CN110437289B - 一种四没食子酰葡萄糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种四没食子酰葡萄糖的制备方法，该方法以毛叶茶为原料进行提取，毛叶茶提取物经大孔吸附树脂纯化后，采用高速逆流色谱法分离得到四没食子酰基葡萄糖。本发明所述制备方具有法简便，重现性好，四没食子酰基葡萄糖的纯度高，收率高的优点，可用于化合物大量制备，并为进一步活性研究奠定了物质基础。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物活性成分的分离纯化技术领域，具体为一种四没食子酰葡萄糖苷的制备方法。
背景技术
没食子酰葡萄糖是一种多酚化合物，广泛存在于多种药材中。现研究较多的是1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖具有抗氧化活性，通过激活胰岛素介导的葡萄糖转导信号途径，起到预防糖尿病和保护肝脏的功能；也能与人体内毒素结合，起到抗内毒素作用。除此之外，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖有抗病毒的功能，如抑制水痘-带状疱疹病毒复制；乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人体免疫机能丧失病毒(HIV)和单纯疱疹病毒(HSV)。
茶是我国传统的重要经济作物，其保健功效为世人所知。毛叶茶(Camelliaptilophylla Chang)是广东特有的茶树资源，因不含咖啡碱而闻名于世。但由于毛叶茶加工茶类适口性差的问题，使得毛叶茶虽然被人所知，开发利用却较为落后。近年来，很多研究表明，没食子酰葡萄糖具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化活性等多种生物活性。申请人发现毛叶茶中含有较高的四没食子酰葡萄糖，对毛叶茶的开发利用具有重要意义。鉴于文献对于没食子酰葡萄糖抗氧化和抗病毒功效的相关研究，建立该茶中的没食子酰葡萄糖的纯化方法并鉴定其结构对毛叶茶的进一步开发利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种毛叶茶四没食子酰葡萄糖的制备方法，通过该方法，可以大量制备得到高纯度的四没食子酰葡萄糖。
一种四没食子酰葡萄糖的制备方法，包括以下步骤，
A.毛叶茶提取液的制备
取毛叶茶，粉碎过筛，加入蒸馏水超声提取和过滤，1-3次收集滤液，调节pH值3±0.1，以3-4BV/h的流速通过层析柱进行吸附，吸附结束后静置30min-60min(目标组分被紧密吸附在色谱柱上，避免被水洗去)；先用3-4BV的水以4-6BV/h的流速淋洗，然后用4-6BV质量浓度为30～70％％的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱至洗脱液无色，收集乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得毛叶茶提取物；
B.高速逆流色谱法分离：
按体积比(4±0.1)：(1±0.1)：(1±0.1)：(1.5±0.1)：(1±0.1)：(1±0.1)用量取0.2％三氟乙酸水溶液、正丁醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙腈和正已烷，作为两相溶剂体系，充分混合后静置过夜，两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相；在流速1.6～2.0mL/min、检测波长280nm条件下，将上述制得的毛叶茶提取物进行高速逆流色谱(HSCCC)分离，根据峰形收集119～130min流出液，将收集的流出液浓缩后干燥，得化合物四没食子酰基葡萄糖。
在其中一个实施例中，所述提取温度为50℃～60℃。
在其中一个实施例中，所述蒸馏水的用量为毛叶茶的9～11倍，更优选为10倍。
在其中一个实施例中，提取2次，每次25min～60min，更优选为30min～40min。
在其中一个实施例中，用盐酸调节pH值为3。
在其中一个实施例中，通过装有极性或弱极性大孔吸附树脂的层析柱以3-4BV/h流速进行吸附，优选AB-8大孔吸附树脂。
在其中一个实施例中，高速逆流色谱(HSCCC)分离时的主机转速850±50rpm，分离温度20±1℃。
在其中一个实施例中，乙醇的浓度为50±5％，优选50％。
在其中一个实施例中，粉碎后过10目-30目筛。
在其中一个实施例中，所述毛叶茶为南昆山毛叶茶。
在其中一个实施例中，0.2％三氟乙酸水溶液，正丁醇，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，乙腈，正已烷的体积比为：4:1:1:1.5:1:1。
在其中一个实施例中，流速1.95～2.0mL/min，和/或上样量为300±50mg的毛叶茶提取物。
通过以上的工艺参数的选择和优化，可以高效地得到有效的提取物。
本发明所述四没食子酰葡萄糖的制备方法，以毛叶茶为原料进行提取，毛叶茶提取物经大孔吸附树脂纯化后，采用优化后的高速逆流色谱法分离得到四没食子酰基葡萄糖。本发明所述制备方法具有简便，重现性好，四没食子酰基葡萄糖的纯度高，收率高的优点，可用于化合物大量制备，并为进一步活性研究奠定了物质基础。
附图说明
图1为毛叶茶原料提取物HPLC色谱图。
图2为实施例1中体系4的HSCCC分离色谱图。
图3为实施例1中体系4分离化合物的HPLC纯度检测图。
图4为实施例2中体系2的HSCCC分离图。
图5为实施例2中体系2分离物HPLC图。
图6实施例3中体系5的HSCCC分离图。
图7实施例3中体系5的分离物HPLC图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1毛叶茶中四没食子酸葡萄糖的制备
1、高速逆流(HSCCC)上样原料(毛叶茶提取物)的制备
