CN113396974B

CN113396974B - 一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途在2型糖尿病中的应用

Info

Publication number: CN113396974B
Application number: CN202110740144.0A
Authority: CN
Inventors: 王晓花; 刘振民; 游春苹; 乔祯逸; 韩瑨; 吴正钧
Original assignee: Bright Dairy and Food Co Ltd
Current assignee: Bright Dairy and Food Co Ltd
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113396974A

Abstract

本发明涉及发酵乳制品领域，特别是涉及一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途在2型糖尿病中的应用。本发明提供一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途，所述副干酪乳杆菌的保藏号为CGMCCNo.20045，所述发酵乳制品为用于改善2型糖尿病的保健食品。本发明提供了副干酪乳杆菌CGMCCNO.20045、并进一步提供了通过其制备的发酵乳制品，所提供的发酵乳制品对肠屏障受损引发的2型糖尿病有积极的调控和缓解作用，并具有一定的降糖效果，且可增强对胰岛素的敏感性，缓解胰岛素抵抗，具有良好的产业化前景。

Description

一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途在2型糖尿病中的应用

技术领域

本发明涉及发酵乳制品领域，特别是涉及一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途在2型糖尿病中的应用。

背景技术

近年来，随着中国经济的飞速发展，人们的生活条件发生了极大的改善，尤其是饮食方面，更是越来越欧美化，如炸鸡、可乐等高热量高脂肪的食物在我们的生活中随处可见。然而，消费者们并不知道，这些食物除了给他们带来美味的体验外，长期、过度食用此类食物还可能伴有各种潜在的危害。高脂饮食通过降低编码肠紧密连接相关蛋白(如Claudin-1和occludin)的基因表达使肠道通透性增高，从而导致肠屏障的完整性遭到破坏，继而激活机体的非特异性免疫引起慢性轻度炎症，最终导致胰岛素抵抗并促进2型糖尿病的发生。

对于肠屏障受损引发的2型糖尿病，单纯依靠常规的2型糖尿病药物(如磺酰脲类、双胍类药物和葡萄糖苷酶抑制剂等)来防治是无法根除病灶的，其复发的概率极高，此外，这些药物对患者有不同程度的副作用，轻则引发胃肠道不适，重则伤及肝、肾等脏器。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌发酵乳(粉)及其制备方法与在改善肠屏障受损中的应用，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途，所述副干酪乳杆菌的保藏号为CGMCC No.20045，所述发酵乳制品为用于改善2型糖尿病的保健食品。

在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品为用于改善肠屏障受损相关的2型糖尿病的保健食品。

在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品选自发酵乳、乳粉中的一种或多种的组合。

在本发明一些实施方式中，所述发酵乳中的副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的活菌数＞8×10⁸CFU/mL；

和/或，所述发酵乳粉中的副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的活菌数＞8×10⁹CFU/g。

在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品的制备方法包括：

将接种有副干酪乳杆菌CGMCC No.20045的脱脂乳进行发酵处理。

在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品的制备方法还包括：

将发酵所得发酵产物进行干燥处理。

在本发明一些实施方式中，所述发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量为1×10⁷～5×10⁷CFU/mL，优选为2×10⁷～4×10⁷CFU/mL，更优选为2.8×10⁷CFU/mL～3.2×10⁷CFU/mL。

在本发明一些实施方式中，所述发酵处理中，脱脂乳为脱脂乳粉的水溶液，按质量百分比计，所述脱脂乳粉的水溶液中，脱脂乳粉所占的质量百分比为3％～12％。

在本发明一些实施方式中，所述发酵处理中，发酵温度为26℃～42℃，优选为30℃～40℃，更优选为36℃～38℃，发酵时间为6h～18h，优选为9～15h，更优选为11～13h。

