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CN113376380A - 一种检测犬il-6的elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测犬il-6的elisa试剂盒及其应用 Download PDF

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CN113376380A CN202110618231.9A CN202110618231A CN113376380A CN 113376380 A CN113376380 A CN 113376380A CN 202110618231 A CN202110618231 A CN 202110618231A CN 113376380 A CN113376380 A CN 113376380A
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Abstract

本发明公开了一种检测犬IL‑6的ELISA试剂盒及其应用。本发明通过IL‑6的引物设计、蛋白诱导和动物免疫，制备出犬IL‑6的单克隆抗体和多克隆抗体，分别将两种抗体作为检测抗体和捕获载体用于ELISA双抗夹心试剂盒中，建立了犬IL‑6的检测试剂盒及其使用方法。本发明所建立的犬IL‑6检测试剂盒可以定量检测样品中IL‑6，兼具灵敏度高和检测范围广的特点，其最低检测值为1.17ng/mL，检测范围为1.17ng/mL～300ng/mL。

Description

一种检测犬IL-6的ELISA试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，涉及一种检测犬IL-6的ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
白介素-6(Interleukin-6，IL-6)，最初被描述为B细胞刺激因子，现在被称为多效性细胞因子，具有多种关键的生物学功能，包括刺激炎症和免疫反应、促进造血和肿瘤发生。它由免疫细胞如单核细胞和巨噬细胞瞬时产生，但也由其他细胞谱系在各种刺激下(如感染或组织损伤)产生。此外，白介素-6作为干细胞扩增和分化的辅助因子与造血相关。
白介素-6的生理特性是复杂的，在免疫系统中具有促炎和抗炎作用。白介素-6在急性炎症状态下调节几种肝脏特异性基因的转录，特别是C-反应蛋白(CRP)，并控制正常浆细胞的存活。此外，白介素-6是T细胞反应的激活剂或抑制剂，这种促炎和抗炎活性的相互作用表明白介素-6可能在调节对疾病的生理反应中起作用。鉴于白介素-6在免疫反应中的作用，在任何针对白介素-6信号传导的治疗策略中，增强易感性都是一个合理的考虑因素，例如白介素-6受体(妥昔单抗、萨里鲁单抗)或白介素-6(斯妥昔单抗)，越来越多地用于治疗类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎。
白介素-6的表达增多与多种疾病过程有关，包括阿尔茨海默病、自身免疫(如类风湿性关节炎)、炎症、心肌梗死、佩吉特病、骨质疏松症、实体瘤、前列腺癌和膀胱癌、某些神经性癌症、B细胞恶性肿瘤。在某些情况下，白介素-6与增殖途径有关，因为它与其他因子一起作用，如肝素结合上皮生长因子和肝细胞生长因子。因此，阻断白介素-6在许多病理情况下可能是有益的。
白介素-6不仅在全身炎症的发病机制中发挥作用，而且在局部炎症的发病机制中起着至关重要的作用，并参与许多类型细胞的生长和分化。在人体内，白介素-6在全层皮肤损伤后迅速产生和释放，甚至在损伤后持续24h。白介素-1β主要由巨噬细胞和单核细胞以及活化成纤维细胞和角质细胞在内的非免疫细胞产生，有助于伤口愈合。在犬体内，白介素-1β通过多种细胞中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路刺激白介素-6的产生和释放，是犬皮肤伤口愈合的关键过程。
虽然检测IL-6水平不能直接作为判断动物是否患有某种疾病的依据，但动物体内IL-6水平与各种疾病存在着关联，因此建立一种高效的检测方法检测动物体内IL-6水平，用于监测动物健康状况、疾病预后情况、及动物免疫状态，对于犬类意义重大。免疫动物血清或细胞中细胞因子水平是衡量疫苗免疫效果的重要指标之一。因此，建立犬IL-6的检测方法，对于评价疫苗的免疫效果具有重要意义。
目前常用的检测细胞因子的方法有放射免疫分析(RIA)、RT-PCR。放射免疫分析法灵敏度受方法本身工作原理的限制，对体内某些含量特别低的物质尚不能测定，且存在放射线辐射和污染等问题。RT-PCR优点为特异性高，灵敏性高，检测速度快。但由于其灵敏度过高，假阳性结果出现的概率过高，必须同时设置阴性对照。RT-PCR需要多次摸条件，操作要求熟练。
目前市面上虽然有检测犬IL-6的ELISA试剂盒，但具有高灵敏度的试剂盒，其试剂盒的检测范围都比较小；而检测范围比较大的试剂盒，其灵敏度却不高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测犬IL-6的ELISA试剂盒及其应用，本发明通过IL-6的引物设计、蛋白诱导和动物免疫，制备出犬IL-6的单克隆抗体和多克隆抗体，分别作为检测抗体和捕获载体用于ELISA双抗夹心试剂盒中，建立了犬IL-6的检测试剂盒及其使用方法。
本发明的第一个目的是提供一种检测犬IL-6的ELISA试剂盒。
本发明的第二个目的是提供所述ELISA试剂盒的使用方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明通过IL-6的引物设计、蛋白诱导和动物免疫，制备出犬IL-6的单克隆抗体和多克隆抗体，分别作为检测抗体和捕获载体用于ELISA双抗夹心试剂盒中。该试剂盒能够定量检测犬IL-6，标准曲线的线性关系良好，并且有着较高的灵敏度和较广的检测范围。
