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CN113295866A - Upⅱ抗原和upⅱ抗体联合在制备检测膀胱癌的产品中的应用 - Google Patents

Upⅱ抗原和upⅱ抗体联合在制备检测膀胱癌的产品中的应用 Download PDF

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CN113295866A
CN113295866A CN202110454579.9A CN202110454579A CN113295866A CN 113295866 A CN113295866 A CN 113295866A CN 202110454579 A CN202110454579 A CN 202110454579A CN 113295866 A CN113295866 A CN 113295866A
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CN
China
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antigen
bladder cancer
antibody
labeled
limited
Prior art date
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Application number
CN202110454579.9A
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李少金
张肄鹏
张勇刚
陈荣贵
吴晓丽
崔易航
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Shenzhen Longhua District Central Hospital
Original Assignee
Shenzhen Longhua District Central Hospital
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Abstract

本发明公开了UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合在制备检测膀胱癌的产品中的应用，属于泌尿生殖肿瘤检测产品技术领域。本发明经过研究发现，UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合，可以用于制备检测膀胱癌的产品，既开拓了UPⅡ抗原和UPⅡ抗体新的应用领域，也开拓了新的检测膀胱癌的产品，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。

Description

UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合在制备检测膀胱癌的产品中的应用
技术领域
本发明涉及UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合在制备检测膀胱癌的产品中的应用，属于泌尿生殖肿瘤检测产品技术领域。
背景技术
膀胱癌是泌尿生殖系统肿瘤之一。在我国，胱胱癌是发病率和死亡率最高的泌尿生殖系统肿瘤,男性发病率约为7.3/10万,女性发病率约为2.0/10万,并且发病率也在逐年上升，严重威胁着人们的健康。因此对膀胱癌患者的早期诊断及术后长期随访在临床工作中显得尤为重要。
膀胱癌的主要症状是有间歇全程无痛性血尿，可表现为肉眼血尿或镜下血尿。但所有血尿症状者只有5％-10％为膀胱癌，且其出现时间及出血量与肿瘤恶性程度、分期、大小和形态并不一致。
目前，诊断膀胱癌的方法主要有四种：膀胱镜检查及组织活检、影像学检查、尿脱落细胞学和尿液膀胱癌标记物，各有利弊，分别简介如下：
膀胱镜检查及组织活检，是目前诊断膀胱最常用方法，但其为侵入性检查方法，一是会给病人带来不适感和痛苦感，二是费用高，三是对操作者要求高，四是敏感性低，特别是癌症早期，检出率更低。
影像学检查包括超声检查、尿路造影、CT、MRI和PET等，在诊断分期中具有优势，但等待周期长，操作繁琐，对早期的诊断率低。
尿脱落细胞学为常用传统方法，但其对分级低的膀胱癌敏感性较低，一方面是由于肿瘤细胞分化较好，与正常细胞具有相似的特征，不易鉴别；另一方面由于癌细胞之间黏结相对紧密，没有足够多的癌细胞脱落到尿中而被检测到，尿细胞学阴性并不能排除低级别尿路上皮癌的存在。另外，细胞的不典型或退行性变、泌尿系感染、结石、膀胱灌注治疗和检查者的技术差异等因素，也会影响尿细胞学检查结果。
膀胱癌标记物是无创检测方法，具有较高的特异性和敏感性，且有发现癌症早期的能力。市场已有NMP22(英文全称：Nuclear Matrix Protein 22，中文名称：核基质蛋白)用于膀胱癌的检测。但存在如下缺陷：一是，NMP22是参与维持细胞核功能的一种三维网状结构蛋白，并非尿路上皮特有的，并且是通过凋亡而释放到尿液中。众所周知，影响细胞凋亡的因素很多，如炎症和细胞自然衰老等，这势必影响此方法的特异性和敏感性。二是，所使用的检测方法是胶体金法，是一种半定量方法，相比免疫发光具有低准确度、低灵敏度和低精密度，重复性差，不能用于自动化。三是，样本类型局限于尿液。
综上，现有技术的诊断膀胱癌的方法均存在缺陷。因此需要一种具有高特异性及高敏感性的检测膀胱癌的试剂盒，以用于膀胱癌早期诊断和长期随访。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合在制备检测膀胱癌的产品中的应用。本发明经过研究发现，UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合，可以用于制备检测膀胱癌的产品，既开拓了UPⅡ抗原和UPⅡ抗体新的应用领域，也开拓了新的检测膀胱癌的产品，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合在制备检测膀胱癌的产品中的应用。
本发明的原理是：
不对称的膀胱上皮膜斑块是由膀胱上皮细胞分泌，保护尿液充盈膀胱膨胀时的血尿屏障，膜斑块由四种尿蛋白(UP)组成，即UPIa、UPIb、UPⅡ和UPⅢ。其中，UPⅡ是大约15kDa的蛋白质。
本发明的有益效果是：
本发明经过研究发现，UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合，可以用于制备检测膀胱癌的产品，既开拓了UPⅡ抗原和UPⅡ抗体新的应用领域，也开拓了新的检测膀胱癌的产品，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述UPⅡ抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
