccctgtc ccccggcaag 990

<210> 24

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

agaaccgtgg ccgcccctag cgtgttcatc tttcctccta gcgatgagca gctgaagtcc 60

ggcacagcct ccgtggtgtg cctgctgaat aacttttacc ccagggaggc caaggtgcag 120

tggaaggtgg acaatgccct gcagagcggc aacagccagg agtccgtgac agagcaggac 180

tccaaggaca gcacatacag cctgtcctcc accctgacac tgtccaaggc cgactacgag 240

aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgaca caccagggcc tgagcagccc cgtgaccaag 300

agcttcaaca ggggcgagtg ttga 324

<210> 25

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 25

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ala Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Val Asp Ser Leu Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Gly Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Thr His Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Met Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Thr Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Thr Leu Asn Trp Leu Thr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 26

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 26

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn

20 25 30

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn

85 90 95

Gly Lys Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 27

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

caggtgcagc tacaacagtg gggcgcagga ctcttgaagc ccgcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctctgttga ttccctcact ggttactacg ggacctggat ccgccagccc 120

ccagggaagg ggctggagtg gatcggggaa atcactcatg gaggaagtac catctacaac 180

ccgtccctca aaagtcgagt caccatttca gaagacatgt ccaagaatca gttctccctg 240

acactaaagt ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtctact actgtgccag tacgcttaac 300

tggcttactc tttggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcagcttc cacaaagggc 360

cctagcgtgt ttcctctggc cccttccagc aagagcacaa gcggcggcac agccgccctg 420

ggatgtctgg tgaaggacta ctttcccgag cccgtgaccg tgagctggaa cagcggcgcc 480

ctgacaagcg gcgtgcacac attccctgcc gtgctgcagt cctccggcct gtacagcctg 540

agcagcgtgg tgacagtgcc ctcctccagc ctgggcacac agacatacat ctgcaacgtg 600

aatcacaagc cttccaacac caaggtggac aagaaggtgg agcctaagtc ctgcgataag 660

acacacacct gccccccttg tcccgcccct gagctgctgg gaggcccatc tgtgttcctg 720

tttcccccta agcctaagga taccctgatg atcagcagaa cacccgaggt gacctgcgtg 780

gtggtggatg tgtcccacga ggaccctgag gtgaagttca attggtacgt ggatggcgtg 840

gaggtgcaca atgccaagac aaagcctagg gaggagcagt acaattccac atacagagtg 900

gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960

gtgagcaata aggccctgcc cgcccctatc gagaagacca tcagcaaggc caagggccag 1020

cccagggagc ctcaggtgta cacactgcct ccttccagag acgagctgac caagaaccag 1080

gtgtccctga cctgtctggt gaaaggcttc tacccctccg acatcgccgt ggagtgggag 1140

tccaatggcc agcctgagaa caactacaag accacacctc ccgtgctgga tagcgatggc 1200

tcctttttcc tgtacagcaa gctgacagtg gacaagtcca ggtggcagca gggcaatgtg 1260

tttagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc 1320

ctgtcccccg gcaag 1335

<210> 28

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

caggctgtgc tgactcagcc acactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggcaaccatc 60

tcctgcaccc gcagtagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120

ccgggcagtg cccccaccac tgtgatctat gaggatgacc aaagaccctc tggggtccct 180

gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240

ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataacgg caaggccgtt 300

gtattcggcg gagggaccca gctgaccgtc ctcagaaccg tggccgcccc tagcgtgttc 360

atctttcctc ctagcgatga gcagctgaag tccggcacag cctccgtggt gtgcctgctg 420

aataactttt accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480

ggcaacagcc aggagtccgt gacagagcag gactccaagg acagcacata cagcctgtcc 540

tccaccctga cactgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaggtg 600

acacaccagg gcctgagcag ccccgtgacc aagagcttca acaggggcga gtgttga 657

<210> 29

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Tyr Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 30

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 30

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 31

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

caggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtaaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaaga cttctggata caccttcacc ggctcctata tacactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180

gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240

atggagctga gcaggctgag atatgacgac acggccgtgt attattgtgc gagagttggg 300

tactatgata gtagtggtta tccctttgac tattggggcc gggggaccct ggtcaccgtc 360

tcctcagctt ccacaaaggg ccctagcgtg tttcctctgg ccccttccag caagagcaca 420

agcggcggca cagccgccct gggatgtctg gtgaaggact actttcccga gcccgtgacc 480

gtgagctgga acagcggcgc cctgacaagc ggcgtgcaca cattccctgc cgtgctgcag 540

tcctccggcc tgtacagcct gagcagcgtg gtgacagtgc cctcctccag cctgggcaca 600

cagacataca tctgcaacgt gaatcacaag ccttccaaca ccaaggtgga caagaaggtg 660

gagcctaagt cctgcgataa gacacacacc tgcccccctt gtcccgcccc tgagctgctg 720

ggaggcccat ctgtgttcct gtttccccct aagcctaagg ataccctgat gatcagcaga 780

acacccgagg tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga ggtgaagttc 840