因此，本发明要求保护以下内容：
一种检测犬IL-6的ELISA试剂盒，包括：pET-IL6单克隆抗体、pET-IL6多克隆抗体、酶标板、封闭液、羊抗兔酶标二抗、显色液、终止液；
其中，所述pET-IL6单克隆抗体和pET-IL6多克隆抗体是由pET-IL6蛋白通过免疫动物制备的抗体，所述pET-IL6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述pET-IL6单克隆抗体作为捕获抗体，pET-IL6多克隆抗体作为检测抗体。
优选地，所述封闭液为2％～5％BSA、2％～5％脱脂奶粉的一种或多种，其中百分数为质量百分比。
更优选地，所述封闭液为质量比为5％的脱脂奶粉。
优选地，所述pET-IL6蛋白的制备方法为：
扩增IL-6基因，将IL-6基因和载体pET-32a(+)连接，得到pET-IL6重组质粒；
将质粒转化到BL21大肠杆菌中，获得pET-IL6重组菌；用0.1～1.5mmol/L IPTG对pET-IL6重组菌进行诱导，22～42℃诱导培养2～6h，收集菌液，离心弃上清，沉淀进行超声破碎后取上清，对所得蛋白进行纯化，即得pET-IL6蛋白；
所述IL-6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
更优选地，扩增IL-6使用特异性引物组为序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
更优选地，所述IPTG浓度为0.1～0.8mmol/L。
最优选地，所述IPTG浓度为0.1mmol/L。
更优选地，所述诱导培养的温度为28～37℃。
最优选地，所述诱导培养的温度为37℃。
更优选地，所述诱导培养的时间为3～5h。
最优选地，所述诱导培养的时间为4h。
优选地，所述pET-IL6单克隆抗体的浓度为24～48μg/mL，pET-IL6多克隆抗体按1：500～1：100稀释。
更优选地，所述pET-IL6单克隆抗体的浓度为36～48μg/mL，pET-IL6多克隆抗体按1：100稀释。
优选地，所述羊抗兔酶标二抗的稀释度为1：1000～1：500。
更优选地，所述羊抗兔酶标二抗的稀释度为1：500。
优选地，所述显色液为四甲基联苯胺。
优选地，所述终止液为H2SO4。
所述ELISA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1.包被：pET-IL6单抗，100μL/孔，加入酶标板内，冰箱过夜；
S2.洗板：弃去酶标板内液体，PBST按200μL/孔，振荡润洗4次，一次60s；
S3.封闭：每孔加100μL的封闭液，于恒温箱37℃进行封闭，封闭后洗板步骤同S2；
S4.加样：每孔100μL样品，37℃条件下孵育，洗板步骤同S2；
S5.加检测抗体：将pET-IL6多抗用封闭液稀释，每孔加100μL稀释后的pET-IL6多抗，于37℃条件下作用60min，洗板同S2；
S6.加二抗：每孔加入稀释后的羊抗兔酶标二抗100μL，于37℃环境下孵育60min，洗板同S2；
S7.显色：避光环境下，加显色液，100μL/孔，37℃条件下作用10min；
S8.终止：每孔加入50μL终止液，终止反应；
S9.读数：使用酶标仪读取每孔的OD450值。
优选地，所述步骤S3中，封闭时间为1～2h。
更优选地，所述步骤S3中，封闭时间为1～1.5h。
最优选地，所述步骤S3中，封闭时间为1h。
优选地，所述步骤S4中，样品的孵育时间为1～2h。
更优选地，所述步骤S4中，样品的孵育时间为1.5～2h。
最优选地，所述步骤S4中，样品的孵育时间为1.5h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用单抗做捕获抗体、多抗做检测抗体的方法，建立的双抗夹心ELISA法较两株相同或不同的单抗分别做捕获抗体、检测抗体灵敏度更高、生产成本更低。
(2)本发明所述的方法单抗做捕获抗体、多抗做检测抗体的方法特异性更强，显色背景颜色值更低。
(3)本发明可以定量检测样品中IL-6含量，兼具灵敏度高和检测范围广，最低检测值为1.17ng/mL，检测范围为1.17ng/mL～300ng/mL。
(4)本发明与目前常用的放射免疫分析(RIA)、RT-PCR等方法相比，本发明检测周期短、操作简便、技术水平要求低、设备简单、可以实现大批样品快速检测。
附图说明
图1本发明中重组子菌液PCR鉴定；
图2本发明中重组质粒pET-IL6的双酶切鉴定；
图3本发明中表达产物的SDS-PAGE分析；
图4本发明中表达产物的Western-biotting分析；
图5本发明中表达产物的可溶性分析；
图6本发明中包涵体的洗涤与溶解鉴定图；
图7本发明中不同诱导时间下pET-IL6表达产物SDS-PAGE分析；
图8本发明中不同诱导温度下pET-IL6表达产物SDS-PAGE分析；
图9本发明中不同IPTG浓度诱导pET-IL6表达产物SDS-PAGE分析；
图10本发明中pET-IL6抗原浓度的自然对数与OD值关系曲线图；
图11本发明中犬IL-6ELISA试剂盒的标准曲线图；
图12本发明中免疫狂犬疫苗与未免疫狂犬疫苗血清中IL-6变化情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 pET-IL6蛋白的制备
1.特异性引物的设计
参考GenBank中犬IL-6的全基因序列，利用引物辅助设计软件Primer5根据确定的保守核甘酸序列设计出了一对特异性引物，用于IL-6基因的扩增。分别在引物上下游中插入BamHⅠ与HindⅢ酶切位点(引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的下划线部分)并加上了保护性碱基，引物由生工公司合成。
