CN113383017B

CN113383017B - 新型双特异性抗体分子以及同时结合pd-l1和lag-3的双特异性抗体

Info

Publication number: CN113383017B
Application number: CN202080010762.3A
Authority: CN
Inventors: 倪海晴; 陈炳良; 刘军建
Original assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Current assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2040-01-23
Also published as: BR112021014522A2; TWI756621B; US20220112284A1; SG11202108062PA; KR20210120008A; EP3916016A4; JP2022518519A; CN113383017A; TW202043277A; CA3126881A1; EP3916016A1; WO2020151762A1; AU2020212228A1

Abstract

一种新型的经人工设计的抗体分子，其包含式(I)的多肽链：VH‑CH1‑Fc‑X‑VHH；和式(II)的多肽链：VL‑CL；其中：VH表示重链可变区；CH表示重链恒定区；Fc包含CH2、CH3，以及任选的CH4；CH1、CH2、CH3和CH4分别表示重链恒定区的结构域1、2、3和4，X可以不存在，或者在存在时表示接头，例如柔性接头；VHH表示单结构域抗原结合位点，例如单结构域抗体；VL表示轻链可变区；CL表示轻链恒定区；任选地，CH1和Fc之间存在铰链区。

Description

新型双特异性抗体分子以及同时结合PD-L1和LAG-3的双特异性抗体

发明领域

本发明总体上涉及免疫学和抗体工程领域。具体而言，本发明涉及新型的经人工设计的双特异性抗体分子，特别是同时结合PD-L1和LAG-3的双特异性抗体、编码所述抗体分子或其各条链的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、包含所述抗体分子的免疫缀合物和药物组合物、以及所述抗体分子在疾病的免疫治疗、预防和/或诊断上的用途。

发明背景

抗体分子能够与其相应的抗原发生靶向性的特异性结合，正日益成为针对各种疾病(例如，癌症、自身免疫病、炎性疾病、感染性疾病等)的重要的治疗剂、预防剂和/或诊断剂。但是，仅针对一种靶点的单特异性抗体在临床应用上存在一些局限性。患者在接受单特异性抗体治疗后可能产生耐药性或无应答。随着对癌症和其他多种疾病的研究，认识到了往往有多种信号转导通路参与疾病的发生和发展，单一靶点的免疫疗法在许多疾病中通常并不足以发挥对疾病的治疗作用。

由于多特异性抗体(例如，双特异性抗体)能够特异性结合不同抗原，能够设计为同时作用于两种或多种不同介质的信号转导通路。这些优势特性为多特异性抗体(例如，双特异性抗体)开辟了广阔的应用前景。

已经通过抗体工程开发了大量富于想象力的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)样式并且研究了它们在疾病应用上的适用性(Brinkmann U.和Kontermann R.E.，Themaking of bispecific antibodies，Mabs，2017，9(2)：182-212)。

多特异性抗体(例如，双特异性抗体)根据不同的组成部分以及构建方式，可以分为许多种类。例如，根据多特异性抗体结构的左右基本上对称性，可分为对称结构和不对称结构；根据多特异性抗体有无IgG的Fc区，可分为有Fc区的抗体样式和无Fc区的抗体样式；根据多特异性抗体中抗原结合位点的数量可分为二价、三价、四价或更多价的抗体等。

现有技术中的多特异性抗体样式在制备和应用中各有利弊，例如，虽然Blinatumomab可以通过重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行大规模培养生产，但是容易形成聚集物、在体内半衰期很短，实际使用的时候需要额外配备连续输液装置；Catumaxomab生产工艺复杂且鼠异源抗体比较容易在人体产生免疫原性问题。

因此，本领域仍然需要可供选择的具有改善性能的多特异性抗体，特别是双特异性抗体。本发明提供了一种新的多特异性抗体样式，所述抗体易于在体外的培养细胞中有效表达，不需要复杂的生产工艺。同时，所述的双特异性抗体能够同时结合不同的抗原，保持各抗原结合位点与相应的不同表位结合的结合活性，以及其他性质。进一步地，本发明的双特异性抗体样式是物理稳定的和生物学稳定的，这允许该抗体具有更好的生产性和可发展性。

发明概述

本文公开了通过抗体工程方法构建的一种新型的双特异性抗体分子。

因此，在一个方面，本发明提供了具有以下一个或多个特性的双特异性抗体分子：

(a)以高亲和力与一种或两种抗原特异性结合；

(b)易于在体外的培养细胞中表达，且抗体分子的各条链之间能够正确偶合或配对；

(c)具有良好的物理稳定性，特别地，具有良好的长期热稳定性；且能长时间保持生物学活性；

(d)在与一种或两种抗原特异性结合后，通过调节(例如，抑制或者激活)各抗原所参与的信号传导通路来发挥生物学功能；

(e)发挥效应子功能；

(f)具有更好的抗肿瘤活性。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含全抗体部分和单结构域抗体部分，后者通过接头连接于全抗体部分的重链恒定区的C端。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含以下部分或由其组成：

式(I)的多肽链(肽链#1)：

VH-CH1-Fc-X-VHH；和

式(II)的多肽链(肽链#2)：

VL-CL；

其中：

VH表示重链可变区；

CH表示重链恒定区结构域；

Fc包含CH2、CH3，以及任选的CH4；

CH1、CH2、CH3和CH4分别表示重链恒定区的结构域1、2、3和4，

X可以不存在，或者在存在时表示接头，例如柔性接头；

VHH表示单结构域抗原结合位点，例如单结构域抗体；

VL表示轻链可变区；

CL表示轻链恒定区；

任选地，CH1和Fc之间还存在铰链区。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含至少一条式(I)的多肽链和一条式(II)的多肽链。优选地，本发明的抗体分子包含两条(例如相同的)式(I)的多肽链和两条(例如相同的)式(II)的多肽链。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子的结构如图1(A)所示。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子或其片段具有2个或4个抗原结合位点，其结合2个、3个或4个不同的抗原，或相同的抗原。在一个实施方案中，式(I)中的VH和式(II)中的VL形成一个抗原结合位点，式(I)的VHH构成一个抗原结合位点(单结构域抗原结合位点)。

在一个实施方案中，不同抗原结合位点结合相同的抗原上的相同表位，或不同表位。

在一个实施方案中，本发明抗体分子中的式(I)中的接头X是柔性接头，例如具有单独或组合的甘氨酸和/或丝氨酸残基的接头。在一个实施方案中，所述接头包含氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7中的正整数，例如，n是2，3，4，5，6。在一个实施方案中，n是1、2、3或4。

在一个实施方案中，由式(I)中的VH和式(II)中的VL形成的抗原结合位点是来自人的或人源化的，或嵌合的。

在一个实施方案中，本发明抗体分子中的单结构域抗原结合位点(VHH)是天然缺乏轻链的抗体的重链可变结构域(例如，骆驼科(Camelidae)物种中天然存在的重链抗体的重链可变结构域)或鱼类中称为新型抗原受体(new antigen receptor，NAR)的免疫球蛋白(如鲨鱼血清中天然存在的IgNAR)中的VH样单结构域、或衍生自它们的经重组的单结构域抗原结合位点(例如，骆驼化的人VH结构域或人源化的骆驼科抗体重链可变结构域)。在一个优选的实施方案中，本发明抗体分子中的所述单结构域抗原结合位点选自骆驼科物种中天然存在的重链抗体的重链可变结构域、骆驼化的人VH结构域和人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。

在一个实施方案中，本发明抗体分子中式(I)的肽链中的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼)中产生的抗体。除骆驼科之外的其他物种也可以产生天然缺乏轻链的重链抗体，这类重链抗体的VHH也处于本发明的范围内。

在一个实施方案中，CH1和Fc来自抗体重链，或其衍生物。

在一个实施方案中，式(I)的“CH1-Fc”为IgG的形式，例如IgG1、IgG2或IgG4的形式。在一个实施方案中，为IgG1的形式。将理解，可以对恒定结构域中的Fc进行突变，以实现稳定抗体的作用，或增强效应子功能的作用。例如在一个具体实施方案中，所述效应子功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，所述氨基酸突变存在于CH2结构域，例如，所述抗体分子包含在第234和235位置(EU编号，根据Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)的EU索引进行编号)处的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是L234A和L235A。

在一个实施方案中，在CH1和CL之间存在二硫键。在一个实施方案中，如果包含两条式(I)多肽链，则在两个式(I)多肽链的CH1和CH2之间的铰链区之间存在二硫键，二硫键的数量依据抗体恒定结构域所来源IgG形式不同而可变化，在一些实施方案中，铰链区之间存在2个或4个二硫键。。

在一个实施方案中，式(II)的轻链恒定结构域CL来自κ或λ。

在一个实施方案中，由式(I)的VH和式(II)的VL形成的结合位点对第一抗原是特异性的，在一个实施方案中，第一抗原是LAG-3。

在一个实施方案中，由式(I)的VHH形成的结合位点对第二抗原是特异性的，在一个实施方案中，第二抗原是PD-L1。

不特别地限制本发明的抗体分子特异性结合的抗原类型，抗原可以是例如细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、配体、细胞表面受体或其片段。在一个实施方案中，本发明的抗体分子特异性结合的抗原选自肿瘤相关抗原、免疫检查点分子、血管新生诱导因子、肿瘤坏死因子受体超家族成员和免疫系统中的共刺激分子，以及这些分子的配体和/或受体，例如，OX40、CD47、PD1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、4-1BB(CD137)、VEGF和GITR。

在一个实施方案中，式(I)的VH-CH1-Fc构成全抗体部分的重链，式(II)的VL-CL构成全抗体部分的轻链。

在一个实施方案中，式(II)的VHH构成单结构域抗体。

在一个实施方案中，本发明的抗体还涵盖其抗原结合片段，例如Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)或(Fab’)₂、单结构域抗体、双抗体(dAb)或线性抗体。

在一些实施方案中，本发明抗LAG-3抗体或其片段的重链和/或轻链还包含信号肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：20)。

在一个方面，本发明提供了编码本发明抗体分子中的任意一条或者多条多肽链的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述核酸或载体的宿主细胞。

在一个方面，本发明提供了包含编码本发明抗体分子中的任意一条或者多条多肽链的多核苷酸的载体，优选地表达载体，例如pTT5。

在一个方面，本发明提供了用于产生本发明抗体分子或其片段的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明抗体的免疫缀合物、药物组合物、试剂盒、组合产品或制品。