取粉碎过10目筛的毛叶茶粉末200g，用为毛叶茶粉末10倍重量的蒸馏水在50～60℃下提取2次，第一次60min，后一次30min，收集提取液，合并，用盐酸调节pH值3，通过装有800mlAB-8大孔吸附树脂的层析柱以4BV/h的流速进行吸附，吸附后静置30min，先用1800ml水以6BV/h的流速淋洗，然后用50％质量浓度的乙醇水溶液洗脱1800ml，流速4BV/h，收集洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得毛叶茶提取物，作为高速逆流的上样原料。
2、HPLC检测方法
高效液相色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×250mm)，流动相A为0.2％的磷酸水溶液，B为乙腈。洗脱梯度为：0→25min:B 5％→72％；25→30min:B 28％→32％，流速为1.0mL/min，DAD检测器，进样量为20μL，柱温：28℃。
取少量的上述制备的毛叶茶提取物用水溶解，过膜进样，HPLC谱图见图1，由图1可见，毛叶茶提取物中含有多个化学成分，保留时间为23.4min的化合物为目标组分。
3、高速逆流色谱(HSCCC)分离
3.1 溶剂系统的选择
通过对多个体系进行筛选，将该体系中不同溶剂按下表1中的比例配制，震摇后静置分层。移取3mL下相溶剂，加入少量上述制备的毛叶茶提取物样品中，用HPLC测定样品在下相溶剂中各目标峰的面积(S萃前)。再取等体积上相进行萃取，测定萃后下相中目标峰面积(S萃后)，按下式(1)计算出各组分的分配系数K。根据K值选择适合的溶剂体系作为HSCCC的固定相与流动相。
式(1)：K＝(S萃前-S萃后)/S萃前
体系1为中等溶剂体系，由于目标组分的水溶性强，在该体系中的分配系数(K)值太小。
体系2是在体系1的基础上加入酸，并改变体系的配比，发现目标组分的K值较为合适，但经上机操作后结果显示，目标组分纯度很低，很多亲水性低含量杂质与目标组分一起流出，完全达不到分离效果。
体系3为亲水性强的成分分离常用体系，但对目标组分的K值又太大；因此，实验将体系1、2组成相结合，并通过调整溶剂的配比，发现体系4、5的K值较好，即以0.2％三氟乙酸水溶液、正丁醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙腈、正已烷作为溶剂体系，上样操作获得较满意的分离效果，优选体系为体系4，即体积百分比0.2％的三氟乙酸水溶液:正丁醇:乙酸乙酯:甲基叔丁基醚:乙腈:正已烷＝4:1:1:1.5:1:1(V/V)。
表1溶剂体系K值筛选表
3.2 HSCCC操作条件
高速逆流色谱柱：TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)：配置有聚四氟乙烯柱，内径1.6mm，柱容积280mL，转速0-1000r/min，TBP-50A泵，TBD-2000UV检测器，LX-300恒温器。
按上述体系4配置溶剂体系，充分混合，静置过夜，两相分离后超声脱气30min。两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相；下相流速2.0mL/min、主机转速850rpm，柱温箱20℃，波长280nm，在该条件下固定相的保留率62％(保留率越高，即上相在仪器管道中的体积就越大，有利于萃取分离)，上样量为300mg，HSCCC分离图谱见图2，收集119～130min的流出液，55℃旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得3.17mg目标化合物。
根据HPLC(分析条件同上)在254nm下的色谱图，见图3，采用峰面积归一法计算目标化合物纯度，目标化合物纯度为92.3％。
采用质谱和核磁共振鉴定分离实施例1所述化合物的结构。
化合物：棕色粉末，ESI-MS m/z:787.1012[M－H]–，分量式为C34H28O22；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:6.99(2H,s,H-2””,6””),6.97(2H,s,H-2”’,6”’),6.95(2H,s,H-2’,6’),6.92(2H,s,H-2”,6”),6.10(1H,d,J＝8.5Hz,H-1),5.89(H,m,H-3),5.20(1H,dd,J＝8.5Hz,7.5Hz,H-2),4.27(2H,m,H-6),4.16(H,m,H-5),3.88(1H,s,H-4)；
13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):δ62.3(C-6),66.22(C-4),70.58C-2),71.65(C-5),72.87(C-3),92.43(C-1),119.38(C-1’),109.48(C-2’,6’),146.10(C-3’,5’),139.94(C-4’),164.97(C-7’),165.33(C-7”),166.00(C-7”’),109.36(C-2”,6”),109.23(C-2”’,6”’),109.23(C-2””,6””),118.03(C-1”),119.31(C-1”’),119.49(C-1””),139.24(C-4”),139.14(C-4””),143.02(C-3”,5”),145.98(C-3”’,5”’),145.95(C-3””,5””)。
根据1H和13C NMR数据和目前公开的资料(例如：肖世基,郭大乐,何达海,等.猕猴桃藤山柳化学成分研究[J].中草药,2016,(03):383-387；舒希凯，芍药花抗氧化活性成分的分离和鉴定[M]，山东师范大学)，确定化合物为：1,2,3,6--四-O-没食子酰基-葡萄糖，其化学结构式如下。
实施例2体系2的分离及分离效果