特异性引物如下：
上游引物P1(SEQ ID NO.3)：5’-CGGGATCCATGAACTCCCTCTCCACAAGC-3’；
下游引物P2(SEQ ID NO.4)：5’-CCAAGCTTCATTATCCGAACAGC-3’。
2.表达载体的构建
以上述引物(上游引物P1、下游引物P2)PCR扩增IL-6基因，以本实验保存的rHEP-CaIL6质粒(详见中国专利申请号：201710087252.6)为模板，扩增体系如表1所示：
表1PCR反应体系中各组分含量
Figure BDA0003093674060000051
扩增IL-6基因目的基因的长度为624bp，反应程序：98℃预变性1min；循环：98℃15s，64℃20s，72℃3min，35个循环；72℃延伸10min。
其中，所述IL-6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
ATGAACTCCCTCTCCACAAGCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGATGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGCAGGAGATTCCAAGGATGATGCCACTTCAAATAGTCTACCACTCACCTCTGCAAACAAAGTGGAAGAACTGATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAGAAAGGAGATGTGTGACAAGTTTAACAAGTGTGAAGACAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACATCTTCCCAAACTGGAGGGAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGAATCACTACCGGTCTTGTGGAGTTTCAGCTACACCTGAATATCCTCCAGAACAACTATGAGGGTGATAAGGAAAATGTCAAGTCTGTGCACATGAGTACCAAGATCCTGGTCCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAAGAATCAGGATGAAGTGACCACTCCTGACCCAACCACAGACGCCAGCCTGCAGGCTATCTTGCAGTCGCAGGATGAGTGGCTGAAGCACACAACAATTCACCTCATCCTGCGGAGTCTGGAGGATTTCCTGCAGTTCAGTCTGAGGGCTGTTCGGATAATGTAG。
将所述IL-6基因和载体pET-32a(+)利用BamHⅠ与HindⅢ进行酶切，用T4连接酶连接，连接体系如表2所示，将各成分吹打混匀后于16℃水浴中连接8h，得到pET-IL6重组质粒。
表2连接体系中各成分含量
Figure BDA0003093674060000061
将所述pET-IL6重组质粒转化到感受态BL21大肠杆菌中，获得pET-IL6重组子菌液。对pET-IL6重组子菌液进行PCR鉴定，即以pET-IL6重组子菌液PCR为模板。用上游引物P1和下游引物P2进行菌液PCR扩增。
菌液PCR反应体系如表3所示，把各组分吹打混匀，在PCR扩增仪上运行下列条件：96℃预变性5min；循环：96℃25s，64℃20s，72℃3min，35循环；72℃延伸5min。
核酸电泳检测出现4个明亮条带即为阳性菌液(如图1所示)，与预期624bp大小一致。说明重组质粒成功转化到大肠杆菌中。
表3菌液PCR反应体系中各成分含量
Figure BDA0003093674060000071
所述pET-IL6重组子菌液经PCR检测完成后，对菌液进行质粒提取，参照Magen公司质粒抽提试剂盒说明书进行。将提取的质粒进行双酶切检测。质粒双酶切反应体系如表4所示：
表4酶切反应体系中各成分含量
Figure BDA0003093674060000072
加完各成分后，用枪吹匀，于37℃水浴酶切5h，取3μL酶切产物进行核酸电泳检测，在照胶仪下观察结果。用菌液PCR做对照，上下条带分别在5900bp处与624bp处，结果如图2所示，与预期相符，说明pET-IL6重组质粒成功构建。
把上述经过PCR验证以及双酶切验证均正确的pET-IL6重组质粒送往生工公司测序，测序数据用SnapGene、DNAStar软件进行对比分析。测序结果中，IL-6基因正确连接到pET-32a(+)载体，同时发现3个碱基发生同义突变(目的序列387bp处的G突变成A、528bp处的G突变成A、545bp处的C突变成G)，但未引起氨基酸的改变，测序验证正确。将所述pET-IL6质粒转化到BL21大肠杆菌中，获得pET-IL6重组菌。
3.目的蛋白的诱导表达
把上述鉴定完成的pET-IL6重组菌划线培养12h，第二天挑出单个菌落，加入到含有6mL Amp+LB的试管中，恒温摇床(210r/min)37℃震摇12h，作为一级种子；取一级种子60μL(按1：100的比例)加入到含有6mL Amp+LB的试管中，37℃恒温摇床(210r/min)震摇3h；加入终浓度为1mM的IPTG，于恒温摇床(210r/min)37℃震摇4h，收菌。吸取20μL 5×蛋白上样缓冲液加到80μL诱导产物中，金属浴加热15min，进行SDS-PAGE蛋白质电泳，或者保存于-20℃。同时设置不诱导表达对照、空载对照以及表达菌自身对照。
经SDS-PAGE结果分析，诱导后的条带明显比未诱导的更清晰明显，位置条带大小与预期38.28KD一致，诱导后的空载pET-32a(+)、BL21大肠杆菌未出现特异性条带，见图3。说明pET-IL6重组质粒在大肠杆菌中成功表达，且经IPTG诱导后的重组菌表达量比未诱导的要高。