在一些实施方案中，本发明的抗体、药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒用于预防或治疗疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤等。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。优选地，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌。在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者或个体疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗体或其片段、药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。在一个实施方案中，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌。在另一方面，本发明还涉及本文所述的任何抗体或其片段或免疫缀合物制备用于在受试者中治疗肿瘤(例如癌症)或感染的药物或药物组合物或试剂盒或组合产品的用途。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。在一个实施方案中，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌。

本发明还涉及在样品中检测抗原的方法。

本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗体或其片段或免疫缀合物或药物组合物或组合产品或试剂盒、方法和用途。

附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1A-1B例示了本发明双特异性抗体的结构。

图2显示了利用大小排阻层析(size exclusion chromatography；SEC)检测的本发明制备的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体IGN-LP的纯度。

图3显示了通过FACS检测的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体IGN-LP、以及作为对照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗体与过量表达PD-L1的CHO细胞(CHOS-PD-L1)的结合。图中横轴表示抗体浓度、纵轴表示平均荧光强度(MFI)。

图4显示了通过FACS检测的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体IGN-LP、以及作为对照的抗LAG-3抗体ADI-31853与过量表达LAG-3的293细胞(293-LAG-3)的结合。图中横轴表示抗体浓度、纵轴表示平均荧光强度(MFI)。

图5显示了抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体IGN-LP对过量表达LAG-3的293细胞(293-LAG-3)和过量表达PD-L1的CHO细胞(CHOS-PD-L1)的同时结合作用。

图6显示，本发明的双特异性抗体IGN-LP，以及作为对照的抗LAG-3抗体ADI-31853、抗PD-L1人源化Nb-Fc抗体、和二者组合，以及IgG在体外对T细胞的激活作用，以IL-2产生的浓度(pg/ml)度量。

图7显示，本发明的双特异性抗体IGN-LP，以及作为对照的抗LAG-3抗体ADI-31853、抗PD-L1人源化Nb-Fc抗体、和二者组合以及IgG在体外在过量表达PD-L1的CHOK1-PD-L1细胞(Promega，CS187109)和过量表达LAG-3的JurkatLAG3(Promega，(Promega，CS187109))细胞混合物中对TCR：Pmhc结合物产生的促进作用。

图8-10显示本发明的双特异性抗体IGN-LP，以及作为对照的抗LAG-3抗体ADI-31853、抗PD-L1人源化Nb-Fc抗体、和二者组合，以及人IgG对肿瘤的抑制作用。

发明详述

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

缩写

除非另外说明，否则本说明书中的缩写具有以下含义：

使用以下缩写：

ADCC 抗体依赖性细胞介导的毒性

CDC 补体依赖性细胞毒性

CDR 在免疫球蛋白可变区中的互补决定区

CHO 中国仓鼠卵巢

EC50 导致50％效力或结合的浓度

K_D 平衡解离常数

ELISA 酶联免疫吸附测定

FACS 流式细胞术

MOA 作用机制

MLR 淋巴细胞混合反应

FR 抗体构架区

IC50 产生50％抑制的浓度

Ig 免疫球蛋白

Kabat 通过Elvin A.Kabat((1991)Sequences ofProteins ofImmun ologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)设立的免疫球蛋白比对和编号系统

mAb或Mab或MAb 单克隆抗体

PCR 聚合酶链式反应

IFN 干扰素

VL 轻链可变区

VH 重链可变区

LC 轻链

HC 重链

HCDR 重链互补决定区

LCDR 轻链互补决定区

IL2 白介素-2

I.定义

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。

在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。

术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指天然存在的包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域(为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。

如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，人LAG-3或PD-L1)中与抗体分子特异性相互作用的部分。

与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。

与参照抗体竞争结合其抗原的抗体是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。

抑制(例如竞争性抑制)参照抗体与其抗原的结合的抗体是指这样的抗体，其抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。抗体与其抗原的结合可以亲和力(例如平衡解离常数)衡量。测定亲和力的方法是本领域已知的，例如ForteBio亲和力测定。

与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。

“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology，273，927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。

例如，根据不同的CDR确定方案，每一个CDR的残基如下所述。

CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。

除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))的编号位置。

在一个实施方案中，本发明抗体的CDR通过Kabat规则确定边界，通过IMGT确定规则，或通过AbM确定规则，或通过其任何组合确定规则。

在本发明的一个实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的VH的HCDR1是通过结合Kabat、AbM、Chothia及经验性等综合因素确定边界，在kabat编号系统中位置为H27-H35B，VH的HCDR2是通过Kabat规则确定，VH的HCDR3是通过IMGT规则确定，式(II)中的VL的LCDR是通过Kabat规则确定。在本发明的一个实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的VHH的HCDR1是通过AbM规则确定，HCDR2和HCDR3是通过Kabat规则确定。

具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat，Chothia，AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG4形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG4。

本文所述的术语“单结构域抗体”通常指这样的抗体，其仅由一个重链可变区组成，具有与抗原结合的活性，即从C端到N端仅包含一条链：FR4-VHHCDR3-FR3-VHHCDR2-FR2-VHHCDR1-FR1的抗体，可来自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、鱼类IgNAR的VH样单结构域(v-NAR))，其可以天然产生或由基因工程技术产生。单结构域抗体的实例包括源自骆驼科(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的单结构域抗体(WO 2005/035572)。

术语“骆驼化的人VH结构域”是指将衍生自骆驼科VHH的关键元件转移到人VH结构域上导致人VH结构域不再需要与VL结构域配对来识别靶抗原，经骆驼化的人VH结构域单独即可赋予抗原结合特异性。

如本文所用的术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示抗体分子中与抗原实际结合的区域，包括由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的VH/VL对、衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、来自鲨鱼科动物的IgNAR的VH样单结构域(v-NAR)、骆驼化的人VH结构域、人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体分子包含至少四个抗原结合位点，例如，包含两个单结构域抗体抗原结合位点(例如，VHH)和两个VH/VL对形成的抗原结合位点。

术语“单结构域抗原结合位点”表示抗体分子的以单个可变结构域(例如，重链可变结构域(VH))与抗原结合的区域。在本发明的一个实施方案中，本发明的单结构域抗原结合位点可构成单结构域抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含两个单结构域抗原结合位点，分别结合相同或不同的抗原。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体分子包含两个单结构域抗原结合位点，分别结合相同或不同的抗原表位。

如本文所用，术语“多特异性”抗体指具有至少两个抗原结合位点的抗体，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。本文提供的抗体通常是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同抗原表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方案中，本文提供了这样的双特异性抗体，其具有针对第一抗原和第二抗原的结合特异性。

术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有一个重链可变区(VH)，也称作重链可变结构域，随后是三个重链恒定区的结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条免疫球蛋白轻链具有一个轻链可变区(VL)，也称作轻链可变结构域，随后是一个轻链恒定结构域(CL)。免疫球蛋白的重链可以归属5个类别之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些类别可以进一步划分成亚类，例如γ₁(IgG1)、γ₂(IgG2)、γ₃(IgG₃)、γ₄(IgG₄)、α₁(IgA₁)和α₂(IgA₂)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。

术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。

术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，小鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始小鼠抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。

“人源化”抗体是一种保留非人类抗体(例如小鼠单克隆抗体)的抗原特异性反应性，同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人类抗原结合位点并且抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即，恒定区以及可变区中不参与结合的部分为人类抗体的相应部分)来实现。参见，例如Padlan，Anatomy of the antibodymolecule，Mol.Immun.，1994，31：169-217。人类抗体工程化技术的其他例子包括但不限于US 5,766,886中公开的Xoma技术。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

术语“...价”抗体指抗体分子中存在的抗原结合位点的数目。“二价”、“三价”和“四价”抗体指抗体分子中分别存在2个抗原结合位点、3个抗原结合位点和4个抗原结合位点。在一个实施方案中，本文中报道的双特异性抗体是“四价的”。

术语“柔性接头”或“接头”是指由氨基酸组成的连接肽，例如单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基，以连接抗体中的各个可变结构域。在一个实施方案中，柔性接头是Gly/Ser连接肽，包括氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7中的正整数，例如2、3或4。在一个实施方案中，所述柔性接头是(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO：5)。还包括在本发明范围内的是WO2012/138475中描述的接头，其通过引用并入本文。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法测定。

术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。技术人员将理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。在本文的一些实施方案中，第一抗原、第二抗原是两种不同的抗原。

术语“肿瘤相关抗原”或“癌症抗原”可互换地指与正常细胞相比，优选在癌细胞表面完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且所述分子可用在药剂对癌细胞的优先靶向中。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是与正常细胞相比在肿瘤细胞中过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过量表达、2倍过量表达、3倍过量表达或更多倍过量表达。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是在肿瘤细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原仅在肿瘤细胞的细胞表面完整表达或作为片段表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。如本文中使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。

“免疫缀合物”是与一个或多个其它物质(包括但不限于细胞毒性剂或标记)缀合的抗体。

术语“淋巴细胞活化基因-3”或“LAG-3”包括全部同种型，哺乳动物(例如，人)LAG-3、人LAG-3的物种同源物和包含LAG-3的至少一个共同表位的类似物。LAG-3(例如，人LAG-3)的氨基酸序列和核苷酸序列是本领域已知的，例如，参见Triebel等人，(1990)J.Exp.Med.171：1393-1405。在一些实施方案中，术语“人LAG-3”指的是人序列LAG-3，如Genbank登录号为NP_002277的人LAG-3的完整氨基酸序列。LAG-3在现有技术中也称为，例如，CD223。人LAG-3序列可以具有例如保守突变或在非保守区中的突变而不同于Genbank登录号NP_002277的人LAG-3，并且该LAG-3与Genbank登录号NP_002277的人LAG-3具有基本上相同的生物功能。例如，人LAG-3的生物功能为具有在LAG-3的胞外结构域中的表位，其被本公开的抗体特异性结合，或者人LAG-3的生物功能为与MHC II类分子结合。

本文所用的术语“抗LAG-3抗体”、“抗LAG-3”、“LAG-3抗体”或“结合LAG-3的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合LAG-3蛋白或其片段。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体与非LAG-3蛋白结合的程度低于所述抗体与LAG-3结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或以上，如例如通过放射性免疫测定(RIA)或生物光干涉测定法或MSD测定法测量的。