MAPLLPIRTLPLILILLALLSPGAADFNISSLSGLLSPALTESLLVALPPCHLTGGNATLMVRRANDSKVVTSSFVVPPCRGRRELVSVVDSGAGFTVTRLSAYQVTNLVPGTKFYISYLVKKGTATESSREIPMSTLPRRNMESIGLGMARTGGMVVITVLLSVAMFLLVLGFⅡALALGSRK
进一步，所述UPⅡ抗原包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的突变、插入或缺失形成具有UPⅡ抗原性的蛋白片段。
采用上述进一步的有益效果是：可以提供UPⅡ抗原片段，能够免疫动物，如鼠、兔和牛等，从而产生单克隆UPⅡ抗体。
所述UPⅡ抗原可以自己制备，具体是：先合成UPⅡ核酸序列，再重组UPⅡ核酸序列到大肠杆菌，培养、提取和纯化，即得UPⅡ抗原。
进一步，所述检测膀胱癌的产品包括通过碱性磷酸酶化学发光法、辣根过氧化物酶化学发光法、吖啶酯类化学发光法和三联吡啶钌电化学发光法中的任意一种检测膀胱癌的试剂盒。
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过大量的试验发现，采用上述检测原理制成的试剂盒，可以用于检测膀胱癌，且具有高特异性和高敏感性。
更进一步，所述检测膀胱癌的试剂盒包括碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原、链霉亲合素包被的磁珠混悬液、发光底物、标准品和缓冲液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述发光底物为Lumi-Phos 530、AMPPD和APS-5中的任意一种；所述标准品为浓度为0ng/mL-10ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系包括但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白，所述表面活性包括但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮；所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫柳求和ProClin300。
采用上述更进一步的有益效果是：该检测膀胱癌的试剂盒采用碱性磷酸酶化学发光法。UPⅡ测定是竞争法。将标准品与碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体在反应管内混合，标准品内的UPⅡ抗原与碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体相结合，孵育5min-10min，然后将生物素标记的UPⅡ抗原添加到反应管内，用于竞争未结合碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体，再将链霉亲合素包被的磁珠混悬液添加到反应管内，孵育5min-10min，此时，生物素标记的UPⅡ抗原与固定在磁珠上的链霉亲合素反应。孵育完成后，结合在磁珠上的物质被磁场吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物添加到反应管内，对反应中所产生的光进行测量，所产生光的量与标准品内的UPⅡ浓度成反比。
其中，碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体和生物素标记的单克隆UPⅡ抗原，含有抗原保护剂，下同。
Lumi-Phos 530，CAS号为146239-76-1，是碱性磷酸酶的化学发光底物。Lumi-Phos530可以市售购买，如可以购自美国贝克曼库尔特有限公司，下同。
AMPPD，中文名称为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐，分子式为C18H23O7P，CAS号为122341-56-4，分子量为382.344781。AMPPD是碱性磷酸酶的化学发光底物，在适宜的缓冲液中，随着酶的催化水解作用，AMPPD分解成AMP-D，后者发出强度很高的光信号，其发光的速度取决于碱磷酶的浓度。AMPPD可以市售购买，如可以购自上海源叶生物科技有限公司，下同。
APS-5，中文名称为9-(4-氯苯硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基二氢吖啶二钠盐，分子式为C22H18NNa2O4PS，CAS号为193884-53-6，分子量为469.4。APS-5与碱性磷酸酶(ALP)混合后，碱性磷酸酶磷酸根水解后，底物立即发生分解反应释放出光子，在特定的碱性磷酸酶浓度范围内，释放的光子数量与溶液中碱性磷酸酶的浓度成正比，所以可以用于碱性磷酸酶的定量检测。APS-5可以市售购买，如可以购自上海麦克林生化科技有限公司，下同。
链霉亲合素包被的磁珠混悬液作为酶联免疫和固相分离载体，用于捕获抗原-抗体复合物。链霉亲合素包被的磁珠混悬液可以市售购买，如可以购自纽龙生物科技有限公司，下同。
更进一步，所述检测膀胱癌的试剂盒包括碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体、UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液、发光底物、标准品和缓冲液，其中，所述发光底物为Lumi-Phos 530、AMPPD和APS-5中的任意一种；所述标准品为浓度为0ng/mL-10ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系包括但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白，所述表面活性包括但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮，所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫柳求和ProClin300,浓度均为0.01％-1％。