取诱导表达后的pET-IL6重组菌液进行Western-blotting分析，结果同样发现诱导后的条带明显比未诱导的更清晰明显，位置条带大小与预期38.28KD一致，诱导后的空载pET-32a(+)、BL21大肠杆菌未出现特异性条带，图4结果与预期一致。说明pET-IL6重组质粒在大肠杆菌中成功表达，且经IPTG诱导后的重组菌表达量比未诱导的要高。
4.目的蛋白的可溶性分析
取所述pET-IL6重组菌液200μL(1：100)加入到20mL Amp+LB中，摇菌8h，作为一级种子。取一级种子按1：100的比例加到含2L Amp+LB中，按照步骤2.13.4摸索出的方法进行诱导：4℃环境下，8000r/min离心15min收集菌泥，弃去培养基，每300mL菌液获得成一管菌泥，共得到6管菌泥；每管菌泥中加15mL PBS悬浮细菌，向管中加1％的PMSF，用涡旋仪震荡混合均匀，同时设定含有pET-32a(+)的BL(DE3)菌液作为阴性对照；将重新悬浮的菌体置于冰上准备进行超声破碎(参数设置为：功率为400w，每超声4s，间隔9s，超声34min)；收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。
结果如图5所示(M：蛋白预染；1～4：菌体破碎后上清；5～8：菌体破碎后沉淀)，破碎后上清条带较浅，破碎后沉淀出现明显特异性蛋白条带，表明pET-IL6蛋白主要以包涵体的形式表达。
用洗涤液(配方见表5)对包涵体(pET-IL6蛋白)进行洗涤，重复两次，然后用Tris-HCl把包涵体洗涤一遍，最后用溶解液(配方见表6)4℃条件下溶解包涵体10～12h，每次洗涤与溶解收集上清和沉淀样，进行SDS-PAGE电泳分析，分析每次溶解与洗涤过程中蛋白量的变化情况。前三次洗涤上清中都有杂蛋白存在，说明三次洗涤有洗去杂蛋白，溶解上清无杂蛋白存在，溶解沉淀中蛋白量也很多，沉淀可以进行二次溶解，见图6(M：蛋白预染；1：第一次包涵体洗涤上清；2：第一次包涵体洗涤沉淀；3：第二次包涵体洗涤上清；4：第二次包涵体洗涤沉淀；5：第三次包涵体洗涤上清；6：第三次包涵体洗涤沉淀；7：包涵体溶解上清；8：包涵体溶解沉淀)。说明洗涤与溶解效果较好，洗涤溶解后的蛋白纯度较高。
所述包涵体洗涤缓冲液：按表5加入各种试剂，加ddH2O至1000mL，摇晃混匀，用HCl调pH到8.0，储存在4℃冰箱待用。
表5包涵体洗涤液配方
Figure BDA0003093674060000091
所述包涵体溶解缓冲液：按表6加入各种试剂，加ddH2O至1000mL，摇晃混匀，用HCl调pH到8.0，储存在4℃冰箱待用。
表6包涵体溶解液配方
Figure BDA0003093674060000092
5.目的蛋白的纯化
采用透析袋透析纯化的方法对pET-IL6蛋白进行纯化，具体操作方法如下：
(1)剪透析袋，根据蛋白量剪所需要的长度(10mL蛋白大约需要14cm)。
(2)清洗一个2L的容器，加入适量的ddH2O，将剪好的透析袋放入容器中，煮15min。
(3)对透析袋进行降温，用ddH2O把透析袋清洗2～3次。
(4)一人用夹子夹紧一端并把另一端打开，一人用枪把IL-6蛋白小心加入开口一端中，赶走气泡并把开口端夹紧，把夹紧后的透析袋置于加有6M尿素TGE的容器中，4℃冰箱透析8h。
(5)弃掉烧杯中的6M尿素TGE并加入4M尿素TGE，4℃冰箱透析12h。
(6)弃掉烧杯中的4M尿素TGE换成2M尿素TGE，4℃冰箱透析12h。
(7)把烧杯中的2M尿素TGE换成0M尿素TGE，4℃冰箱透析12h。
(8)弃去烧杯中的0M尿素TGE换成PBS，冰箱4℃透析12h。
(9)得到透析后的纯化pET-IL6蛋白。
其中，6M尿素的透析液(TGE)：按照表7加入各种试剂，然后加入360.36g尿素，加ddH2O至1000mL，磁力搅拌器混合均匀，用HCl调pH到8.0，4℃条件放置。
4M尿素的透析液(TGE)：按照表7加入各种试剂，然后加入240.24g尿素，加ddH2O至1000mL，磁力搅拌器混合均匀，用HCl调pH至8.0，4℃条件放置。
2M尿素的透析液(TGE)：按照表7加入各种试剂，然后加入120.12g尿素，加ddH2O至1000mL，磁力搅拌器混合均匀，用HCl调pH值至8.0，4℃条件放置。
0M尿素的透析液(TGE)：按照表7加入各种试剂，然后加入0g尿素，加ddH2O至1000mL，磁力搅拌器混合均匀，用HCl调pH至8.0，4℃条件放置。
表7透析液配方
Figure BDA0003093674060000101
将纯化的pET-IL6蛋白送往生工公司采用LC-MS/MS质谱分析法进行蛋白质谱鉴定。经肽指纹图谱鉴定及部分强信号肽段测序匹配到7段置信度较高的肽段DDATSNSLPLTSANKVEELIK、EALAENNLHLPKLEGK、SVHMSTKILVQMLK、DGCFQSGFNQETCLTRITTGLVEFQLHLNILQNNYEGDKENVK、AVRIM、SKVK和HTTIHLILRSLEDFLQFSLR，可信度≥95％的肽段占24.15％，故本次质谱结果可信度较高。
说明成功制备得到目的pET-IL6蛋白，pET-IL6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMAMNSLSTSAFSLGLLLVMATAFPTPGPLAGDSKDDATSNSLPLTSANKVEELIKYILGKISALRKEMCDKFNKCEDSKEALAENNLHLPKLEGKDGCFQSGFNQETCLTRITTGLVEFQLHLNILQNNYEGDKENVKSVHMSTKILVQMLKSKVKNQDEVTTPDPTTDASLQAILQSQDECVKHTTIHLILRSLEDFLQFSLRAVRIM
实施例2诱导时间、温度和IPTG浓度对目的蛋白表达的影响
