CN113480585B - 一种山茱萸新苷原料药的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种山茱萸新苷原料药的制备方法，其包括步骤：将山茱萸果实粉碎获得山茱萸粉，向山茱萸粉加入提取溶剂回流提取获得提取液，过滤，减压浓缩，获得浓缩液；利用有机溶剂对所述浓缩液进行萃取，减压浓缩，获得萃取后水浓缩液；将萃取后水浓缩液依次经大孔吸附树脂柱层析和聚酰胺树脂柱层析，后利用洗脱溶剂进行梯度洗脱，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有山茱萸新苷的洗脱液，减压浓缩，得山茱萸新苷浓缩液；最后将山茱萸新苷浓缩液进行重结晶处理，随后干燥，制得山茱萸新苷。本发明工艺流程简单实用、低毒环保，且由于在各步骤中采用特定的工艺条件，从而获得了高得率、高纯度的山茱萸新苷。

Description

一种山茱萸新苷原料药的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种山茱萸新苷原料药的制备方法。

背景技术

目前，山茱萸新苷(cornuside)是山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.Et Zucc.)的干燥成熟果实中所含的一种环烯醚萜苷类化合物，其结构式如下：

【CAS】131189-57-6

【分子式及分子量】C₂₄H₃₀O₁₄；542.49

【理化性质】白色粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜，微溶于乙醚，难溶于乙酸乙酯，不溶于石油醚。比旋光度：-91(c＝1.0甲醇)；熔点：108-109℃。

山茱萸新苷(cornus i de)为环烯醚萜苷类化合物，是中药山茱萸的主要成分之一，具有降血糖、抗心律失常、抑制细胞毒性等药理活性。

CN104147079A公开了一种超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，其方法的步骤包括：开水浸泡，去果壳，干燥粉碎得粗粉，将粗粉用溶剂溶解，超声，抽滤，过膜等山茱萸环烯醚萜苷。该方法的缺陷在于：1)未分离得到纯的山茱萸新苷，获得是山茱萸环烯萜苷的粗提物，其中还包括莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷等一些量大的环烯醚萜成分；2)制备工艺对设备要求高，设备投入大，成本高；3)超声提取尚无工业级设备，无法大规模和工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山茱萸新苷原料药的制备方法，该工艺方法以富含山茱萸新苷的中药山茱萸的果实为原料，生产成本低廉，工艺流程简单，产品得率和纯度均高等特点。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种山茱萸新苷原料药的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：将山茱萸果实粉碎获得山茱萸粉，向山茱萸粉加入提取溶剂回流提取获得提取液，过滤，减压浓缩，获得浓缩液；

步骤二：利用有机溶剂对所述浓缩液进行萃取，减压浓缩，获得萃取后水浓缩液；

步骤三：将萃取后水浓缩液依次经大孔吸附树脂柱层析和聚酰胺树脂柱层析，后利用洗脱溶剂进行梯度洗脱，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有山茱萸新苷的洗脱液，减压浓缩，得山茱萸新苷浓缩液；

步骤四：利用二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇或其混合物将山茱萸新苷浓缩液进行重结晶处理，随后干燥，制得山茱萸新苷。

进一步地，步骤三中洗脱溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮或其混合物。

进一步地，步骤二中，将浓缩液用有机溶剂萃取3-5次，合并水相，减压浓缩，得萃取后水浓缩液；有机溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、或乙酸丙酯；所述有机溶剂的用量为浓缩液体积的1-3倍；萃取后水浓缩液密度为1.05-1.30。

进一步地，步骤一中，提取溶剂加入量为山茱萸粉质量的8-15倍，回流提取2-4次，每次提取时间为2-3小时，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液。