在本发明一些实施方式中，所述发酵处理为厌氧发酵处理。

附图说明

图1显示为本发明实施例7中葡萄糖耐受实验的结果示意图。

图2显示为本发明实施例7中空腹血糖水平实验的结果示意图。

图3显示为本发明实施例7中血清胰岛素水平实验的结果示意图。

图4显示为本发明实施例7中胰岛素抵抗指数实验的结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

本发明第一方面提供一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途，所述副干酪乳杆菌的保藏号为CGMCC No.20045，所述发酵乳制品为用于改善2型糖尿病的保健食品。上述副干酪乳杆菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.20045。本申请发明人经过大量筛选研究，发现通过副干酪乳杆菌CGMCCNo.20045制备的乳制品，对肠屏障受损相关的2型糖尿病有积极的调控和缓解作用，并具有一定的降糖效果，且可增强对胰岛素的敏感性，缓解胰岛素抵抗，从而提供了副干酪乳杆菌CGMCC No.20045在制备保健食品的用途。

上述用途中，如上所述，上述副干酪乳杆菌CGMCC No.20045可以被用于制备发酵乳制品，这些发酵乳制品可以为用于改善2型糖尿病的保健食品，尤其可以是用于改善肠屏障受损相关的2型糖尿病(例如，可以是具有一定的降糖效果、且可增强对胰岛素的敏感性、缓解胰岛素抵抗等)的保健食品。这些发酵乳制品通常可以是发酵乳、乳粉等。

上述用途中，如上所述，发酵乳制品可以是发酵乳、发酵乳粉等。发酵乳制品中，通常需要具有一定量的活菌数。例如，在发酵乳中的副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的活菌数＞8×10⁸CFU/mL。再例如，在发酵乳粉中的副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的活菌数＞8×10⁹CFU/g。

上述用途中，发酵乳制品的制备方法可以包括：将接种有副干酪乳杆菌CGMCCNo.20045的脱脂乳进行发酵处理。本领域技术人员可选择合适的方法将接种有副干酪乳杆菌CGMCC No.20045的脱脂乳进行发酵处理。

上述用途中，发酵乳制品的制备方法还可以包括：将发酵所得发酵产物进行干燥处理。发酵获得打得发酵产物或发酵乳制品通常可以是发酵乳，进一步进行干燥以后，即可提供发酵乳粉。合适的对发酵产物进行干燥的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是冻干等。

上述用途中，发酵制备过程中的工艺参数会对发酵产物产生微妙的作用，合适的制备工艺可以使得制备获得的产品具有更佳的效果。例如，发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量可以为1×10⁷～5×10⁷CFU/mL、1×10⁷～1.5×10⁷CFU/mL、1.5×10⁷～2×10⁷CFU/mL、2×10⁷～2.5×10⁷CFU/mL、2.5×10⁷～2.8×10⁷CFU/mL、2.8×10⁷～3×10⁷CFU/mL、3×10⁷～3.2×10⁷CFU/mL、3.2×10⁷～3.5×10⁷CFU/mL、3.5×10⁷～4×10⁷CFU/mL、4×10⁷～4.5×10⁷CFU/mL、或4.5×10⁷～5×10⁷CFU/mL，优选为2×10⁷～4×10⁷CFU/mL，更优选为2.8×10⁷CFU/mL～3.2×10⁷CFU/mL；再例如，发酵处理中，脱脂乳为脱脂乳粉的水溶液，按质量百分比计，所述脱脂乳粉的水溶液中，脱脂乳粉所占的质量百分比可以为3％～12％、3％～4％、4％～5％、5％～6％、6％～7％、7％～8％、8％～9％、9％～10％、10％～11％、或11％～12％；再例如，发酵处理中，发酵温度可以为26℃～42℃、26℃～28℃、28℃～30℃、30℃～32℃、32℃～34℃、34℃～36℃、36℃～37℃、37℃～38℃、38℃～40℃、或40℃～42℃，优选为30℃～40℃，更优选为36℃～38℃，发酵时间可以为6h～18h、6h～7h、7h～8h、8h～9h、9h～10h、10h～11h、11h～12h、12h～13h、13h～14h、14h～15h、15h～16h、16h～17h、或17h～18h，优选为9～15h，更优选为11～13h；再例如，发酵处理可以为厌氧发酵处理。由本发明所提供的相关实施例可知，在优选发酵参数的范围之外时，副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045在脱脂乳中的增殖效果明显下降，而在优选范围之内时，接种量、脱脂乳浓度、发酵温度和时间相互影响，使得副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045发酵乳(粉)中活菌数量更高，从而使代谢产生的可协助改善高脂饮食引发的肠屏障受损的物质的合成量大幅增加。例如，在接种量过少时，菌种繁殖速度慢，使得最终获得的发酵乳(粉)中活菌数量低于优选的接种量范围。