1.诱导时间
按照实施例1中“3.目的蛋白的诱导表达”的步骤表达pET-IL6重组菌，待菌液浓度达到OD600达到0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，用37℃分别诱导培养2h、3h、4h、5h、6h，分别取诱导产物并进行考马斯染色检测。经SDS-PAGE电泳分析，发现诱导4h蛋白量较多，结果见图7(图中，M：蛋白预染；1：2h诱导；2：3h诱导；3：4h诱导；4：5h诱导；5：6h诱导)。
2.诱导温度
按照实施例1中“3.目的蛋白的诱导表达”的步骤表达pET-IL6重组菌，待菌液浓度达到OD600达到0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，分别在16℃、22℃、28℃、37℃、42℃条件下诱导培养4h，分别取诱导产物进行考马斯染色检测，比较不同诱导温度下蛋白表达量的差异。经SDS-PAGE电泳分析，发现37℃诱导时蛋白量较多，结果见图8(M：蛋白预染；1：16℃诱导；2：22℃诱导；3：28℃诱导；4：37℃诱导；5：42℃诱导)。
3.IPTG浓度
按照实施例1中“3.目的蛋白的诱导表达”的步骤表达pET-IL6重组菌，待菌液浓度达到OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L的IPTG，于37℃培养条件下，诱导培养4h，分别取诱导产物进行考马斯染色检测蛋白表达量的差异。经SDS-PAGE电泳分析，发现各浓度差异不大，选用终浓度为0.1mmol/L的IPTG，结果如图9(M：蛋白预染；1：0.1mmol/L诱导；2：0.5mmol/L诱导；3：0.8mmol/L诱导；4：1.0mmol/L诱导；5：1.2mmol/L诱导；6：1.5mmol/L诱导)。
实施例3 pET-IL6抗体的制备
1.单克隆抗体的制备
用纯化的pET-IL6蛋白(实施例1中制备所得)与佐剂混合乳化后免疫BALB/c小鼠，当血清效价达到1∶105，取细胞形态为圆形、透光性好、大小均一的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合。
具体操作如下：
用纯化的pET-IL6蛋白(实施例1中制备所得)与佐剂混合乳化后免疫BALB/c小鼠，第一次免疫，在小鼠颈背部皮下多点注射；分别在第14d和第28d，用弗氏不完全佐剂(IFA)与等体积的IL-6蛋白充分混合乳化后进行第二、第三次免疫；在第一免疫32d后，眼眶采血，离心取上清，对血清抗体水平进行检测，当阳性血清效价达到1∶105后即可准备进行细胞融合；用非乳化的抗原于融合前3d腹腔注射小鼠加强免疫，3～4d无菌取小鼠脾细胞进行SP2/0细胞的融合，具体免疫程序见表8。
表8BABL/c小鼠免疫程序
Figure BDA0003093674060000121
提前准备好小鼠脾细胞与SP2/0细胞，将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞以1：(5～10)(细胞数量)的比例混合，在PEG1450下融合，洗涤、离心后以HAT培养基悬浮，置于96孔培养板中，在37℃含5％的CO2培养箱中培养3天后以HAT培养基换液，第9天换成HT培养基，间接ELISA法筛选细胞阳性孔，具体操作如下：
抗原包被：将实施例1制备的IL-6蛋白按8μg/mL用包被液进行稀释，每孔100μL，加入孔内，于4℃冰箱过夜；
洗板：弃去板内的液体，甩干水分，每孔加200μL PBST置于微量振荡器震荡60s，甩干水分，洗板4遍；
封闭：将封闭液100μL/孔加到孔内，置于37℃2h(或者4℃过夜封闭)；
所述封闭液为：取25g牛血清白蛋白(BSA)，加入500mL的PBST，充分混合，分装到离心管中，放置于冰箱-20℃；
洗板：弃去板内的液体，甩干水分，200μL/孔PBST，甩干水分，洗板4遍；
孵一抗：将所述融合孔细胞上清以及阳性、阴性、空白对照每孔100μL加入酶标板内，于37℃条件下作用70min；
洗板：弃掉板内的融合孔细胞上清，甩干水分，200μL/孔PBST，甩干液体，洗涤4次；
孵二抗：用PBS 1：10000稀释HRP-羊抗鼠IgG，每孔加100μL稀释后的二抗，于37℃条件下作用40min；
洗板：弃掉板内的二抗，甩干水分，200μL/孔PBST，甩干水分，洗板4遍；
显色：每孔100μL显色液，37℃条件下作用10min(避光操作)；
终止：于每孔加50μL稀释后的硫酸终止反应，尽快使用酶标仪读数。
筛选出的细胞阳性孔进一步用间接ELISA法鉴定筛选(用纯化的pET-32a(+)空载蛋白、pET-IL6蛋白以及使用pET-32a(+)空载表达的其他融合蛋白作为抗原进行包被，筛除假阳性。)，有限稀释法克隆至大约每孔<1个细胞，10天后检测为阳性且竞争较好的单克隆孔所得细胞株即为分泌单克隆抗体的细胞株。经间接ELISA筛选及三次亚克隆后，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株(见表9亚克隆的到9个单克隆孔，标注阴影的部分即为单克隆孔)，用于IL-6单克隆抗体的制备。
表9阳性杂交瘤细胞的亚克隆
Figure BDA0003093674060000131
Figure BDA0003093674060000141
2.单克隆抗体的制备及鉴定
取分泌抗体能力强、生长状态良好的阳性杂交瘤细胞通过体内诱生法制备腹水。用弗氏不完全佐剂致敏小鼠，每只雌性BALB/c小鼠腹腔注射500μL，7～10d后备用。把细胞从大皿上吹下来，用1640洗涤2～3次，将数量调整到1×106个/mL，将细胞腹腔注射到致敏后的小鼠体内。1～2周后，待小鼠腹部明显膨大时抽出腹水，经10000～12000r/min离心15min，取上清，分装储存于-80℃，即得单克隆抗体。