采用上述进一步的有益效果是：该检测膀胱癌的试剂盒采用碱性磷酸酶化学发光法。UPⅡ测定是竞争法。将标准品与碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体在反应管内混合，标准品内的UPⅡ与碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体相结合，孵育5min-10min，然后将UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液添加到反应管内，用于竞争未结合碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体，孵育5min-10min。孵育完成后，结合在磁珠上的物质被磁场吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物添加到反应管内，对反应中所产生的光进行测量。所产生光的量与标准品内的UPⅡ浓度成反比。
其中，UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液，可以市售购买，如可以购自纽龙生物科技有限公司，下同。
更进一步，所述检测膀胱癌的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原、链霉亲合素包被的磁珠混悬液、发光底物、标准品和缓冲液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述发光底物为Lumi-Phos530、AMPPD和APS-5中的任意一种；所述标准品为浓度为0ng/mL-10ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系包括但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白，所述表面活性包含但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮，所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫柳求和ProClin300。
采用上述进一步的有益效果是：该检测膀胱癌的试剂盒采用辣根过氧化物酶化学发光法。UPⅡ测定是竞争法。将标准品与辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体在反应管内混合，标准品内的UPⅡ与辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体相结合，孵育5min-10min，然后将生物素标记的UPⅡ抗原添加到反应管内，用于竞争未结合碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体，再将链霉亲合素包被的磁珠混悬液添加到反应管内，孵育5min-10min，此时，生物素标记的UPⅡ抗原与固定在磁珠上的链霉亲合素反应。孵育完成后，结合在磁珠上的物质被磁场吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物添加到反应管内，对反应中所产生的光进行测量，所产生光的量与标准品/样本内的UPⅡ抗原浓度成反比。
更进一步，所述检测膀胱癌的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体、UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液和发光底物，其中，所述发光底物为Lumi-Phos 530、AMPPD和APS-5中的任意一种。
采用上述更进一步的有益效果是：该检测膀胱癌的试剂盒采用辣根过氧化物酶化学发光法。UPⅡ测定是竞争法。将标准品与辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体在反应管内混合，标准品内的UPⅡ与辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体相结合，孵育5min-10min，然后将UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液添加到反应管内，用于竞争未结合辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体，孵育5min-10min。孵育完成后，结合在磁珠上的物质被磁场吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物添加到反应管内，对反应中所产生的光进行测量，所产生光的量与标准品/样本内的UPⅡ抗原浓度成反比。
更进一步，所述检测膀胱癌的试剂盒包括吖啶酯标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原、链霉亲合素包被的磁珠混悬液、碱性过氧化氢溶液、标准品和缓冲液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述标准品为浓度为0ng/mL-10ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系包括但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白，所述表面活性包括但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮，所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫柳求和ProClin300。其中，所述碱性过氧化氢溶液的浓度为0.1mol/L
采用上述更进一步的有益效果是：该检测膀胱癌的试剂盒采用吖啶酯类化学发光法。UPⅡ测定是竞争法。将标准品与吖啶酯标记的UPⅡ抗体在反应管内混合，标准品内的UPⅡ与吖啶酯标记的UPⅡ抗体相结合，孵育5min-10min，然后将生物素标记的UPⅡ抗原添加到反应管内，用于竞争未结合辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体，再将链霉亲合素包被的磁珠混悬液添加到反应管内，孵育5min-10min，此时，生物素标记的UPⅡ抗原与固定在磁珠上的链霉亲合素反应。孵育完成后，结合在磁珠上的物质被磁场吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物添加到反应管内，对反应中所产生的光进行测量，所产生光的量与标准品/样本内的UPⅡ抗原浓度成反比。
更进一步，所述检测膀胱癌的试剂盒包括吖啶酯标记的UPⅡ抗体、UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液和碱性过氧化氢溶液，其中，所述碱性过氧化氢溶液的浓度为0.1mol/L。