如本文所用的术语“程序性细胞死亡1配体1”、“PD-L1”、“程序性死亡配体1”、“分化簇274”、“CD274”或“B7同系物1”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的PD-L1以及由细胞中的加工所产生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作为跨膜蛋白或作为可溶性蛋白存在。所述术语还涵盖天然存在的PD-L1的变体，例如剪接变体或等位基因变体。PD-L1的基本结构包括4个结构域：胞外Ig样V型结构域和Ig样C2型结构域、跨膜结构域以及细胞质结构域。可在NCBI Gene ID No.29126下找到关于人PD-L1基因(包括基因组DNA序列)的另外信息。可在NCBI Gene ID No.60533下找到关于小鼠PD-L1基因(包括基因组DNA序列)的另外信息。示例性全长人PD-L1蛋白的氨基酸序列可例如在NCBI登录号NP_001254653或UniProt登录号Q9NZQ7下找到，而可例如在NCBI登录号NP_068693或Uniprot登录号Q9EP73下找到示例性全长小鼠PD-L1蛋白序列。

本文所用的术语“抗PD-L1抗体”、“抗PD-L1”、“PD-L1抗体”或“结合PD-L1的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合PD-L1蛋白或其片段。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体与非PD-L1蛋白结合的程度低于所述抗体与PD-L1结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或以上，如例如通过放射性免疫测定(RIA)或生物光干涉测定法或MSD测定法测量的。

术语“抑制剂”或“拮抗剂”包括使所给出分子的某些参数(例如，活性)降低的物质。例如，这个术语包括使得所给出的分子被抑制至少5％、10％、20％、30％、40％或更多的活性(例如，LAG-3活性或PD-L1活性)的物质。因此，抑制作用不必是100％。

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文所公开的那些。

“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达Fc使效应器功并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。

术语“有效量”指本发明的抗体或片段或缀合物或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。可选地，可以通过检验化合物抑制的能力评价组合物的这种特性，所述抑制在体外通过熟练技术人员已知的测定法。

“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。

“Fab”片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab’-SH是对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)₂抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6^thed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。

术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。

术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。

术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。

术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。

本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接被标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体进行的一级抗体的检测和具有生物素的DNA探针的末端标记，使得其可以用荧光标记的链霉抗生素蛋白来检测。

“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

如下进行序列之间序列同一性的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http：//www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http：//www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和w.Miller算法，((1989)CABIOS，4：11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

如本文所用，术语“在低严格性、中等严格性、高严格性或极高严格性条件下杂交”描述了杂交和洗涤条件。进行杂交反应的指导可以在通过引用方式并入的CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。参考文献中描述了含水方法和非含水方法并且可以使用任一方法。本文中提及的特异性杂交条件如下：1)低严格性杂交条件是在约45℃于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后至少在50℃(对于低严格性条件，可以增加洗涤的温度至55℃)于0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤两次；2)中等严格性杂交条件是在约45℃于6X SSC中、随后在60℃在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严格性杂交条件是在约45℃在6X SSC中、随后在65℃于0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；并且优选地4)极高严格性杂交条件是在65℃于0.5M磷酸钠、7％SDS中、随后在65℃于0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。极高严格性条件(4)是优选的条件和除非另外说明，否则应当使用的一个条件。

术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、载体、赋形剂或稳定剂等。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。

本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗疾病，例如肿瘤(例如癌症)和感染中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。

“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化学化合物。

本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。

术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。

术语“抗感染活性剂”包括在施用浓度和给药间隔下特异性抑制或消除微生物生长但对宿主不致命的任何分子，所述微生物诸如病毒、细菌、真菌或原生动物，例如寄生虫。用于本文时，术语抗感染活性剂包括抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。在一个具体方面中，抗感染活性剂在施用浓度和给药间隔对宿主是无毒的。

抗细菌的抗感染活性剂或抗细菌剂可广泛的分类为杀菌的(即，直接杀死)或抑菌的(即，阻止分裂)。抗菌的抗感染活性剂可进一步再分类为窄谱抗菌剂(即，仅影响小类细菌亚型，例如，革兰氏阴性等)或广谱抗菌剂(即，影响广泛种类)。术语“抗病毒剂”包括抑制或消除病毒生长、致病和/或存活的任何物质。术语“抗真菌剂”包括抑制或消除真菌生长、致病和/或存活的任何物质。术语“抗原生动物剂”包括抑制或消除原生动物生物体(例如寄生虫)生长、发病和/或存活的任何物质。

术语“组合产品”是指一种剂量单位形式的固定组合或非固定组合或用于组合施用的部分的试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可以独立地在同一时间同时施用或在一定时间间隔内分开施用，尤其是在这些时间间隔允许组合伴侣展示协作，例如，协同效应时。术语“固定组合”是指本发明抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂)以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指本发明抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂)作为分开的实体同时、并行或依次施用于患者，没有特定的时间限制，其中这样的施用提供了患者体内两种治疗剂的治疗有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种治疗剂。在一个优选的实施方案中，药物组合是非固定组合。

术语“组合疗法”或“联合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗如本公开所述的癌症或感染。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用或分开施用或依次施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。在一些实施方案中，施用还包括以大致相同的时间，或在不同的时间以顺序的方式，使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。

Ⅱ.本发明的抗体分子

本发明提供了一种新型的抗体分子，其能够用于多种疾病的免疫治疗、预防和/或诊断。本发明的抗体分子包含至少2个、3个或4个抗原结合位点，其能够作为单特异性抗体或双特异性抗体或多特异性抗体发挥作用，优选地，其能够作为双特异性抗体发挥作用。

在一个实施方案中，本发明抗体分子中式(I)的单结构域抗原结合位点(VHH)是能够以较高亲和力特异性结合靶抗原表位的单个重链可变结构域，例如，衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、来自鲨鱼科动物的IgNAR的v-NAR、骆驼化的人VH结构域、人源化的骆驼科抗体重链可变结构域、和它们的经重组的单结构域。在一个实施方案中，本发明抗体分子中的单结构域抗原结合位点是衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、骆驼化的人VH结构域和/或人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。现有技术中已经对从骆驼科物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼)获得的抗体蛋白的大小、结构和针对人类受试者的抗原性进行了表征。在自然界中来自骆驼科哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并且因此在结构上区别于来自其他动物的具有两条重链和两条轻链的常见四链抗体结构。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公布的WO 94/04678)。

可以通过基因工程方法获得骆驼科重链抗体的对靶抗原具有高亲和力的重链可变结构域VHH。参见例如1998年6月2日授予的美国专利号5,759,808。与其他非人源抗体片段一样，骆驼科VHH的氨基酸序列可以重组地改变以获得更逼真模仿人序列的序列，即，“人源化”，由此降低骆驼科VHH对人类的抗原性。另外，也可以将衍生自骆驼科VHH的关键元件转移到人VH结构域上，获得骆驼化的人VH结构域。VHH的分子量是人IgG分子的分子量的十分之一，并且具有仅数纳米的物理直径。VHH本身具有极高的热稳定性、对极端pH和蛋白酶解消化稳定和抗原性低，因此，在本发明抗体分子的一个实施方案中，式(I)中的VHH作为构建模块对本发明抗体分子的稳定性、对人受试者的低抗原性做出了贡献。

在一个实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的VHH特异性结合PD-L1(例如人PD-L1)。

在一个实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的特异性结合PD-L1的VHH包含

(i)SEQ ID NO：6中所含的三个互补决定区域(VHH CDR)，或

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。

在优选的实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的特异性结合PD-L1的VHH包含：

互补决定区域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3，其中VHH CDR1包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者VHH CDR1包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；VHH CDR2包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者VHH CDR2包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；VHH CDR3包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者VHH CDR3包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的特异性结合PD-L1的VHH包含或由其组成：

(i)SEQ ID NO：6所示的序列，

(ii)与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或

(iii)与SEQ ID NO：6的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一个实施方案中，式(I)的VH和式(II)的VL构成的抗原结合位点特异性结合LAG-3，例如人LAG-3。

在一些具体的实施方案中，在本发明抗体分子中，式(I)中的VH包含

(i)如SEQ ID NO：2所示的重链可变区VH的3个互补决定区HCDR，或

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，和/或

式(II)中的VL包含

(i)如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区VL的3个互补决定区LCDR，或

在一些实施方案中，在本发明的抗体分子中，式(I)中的VH包含

互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与SEQID NO：15的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；

和/或

式(II)中的VL包含

互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ IDNO：17的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR3包含与SEQID NO：18的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在本发明的抗体分子中，

(a)式(I)中的VH

(i)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者

(ii)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；

和/或

(b)式(II)中的VL

(i)包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明抗体分子式(I)的Fc来自IgG1、IgG2或IgG4。在一些实施方案中，所述Fc来自IgG1。在一些实施方案中，Fc

(i)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明抗体分子式(I)的CH1来自来自IgG1、IgG2或IgG4。在一些实施方案中，CH1来自IgG1。在一些实施方案中，CH1

(i)包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明抗体分子式(I)的CL

(i)包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明抗体分子式(I)的X是柔性接头，例如具有单独或组合的甘氨酸和/或丝氨酸残基的接头。在一个实施方案中，所述接头包含氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7中的正整数，例如，n是2，3，4，5，6。在一个实施方案中，n是1、2、3或4。在一个实施方案中，X具有SEQ ID NO：5所示的序列。

在一些实施方案中，在本发明的抗体分子中，

(a)式(I)中的VH-CH1-Fc

(i)包含与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：19的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在重链可变区中；

和/或

(b)式(II)的VL-CL

(i)包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链可变区中。

在一些实施方案中，本发明抗体分子在式(I)的VH或式(II)的VL的N端还包含信号肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：20)。

在本发明的优选的实施方案中，本发明涉及这样的抗体分子，其中式(I)的多肽链包含SEQ ID NO：1所示的序列，或包含与其具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或其中式(II)的多肽链包含SEQ IDNO：7所示的序列，或包含与其具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含全抗体部分作为其一部分。在一些实施方案中，本发明的全抗体部分包含式(I)链的VH-CH1-Fc，以及式(II)链的VL-CL。其中VH构成全抗体部分的重链可变区，CH1-Fc构成全抗体部分的重链恒定区，二者一起构成全抗体部分的重链；VL构成全抗体部分的轻链可变区，CL构成全抗体部分的轻链恒定区，二者一起构成全抗体部分的轻链。