本发明提供了副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045、并进一步提供了通过其制备的发酵乳制品，所提供的发酵乳制品对肠屏障受损引发的2型糖尿病有积极的调控和缓解作用，并具有一定的降糖效果，且可增强对胰岛素的敏感性，缓解胰岛素抵抗，具有良好的产业化前景。

下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 andperiodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：

副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045：将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.，美国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mLMRS液体培养基(购买自Merck Co.，美国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基(购买自Merck Co.，美国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为1×10⁹CFU/mL。

(b)脱脂乳的制备：

将质量百分比为8％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需脱脂乳。

2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备

将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量3％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)无菌接种于8％(w/w，质量百分比，下同)脱脂乳，37℃厌氧培养12h得发酵乳a，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉A。

实施例2

1、材料与方法：

(a)种子(发酵菌种)的制备：

同实施例1。

(b)脱脂乳的制备：

将质量百分比为12％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得脱脂乳。

2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备

将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量1％(v/v)无菌接种于12％(w/w)脱脂乳，42℃厌氧培养18h得发酵乳b，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉B。

实施例3

1、材料与方法：

(a)种子(发酵菌种)的制备：

同实施例1。

(b)脱脂乳的制备：

将质量百分比为3％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得脱脂乳。

2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备：

将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量5％(v/v)无菌接种于3％(w/w)脱脂乳，26℃厌氧培养6h得发酵乳c，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉C。

实施例4

1、材料与方法：

(a)种子(发酵菌种)的制备：

同实施例1。

(b)脱脂乳的制备：

将质量百分比为10％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得脱脂乳。

2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备

将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量4％(v/v)无菌接种于含10％(w/w)脱脂乳，40℃厌氧培养15h得发酵乳d，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉D。

实施例5

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：

同实施例1。

(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为5％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在115℃下灭菌12min，冷却至室温，即得脱脂乳。

2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备：

将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量2％(v/v)无菌接种于5％(w/w)脱脂乳，30℃厌氧培养9h得发酵乳e，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉E。

实施例6

发酵乳(粉)活菌检测

对上述实施例1-5所制备的副干酪乳杆菌发酵乳产品a、b、c、d和e、发酵乳粉产品A、B、C、D和E进行活菌计数，结果如表1所示。

表1副干酪乳杆菌发酵乳(粉)活菌计数结果

如表所示，通过本发明技术方案中的方法所制得的副干酪乳杆菌发酵乳中活菌数量稳定保持在8×10⁸CFU/mL以上，所制得的副干酪乳杆菌发酵乳粉中活菌数量稳定保持在8×10⁹CFU/g以上。

实施例7

副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045发酵乳粉对肠屏障受损引发的2型糖尿病的改善作用的测定：

建立动物模型：购买SPF级4周龄的雌性成年C57BL/6小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，饲喂高脂饲料(60％脂肪含量)8周。

动物实验：选取达到高血糖标准的小鼠20只，每组10只随机分为2组(模型对照组、发酵乳粉干预组)。根据表2所示方法，向各组饲喂对应饲料，并用发酵乳粉复原液(由实施例4中方法制备的发酵乳粉按配制而成)或空白样品(实施例4中配制的10％脱脂乳)灌胃(0.375g/Kg·d)。

表2实验动物分组与灌胃方法

实验期间，根据表3所述方法测定实验动物各项检测。

表3

葡萄糖耐受实验的结果如图1所示。模型对照组小鼠的糖耐能力较差，摄入葡萄糖后其血糖值在达到峰值后下降缓慢，表明模型对照组小鼠的葡萄糖代谢能力受到高脂饮食导致的肠屏障损伤的负面影响，模型建立成功。发酵乳粉干预组小鼠在摄入葡萄糖后，血糖值下降速率快，且显著优于模型对照组。