采用上述更进一步的有益效果是：该检测膀胱癌的试剂盒采用吖啶酯类化学发光法。UPⅡ测定是双抗夹心法。将标准品和UPⅡ抗体包被的磁珠混悬液与吖啶酯标记的UPⅡ抗体在反应管内混合，标准品内的UPⅡ分别与UPⅡ抗体包被的磁珠混悬液和吖啶酯标记的UPⅡ抗体相结合，孵育5min-10min，形成UPⅡ抗体包被的磁珠混悬液-UPⅡ抗原-吖啶酯标记的UPⅡ抗体的夹心结构，孵育完成后，结合在磁珠上的物质被磁场吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，将化学发光底物添加到反应管内，对反应中所产生的光进行测量。所产生光的量与标准品/样本内的UPⅡ抗原浓度成正比。
更进一步，所述检测膀胱癌的试剂盒包括三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原和链霉亲合素包被的磁珠混悬液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL。
采用上述更进一步的有益效果是：该检测膀胱癌的试剂盒采用三联吡啶钌电化学发光法。UPⅡ测定是竞争法。将标准品与三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体在反应管内混合，标准品内的UPⅡ与三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体相结合，孵育5min-10min，然后将生物素标记的UPⅡ抗原添加到反应管内，用于竞争未结合三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体，再将链霉亲合素包被的磁珠混悬液添加到反应管内，孵育5min-10min，此时，生物素标记的UPⅡ抗原与固定在磁珠上的链霉亲合素反应。孵育完成后，结合在磁珠上的物质被磁场吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，采用电化学发光分析进行检测，所产生光的量与标准品/样本内UPⅡ抗原的浓度成反比。
更进一步，所述检测膀胱癌的试剂盒包括三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体和UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液。
采用上述更进一步的有益效果是：该检测膀胱癌的试剂盒采用三联吡啶钌电化学发光法。UPⅡ测定是竞争法。将标准品与三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体在反应管内混合，孵育5min-10min，然后将UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液添加到反应管内，用于竞争未结合三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体，孵育5min-10min。孵育完成后，结合在磁珠上的物质被磁场吸附住，而未结合的物质被冲洗除去。然后，采用电化学发光分析进行检测，所产生光的量与标准品/样本内UPⅡ抗原的浓度成反比。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例的检测膀胱癌的试剂盒，为通过碱性磷酸酶化学发光法检测膀胱癌的试剂盒。所述检测膀胱癌的试剂盒包括碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原、链霉亲合素包被的磁珠混悬液、发光底物、标准品和缓冲液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述发光底物为AMPPD；所述标准品为浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL和8ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系为pH值为7.4的磷酸缓冲液，所述蛋白质为质量百分数为0.1％的牛血清白蛋白，所述表面活性为质量百分数为0.05％的吐温20，所述防腐剂为质量百分数为0.05％的ProClin300和质量百分数为0.01％的叠氮钠。
尿液样本运用Roche cobas702全自动生化仪测定样本中肌酐含量。采用该试剂盒检测膀胱癌，包括如下步骤：
步骤1：96孔白色酶标板(JET公司)中分别加入50μL标准品/样本和50μL碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤2：每孔分别加入物素标记的UPⅡ抗原和50μL，浓度为0.1mg/mL的链霉亲合素包被的磁珠混悬液，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤3：取出酶标板，于磁力板(Easyinno公司)上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
步骤4：用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗4次，每次300μL。
步骤5：每孔加入200μL发光底物液(AMPPD)，于Thermo发光仪(Thermo公司)波长477nm中读取发光值，根据不同的标准品浓度和吸光度建立标准曲线，样本通过标准曲线计算出样本浓度，尿液样本等于测定样本浓度除以肌酐。
结果如表1所示。
表1：膀胱癌阳性样本和对照组(阴性样本)的发光值
Figure BDA0003040106100000111
实施例2
本实施例的检测膀胱癌的试剂盒，为通过碱性磷酸酶化学发光法检测膀胱癌的试剂盒。所述检测膀胱癌的试剂盒包括碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体、UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液、发光底物、标准品和缓冲液，其中，所述发光底物为AMPPD；所述标准品为浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL和8ng/mL的UPII抗原；所述缓冲体系为pH值为7.4的磷酸缓冲液，所述蛋白质为质量百分数为0.1％的牛血清白蛋白，所述表面活性为质量百分数为0.05％的吐温20，所述防腐剂为质量百分数为0.05％的ProClin300和质量百分数为0.01％的叠氮钠。
采用该试剂盒检测膀胱癌，包括如下步骤：