经Western-blotting和IFA验证证明获得的单抗为构象表位，说明成功制备小鼠的抗IL-6单克隆抗体。
3.多克隆抗体的制备
将实施例1中制备的pET-IL6蛋白与佐剂混合乳化后免疫新西兰大白兔，经三次免疫后(1mg/只与等量佐剂混合乳化)，采血离心取血清，得到pET-IL6多抗，用间接ELISA方法测定效价，具体方法如下：
抗原包被：将实施例1制备的IL-6蛋白按8μg/mL用包被液进行稀释，每孔100μL，加入孔内，于4℃冰箱过夜；
洗板：弃去板内的液体，甩干水分，每孔加200μL PBST置于微量振荡器震荡60s，甩干水分，洗板4遍；
封闭：将封闭液100μL/孔加到孔内，置于37℃2h(或者4℃过夜封闭)；
所述封闭液为：取25g牛血清白蛋白(BSA)，加入500mL的PBST，充分混合，分装到离心管中，放置于冰箱-20℃备用；
洗板：弃去板内的液体，甩干水分，200μL/孔PBST，甩干水分，洗板4遍；
孵一抗：将上述兔血清以及阳性、阴性、空白对照每孔100μL加入酶标板内，于37℃条件下作用70min；
洗板：弃掉板内的兔血清，甩干水分，200μL/孔PBST，甩干液体，洗涤4次；
孵二抗：用PBS 1：10000稀释HRP-羊抗鼠IgG，每孔加100μL稀释后的二抗，于37℃条件下作用30～40min；
洗板：弃掉板内的二抗，甩干水分，200μL/孔PBST，甩干水分，洗板4遍；
显色：每孔100μL显色液，37℃条件下作用5～10min(避光操作)；
终止：于每孔加50μL稀释后的硫酸终止反应，尽快使用酶标仪读数。
效价如表10所示，说明抗体效价较高，所述pET-IL6多抗可以作为检测抗体使用。
表10兔血清效价测定
Figure BDA0003093674060000151
实施例4检测犬IL-6的ELISA试剂盒的建立
一、ELISA试剂盒的组成
ELISA试剂盒包括：
pET-IL6单克隆抗体(实施例3制备所得)；
pET-IL6多克隆抗体(实施例3制备所得)；
酶标板；
封闭液：5％脱脂奶粉(质量比)；
羊抗兔酶标二抗；
显色液：四甲基联苯胺(TMB)；
终止液：2mol/L的H2SO4；
包被液：0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6，Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g)；
洗涤液：含0.05％吐温20的PBS(PBST)缓冲液。
二、ELISA试剂盒的使用
ELISA试剂盒的使用，包括以下步骤：
S1.包被：用包被液把pET-IL6单抗稀释到48μg/mL，100μL/孔加入板内，4℃冰箱过夜；
S2.洗板：弃去酶标板内液体，PBST(磷酸盐吐温缓冲液)按200μL/孔，振荡润洗4次，一次60s；
S3.封闭：每孔加100μL的封闭液，于恒温箱37℃进行封闭60min，封闭后洗板步骤同S2；
S4.加样：每孔100μL样品，37℃条件下孵育1.5h，洗板步骤同S2；
S5.加检测抗体：将pET-IL6多抗用封闭液按1：100稀释，每孔加100μL稀释后的IL-6多抗，于37℃条件下作用60min，洗板同S2；
S6.加二抗：每孔加入1：500用封闭液稀释后的羊抗兔酶标二抗100μL，于37℃环境下孵育60min，洗板同S2；
S7.显色：避光环境下，加显色液，100μL/孔，37℃条件下作用10min；
S8.终止：每孔加入50μL终止液，终止反应；
S9.读数：使用酶标仪读取每孔的OD450值。
实施例5 ELISA试剂盒中封闭液的选择
一、实验方法
分别用2％BSA、5％BSA、2％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉，代替实施例4试剂盒中的封闭液，进行封闭，使用试剂盒对8μg/mL pET-IL6蛋白样品进行检测。
二、实验结果
最终比较P/N值发现使用5％脱脂奶粉进行封闭时P/N值最大，数据结果表明在同等条件下，使用5％脱脂奶粉进行封闭时效果最佳，见表11。
表11封闭液的选择
Figure BDA0003093674060000161
实施例6 ELISA试剂盒中pET-IL6抗体最佳浓度的确定
一、实验方法
采用棋盘法对捕获抗体和检测抗体的浓度进行摸索，用包被液把捕获抗体pET-IL6单抗(实施例3制备所得)稀释成48μg/mL、24μg/mL、12μg/mL、6μg/mL、3μg/mL、1.5μg/mL，代替实施例4试剂盒中的pET-IL6单抗。用封闭液将pET-IL6蛋白样品(实施例1制备所得)稀释成8μg/mL，作为检测样品。将检测抗体pET-IL6多抗(实施例3制备所得)用封闭液按1：100、1：500、1：1000、1：5000、1：10000、1：50000稀释，每孔100μL，代替实施例4试剂盒中的pET-IL6多抗。使用实施例4中的试剂盒分别对上述不同浓度的抗体搭配进行检测。用P/N值确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度。
二、实验结果
根据表12数据显示，pET-IL6单抗浓度在48μg/mL，pET-IL6多抗按1：100稀释时P/N值最大，夹心ELISA检测效果最佳。
表12捕获抗体和检测抗体的最佳浓度的确定
Figure BDA0003093674060000171
实施例7 ELISA试剂盒中封闭时间的确定
一、实验方法
使用实施例4中的试剂盒，分别使用1h、1.5h、2h作为试剂盒使用S3中的封闭时间。分别用不同的封闭时间对8μg/mL pET-IL6蛋白样品进行检测。
二、实验结果
结果如表13，封闭时间为1h时P/N最大，最适封闭时长可选用1h。
表13封闭时间的确定
Figure BDA0003093674060000172