进一步地，步骤一中提取溶剂选自水、甲醇、乙醇或其混合物；提取温度为70℃至提取溶剂的沸点温度；所制得的浓缩液密度为1.00-1.30。

进一步地，步骤一中提取溶剂为水和乙醇的混合物时，乙醇浓度为0-90％。

优选地，步骤一中，提取溶剂为水和乙醇的混合物，混合后乙醇浓度范围为35-60％；优选提取溶剂的用量为山茱萸粉质量的10倍。

优选地，步骤二中，有机溶剂为乙酸乙酯。

优选地，步骤三中，大孔吸附树脂优选D101；聚酰胺树脂优选醇溶性聚酰胺树脂；

优选地，步骤三中，洗脱溶剂为水和乙醇的混合物，混合后乙醇浓度范围为30-80％；

优选地，步骤四中，重结晶用溶剂为乙酸乙酯或乙醇或二者混合物；干燥方式为减压干燥、冷冻干燥或喷雾干燥。

本发明的山茱萸新苷的生产工艺，以山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.Et Zucc.)的干燥成熟果实为原料经过溶剂提取、有机溶剂萃取、大孔吸附树脂柱层析、聚酰胺树脂柱层析、重结晶和干燥等步骤获得山茱萸新苷。

在提取时，由于本申请特定的溶剂，即如上所述的选自水、甲醇、乙醇或其混合物来提取，具有提取率高的特点；特别地，优选特定的提取溶剂(即35-65％乙醇-水的混合物)提取，因乙醇和水均为人体所能耐受的毒性较小的溶剂，35％的乙醇-水混合物即可得到富含山茱萸新苷的提取液，而当乙醇浓度增加到65％时则引入小极性杂质的概率大大增加，因此为了富集到量大且纯的山茱萸新苷，兼顾大生产的可操作性、成本与效益，故优选35-65％乙醇-水的混合物为提取溶剂。

在步骤二的萃取的时候，充分考虑了山茱萸新苷与有机溶剂的相溶性。在大孔吸附树脂柱层析前用上述特定的有机溶剂萃取是优于传统柱层析的关键环节，该步骤可除去非极性及小极性的杂质，以便简化后续的柱层析步骤。

采用大孔吸附树脂柱层析结合聚酰胺树脂柱层析的方法，有利于山茱萸新苷的逐步富集与纯化。大孔吸附树脂柱层析后初步得到含有山茱萸新苷的粗样，为进一步去除杂质，选用聚酰胺树脂柱进一步富集纯化山茱萸新苷。此处考虑到山茱萸新苷的极性统一采用乙醇水溶液作为梯度洗脱溶剂，此步骤既降低了生产成本又减少了环境污染。

萃取后为进一步纯化除杂，采用重结晶的方法，通过前期实验筛选出山茱萸新苷在乙酸乙酯、乙醇或其混合物中易于重结晶且晶型较好，同样考虑到乙酸乙酯和乙醇在大生产中应用较多、毒性较小，故优选这二者。

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

本发明的方法采用了工业化常用的溶剂提取、有机溶剂萃取、色谱分离、重结晶和干燥等步骤，工艺流程简单实用、低毒环保，且由于在各步骤中采用特定的工艺条件，从而获得了高得率、高纯度的山茱萸新苷，因此产生了更适于工业化生产的效果，山茱萸新苷的得率高达0.11％，纯度高达99.0％，可直接作为原料药。

附图说明

附图1：山茱萸新苷原料药的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的解释说明。

实施例一

(1)将山茱萸果实粉碎成粉，加浓度50％乙醇进行回流提取若干次(例如2-4次，每次2-4h)，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，获得浓缩液；

(2)将上述浓缩液加水分散后，用乙酸乙酯萃取若干次(例如2-4次)，合并水相，减压浓缩，得萃取后水浓缩液；

(3)将萃取后水浓缩液缓慢上样于D101大孔吸附树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:5)，先用35％乙醇洗脱6BV，弃去；再以55％乙醇洗脱5BV，洗脱液以三分之一或四分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有山茱萸新苷的洗脱液，减压浓缩得浓缩液(相对密度为1.15)；将浓缩液上于60-100目醇溶性聚酰胺树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:8)，先用30％乙醇洗脱4BV，弃去；再以50％乙醇洗脱5BV，洗脱液以二分之一或三分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有山茱萸新苷的洗脱液，减压浓缩至至无醇味，得山茱萸新苷浓缩液；