步骤1：在96孔白色酶标板(JET公司)中分别加入50μL标准品/样本和50μL碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤2：每孔分别加入UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤3：取出酶标板，于磁力板(Easyinno公司)上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
步骤4：用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗4次，每次300μL。
步骤5：每孔加入200μL发光底物液(AMPPD)，于Thermo发光仪(Thermo公司)波长477nm中读取发光值。根据不同的标准品浓度和吸光度建立标准曲线，样本通过标准曲线计算出样本浓度，尿液样本等于测定样本浓度除以肌酐。
结果如表2所示。
表2：膀胱癌阳性样本和对照组(阴性样本)的发光值
Figure BDA0003040106100000121
实施例3
本实施例的检测膀胱癌的试剂盒，为通过辣根过氧化物酶化学发光法检测膀胱癌的试剂盒。所述检测膀胱癌的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原、链霉亲合素包被的磁珠混悬液、发光底物、标准品和缓冲液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述发光底物为Lumi-Phos 530；所述标准品为浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL和8ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系为pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液，所述蛋白质为质量百分数为0.1％的牛血清白蛋白，所述表面活性为质量百分数为0.05％的吐温20，所述防腐剂为质量百分数为0.05％的ProClin300和质量百分数为0.01％的叠氮钠。
尿液样本运用Roche cobas702全自动生化仪测定样本中肌酐含量。采用该试剂盒检测膀胱癌，包括如下步骤：
步骤1：在96孔白色酶标板(JET公司)中分别加入50μL标准品/样本和50μL辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤2：每孔分别加入物素标记UPⅡ抗原以及50μL，浓度为0.1mg/mL的链霉亲合素包被的磁珠混悬液，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤3：取出酶标板，于磁力板(Easyinno公司)上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
步骤4：用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗4次，每次300μL。
步骤5：每孔加入200μL发光底物液Lumi-Phos 530，于Thermo发光仪(Thermo公司)波长485nm中读取发光值。根据不同的标准品浓度和吸光度建立标准曲线，样本通过标准曲线计算出样本浓度，尿液样本等于测定样本浓度除以肌酐。
结果如表3所示。
表3：膀胱癌阳性样本和对照组(阴性样本)的发光值
Figure BDA0003040106100000131
实施例4
本实施例的检测膀胱癌的试剂盒，为通过辣根过氧化物酶化学发光法检测膀胱癌的试剂盒。所述检测膀胱癌的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体、UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液和发光底物，其中，所述发光底物为Lumi-Phos 530。
采用该试剂盒检测膀胱癌，包括如下步骤：
步骤1：在96孔白色酶标板(JET公司)中分别加入50μL标准品/样本和50μL辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤2：每孔分别加入UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤3：取出酶标板，于磁力板(Easyinno公司)上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
步骤4：用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗4次，每次300μL。
步骤5：每孔加入200μL发光底物液Lumi-Phos 530，于Thermo发光仪(Thermo公司)波长485nm中读取发光值。根据不同的标准品浓度和吸光度建立标准曲线，样本通过标准曲线计算出样本浓度，尿液样本等于测定样本浓度除以肌酐。
结果如表4所示。
表4：膀胱癌阳性样本和对照组(阴性样本)的发光值
Figure BDA0003040106100000141
实施例5
本实施例的检测膀胱癌的试剂盒，为通过吖啶酯类化学发光法检测膀胱癌的试剂盒。本实施例的检测膀胱癌的试剂盒，为通过吖啶酯类化学发光法检测膀胱癌的试剂盒。所述检测膀胱癌的试剂盒包括吖啶酯标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原、链霉亲合素包被的磁珠混悬液、碱性过氧化氢溶液、标准品和缓冲液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述UPII抗原标准品为浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL和8ng/mL；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系为pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液，所述蛋白质为质量百分数为0.1％的牛血清白蛋白，所述表面活性为质量百分数为0.05％的吐温20，所述防腐剂为质量百分数为0.02％的ProClin300和质量百分数为0.01％的叠氮钠，其中所述碱性过氧化氢溶液的浓度为0.1mol/L。
尿液样本运用Roche cobas702全自动生化仪测定样本中肌酐含量。采用该试剂盒检测膀胱癌，包括如下步骤：
步骤1：在96孔白色酶标板(JET公司)中分别加入50μL标准品/样本和50μL吖啶酯标记的UPⅡ抗体，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤2：每孔分别加入物素标记UPⅡ抗原以及50μL链霉亲合素包被的磁珠混悬液，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤3：取出酶标板，于磁力板(Easyinno公司)上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