按上述体系2配置溶剂体系，充分混合，静置过夜，两相分离后超声脱气30min。下相流速2.0mL/min、主机转速850rpm，柱温箱20℃，波长280nm，在该条件下固定相的保留率为51％，上样量300mg，HSCCC分离图谱见图4，收集195～210min的流出液，HPLC检测结果见图5，结果表明，在该段流出液中将原料中低含量的两个组分也富集并与目标组分完全不能分离。
实施例3体系5的分离及分离效果
按上述体系5配置溶剂体系，充分混合，静置过夜，两相分离后超声脱气30min。两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相；下相流速2.0mL/min、主机转速850rpm，柱温箱20℃，波长280nm，在该条件下固定相的保留率53％，上样量300mg，HSCCC分离图谱见图6，收集141～147min的流出液，55℃旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得约1.8mg目标化合物。HPLC(分析条件同上)在254nm下的色谱图，见图7，采用峰面积归一法计算化合物纯度，化合物纯度为90.6％。结果表明，该方法的固定相保留率、目标化合物得率和纯度均低于体系4的配比。
本文中所举例说明的发明可适当地在不存在本文中未具体公开的任何要素、限制的情况下实施。因此，例如术语“包含/包括”等应理解为开放式的且没有限制。另外，本文中采用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且并非旨在使用排除所示出且描述的特征或其部分的任何等同特征的此类术语和表达，但是应认识到，在本发明所要求保护的范围可进行多种修改。因此，应理解，尽管已通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可采用本文中公开的其中体现发明的修改方案和变化方案，并且这样的修改方案和变化方案被认为在本发明的范围之内。
已在本文中对本发明进行了广泛且一般性的描述。落入一般性公开内容内的较窄类别和亚属分组各自也形成本发明的一部分。这包括具有从该属中除去任何主题的条件或负面限制的本发明的一般性描述，不管所删除内容是否在本文中具体详述。
Claims (12)
1.一种四没食子酰葡萄糖的制备方法，包括以下步骤，
A.毛叶茶提取液的制备：
取毛叶茶，粉碎过筛，加入蒸馏水超声提取和过滤1-3次，收集滤液，调节pH值3.0±0.1，以3-4BV/h流速通过层析柱进行吸附，吸附后静置30min-60min，先用3-4BV的水以4-6BV/h的流速淋洗，然后用4-6BV质量浓度为50±5％的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱至洗脱液无色，收集乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得毛叶茶提取物；
B.高速逆流色谱法分离：
按体积比(4±0.1):(1±0.1):(1±0.1):(1.5±0.1):(1±0.1):(1±0.1)用量取0.2％三氟乙酸水溶液、正丁醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙腈和正已烷，作为两相溶剂体系，充分混合后静置过夜；
两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相，在流速1.6～2.0mL/min、检测波长280nm条件下，将上述制得的毛叶茶提取物进行高速逆流色谱分离，根据峰形收集119～130min流出液，将收集的流出液浓缩后干燥，得四没食子酰基葡萄糖，所述四没食子酰基葡萄糖为1,2,3,6--四-O-没食子酰基-葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述蒸馏水的用量为毛叶茶的9-11倍。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述蒸馏水的用量为毛叶茶的10倍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述提取温度为50℃～60℃；和/或提取2次，每次25min～60min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，提取2次，每次为30min～40min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，用盐酸调节pH值为3。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，通过装有AB-8大孔吸附树脂的层析柱以3-4BV/h流速进行吸附；和或高速逆流色谱分离时，主机转速850±50rpm，分离温度25±5℃。
8.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征是，所述乙醇水溶液的浓度为50％。
9.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征是，粉碎后过10目-30目筛。
10.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征是，所述毛叶茶为南昆山毛叶茶。
11.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征是，所述0.2％三氟乙酸水溶液、正丁醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙腈、正已烷的体积比为：4:1:1:1.5:1:1。
12.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征是，上样量为300±50mg的毛叶茶提取物。
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