实施例8 ELISA试剂盒使用中样品与pET-IL6捕获抗体的孵育时间的确定
一、实验方法
使用实施例4中的试剂盒，分别使用1h、1.5h、2h，作为试剂盒的使用步骤S4中的孵育时间。分别用不同的孵育时间对8μg/mL pET-IL6蛋白样品进行检测。
二、实验结果
结果如表14所示，抗原作用1.5h时P/N最高，因此抗原作用时间可选用1.5h。
表14抗原作用时间的确定
Figure BDA0003093674060000181
实施例9 ELISA试剂盒中羊抗兔酶标二抗的稀释度的确定
一、实验方法
使用实施例4中的试剂盒，将羊抗兔酶标二抗按1：500、1：1000、1：5000、1：10000稀释，分别代替试剂盒中的羊抗兔酶标二抗，对8μg/mL pET-IL6蛋白样品进行检测。
二、实验结果
结果如表15所示，1：500稀释的二抗的P/N最高，因此二抗可按1：500稀释。
表15酶标二抗稀释度的选择
Figure BDA0003093674060000182
实施例10标准曲线的建立
一、实验方法
把IL-6标准蛋白稀释成600ng/mL、300ng/mL、150ng/mL、75ng/mL、37.5ng/mL、18.75ng/mL、9.38ng/mL、4.69ng/mL、2.34ng/mL、1.17ng/mL、0.59ng/mL，每个浓度做两个重复，100μL/孔加到板内，设置无蛋白对照组，使用实施例4中的试剂盒分别进行检测，根据结果绘制标准曲线。
二、实验结果
标准曲线的绘制如图10和图11所示，结果显示IL-6蛋白浓度在1.17ng/mL～300ng/mL之间时，IL-6蛋白浓度的自然对数与OD值的线性关系良好，由此可绘制出标准曲线，回归方程为：y＝0.2001x+0.1258，R2＝0.9912，x＝Ln(X)。检测范围为1.17ng/mL～300ng/mL，检测下限为1.17ng/mL。
实施例11 ELISA试剂盒的临床应用
一、实验方法
使用实施例4中的试剂盒，对增城狗场中，免疫过狂犬疫苗的狗与未免疫过狂犬疫苗的狗，11个月内狗体内IL-6的变化情况进行检测，免疫组与未免疫组每个月各3份样品，取样品血清进行测定，并对结果进行分析。
二、实验结果
以每个月样品平均OD值作为纵坐标，月份作为横坐标，制作成图12。由图12可知，与未免疫狂犬疫苗的犬血清相比，免疫狂犬疫苗后IL-6在犬体内分泌增加，随着时间增长，IL-6水平呈缓慢下降趋势，在1月最高，IL-6含量达到3.17ng/mL，往后逐渐呈下降趋势，直至达到正常水平。而未免疫狂犬疫苗的犬血清中IL-6含量一直处于同一水平，波动很小。说明狂犬疫苗免疫后一年内仍刺激机体产生抗体，试剂盒检测效果较好，检测灵敏度高。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<120> 一种检测犬IL-6的ELISA试剂盒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 368
<212> PRT
<213> 犬(Canis lupus familiaris)
<400> 1
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Met Asn Ser Leu Ser Thr Ser Ala Phe Ser Leu Gly Leu Leu Leu
165 170 175
Val Met Ala Thr Ala Phe Pro Thr Pro Gly Pro Leu Ala Gly Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Asp Ala Thr Ser Asn Ser Leu Pro Leu Thr Ser Ala Asn Lys
195 200 205
Val Glu Glu Leu Ile Lys Tyr Ile Leu Gly Lys Ile Ser Ala Leu Arg
210 215 220
Lys Glu Met Cys Asp Lys Phe Asn Lys Cys Glu Asp Ser Lys Glu Ala
225 230 235 240
Leu Ala Glu Asn Asn Leu His Leu Pro Lys Leu Glu Gly Lys Asp Gly
245 250 255
Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Gln Glu Thr Cys Leu Thr Arg Ile Thr
260 265 270
Thr Gly Leu Val Glu Phe Gln Leu His Leu Asn Ile Leu Gln Asn Asn
275 280 285
Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Asn Val Lys Ser Val His Met Ser Thr Lys
290 295 300
Ile Leu Val Gln Met Leu Lys Ser Lys Val Lys Asn Gln Asp Glu Val
305 310 315 320
Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asp Ala Ser Leu Gln Ala Ile Leu Gln
325 330 335
Ser Gln Asp Glu Cys Val Lys His Thr Thr Ile His Leu Ile Leu Arg
340 345 350
Ser Leu Glu Asp Phe Leu Gln Phe Ser Leu Arg Ala Val Arg Ile Met
355 360 365
<210> 2
<211> 624
<212> DNA