在一些实施方案中，全抗体部分是人抗体。在一些实施方案中，全抗体部分是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG4形式的抗体。在一些实施方案中，全抗体部分可独立地构成单克隆抗体。在一些实施方案中，全抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，全抗体部分是嵌合抗体。在一些实施方案中，至少部分的全抗体部分的框架序列是人共有框架序列。

在一个具体的实施方案中，全抗体部分是的抗LAG-3抗体。

在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。

在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。

在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表A所示：

表A

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。

举例而言，可实施一或多种氨基酸置换以消除一或多个可变区构架糖基化位点，由此消除该位点处的糖基化。这类无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。例如参见美国专利第5,714,350号及第6,350,861号。可制备具有改变类型的糖基化的抗体，例如具有减小量的岩藻糖基残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的等分GlcNac结构的抗体。这类改变的糖基化模式已显示可增加抗体的ADCC能力。可通过例如在具有改变的糖基化体系的宿主细胞中表达抗体来实现这类糖类修饰。备选地，可使用岩藻糖苷酶切除抗体的岩藻糖残基；举例而言，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗体去除岩藻糖基残基(Tarentino等人(1975)Biochem.14：5516-23)。

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体治疗癌症或细胞增殖性疾病的有效性。Fc区的修饰包括氨基酸变化(置换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化、和添加多个Fc。对Fc的修饰还可以改变治疗性抗体中的抗体的半衰期，从而实现更低频率的给药和因而增加的方便和减少的材料使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731，734-735页。

在一个实施方案中，可以改变抗体的半胱氨酸残基数目以修饰抗体特性。例如对CH1的铰链区实施修饰，从而改变(例如增加或降低)铰链区中的半胱氨酸残基的数目。此办法进一步阐述于美国专利第5,677,425号中。可以改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以例如促进轻链及重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。

任选地，本发明的抗体包括对抗体链的翻译后修饰。示例性的翻译后修饰包括二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合。

在本发明的一个实施方案中，本发明所述抗体或片段用经工程改造的酵母N-连接的聚糖或CHO N-连接的聚糖糖基化。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

本发明所涵盖的另一种对本文所述抗体或其片段的修饰是聚乙二醇化(pegylation)。可对抗体实施聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。如本文中所使用，术语“聚乙二醇”意图涵盖已用于衍生化其他蛋白质的PEG的任一形式，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，要聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。本领域中已知使蛋白质聚乙二醇化的方法且可将其应用于本发明的抗体，例如参见EP 0154316及EP 0401384。

在一些实施方案中，本发明的抗体分子是人源化的。用于使抗体人源化的不同方法是技术人员已知的，如由Almagro&Fransson综述的，其内容通过提述完整并入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers inBioscience13：1619-1633)。

在一些实施方案中，本发明的抗体分子是人抗体或人源化抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体或人源化抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗体分子是嵌合抗体。

在一些实施方案中，至少部分的本发明的抗体分子的框架序列是人共有框架序列。

在一个实施方案中，本发明的本发明的抗体分子还涵盖其抗体片段，例如以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)或(Fab’)₂、或线性抗体。

在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体具有如下一种或多种性质：

(1)本发明的双特异性抗体或其片段以高亲和力同时结合两种抗原，例如，以以下平衡解离常数(K_D)与LAG-3(例如人LAG-3)结合，所述K_D小于或等于大约10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM，最优选地，所述K_D小于或等于大约1.9nM或1.8nM，在一些实施方案中，所述K_D在大约1nM、1.1nM、1.2nM、1.3nM、1.4nM、1.5nM、1.6nM或1.7nM以上；且同时，以以下平衡解离常数(K_D)与PD-L1(例如人PD-L1)结合，所述K_D小于或等于大约100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM或20nM，最优选地，所述K_D小于或等于大约19nM或18nM或17nM，在一些实施方案中，所述K_D在大约10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM或16nM以上；在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用生物光干涉测定法(例如Forebio亲和测定)测定的。

(2)本发明的抗体或其片段结合表达人PD-L1的细胞，例如，以小于或等于大约3nM、2nM、1.5nM、1.4nM、1.3nM、1.2nM或1.1nM的EC50(在一些实施方案中，所述EC50在大约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0nM以上)，且同时，结合表达人LAG-3的细胞，例如，以小于或等于大约3nM、2nM、1.5nM、1.4nM、1.3nM、1.2nM、1.1nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM或0.5nM的EC50(在一些实施方案中，所述EC50在大约0.3或0.4nM以上)。在一些实施方案中，所述结合用流式细胞术(例如FACS)测定。在一些实施方案中，表达人LAG-3的细胞为表达人LAG-3的293细胞(例如HEK293细胞)和/或表达人PD-L1的细胞为表达人PD-L1的CHO细胞(例如CHOS细胞)。

(3)本发明的抗体或其片段具有良好的热稳定性。在一些实施方案中，所述抗体或其片段通过差式扫描荧光法测定的Tm大于或等于大约60℃、61℃、62℃或63℃。

(4)本发明的抗体或其片段激活CD4+ T细胞(例如人CD4+T细胞)，例如促进其IL-2的表达。

(5)本发明的抗体或其片段抑制LAG-3和PD-L1的一种或多种活性，例如，导致以下一种或多种：阻断PD-L1与PD-1的结合或PD-L2与PD-1的结合、CD4+ T淋巴细胞的抗原依赖性刺激增加；T细胞增殖增加；活化抗原(例如，CD25)的表达增加；细胞因子(例如，干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)或白介素-4(IL-4))的表达增加；趋化因子(例如，CCL3、CCL4或CCL5)的表达增加；Treg细胞的阻抑活性减少；T细胞稳态增加；肿瘤浸润型淋巴细胞增加；或癌细胞的免疫逃避减少。

(6)本发明的抗体或其片段能够诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性：

(i)显示与本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ IDNO：7作为式(II)的肽链)对LAG-3和PD-L1相同或相似的结合亲和力和/或特异性；

(ii)抑制(例如，竞争性抑制)本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ ID NO：7作为式(II)的肽链)与LAG-3和PD-L1的结合；

(iii)与本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ ID NO：7作为式(II)的肽链)结合相同或重叠的表位；

(iv)与本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ ID NO：7作为式(II)的肽链)竞争结合LAG-3和PD-L1；

(v)具有本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ ID NO：7作为式(II)的肽链)的一个或多个生物学特性。

III.免疫缀合物

在一些实施方案中，本发明还涵盖与其他物质缀合的抗体(“免疫缀合物”)。在一些实施方案中，其它物质例如治疗剂或标记，如细胞毒性剂或免疫抑制剂或化疗剂。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的。

另外，本发明的抗体分子可以与标记序列(如肽)缀合以促进纯化。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)等中提供的标签，它们中的许多是可商业获得的。如Gentz等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如，六组氨酸提供融合蛋白的便利纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984，Cell 37：767)和“flag”标签。

在其他实施方案中，本发明的抗体分子与诊断剂或可检测剂缀合。这类抗体可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的效力)，用于监测或预测疾病或病症的发作、形成、进展和/或严重性。可以通过将抗体与可检测物质偶联实现这类诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于多种酶；辅基；荧光物质；发光物；和用于各种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。

另外，本发明的抗体分子可以与调节给定生物学反应的治疗性部分或药物部分缀合。治疗性部分或药物部分不得解释为限于经典的化学治疗药。例如，药物部分可以是拥有所需生物学活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可以例如包括毒素；蛋白质或生物学反应调节物。

另外，本发明的抗体分子可以缀合至治疗性部分如放射性金属离子或可用于使放射金属离子缀合至多肽的大环螯合剂。用于治疗性部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见，例如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，引自Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编著)，第243-256页(Alan R.Liss，Inc.1985)。

抗体也可以连接至固相支持物，所述支持物特别可用于免疫测定法或靶抗原的纯化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤等。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。优选地，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌。

IV.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞

在一方面，本发明提供了编码以上任何抗体或其片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO：1-9中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO：1-9中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。

本发明还涵盖与下述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与下述核酸具有一个或多个置换(例如保守性置换)、缺失或插入的核酸：包含编码选自SEQ ID NO：1-9中任一项所示氨基酸序列的核酸序列的核酸；或包含编码与选自SEQ ID NO：1-9中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列的核酸。

在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一些实施方案中，载体是pTT5载体。

一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。

另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

在一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHOS细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in MolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞，例如CHOS细胞或293细胞，例如HEK293细胞。

V.本发明的抗体分子的生产和纯化

在一个实施方案中，本发明提供制备本发明抗体分子或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包括在适于表达编码本发明抗体分子或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收本发明抗体分子或其片段(优选地抗原结合片段)。

在一个实施方案中，提供了制备本发明抗体分子的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体(例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生本发明抗体分子，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体，例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸，并将其插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。

VI.测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗体分子鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对所结合抗原的结合，本文中公开了例示性方法，例如生物膜层干涉技术。

本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗体的测定法。生物学活性可以包括例如结合抗原，对细胞表面抗原的结合、对抗原的抑制作用等。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。

本发明还提供用于鉴定抗体的性质，例如成药性相关性质的方法。所述成药性相关性质包括例如热稳定性。

供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达抗原或经改造而表达抗原的细胞系。此类细胞还包括表达抗原的细胞系和并非正常情况下表达抗原的编码抗原的DNA转染的细胞系。

可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换或补充本发明的抗体分子来进行任何上述测定法。

可以理解的是，能够使用本发明的抗体分子和别的活性剂来进行任何上述测定法。

在一些实施方案中，所述抗原为PD-L1(例如人PD-L1)和/或LAG-3(例如人LAG-3)。

VII.药物组合物和药物制剂

在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗体分子或其片段(优选地其抗原结合片段)或其免疫缀合物的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的抗体分子或其片段或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂)的组合。

在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤等。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。优选地，肿瘤例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌。

本发明还包括包含本发明抗体或其免疫缀合物的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和/或包含编码本发明抗体的多核苷酸的组合物(包括药物组合物或药物制剂)。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种本发明抗体或其片段或一种或多种编码一种或多种本发明抗体或其片段的多核苷酸。

这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。

如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。

合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”，第五版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，PharmaceuticalPress，London，Chicago。

若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。

本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、分散体剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。常见的优选组合物处于可注射用溶液剂或可输注溶液剂形式。优选的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹腔(i.p.)、肌内)注射。在一个优选实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体分子。在另一个优选实施方案中，通过肌内、腹腔或皮下注射施用抗体分子。

