CN110441531B - 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 - Google Patents
一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110441531B CN110441531B CN201910761050.4A CN201910761050A CN110441531B CN 110441531 B CN110441531 B CN 110441531B CN 201910761050 A CN201910761050 A CN 201910761050A CN 110441531 B CN110441531 B CN 110441531B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer solution
- solution
- procalcitonin
- washing
- pbs buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 title claims abstract description 45
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 37
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 14
- -1 polysaccharide compound Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims abstract description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 9
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 8
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 5
- 229940071089 sarcosinate Drugs 0.000 claims description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 229940113116 polyethylene glycol 1000 Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 5
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 4
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 4
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 201000005008 bacterial sepsis Diseases 0.000 description 2
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical class 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108010075850 pro-calcitonin gene-related peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法，试剂盒包括包被捕获抗体的固相载体、生物素标记的检测抗体、荧光素标记链霉亲和素、洗涤缓冲液等；本发明石英针表面覆有具有生物相容性的多糖复合物，多糖复合物可有效增强特异性的免疫信号，检测信号的放大是通过在多糖复合物表面形成多层荧光素‑链霉亲和素分子层而实现的；本发明在洗涤缓冲液中添加洗涤能力较强的SDS和Triton‑X100，同时提高洗涤液的离子强度，有效控制了分子之间的非特异性相互作用，进而实现检测结果的低背景和高信噪比，提高检测的敏感性和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种检测血液中降钙素原的试剂盒及检测方法。
背景技术
PCT(降钙素原，procalcitonin)是一种蛋白质，来自定位于第11号染色体上(11p15,4)的单拷贝基因,该基因由2800个碱基对组成,含6个外显子和5个内含子。转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降钙素原前体,包括N端84个氨基酸、活性降钙素和降钙蛋白三部分。降钙素原前体在内源多肽酶作用下剪掉nPro-CT端单一序列,生成116氨基酸的PCT,分子量约为13kD,PCT和降钙素具有一个相同的32个氨基酸的序列(60～91位)。
PCT是无激素活性的降钙素前肽物质。在健康人体内含量极少，血液中几乎不能被检测到(<0.1ng/ml)。而在病理状态下，各组织器官几乎都能分泌PCT，其生成过程细菌毒素和炎症细胞因子的多种因素的调节。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。
当发生严重细菌感染和脓毒症时，血浆PCT异常升高，2小时即可检测到，6小时急剧上升，8-24小时维持高水平，半衰期为22-29小时。
PCT在体内外稳当性好，不易被降解，PCT的检测不受临床用药的影响，与机体感染的严重程度成正比，PCT浓度的升高不受机体免疫抑制状态的影响，当机体处于严重细菌感染及脓毒症时，即使患者处于免疫抑制状态或无明显临床表现，血浆中PCT浓度都可见明显升高。
检测PCT的实验室方法有很多，常用的有放射免疫学分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、胶体金比色法(GICA)和酶联免疫法(ELISA)，放射免疫学分析法利用人工合成的多克隆抗体特异地识别和连接合成氨基酸降钙素原。该方法能检测正常人的血清PCT，可靠敏感度为4pm/mL，检测的是游离PCT、结合型PCT和降钙素基因相关肽前体的混合物，而不能区分上述三种物质。该法检测耗时长(19～22h)，而且有放射性元素的污染使用受到限制。化学发光免疫分析法(CLIA)是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体；这种激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测定PCT的浓度。目前市场上有管式和板式两种试剂盒，但此法存在吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺直接标记抗体的发光效率低，标记物不稳定的缺点，而且这种直接标记法属于瞬间发光型，很难保证测试结果的稳定性和重复性，还需要特殊的检测仪器。不便于常规实验室开展。而利用生物素-亲和素系统检测PCT的电化学发光免疫试剂盒，需要配套昂贵的全自动电化学发光检测仪，常规实验室无法开展，而且给患者带来不必要的费用，增加患者负担。采用胶体金技术，包括胶体金标记的抗抗钙素的单克隆抗体和用作包被的抗降钙素多克隆抗体，当标本(血清或血浆)加入标本孔，金标单克隆抗体与标本中的PCT结合，形成金标记的抗原抗体复合物。该复合物在反应膜上移动，与固定在膜上的抗降钙素抗体结合形成更大的复合物。当PCT浓度超过0.5ng/mL，该复合物显示红色，红色的深浅与PCT的浓度成正比，与标准比色板比较即可得出PCT的浓度范围。该法具有快速简便，易观察的特点。但检测结果只能达到半定量的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法，增强了特异性的免疫信号且显著降低了非特异性结合，从而提高检测的敏感性和准确性。