<213> 犬(Canis lupus familiaris)
<400> 2
atgaactccc tctccacaag cgccttctcc ctggggctgc tcctggtgat ggctactgct 60
ttccctaccc cgggacccct ggcaggagat tccaaggatg atgccacttc aaatagtcta 120
ccactcacct ctgcaaacaa agtggaagaa ctgattaagt acatcctcgg caaaatctct 180
gcactgagaa aggagatgtg tgacaagttt aacaagtgtg aagacagcaa agaggcactg 240
gcagaaaata acctacatct tcccaaactg gagggaaaag atggatgctt ccaatctggg 300
ttcaatcagg agacctgctt gacaagaatc actaccggtc ttgtggagtt tcagctacac 360
ctgaatatcc tccagaacaa ctatgagggt gataaggaaa atgtcaagtc tgtgcacatg 420
agtaccaaga tcctggtcca gatgctaaag agcaaggtaa agaatcagga tgaagtgacc 480
actcctgacc caaccacaga cgccagcctg caggctatct tgcagtcgca ggatgagtgg 540
ctgaagcaca caacaattca cctcatcctg cggagtctgg aggatttcct gcagttcagt 600
ctgagggctg ttcggataat gtag 624
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgggatccat gaactccctc tccacaagc 29
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaagcttca ttatccgaac agc 23

Claims (10)

1.一种检测犬IL-6的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括：pET-IL6单克隆抗体、pET-IL6多克隆抗体、酶标板、封闭液、羊抗兔酶标二抗、显色液、终止液；
其中，所述pET-IL6单克隆抗体和pET-IL6多克隆抗体是由pET-IL6蛋白通过免疫动物制备的抗体，所述pET-IL6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述pET-IL6单克隆抗体作为捕获抗体，pET-IL6多克隆抗体作为检测抗体。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液为2％～5％BSA、2％～5％脱脂奶粉的一种或多种；其中百分数为质量比百分数。
3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述pET-IL6蛋白的制备方法为：
扩增IL-6基因，将IL-6基因和载体pET-32a(+)连接，得到pET-IL6重组质粒；
将质粒转化到BL21大肠杆菌中，获得pET-IL6重组菌；用0.1～1.5mmol/L IPTG对pET-IL6重组菌进行诱导，22～42℃诱导培养2～6h，收集菌液，离心弃上清，沉淀后取上清，对所得蛋白洗涤溶解，进行纯化，即得pET-IL6蛋白；
其中，所述IL-6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述IL-6抗体，其特征在于，所述pET-IL6单克隆抗体的浓度为24～48μg/mL，pET-IL6多克隆抗体按1：500～1：100稀释。
5.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述羊抗兔酶标二抗的稀释度为1：1000～1：500。
6.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为四甲基联苯胺。
7.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为H2SO4。
8.权利要求1到权利要求7之一所述ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.包被：pET-IL6单克隆抗体，100μL/孔，加入酶标板内，将酶标板放入冰箱过夜；
S2.洗板：弃去S1中酶标板内液体，使用PBST进行洗板；
S3.封闭：在S2的酶标板中每孔加100μL的封闭液，于恒温箱37℃进行封闭，封闭后洗板步骤同S2；
S4.加样：在S3的酶标板中，每孔加入100μL样品，37℃条件下孵育，洗板步骤同S2；
S5.加检测抗体：将pET-IL6多克隆抗体用封闭液稀释，在S4的酶标板中每孔加100μL稀释后的pET-IL6多克隆抗体，于37℃条件下作用60min，洗板同S2；
S6.加二抗：向S5的酶标板中每孔加入稀释后的羊抗兔酶标二抗100μL，于37℃环境下孵育60min，洗板同S2；
S7.显色：避光环境下，向S6的酶标板中加显色液，100μL/孔，37℃条件下作用10min；
S8.终止：向S7的酶标板中每孔加入50μL终止液，终止反应；
S9.读数：使用酶标仪读取S8中酶标板每孔的OD450值。
9.根据权利要求8所述使用方法，其特征在于，所述步骤S3中，封闭时间为1～2h。
10.根据权利要求8所述使用方法，其特征在于，所述步骤S4中，样品的孵育时间为1～2h。
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