可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体与一种或多种任选的药用辅料(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，例如化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

在一些实施方案中，治疗剂选自以下类别(i)-(iii)中的一个、两个或全部类别：(i)增强抗原呈递(例如，肿瘤抗原呈递)的药物；(ii)增强效应细胞反应(例如，B细胞和/或T细胞活化和/或动员)的药物；或(iii)减少免疫抑制的药物。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

本发明的药物组合物适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。

治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或冻干形式。可以通过将活性化合物(即抗体分子)以要求的量加入适宜的溶剂中，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。通常，通过将所述活性化合物并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和其他成分。可以使用包衣剂如卵磷脂等。在分散体的情况下，可以通过使用表面活性剂来维持溶液剂的适宜流动性。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶而引起可注射组合物的延长吸收。

包含本文所述抗体分子的试剂盒也处于本发明的范围内。试剂盒可以包含一个或多个其他要素，例如包括：包装插页；其他试剂，例如标记物或用于偶联的试剂；可药用载体；和用于施用至受试者的装置或其他材料。

VIII.组合产品或试剂盒

在一些实施方案中，本发明还提供了组合产品，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂、疫苗、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等)。在一些实施方案中，所述组合产品用于用于预防或治疗疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤等。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。优选地，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌。在一些方案中，所述组合产品中的两种或多种成分可以依次、分开或同时联合施用给受试者。

在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的抗体、药物组合物、免疫缀合物或组合产品的试剂盒，以及任选的指导施用的包装插页。

在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的抗体、药物组合物、免疫缀合物、组合产品的药物制品，任选地，所述药物制品还包括指导施用的包装插页。

IX.本发明的抗体分子的用途

在一个方面，本发明涉及使用本发明的抗体分子体内用来治疗或预防需要在受试者中调节免疫应答的疾病，从而抑制或减少相关疾病如癌性肿瘤、自身免疫病、炎性疾病、感染性疾病的出现或复发。可以单独使用本发明的抗体分子。备选地，抗体分子可以与其他疗法(例如治疗剂/预防剂/治疗方式)组合施用。当本发明的抗体分子与一种或多种其他药物组合施用时，这种组合可以按任何顺序依次施用、分开或者同时施用。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种调节受试者中免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗体分子。在另一个实施方案中，本发明提供一种防止受试者中疾病出现或者复发的方法，所述方法包括向受试者施用预防有效量的本文所述的抗体分子。

在一些实施方案中，所述疾病是患者中具有(例如升高的水平，例如蛋白质或核酸水平的)LAG-3的疾病。在一些实施方案中，所述疾病是患者中具有(例如升高的水平，例如蛋白质或核酸水平的)PD-L1或PD-1或PD-L2的疾病。在一些实施方案中，所述疾病是患者中具有(例如升高水平的，例如蛋白质或核酸水平的)LAG-3以及PD-L1或PD-1或PD-L2的疾病，例如癌症。在一些实施方案中，所述疾病是将受益于抑制核酸或蛋白质水平的LAG-3和/或PD-L1或PD-1或PD-L2的疾病。在一些实施方案中，所述疾病受益于阻断PD-1与PD-L1的结合，或PD-1与PD-L2的结合。

在一些实施方案中，本发明涉及在个体中抑制抗原作用的方法，该方法包括向对象施用有效量的本文公开的抗体分子(例如，抗PD-L1/LAG3抗体)或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。在一些实施方案中，所述抗原为LAG-3(例如人LAG-3)和/或PD-L1(例如人PD-L1)。在一些实施方案中，抑制抗原作用是指阻断PD-1与PD-L1的结合，或阻断PD-1与PD-L2的结合，和/或抑制LAG-3作用。

在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的肿瘤(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗体分子或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症。

在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗体分子或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的自身免疫性疾病和/或炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗体分子或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。

受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的患者)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，如本文所述的肿瘤或感染或自身免疫性疾病)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。备选地或组合下，受试者因感染而免疫受损或具有因感染而免疫受损的风险。

在一些实施方案中，用抗体分子治疗和/或预防的癌包括但不限于实体瘤、血液学癌及转移性病灶。在一个实施方案中，癌是实体瘤。实体瘤的例子包括恶性肿瘤。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。

本文公开的方法和组合物可用于治疗与前述癌症相关的转移性病灶。

在一些实施方案中，所述肿瘤是表达(例如升高水平的)LAG-3的肿瘤，例如癌症。在一些实施方案中，所述肿瘤是表达(例如升高水平的)PD-L1的肿瘤，例如癌症。在一些实施方案中，所述肿瘤是表达(例如升高水平的)LAG-3以及PD-L1的肿瘤，例如癌症。

在一些实施方案中，用抗体分子治疗和/或预防的感染性疾病包括目前不存在有效疫苗的病原体或常规疫苗对其未及完全有效的病原体。本发明例示的抗体分子对PD-L1阻断作用特别可用来对抗随感染过程推移出现变异抗原的病原体所建立的感染。这些变异抗原在施用本发明抗体时能够被视为外来抗原，由此，本发明例示的抗体分子能够通过PD-L1激发不受负向信号抑制的强烈T细胞反应。

在一些实施方案中，用本发明的抗体分子治疗和/或预防炎性和自身免疫性疾病及移植物抗宿主病(GvHD)，来下调免疫系统。

在其他方面，本发明提供抗体分子或其片段或其免疫缀合物或组合物或组合产品或试剂盒在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗本文提及的相关疾病或病症。

在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段或免疫缀合物或组合物或组合产品或试剂盒会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。

在一些实施方案中，本发明的抗体或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的预防和/或治疗。

在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术；放射疗法、局部照射或聚焦照射等。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂或免疫调节剂。

示例性的疫苗包括但不限于癌症疫苗。疫苗可以是基于DNA的疫苗、基于RNA的疫苗或基于病毒转导的疫苗。癌症疫苗可以是预防性的或治疗性的。

示例性的抗感染活性剂包括但不限于，抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗细菌剂。

在进一步的一些实施方案中，本发明的抗体或其片段还能与酪氨酸激酶抑制剂组合使用。

在本发明的任何方法的一些实施方案中，本发明的抗体或其片段的施用与肿瘤抗原的施用组合。抗原可以例如是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌性抗原或来自病原体的抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含蛋白质。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含核酸。在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤细胞。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可以与抗肿瘤剂联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可以与细胞因子联合施用。细胞因子可以作为与本发明的抗体分子的融合分子施用，或作为单独的组合物施用。在一个实施方案中，本发明的抗体与一种、两种、三种或更多种细胞因子(例如，作为融合分子或作为单独组合物)组合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可以与本领域常规的癌症疗法组合，常规的癌症疗法包括但不限于：(i)放射疗法或用电离辐射杀死癌细胞并缩小肿瘤。放射疗法可经体外放射治疗(EBRT)或经内部近距离放射疗法施用；(ii)化学疗法，或应用细胞毒药物，其一般影响快速分裂的细胞；(iii)靶向疗法，或特异性影响癌细胞蛋白去调节的药剂；(iv)免疫疗法，或增强宿主免疫应答(例如，疫苗)；(v)激素疗法，或阻断激素(例如，当肿瘤是激素敏感的时候)，(vi)血管发生抑制剂，或阻断血管形成和生长，和(vii)姑息护理，或这样的治疗，其涉及改善护理质量以降低疼痛、恶心、呕吐、腹泻和出血，从而可容许更具攻击性的治疗方案。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可以与增强宿主免疫功能的常规方法组合。

上文所述的各种组合疗法可以进一步组合以用于治疗。

此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的疗法，例如治疗方式和/或治疗剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。抗体分子和/或其他疗法，例如治疗剂或治疗方式可以在活动性疾病期间或在缓解或活动度更小的疾病期间施用。抗体分子可以在其他治疗前、与其他治疗同时、治疗后或在疾病缓解期间施用。

在一个实施方案中，本发明的抗体的施用和别的疗法(例如治疗方式或治疗剂)的施用彼此在约一个月内，或约一，两或三周内，或约1，2，3，4，5，或6天内发生。

可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物或组合物或组合产品或试剂盒替换或补充本发明的抗体来进行任何治疗。

本发明的抗体(以及包含其的药物组合物或免疫缀合物，以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。

可以由技术人员确定本发明抗体分子的剂量和治疗方案。在一些实施方案中，调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次团注，可以随时间推移施用几个分开的剂量或可以如治疗情况的危急性所示，按比例减少或增加该剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于剂量的施用和均匀性。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗对象的单一剂量的物理分立的单元；每个单元含有预定量的活性化合物，所述的预定量经计算与所要求的药用载体结合时产生所需的治疗效果。用于本发明剂量单位形式的规格直接取决于(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，以及(b)混合这种活性化合物用于个体中敏感性治疗的领域内所特有的限制。

X.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段可以用于检测其所结合抗原在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶。

在一个方面，本发明提供了体外或体内检测生物样品，例如血清、精液或尿或组织活检样品(例如，来自过度增生性或癌性病灶)中存在相关抗原的诊断方法。该诊断方法包括：(i)在允许相互作用发生的条件下使样品(和任选地，对照样品)与如本文所述的抗体分子接触或向受试者施用所述抗体分子和(ii)检测所述抗体分子和样品(和任选地，对照样品)之间复合物的形成。复合物的形成表示存在相关抗原，并且可以显示本文所述治疗和/或预防的适用性或需求。

在一个实施方案中，可以使用本发明抗体诊断疾病，例如评价(例如，监测)对象中本文所述疾病(例如，肿瘤或感染)的治疗或进展、其诊断和/或分期。在某些实施方案中，提供标记的本发明的抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀±螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，以及利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

在本文中提供的任何发明的一些实施方案中，样品是在用本发明的抗体治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在癌症已经转移之后获得的。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定、石蜡包膜(FFPE)的。在一些实施方案中，样品是活检(例如芯活检)，手术标本(例如来自手术切除的标本)，或细针吸出物。

在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测相关抗原。

在一些实施方案中，体内确定相关抗原的水平和/或分布，例如，以非侵入方式确定(例如，通过使用合适的成像技术(例如，正电子发射断层摄影术(PET)扫描)检测可检测物标记的本发明抗体分子。在一个实施方案中，例如，通过检测用PET试剂(例如，¹⁸F-氟脱氧葡萄糖(FDG))以可检测方式标记的本发明抗体分子，体内测定相关抗原的水平和/或分布。