空腹血糖水平实验的结果如图2所示。模型对照组小鼠的空腹血糖值始终维持在较高水平(11～13mmol/L)，表明肠屏障受损引发的2型糖尿病模型建立成功。而经副干酪乳杆菌发酵乳粉干预后，小鼠的空腹血糖水平发生显著下降(9.5～11.5mmol/L)，且明显低于模型对照组。上述实验结果表明的空腹血糖具有积极的调控和缓解作用。

血清胰岛素水平实验的结果如图3所示。模型对照组小鼠的血清胰岛素处于较高水平(24～28mmol/L)，表明小鼠肠道受损后血清胰岛素的敏感性发生降低，而发酵乳粉干预组小鼠血清中的胰岛素水平为12～23mmol/L，显著低于模型对照组。上述实验结果表明副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045发酵乳粉的干预增强了肠屏障受损引发的2型糖尿病小鼠血清胰岛素的敏感性。

胰岛素抵抗指数实验的结果如图4所示。模型对照组小鼠体内的胰岛素抵抗指数较高(9～11mmol/L×mlU/L/22.5)，表明高脂饮食引起了小鼠高水平的胰岛素抵抗，而发酵乳粉干预组小鼠的胰岛素抵抗指数为6.5～9mmol/L×mlU/L/22.5，显著低于模型对照组。将按与发酵乳粉活菌数等量换算的发酵乳样品用于上述干预实验以后，效果与发酵乳粉干预效果相当。上述实验结果表明副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045发酵乳(粉)可有效缓解高脂饮食引发的胰岛素抵抗。

实施例8

将实施例1中的接种量，脱脂乳浓度，培养温度以及发酵时间逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的副干酪乳杆菌发酵乳粉，各组所得发酵乳粉中活菌数如表4所示。

表4不同方法制备所得副干酪乳杆菌发酵乳粉中活菌数

从表4所示的结果中可以得出，将所述发酵乳粉的制备方法中接种量，脱脂乳浓度，培养温度以及发酵时间调整到优选范围之外的时候，副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045依然可以在脱脂乳中得到部分增殖生长，但是其增殖效果明显下降，因此所制备得到的发酵乳粉中活菌数量远远低于优选范围内制备的发酵乳粉，从而影响其积极调控高脂饮食引起的肠屏障受损的物质的大量合成。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

分类命名：副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei

保藏单位全称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年06月08日

保藏编号：CGMCC No.20045

Claims

1.一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途，所述副干酪乳杆菌的保藏号为CGMCC No. 20045，所述发酵乳制品为用于降血糖的保健食品。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述发酵乳制品选自发酵乳、乳粉中的一种或多种的组合。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述发酵乳中的副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的活菌数＞8×10⁸ CFU/mL；

和/或，所述发酵乳粉中的副干酪乳杆菌CGMCC NO. 20045的活菌数＞8×10⁹ CFU/g。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述发酵乳制品的制备方法包括：

将接种有副干酪乳杆菌CGMCC No. 20045的脱脂乳进行发酵处理。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述发酵乳制品的制备方法还包括：

将发酵所得发酵产物进行干燥处理。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量为1×10⁷～5×10⁷ CFU/mL。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量为2×10⁷～4×10⁷ CFU/mL。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量为2.8×10⁷CFU/mL～3.2×10⁷ CFU/mL。

9.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述发酵处理中，脱脂乳为脱脂乳粉的水溶液，按质量百分比计，所述脱脂乳粉的水溶液中，脱脂乳粉所占的质量百分比为3%～12%。

10.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述发酵处理中，发酵温度为26℃～42℃，发酵时间为6h～18h。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述发酵处理中，发酵温度为30℃～40℃，发酵时间为9～15h。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述发酵处理中，发酵温度为36℃～38℃，发酵时间为11～13h。

13.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述发酵处理为厌氧发酵处理。