步骤4：用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗4次，每次300μL。
步骤5：每孔加入200μL碱性过氧化氢溶液，于Thermo发光仪(Thermo公司)波长430nm中读取发光值。根据不同的标准品浓度和吸光度建立标准曲线，样本通过标准曲线计算出样本浓度，尿液样本等于测定样本浓度除以肌酐。
结果如表5所示。
表5：膀胱癌阳性样本和对照组(阴性样本)的发光值
Figure BDA0003040106100000161
实施例6
本实施例的检测膀胱癌的试剂盒，为通过吖啶酯类化学发光法检测膀胱癌的试剂盒。所述检测膀胱癌的试剂盒包括吖啶酯标记的UPⅡ抗体、UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液和碱性过氧化氢溶液，其中，所述碱性过氧化氢溶液的浓度为0.1mol/L。
采用该试剂盒检测膀胱癌，包括如下步骤：
步骤1：在96孔白色酶标板(JET公司)中分别加入50μL标准品/样本和50μL吖啶酯标记的UPⅡ抗体，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤2：每孔分别加入UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤3：取出酶标板，于磁力板(Easyinno公司)上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
步骤4：用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗4次，每次300μL。
步骤5：每孔加入200μL浓度为0.1mol/L的碱性过氧化氢溶液，于Thermo发光仪(Thermo公司)波长430nm中读取发光值。根据不同的标准品浓度和吸光度建立标准曲线，样本通过标准曲线计算出样本浓度，尿液样本等于测定样本浓度除以肌酐。
结果如表6所示。
表6：膀胱癌阳性样本和对照组(阴性样本)的发光值
Figure BDA0003040106100000171
实施例7
本实施例的检测膀胱癌的试剂盒，为通过三联吡啶钌电化学发光法检测膀胱癌的试剂盒。所述试剂盒包括三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原和链霉亲合素包被的磁珠混悬液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述UPII抗原标准品为浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL和8ng/mL。
尿液样本运用Roche cobas702全自动生化仪测定样本中肌酐含量。采用该试剂盒检测膀胱癌，包括如下步骤：
步骤1：在96孔白色酶标板(JET公司)中分别加入50μL标准品/样本和50μL三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤2：每孔分别加入物素标记UPⅡ抗原以及50μL链霉亲合素包被的磁珠混悬液，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤3：取出酶标板，于磁力板(Easyinno公司)上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
步骤4：用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗4次，每次300μL。
步骤5：电化学发光分析仪波长620nm中读取发光值。根据不同的标准品浓度和吸光度建立标准曲线，样本通过标准曲线计算出样本浓度，尿液样本等于测定样本浓度除以肌酐。
结果如表7所示。
表7：膀胱癌阳性样本和对照组(阴性样本)的发光值
Figure BDA0003040106100000181
实施例8
本实施例的检测膀胱癌的试剂盒，为通过三联吡啶钌电化学发光法检测膀胱癌的试剂盒。所述检测膀胱癌的试剂盒包括三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体和UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液。
采用该试剂盒检测膀胱癌，包括如下步骤：
步骤1：在96孔白色酶标板(JET公司)中分别加入50μL样本和50μL三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤2：每孔分别加入UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液，振荡混匀后，37℃恒温箱温育7分钟。
步骤3：取出酶标板，于磁力板(Easyinno公司)上静置3-5分钟以分离磁珠与上清液，弃上清液。
步骤4：用三羟甲基氨基甲烷洗涤液(TBST)洗4次，每次300μL。
步骤5：化学发光分析仪波长620nm中读取发光值。根据不同的标准品浓度和吸光度建立标准曲线，样本通过标准曲线计算出样本浓度，尿液样本等于测定样本浓度除以肌酐。
结果如表8所示。
表8：膀胱癌阳性样本和对照组(阴性样本)的发光值
Figure BDA0003040106100000191
由实施例1-实施例8可知，UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合，可以用于制备检测膀胱癌的试剂盒。
所述UPⅡ抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
MAPLLPIRTLPLILILLALLSPGAADFNISSLSGLLSPALTESLLVALPPCHLTGGNATLMVRRANDSKVVTSSFVVPPCRGRRELVSVVDSGAGFTVTRLSAYQVTNLVPGTKFYISYLVKKGTATESSREIPMSTLPRRNMESIGLGMARTGGMVVITVLLSVAMFLLVLGFⅡALALGSRK
所述UPⅡ抗原包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的突变、插入或缺失形成具有UPⅡ抗原性的蛋白片段。
所述UPⅡ抗原可以自己制备，具体是：先合成UPⅡ核酸序列，再重组UPⅡ核酸序列到大肠杆菌，培养、提取和纯化，即得UPⅡ抗原。