在一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述抗体分子和使用说明书的诊断试剂盒。

在一些实施方案中，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，包含癌细胞的受试者样品)检验相关抗原的存在，因而确定其值，将该值与对照值(例如健康个体中的相关抗原的值)比较，并且如果大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明的抗体，因而治疗疾病。

在一些实施方案中，抗原是PD-L1(例如人PD-L1)和/或LAG-3(例如人LAG-3)。

能够理解的是，在本发明各部分中描述的各个实施方案，例如疾病、治疗剂、治疗方式和施用等同样适用于本发明的其他部分的实施方案，或可以与其他部分的实施方案组合。在本发明各部分中描述的适用于抗体分子的性质、用途、和方法等实施方案，同样适用于包含抗体的组合物、缀合物、组合产品和试剂盒等。

描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。

实施例

实施例1抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体的构建

在本实施例中，构建了如图1所示结构的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体，其中抗原A为LAG-3，抗原B为PD-L1。

双特异性抗体的具体序列如下：

VL： SEQ ID NO：8；

VL-CL，即肽链#2：SEQ ID NO：7；

接头： SEQ ID NO：5

VH： SEQ ID NO：2

CH1： SEQ IDNO：3

Fc(即CH2-CH3)：SEQ ID NO：4

VHH： SEQ ID NO：6

VH-CH1-Fc-VHH，即肽链#1：SEQ ID NO：1。

实施例2.抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体的表达、纯化和分析

在本实施例中，将编码实施例1中构建的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体的肽链#1、肽链#2的核苷酸序列分别通过多克隆位点连接入市售的真核表达载体pTT5，在真核细胞中进行表达和纯化，获得了抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体IGN-LP。具体操作如下。

委托苏州金唯智生物科技有限公司(Genewiz)合成了双特异性抗体IGN-LP的上述各肽链的编码核苷酸序列。使用合适的限制性内切酶和连接酶将所合成的编码肽链的核苷酸序列分别连接入载体pTT5中，获得了分别含有所述编码肽链的核苷酸序列的重组载体。

所述重组载体经测序验证正确后用于随后的表达。

将HEK293细胞(购自Invitrogen公司)传代培养于Expi293细胞培养液(购自Invitrogen公司)中。转染前一天离心细胞培养物，获得细胞沉淀，用新鲜的Expi293细胞培养液悬浮细胞，将细胞密度调整为1×10⁶个细胞/ml。继续培养HEK293细胞，使得转染当天的培养物中细胞密度约为2×10⁶个细胞/ml。

取HEK293细胞悬浮液终体积1/10的F17培养基(购自Gibco公司，产品目录号A13835-01)作为转染缓冲液。向每毫升转染缓冲液中加入200μg的1∶1摩尔比率的上述制备的分别包含编码肽链#1或肽链#2的核苷酸序列的重组质粒，混匀，再加入聚乙烯亚胺(polyethylenimine(PEI))(Polysciences，目录号：23966)30μg，混匀，室温温育10分钟后，将PEI/DNA混合物轻柔倒入HEK293细胞悬浮液中。轻轻混匀，置于8％CO₂、36.5℃过夜培养。

过夜培养后，向培养瓶中补加转染后培养物体积1/50的浓度为200g/L的FEED(Sigma，目录号：H6784-100G)和转染后培养物体积1/50的浓度为200g/L的葡萄糖溶液，轻轻混匀，置于8％CO₂、36.5℃继续培养。20小时后，加入VPA(Gibco，目录号：11140-050)至终浓度为2mM/L。连续培养至第7天或者细胞活力≤60％时，收集培养物，以7500转/分钟离心30分钟，取细胞上清，使用SARTOPORE(Sartorius，目录号：5441307H4)过滤后，在AKTApure系统(GE Healthcare)上通过亲和层析进行纯化。

具体的亲和层析纯化操作步骤为：

1)亲和纯化：选用MabSelect SuRe(GE Healthcare，目录号：17-5438-03)亲和层析柱，并置于AKTApure系统内。用0.1M NaOH对装备有MabSelect SuRe亲和层析柱的AKTApure系统过夜除内毒。收样当天将细胞7500rpm/min离心30min，使用SARTOPORE(Sartorius，5441307H4)过滤。

然后用5倍柱体积的结合缓冲液(Tris 20mM，NaCl 150mM，pH 7.2)清洗系统以及平衡柱子。将上述过滤后的细胞上清通过柱子。用5至10倍柱体积的结合缓冲液再平衡，使用AKTApure系统配备的紫外检测装置监测至紫外走平。

然后，用洗脱缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠100mM，pH 3.5)洗脱抗体，根据紫外吸收值来收集样品。每1ml的收集液加80ul的中和缓冲液(Tris-HCl 2M)中和备用。

2)更换缓冲液：利用大小排阻层析(size exclusion chromatography；SEC)检测收集的各级分管中样品的纯度。

将纯化后的双特异性抗体溶液使用15ml超滤离心管，4500转/分钟离心30分钟。使用PBS将蛋白稀释后继续离心，4500转/分钟离心30分钟，重复该操作2次，以更换缓冲液。将更换缓冲液后的抗体合并，测抗体浓度。SEC结果分别如图2所示，IGN-LP纯度较高，其单体主峰纯度为98.99％。

在后续实验中选取获得的抗体进行进一步的研究。

实施例3.抗LAG-3抗体ADI-31853的生产和纯化

根据本领域常规方法，将编码抗LAG-3抗体ADI-31853的轻链氨基酸序列和重链氨基酸序列(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：19)的cDNA分别克隆到表达载体pTT5中。

将含有目标抗体基因的上述表达载体与转染试剂PEI(Polysciences)按照生产产商提供的方案瞬时转染培养的人肾胚细胞293细胞(Invitrogen)，转染后，弃去培养基并用新鲜的EXPI293培养基(Gibco)把细胞稀释到4×10⁶/ml。在37℃，5％CO₂的条件下培养细胞7天，每48小时流加新鲜培养基。7天后，1300rpm离心20min。取上清液，用Protein A纯化上清液，使抗体的纯度＞95％。

按照ZL201710657665.3中方法获得抗PD-L1人源化Nb-Fc抗体。

实施例4.双特异性抗体和抗原的结合活性检测

使用Octet系统(ForteBio公司生产)通过动力学结合测定法确定本发明的制备的示例性抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体IGN-LP结合LAG-3和PD-L1的平衡解离常数(K_D)。按照文献中报导的方法(Estep，P等人，High throughput solution Based measurement ofantibody-antigen affinitv and epitope binning.MAbs，2013，5(2)：p.270-278)进行ForteBio亲和力测定。简言之：

1)准备传感器：在实验开始前半个小时，将AHQ传感器(Pall，目录号：1506091)浸泡于SD缓冲液(PBS 1×，BSA 0.1％，吐温200.05％)中于室温平衡。

2)向96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner)的孔中分别加入100μl的SD缓冲液作为空白对照(用于扣除背景)、100μl 100nM纯化的双特异性抗体IGN-LP和作为对照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗体(ZL201710657665.3)、抗LAG-3抗体ADI-31853(如实施例3所示制备)、100μl稀释于SD缓冲液中作为抗原的人PD-L1-his(100nM)和人LAG-3-his (100nM)(均来自义翘神州)的溶液。将抗人IgG Fc生物传感器AHQ浸没于分别含所述抗体溶液的孔中，在室温浸没600秒上样。随后将传感器在SD缓冲液中洗涤至达到基线，然后浸没于含100ul抗原溶液的孔中，监测抗体与抗原的结合。随后将传感器转移至含有100ul SD缓冲液的孔，监测抗体解离(设置运行步骤及时间：Baseline、Loading～1nm、Baseline、Association和Dissociation时间取决于样品结合、解离速度)。转速为400转/分钟，温度为30℃。通过Octet分析软件(ForteBio)拟合经背景校正的结合曲线和解离曲线，产生结合(k_on)和解离(k_dis)速率常数，它们随后用来计算平衡解离常数(K_D)。表1和表2中显示了双特异性抗体IGN-LP与抗原LAG-3或PD-L1的k_on、k_dis和K_D数据。

表1.通过ForteBio动力学结合测定法确定的抗PD-L1/LAG-3双特异性抗体和LAG-3的亲和力

表2.通过ForteBio动力学结合测定法确定的抗PD-L1/LAG-3双特异性抗体和PD-L1的亲和力

如上表所示，IGN-LP可以同时和PD-L1及LAG-3蛋白结合，且维持了亲本抗体的亲和力常数。

实施例5.本发明的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体与过量表达LAG-3或PD-L1的细胞的结合分析

通过FACS测量了本发明的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体IGN-LP与过量表达LAG-3或PD-L1细胞的结合。

简而言之，使用ExpiCHO^TM Expression System Kit(Invitrogen，目录号：A29133)，根据制造商的说明书实施如下操作：

将携带克隆至多克隆位点MCS的人LAG-3或人PD-L1 cDNA(Sino BiologicalInc.)的pCHO1.0载体(Invitrogen)分别转染至HEK293(Invitrogen)细胞及中国仓鼠卵巢癌细胞(CHOS)(Invitrogen)，产生过表达人LAG-3的293细胞(293-LAG-3)及过表达PD-L1的CHOS细胞(CHO-PD-L1)。

为了验证双特异性抗体是否可以和细胞表面表达的抗原相结合，本研究利用流式细胞技术检测了双特异性抗体和293-LAG-3或CHOS-PD-L1细胞的结合，实验过程如下：

1)将293-LAG-3/CHO-PD-L1细胞计数，用细胞培养基稀释至1×10⁶个细胞/ml，，向U型底96孔板中以100μl/孔加入。

2)检测步骤：在离心机上以400g离心5分钟，去除细胞培养基。分别将100μl梯度稀释的本发明的双特异性抗体IGN-LP和作为对照的人源化Nb-Fc、抗LAG-3抗体ADI31853加入U型板并重悬细胞，冰上静置30分钟。400g离心5分钟，去除上清，通过用PBS洗涤细胞，移除未结合的抗体。400g离心5分钟，去除PBS。每孔加入100μl1∶200稀释的PE缀合的抗人Fc抗体(Jackson Immuno Research)，冰上避光孵育30分钟。400g离心5分钟，去除上清。通过用PBS洗涤细胞1次，移除未结合的PE缀合的抗人Fc抗体。用100μl PBS重悬细胞，通过FACS检测抗体与细胞的结合。