附图1为山茱萸新苷原料药的高效液相色谱图，测定方法为：检测系统：Agi l entTechno l ogies 1260I nfi nityⅡ型HPLC仪；色谱柱：Sonoma C18(2)(250×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇/水(50:50-95:5,V/V，50mi n)；进样量：20μL；流速：1.0mL/mi n；检测波长：280nm；柱温：25℃。

(4)将山茱萸新苷浓缩液用适量乙酸乙酯-乙醇(3:7)溶解，静置待其析晶，用适量乙醇洗去晶体表面杂质，重结晶若干次(例如2-4次)后山茱萸新苷的纯度99.5％，再经过减压干燥得山茱萸新苷原料药约0.55g，得率为0.11％。

本发明的一种山茱萸新苷的制备方法已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

实施例二

(1)将山茱萸果实粉碎成粉，加浓度40％乙醇进行回流提取若干次(例如2-4次，每次2-4h)，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，获得浓缩液；

(2)将上述浓缩液加水分散后，用乙酸乙酯萃取若干次(例如2-4次)，合并水相，减压浓缩，得萃取后水浓缩液；

(3)将萃取后水浓缩液缓慢上样于AB-8大孔吸附树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:5)，先用35％乙醇洗脱6BV，弃去；再以55％乙醇洗脱5BV，洗脱液以三分之一或四分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有山茱萸新苷的洗脱液，减压浓缩得浓缩液(密度为1.10)；将浓缩液上于60-100目醇溶性聚酰胺树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:8)，先用30％乙醇洗脱4BV，弃去；再以50％乙醇洗脱5BV，洗脱液以二分之一或三分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有山茱萸新苷的洗脱液，减压浓缩至至无醇味，得山茱萸新苷浓缩液；

(4)将山茱萸新苷浓缩液用适量乙酸乙酯-乙醇(4:6)溶解，静置待其析晶，用适量乙醇洗去晶体表面杂质，重结晶若干次(例如2-4次)后山茱萸新苷的纯度99.2％，再经过冷冻干燥得山茱萸新苷原料药约0.50g，得率为0.10％。

实施例三

(1)将山茱萸果实粉碎成粗粉，加60％乙醇进行回流提取若干次(例如2-4次，每次3h)，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，得浓缩液；

(2)将上述浓缩液加水分散后，用乙酸乙酯萃取若干次(例如2-4次)，合并水相，减压浓缩，得萃取后水浓缩液；

(3)将萃取后水浓缩液缓慢上样于HP-20大孔吸附树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:5)，先用35％乙醇洗脱6BV，弃去；再以55％乙醇洗脱5BV，洗脱液以三分之一或四分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有山茱萸新苷的洗脱液，减压浓缩得浓缩液(相对密度为1.13)；将浓缩液上于60-100目醇溶性聚酰胺树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:8)，先用30％乙醇洗脱4BV，弃去；再以50％乙醇洗脱5BV，洗脱液以二分之一或三分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有山茱萸新苷的洗脱液，减压浓缩至至无醇味，得山茱萸新苷浓缩液；

(4)将山茱萸新苷浓缩液用适量乙酸乙酯-乙醇(2:8)溶解，静置待其析晶，用适量乙醇洗去晶体表面杂质，重结晶若干次(例如2-4次)后山茱萸新苷的纯度99.0％，再经过喷雾干燥得山茱萸新苷原料药约0.45g，得率为0.09％。

此外，为了进一步对比本发明选择特定的制备方法的效果，因实施例一山茱萸新苷得率高达0.11％，纯度高达99.5％，特设置如下对比例来与本申请实施例一进行对比，具体结果也见下表1。其中，所有实施例和对比例中山茱萸粉的用量相同。

对比例1：除大孔吸附树脂柱前不采用有机溶剂萃取外，其余同实施例一。该对比例表明大孔吸附树脂柱前不采用有机溶剂萃取最终获得的山茱萸新苷纯度仅为80.3％，效果不如本发明制备的山茱萸新苷原料药纯度。

对比例2：除不采用大孔吸附树脂柱来进行层析外，其余同实施例一；该对比例表明不采用大孔吸附树脂柱层析最终获得的山茱萸新苷的纯度仅为82.7％，效果不如本发明制备的山茱萸新苷原料药纯度。