上述膀胱癌的尿液和血液样本由湖南省肿瘤医院收集,并与病人签订样本采集同意书，对照尿液和血液样本由深圳市龙华区中心医院收集并与病人签订样本采集同意书。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.UPⅡ抗原和UPⅡ抗体联合在制备检测膀胱癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测膀胱癌的产品包括通过碱性磷酸酶化学发光法、辣根过氧化物酶化学发光法、吖啶酯类化学发光法和三联吡啶钌电化学发光法中的任意一种检测膀胱癌的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测膀胱癌的试剂盒包括碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原、链霉亲合素包被的磁珠混悬液、发光底物、标准品和缓冲液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述发光底物为Lumi-Phos 530、AMPPD和APS-5中的任意一种；所述标准品为浓度为0ng/mL-10ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系包括但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白，所述表面活性包括但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮；所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫柳求和ProClin300。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测膀胱癌的试剂盒包括碱性磷酸酶标记的UPⅡ抗体、UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液、发光底物、标准品和缓冲液，其中，所述发光底物为Lumi-Phos 530、AMPPD和APS-5中的任意一种；所述标准品为浓度为0ng/mL-10ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系包括但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白，所述表面活性包括但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮，所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫柳求和ProClin300。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测膀胱癌的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原、链霉亲合素包被的磁珠混悬液、发光底物、标准品和缓冲液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述发光底物为Lumi-Phos 530、AMPPD和APS-5中的任意一种；所述标准品为浓度为0ng/mL-10ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系包括但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白，所述表面活性包含但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮，所述防腐包括但不限于叠氮钠、硫柳求和ProClin300。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测膀胱癌的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的UPⅡ抗体、UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液和发光底物，其中，所述发光底物为Lumi-Phos 530、AMPPD和APS-5中的任意一种。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测膀胱癌的试剂盒包括吖啶酯标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原、链霉亲合素包被的磁珠混悬液、碱性过氧化氢溶液、标准品和缓冲液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL；所述标准品为浓度为0ng/mL-10ng/mL的UPII抗原；所述缓冲液包括缓冲体系、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲体系包括但不限于硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl和醋酸盐，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白，所述表面活性包括但不限于吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮，所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、硫柳求和ProClin300。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测膀胱癌的试剂盒包括吖啶酯标记的UPⅡ抗体、UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液和碱性过氧化氢溶液，其中，所述碱性过氧化氢溶液的浓度为0.1mol/L。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测膀胱癌的试剂盒包括三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体、生物素标记的单克隆UPⅡ抗原和链霉亲合素包被的磁珠混悬液，其中，所述链霉亲合素包被的磁珠混悬液的浓度为0.1mg/mL。
10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测膀胱癌的试剂盒包括三联吡啶钌标记的UPⅡ抗体和UPⅡ抗原包被的磁珠混悬液。
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