检测结果如图3所示，IGN-LP能够和细胞表面的PD-L1结合，结合EC50分别为1.033nM，和亲本抗PD-L1抗体的结合能力相似(EC50为1.199nM)。如图4所示，IGN-LP能够和细胞表面的LAG-3结合，结合EC50为0.4345nM，和亲本抗LAG-3抗体ADI-31853的结合能力相似(EC50为0.5039nM)。

实施例6.本发明的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体同时结合过量表达LAG-3的293细胞和过量表达PD-L1的CHO细胞的分析

为了验证双特异性抗体是否可以同时和来自不同细胞上的靶抗原结合，本实施例利用流式细胞技术，检测了双特异性抗体诱导的不同细胞交联情况。具体实验过程如下。

1)如实施例5所述获得CHO-PD-L1细胞和293-LAG-3细胞并培养。分别将含有CHO-PD-L1细胞和293-LAG-3细胞的培养物在离心机上以400g离心5分钟，去除细胞培养基。用PBS洗一遍后，再用PBS重悬细胞。计数细胞，并调整细胞密度为2×10⁶个细胞/ml。将CHO-PD-L1细胞和293-LAG-3细胞中分别按照1∶5000加入CellTracker^TMDeep Red(Thermo)和Cell Trace CFSE(Invitrogen)染料，于37℃放置30分钟。在离心机上以400g离心5分钟，去除上清液，用PBS洗一次细胞。

2)将梯度稀释的本发明的双特异性抗体IGN-LP和作为对照的人源化Nb-Fc(1000nM)、抗LAG-3抗体ADI31853(1000nM)分别加入U型底96孔板中。加入上述1)的染色后CHO-PD-L1细胞，混合(细胞终密度为1.5×10⁶个/ml)。将U型底96孔板4℃放置30分钟后取出板，于400g离心5分钟，然后用PBS洗四次，并用PBS重悬细胞。

3)向U型底96孔板的上述2)的细胞悬液中加入上述1)的染色后的293-LAG-3细胞，使得293-LAG-3细胞终密度为1×10⁶个/ml，于室温放置1小时后进行流式细胞仪(BD，ACCURIC6)检测。通道2及通道4双阳性细胞的比例可反映出由双特异性抗体IGN-LP引起的细胞交联情况。

检测结果如图5所示，IGN-LP能够诱导CHOS-PD-L1细胞及293-LAG-3细胞的交联，证明本发明的双特异性抗体能够同时结合来自不同细胞表面的靶抗原。

本实施例中使用的IgG1阴性对照的重链(HC)氨基酸序列如下：

IgG1阴性对照的轻链(LC)氨基酸序列如下：

实施例7.本发明的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体的热稳定性检测

差示扫描荧光法(DSF)可根据图谱中的荧光变化过程提供有关结构稳定性的信息，检测蛋白的构型变化。荧光曲线绝对值最大时对应的温度为该蛋白的Tm。本研究利用DSF法，测定本发明的双特异性抗体的Tm值，实验过程如下：

1)用PBS稀释抗体样品至1mg/ml。用PBS将SYPRO Orange蛋白凝胶染色(Gibco，S6650)稀释50倍，即4μl SYPRO Orange蛋白凝胶染色母液加196μl PBS；

2)在96孔PCR板中加入50μl稀释后抗体样品+10μl SYPRO Orange蛋白凝胶染色稀释液+40μl水。置于7500实时PCR系统进行检测。

实验结果如表3所示，双特异性抗体的Tm＞63℃，具有较好的热稳定性。

表3：本发明的双特异性抗体IGN-LP的DSF的Tm值

实施例8.本发明的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体对T细胞的激活效果检测

本研究使用混合淋巴细胞实验检测了双特异性抗体对人T细胞的激活作用，具体实验过程如下：

1)PBMC分离：取捐赠者新鲜血液50ml，添加2.5倍PBS，轻轻加入到FiColl(Thermo)分4管，每管12.5ml，在离心机中400g，30min离心，0减速度停止。吸取中间白色条带至PBS中，PBS洗2次。

2)DC细胞分离：取分离的PBMC细胞添加5ml T细胞培养基(X-VIVO 15(LONZA))，37℃、6％CO₂、贴壁培养2h，吸取悬浮细胞液做CD4+细胞分离，剩下细胞添加3ml DC培养基，培养2天后添加3ml DC培养基(X-VIVO 15(Lonza)99％，人AB血清(Access)1％，HEPES 10mM，β-Me 50μM，IL-4(R&D Systems)1000U/ml，GM-CSF(R&D Systems)1000U/m1)，再培养第5天，然后添加rTNFa(R&D Systems)(1000U/ml)，IL-1b(R&D Systems)(5ng/ml)，IL-6(R&DSystems)(10ng/ml)和1μM PGE2(R&D Systems)培养2天，作为淋巴细胞混合反应(MLR)的DC细胞。

3)CD4+细胞分离：1)中获得的PBMC静置培养2h，吸取悬浮的细胞液至20ml离心管中，200g离心10min，沉淀加入500μl分离液、100μl AB型血清、100μl纯化抗体重悬，4℃孵育20min，用分离液(Stemcell(20144))清洗一次，再加入500μl Bead Buffer孵育15min，磁场去除Bead，T细胞培养基(X-VIVO 15(LONZA)))洗一次，使用8ml T细胞培养基重悬，37℃、6％CO₂培养。(按照‘Human CD4+T cell Enrichment Kit’(19052，Stemcell)说明书操作，例如该试剂盒进行操作，所用试剂均来自该试剂盒)。

4)CD4+Beads刺激：将3)中获得的CD4+Cells(1×107个)重悬于4ml培养基中，以1∶1加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)，培养三天。

5)MLR：将成熟的DC细胞与刺激的CD4+细胞混合，每孔体积200μl，DC细胞10000个，CD4+细胞100000个，加入梯度稀释的抗体和1nM SEE(Toxin technology)，IgG(人IgG(equitech-Bio))作为阴性对照，混合培养3天。

6)所用的抗体以及其起始浓度如下：

IgG：10mg/ml

IGN-LP：11.3mg/ml

抗PD-L1人源化Nb-Fc抗体：1.27mg/ml

抗LAG-3抗体ADI-31853：10.5mg/ml

7)采用Cisbio Human IL-2kit检测培养基中IL-2的浓度。

检测液配制(试剂均来自Human IL2 1000tests试剂盒，Cisbio)

取30μl Human IL-2d2 antibody(来源)至570μl检测缓冲液(来源)中，取30μlHuman IL-2cryptate antibody(来源)至570μl检测缓冲液中，二者1∶1混合。

实验结果如图6所示，双特异性抗体可以在体外激活T细胞，其激活效果比抗PD-L1或抗LAG-3抗体单独使用更强，和抗PD-L1和抗LAG-3抗体联合使用相似。

实施例9.双特异性抗体促进TCR：pMHC结合能力的检测

提前一天在96孔板中铺板CHOK1-PD-L1(Promega，CS187109)，4×10⁵个/孔，每孔100ul RPMI1640(Gibco，22400-071)。实验当天，对Jurkat-LAG3(Promega，(Promega，CS187109))进行计数，利用培养基调整细胞密度为2.5×10⁶个/ml。

将作为阴性对照的IgG(人IgG(equitech-Bio))、本发明的双特异性抗体IGN-LP、抗PD-L1人源化Nb-Fc抗体、抗LAG-3抗体ADI-31853，以及Nb-Fc+ADI-31853作为样品利用RPMI 1640(Gibco，22400-071)培养基进行三倍梯度稀释，起始浓度为200nM，共10个梯度。

移去96孔板中CHOK1-PD-L1的上清，加入上述Jurkat-LAG3细胞，40ul/孔；分别加入上述稀释好的各个样品，40ul/孔，37℃孵育16小时。

16小时后，用多功能酶标仪(Thermo，Max I3)进行读数，获取TCR：pMHC的生物发光(RU)(荧光信号)。用GraphPad拟合浓度依赖的曲线。检测结果如图7所示，双特异性抗体IGN-LP相比各自的单抗人源化Nb-Fc抗体和抗LAG-3抗体ADI-31853甚至联合(人源化Nb-Fc抗体+抗LAG-3抗体ADI-31853)更能促进TCR：pMHC结合，并激活下游信号通路。

实施例10.本发明抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体的抗肿瘤活性

本研究采用接种有MC38-huPD-L1 KI(MJ-1)结肠癌细胞的PD-L1转基因小鼠(MC38-huPD-L1 KI荷瘤小鼠模型，简称MC38/PD-L1模型)测定本发明的抗LAG-3/PD-L1抗体IGNLP(即如实施例2所述制备的IGN-LP)的抗肿瘤作用。

采用皮下接种的方式建立MC38-huPD-L1 KI荷瘤小鼠模型，成瘤后分组，给予不同抗体的治疗，监测给药期间各组小鼠肿瘤体积和体重变化，给药频率为2次/周，给药2周，共给药5次。监测频率均为2次/周，连续监测4周，给药剂量和方式如下所述。给药结束后计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝i00％*(h-IgG对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/(h-IgG对照组肿瘤体积-h-IgG对照组给药前肿瘤体积)，其中h-IgG对照组给药前肿瘤体积平均值为80mm³。

小鼠：PD-L1转基因小鼠，雌性，7-8周(肿瘤细胞接种时的小鼠周龄)，体重18-20g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司。小鼠在到达后驯化7天，随后开始研究。

细胞：小鼠的结肠癌细胞MC38(上海和元生物，HYC0116)购自上海和元生物，并敲入人PD-L1基因(南京银河生物医药有限公司)，获得包含人PD-L1的MC38细胞，用RPMI 1640培养基(Gibco，22400-071)培养，严格按照MC38培养要求进行常规传代培养用于后续体内实验。离心(400g/分，5分钟)收集细胞，在无菌RPMI 1640基础培养基中重悬细胞并调整细胞密度为5×10⁶个/ml。PD-L1转基因小鼠右侧背部剃毛，皮下注射MC38-huPD-L1 KI细胞，0.2ml/只。肿瘤细胞接种5天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤平均体积在76-80mm³范围内的小鼠按瘤体积随机分组。按如下给药方式，检测抗LAG-3/PD-L1抗体单独使用的抗肿瘤活性。