对比例3：除不采用聚酰胺树脂柱来进行层析外，其余同实施例一；该对比例表明不采用聚酰胺树脂柱层析最终获得的山茱萸新苷的纯度仅为84.5％，效果不如本发明制备的山茱萸新苷原料药纯度。

对比例4：除不采用乙醇水对大孔吸附树脂柱和聚酰胺树脂柱进行洗脱外，其余同实施例一；该对比例表明不采用乙醇水对大孔吸附树脂柱和聚酰胺树脂柱进行洗脱会使最终获得的山茱萸新苷的纯度仅为89.5％，效果不如本发明制备的山茱萸新苷原料药纯度。

对比例5：除不采用重结晶外，其余同实施例一；该对比例表明不采用重结晶最终获得的山茱萸新苷的纯度仅为91.8％，效果不如本发明制备的山茱萸新苷原料药纯度。

对比例6：除步骤一的提取溶剂为水外，其余同实施例一；该对比例表明不采用优选的提取溶剂提取最终获得的山茱萸新苷的得率仅为0.07％，效果差于本申请的效果；

对比例7：除步骤一的提取溶剂为20％的乙醇外，其余同实施例一；该对比例表明采用低于优选提取溶剂比例范围的溶剂提取最终获得的山茱萸新苷的得率仅为0.06％，效果差于本申请的效果。

对比例8：除步骤二的萃取有机溶剂为正丁醇外，其余同实施例二；该对比例表明不采用乙酸乙酯萃取最终获得的山茱萸新苷的得率仅为0.05％，效果差于本申请的效果。

对比例9：除步骤三的萃取有机溶剂为二氯甲烷外，其余同实施例三；该对比例表明不采用乙酸乙酯萃取最终获得的山茱萸新苷的得率仅为0.06％，效果差于本申请的效果。

对比例10：除大孔吸附树脂柱为DA201外，其余同实施例一；该对比例表明不采用优选的大孔吸附树脂进行柱层析最终获得的山茱萸新苷的得率仅为0.04％，纯度仅为95.0％，效果差于本申请的效果。

表1对比实验结果表

从表1中可以看出，本发明申请工艺流程简单，样品损耗少，对环境污染小，节约溶剂和时间，山茱萸新苷原料药得率、纯度均高，更适合工业化生产；此外，与对比例1-10相比，本发明特定选择溶剂提取-有机溶剂萃取-大孔吸附树脂-聚酰胺树脂-重结晶等分离步骤，以及对制备过程中的工艺条件进行特定的选择等，这些对最终产物的得率和纯度有重要的影响。其中实施例一的效果最佳。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.一种山茱萸新苷原料药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：将山茱萸果实粉碎获得山茱萸粉，向山茱萸粉加入提取溶剂回流提取获得提取液，提取溶剂加入量为山茱萸粉质量的8-15倍，回流提取2-4次，每次提取时间为2-3小时，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液；

提取溶剂为水和乙醇的混合物，混合后乙醇浓度范围为35-60%；

提取温度为70°C至提取溶剂的沸点温度；所制得的浓缩液密度为1.00-1.30；

步骤二：将浓缩液用有机溶剂萃取3-5次，合并水相，减压浓缩，得萃取后水浓缩液；有机溶剂为乙酸乙酯；所述有机溶剂的用量为浓缩液体积的1-3倍；萃取后水浓缩液密度为1.05-1.30；

步骤三：将萃取后水浓缩液依次经大孔吸附树脂柱层析和聚酰胺树脂柱层析，后利用洗脱溶剂进行梯度洗脱，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有山茱萸新苷的洗脱液，减压浓缩，得山茱萸新苷浓缩液；其中，大孔吸附树脂为D101；聚酰胺树脂为醇溶性聚酰胺树脂；洗脱溶剂为水和乙醇的混合物，混合后乙醇浓度范围为30-80%;

步骤四：将山茱萸新苷浓缩液进行重结晶处理，重结晶用溶剂为乙酸乙酯和乙醇的混合物，随后干燥，制得山茱萸新苷。