aattggtacg tggatggcgt ggaggtgcac aatgccaaga caaagcctag ggaggagcag 900

tacaattcca catacagagt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 960

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaat aaggccctgc ccgcccctat cgagaagacc 1020

atcagcaagg ccaagggcca gcccagggag cctcaggtgt acacactgcc tccttccaga 1080

gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctgg tgaaaggctt ctacccctcc 1140

gacatcgccg tggagtggga gtccaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 1200

cccgtgctgg atagcgatgg ctcctttttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagtcc 1260

aggtggcagc agggcaatgt gtttagctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1320

tacacccaga agagcctgtc cctgtccccc ggcaag 1356

<210> 32

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaccag tctgcaacct 240

gaagatgttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagc tggagatcaa aagaaccgtg gccgccccta gcgtgttcat ctttcctcct 360

agcgatgagc agctgaagtc cggcacagcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttttac 420

cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagagcgg caacagccag 480

gagtccgtga cagagcagga ctccaaggac agcacataca gcctgtcctc caccctgaca 540

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac acaccagggc 600

ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gttga 645

Claims (12)

1.一对人源抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区；

其中，抗体A1的重链可变区包含三个互补决定区A1-CDR-H1、A1-CDR-H2、A1-CDR-H3，抗体A1的轻链可变区包含三个互补决定区A1-CDR-L1、A1-CDR-L2、A1-CDR-L3，

各互补决定区的氨基酸序列如下：

A1-CDR-H1：VDSLTGYY

A1-CDR-H2：ITHGGST

A1-CDR-H3：ASTLNWLTL

A1-CDR-L1：SGSIASNY

A1-CDR-L2: EDD

A1-CDR-L3: QSYDNGKAVV；

其中，抗体A12的重链可变区包含三个互补决定区A12-CDR-H1、A12-CDR-H2、A12-CDR-H3，抗体A12的轻链可变区包含三个互补决定区A12-CDR-L1、A12-CDR-L2、A12-CDR-L3，

各互补决定区的氨基酸序列如下：

A12-CDR-H1：GYTFTGSY

A12-CDR-H2：INPNSGGT

A12-CDR-H3：ARVGYYDSSGYPFDY

A12-CDR-L1：QSISSY

A12-CDR-L2：AAS

A12-CDR-L3：QQSYSTPLT。

2.根据权利要求1所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：所述抗体A1的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述抗体A1的轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；

所述抗体A12的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述抗体A12的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

3.根据权利要求2所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：所述抗体为人单克隆抗体，由两个相同的半分子组成，其中每个半分子分别由一条重链和一条轻链连接而成；所述的两个半分子的重链之间通过二硫键连接；

所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为权利要求1或2所述的重链可变区，所述轻链可变区为权利要求1或2所述的轻链可变区；

所述抗体的重链含有重链恒定区为人抗体的重链恒定区；

所述抗体的轻链含有轻链恒定区为人抗体的轻链恒定区；

所述抗体A1和抗体A12重链恒定区氨基酸序列一致，所述抗体A1和抗体A12轻链恒定区氨基酸序列一致。

4.根据权利要求3所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO.22所示。

5.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：所述抗体A1的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述抗体A1的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；所述抗体A12的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述抗体A12的轻链氨基酸序列如SEQ IDNO.30所示。

6.一种核酸分子，可用人工合成或PCR等基因工程方法分离获得，其特征在于：其编码如权利要求1-5任一项所述的抗LAM单克隆抗体或抗原结合片段。

7.一种表达载体，其特征在于：其含有权利要求6所述的核酸分子。

8.一种重组细胞，其特征在于：其含有权利要求7所述的表达载体。

9.一种制备如权利要求1-5任一项所述的抗LAM单克隆抗体的方法，其特征在于：包括培养权利要求8所述的重组细胞，从培养物中分离纯化得到所述单克隆抗体或其抗原结合片段。

10.一种抗体偶联物，其特征在于：包含权利要求1-5任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

11.一种检测组合物，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

12.一种检测分枝杆菌的试剂或试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-5任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，或者权利要求10所述的抗体偶联物，或者权利要求11所述的检测组合物。

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