给药：将小鼠分为11组(每组6只小鼠)，每组分别皮下注射如下剂量的抗体：

(1)人IgG(equitech-Bio)，15mg/kg；

(2)抗PD-L1抗体(人源化抗PD-L1抗体Nb-Fc)，1.25mg/kg；

(3)抗PD-L1抗体(人源化抗PD-L1抗体Nb-Fc)，2.5mg/kg；

(4)抗PD-L1抗体(人源化抗PD-L1抗体Nb-Fc)，5mg/kg；

(5)LAG-3(ADI-31853)，10mg/kg；

(6)LAG-3(ADI-31853)，10mg/kg+抗PD-L1抗体(人源化抗PD-L1抗体Nb-Fc)，1.25mg/kg；

(7)LAG-3(ADI-31853)，10mg/kg+抗PD-L1抗体(人源化抗PD-L1抗体Nb-Fc)，2.5mg/kg；

(8)LAG-3(ADI-31853)，10mg/kg+抗PD-L1抗体(人源化抗PD-L1抗体Nb-Fc)，5mg/kg；

(9)抗LAG-3/PD-L1抗体(IGNLP)，3mg/kg；

(10)抗LAG-3/PD-L1抗体(IGNLP)，6mg/kg；

(11)抗LAG-3/PD-L1抗体(IGNLP)，12mg/kg。

人IgG为获自Equitech-Bio的人IgG制备物。

在肿瘤细胞接种后的第5天、第9天、第12天、第15天和第18天，分别用如上抗体为每组小鼠按如上剂量给药。

分析：在整个研究期间每周测量两次肿瘤和体重，当肿瘤达到端点时(肿瘤体积＞3000mm³)或当小鼠具有＞20％体重减轻时，使小鼠安乐死。采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W²/2。将来自每组的小鼠的肿瘤尺寸与时间作图。使用方差分析(ANOVA)来确定统计显著性。<0.05的P值被视为在所有分析中具有统计显著性。

实验结果见下表和图8-10，可见本申请的抗LAG-3/PD-L1抗体IGNLP单独使用时与IgG对照(equitech-Bio)或抗LAG-3或抗PD-L1抗体单独或组合使用相比，能显著抑制肿瘤的生长。

表4.第29天肿瘤抑制率

表5序列信息：

表6序列

Claims

1.一种抗体分子或其抗原结合片段，所述抗体分子或其抗原结合片段由两条式(I)的多肽链和两条式(II)的多肽链组成：

(i)式(I)的多肽链：

VH-CH1-Fc-X-VHH；和

(ii)式(II)的多肽链：

VL-CL；

其中：

VH表示重链可变区，其包含

(i)互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成；HCDR2由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；HCDR3由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成；

CH表示重链恒定区；

Fc包含CH2、CH3，以及任选的CH4；

CH1、CH2、CH3和CH4分别表示重链恒定区的结构域1、2、3和4；

X可以不存在，或者在存在时表示接头；

VHH表示单结构域抗原结合位点；

VL表示轻链可变区，其包含

互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成；LCDR2由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成；LCDR3由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成；

CL表示轻链恒定区；

其中由VH和VL形成的抗原结合位点对第一抗原是特异性的，且第一抗原是人LAG-3；

任选地，CH1和Fc之间存在铰链区。

2.权利要求1的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述接头是柔性接头。

3.权利要求2的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述接头包含氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。

4.权利要求3的抗体分子或其抗原结合片段，其中n是1、2、3、4、5、6或7。

5.权利要求1的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述抗体分子是人源化抗体或嵌合抗体。

6.权利要求1-5中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述单结构域抗原结合位点VHH是天然缺乏轻链的抗体的重链可变结构域或衍生自其的经重组的单结构域抗原结合位点。

7.权利要求6的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述重链可变结构域选自骆驼科物种中天然存在的重链抗体的重链可变结构域或鱼类中称为新型抗原受体的免疫球蛋白中的VH样单结构域或骆驼化的人VH结构域或人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。

8.权利要求6的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述单结构域抗原结合位点选自骆驼科物种中天然存在的重链抗体的重链可变结构域、骆驼化的人VH结构域和人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。

9.权利要求1-5中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)的“CH1-Fc”为IgG的形式和/或式(II)的CL来自κ或λ。

10.权利要求9的抗体分子或其抗原结合部分，其中IgG的形式为IgG1、IgG2或IgG4的形式。

11.权利要求1-5中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，由VHH形成的抗原结合位点对第二抗原是特异性的，其中第一抗原与第二抗原相同或不同。

12.权利要求11的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述第二抗原选自生长因子或血管新生诱导因子，以及这些分子的配体和/或受体。

13.权利要求11的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述第二抗原选自OX40、CD47、PD1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、4-1BB(CD137)、VEGF和GITR。

14.权利要求13的抗体分子或其抗原结合片段，其中第二抗原是PD-L1。

15.权利要求14的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述第二抗原是人PD-L1。

16.权利要求15的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)中的VHH包含

互补决定区域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3，

其中VHH CDR1由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成；VHH CDR2由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成；VHH CDR3由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。

17.权利要求16的抗体分子或其抗原结合片段，其中VHH包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

18.权利要求17的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述VHH包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

19.权利要求18的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述VHH由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成。

20.权利要求1-5和12-19中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中

式(I)中的VH包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；

和/或

VL包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

21.权利要求20的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)中的VH包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和/或VL包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

22.权利要求20的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)中的VH由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，且VL由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。

23.权利要求1-5和12-19和21或22中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中

(a)式(I)中的VH-CH1-Fc包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；

和/或

(b)式(II)的VL-CL包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

24.权利要求23的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)中的VH-CH1-Fc包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列或由其组成，和/或式(II)的VL-CL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成。

25.权利要求23的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)中的VH-CH1-Fc由SEQ IDNO:19的氨基酸序列组成；且式(II)的VL-CL由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。

26.权利要求1-5和12-19、21-22和24-25中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)的多肽链包含与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；和/或其中式(II)的多肽链包含与SEQ ID NO:7所示的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

27.权利要求26的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)的多肽链包含SEQ ID NO:1所示的序列，和/或式(II)的多肽链包含SEQ ID NO:7所示的序列。

28.权利要求27的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)的多肽链由SEQ ID NO:1所示的序列组成，且式(II)的多肽链由SEQ ID NO:7所示的序列组成。

29.分离的核酸，其编码权利要求1至28中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段。

30.包含权利要求29的核酸的载体。

31.权利要求30的载体，其中所述载体是表达载体。

32.权利要求31的载体，其中所述载体是pTT5载体。

33.包含权利要求29的核酸或权利要求30-32中任一项的载体的宿主细胞。

34.权利要求33的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。

35.权利要求33的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

36.权利要求33的宿主细胞，其中所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。

37.制备权利要求1至28中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达权利要求29的核酸的条件下培养权利要求33-36中任一项的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选的所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗体或其抗原结合片段。

38.免疫缀合物，其包含权利要求1至28中任一项的抗体分子或其抗原结合片段和其它物质。

39.权利要求38的免疫缀合物，其中所述其它物质是治疗剂或标记。

40.权利要求38的免疫缀合物，其中所述其它物质是细胞毒性剂。

41.药物组合物，其包含权利要求1至28中任一项的抗体分子或其抗原结合片段或者权利要求38-40中任一项的免疫缀合物，以及任选的药用辅料。

42.药物组合物，其包含权利要求1至28中任一项的抗体分子或其抗原结合片段或者权利要求38-40中任一项的免疫缀合物，以及其它治疗剂，以及任选的药用辅料。

43.权利要求42的药物组合物，其中所述其它治疗剂选自化疗剂、其它抗体、细胞毒性剂、疫苗、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。

44.组合产品，其包含权利要求1至28中任一项的抗体分子或其抗原结合片段或权利要求38-40中任一项的免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂。

45.权利要求44的组合产品，其中所述其它治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。

46.权利要求1至28中任一项的抗体分子或其抗原结合片段、或权利要求38-40中任一项的免疫缀合物、或权利要求41-43中任一项的药物组合物在制备药物或组合产品中的用途，其中所述药物或组合产品用于在受试者中预防或治疗疾病，其中所述疾病为肿瘤。

47.权利要求46的用途，其中所述肿瘤是癌症。

48.权利要求47的用途，其中所述癌症是具有升高的表达水平的PD-1、PD-L1或PD-L2和/或LAG-3的癌症。

49.权利要求47或48的用途，其中所述癌症是结肠癌或结直肠癌或直肠癌。

50.权利要求46-48中任一项所述的用途，其中所述药物或组合产品与一种或多种其它疗法联合施用。

51.权利要求50的用途，其中所述疗法包括手术治疗和/或放射疗法和/或其它治疗剂。

52.权利要求51的用途，其中所述治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。

53.权利要求1至28中任一项的抗体分子或其抗原结合片段在制备用于检测样品中LAG3的检测试剂中的用途，所述检测包括

(a)将样品与权利要求1-28任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；和

(b)检测抗体或其抗原结合片段和抗原间的复合物的形成，任选地，所述抗体被可检测的标记。

54.权利要求12的抗体分子或其抗原结合片段在制备用于检测样品中LAG3和其它抗原的检测试剂中的用途，所述检测包括

(a)将样品与权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段接触；和

(b)检测抗体或其抗原结合片段和抗原间的复合物的形成，任选地，所述抗体被可检测的标记，其中所述其它抗原选自生长因子、血管新生诱导因子，以及这些分子的配体和/或受体。

55.权利要求13的抗体分子或其抗原结合片段在制备用于检测样品中LAG3和其它抗原的检测试剂中的用途，所述检测包括

(a)将样品与权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段接触；和

(b)检测抗体或其抗原结合片段和抗原间的复合物的形成，任选地，所述抗体被可检测的标记，其中所述其它抗原选自OX40、CD47、PD1、PD-L1、PD-L2、4-1BB(CD137)、VEGF和GITR。

56.权利要求14的抗体分子或其抗原结合片段在制备用于检测样品中LAG3和其它抗原的检测试剂中的用途，所述检测包括

(a)将样品与权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段接触；和

(b)检测抗体或其抗原结合片段和抗原间的复合物的形成，任选地，所述抗体被可检测的标记，其中所述其它抗原为PD-L1。

57.权利要求53-56中任一项的用途，其中所述LAG3为人LAG-3。