为实现上述目的，本发明的技术方案提供一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法，包括包被捕获抗体的固相载体、生物素标记的检测抗体、荧光素标记链霉亲和素、洗涤缓冲液。
优选的，所述固相载体为石英针。
优选的，所述固相载体上涂覆有多糖复合物，多糖复合物为含质量分数0.5～2.5％壳聚糖、0.1～0.5％甘油，0.5～1.5％聚乙二醇1000的去离子水溶液。
优选的，所述洗涤缓冲液为含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠的PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)。
一种检测血液中降钙素原的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)包被捕获抗体的固相载体：将石英针的下端在多糖复合物中浸泡1-3分钟，4℃冷冻干燥，将降钙素原捕获抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，将干燥后的石英针下端部放置于降钙素原捕获抗体溶液中，24℃反应2小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液洗涤3次，再置于封闭液中封闭8-12h，封闭液为含有1％BSA、0.1％酪蛋白、3％蔗糖的Tris-Hcl缓冲液，制得包被捕获抗体的固相载体；
(2)生物素标记的检测抗体：将降钙素原检测抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：生物素＝1:3-1:8的比例添加生物素，24℃反应8-12小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液透析16-24小时，换液3次，制得生物素标记的检测抗体；
(3)洗涤缓冲液：称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL，制得PBS缓冲液，根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤缓冲液所需各原料的量：0.35M的NaCl、0.1％vol的曲拉通X-100、4g/L的十二烷基肌氨酸钠，称量完毕后置于上述制备的PBS缓冲液中溶解，并混合均匀，即得洗涤缓冲液。
本发明具有有益效果：本发明石英针表面覆有具有生物相容性的多糖复合物，多糖复合物可与蛋白质分子形成氢键弱相互作用，减少非特异性吸附，多糖复合物可有效增强特异性的免疫信号，检测信号的放大是通过在多糖复合物表面形成多层荧光素-链霉亲和素分子层而实现的；本发明在洗涤缓冲液中添加洗涤能力较强的SDS和Triton-X100，同时提高洗涤液的离子强度，有效控制了分子之间的非特异性相互作用，进而实现检测结果的低背景和高信噪比，提高检测的敏感性和准确性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
荧光素标记链霉亲和素购自Solarbio，货号为SF068-0.1ml。
实施例1
一种检测血液中降钙素原的试剂盒，包括包被捕获抗体的石英针、生物素标记的检测抗体、荧光素标记链霉亲和素、洗涤缓冲液。
所述固相载体上涂覆有多糖复合物，多糖复合物为含质量分数0.5～2.5％壳聚糖、0.1～0.5％甘油，0.5～1.5％聚乙二醇1000的去离子水溶液。
所述洗涤缓冲液为含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠的PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)。
实施例2
一种检测血液中降钙素原的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)包被捕获抗体的固相载体：将石英针的下端在多糖复合物中浸泡1-3分钟，4℃冷冻干燥，将降钙素原捕获抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，将干燥后的石英针下端部放置于降钙素原捕获抗体溶液中，24℃反应2小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液洗涤3次，再置于封闭液中封闭8-12h，封闭液为含有1％BSA、0.1％酪蛋白、3％蔗糖的Tris-Hcl缓冲液，制得包被捕获抗体的固相载体；
(2)生物素标记的检测抗体：将降钙素原检测抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：生物素＝1:3-1:8的比例添加生物素，24℃反应8-12小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液透析16-24小时，换液3次，制得生物素标记的检测抗体；
(3)洗涤缓冲液：称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL，制得PBS缓冲液，根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤缓冲液所需各原料的量：0.35M的NaCl、0.1％vol的曲拉通X-100、4g/L的十二烷基肌氨酸钠，称量完毕后置于上述制备的PBS缓冲液中溶解并混合均匀，即得洗涤缓冲液。
实施例3
试剂盒的使用方法：将包被捕获抗体的固相载体放入样本中，10-60s后取出用洗涤缓冲液清洗3-5次，清洗后放入生物素标记的检测抗体中，10-60s后取出用洗涤缓冲液清洗3-5次，清洗后放入荧光素标记链霉亲和素中10-60s后取出用洗涤缓冲液清洗3-5次，即可采用荧光分析检测仪检测。
本发明样本中的目标抗原首先与固相载体表面的捕获抗体结合，该固相载体随后依次浸入含有生物素标记的检测抗体中以及荧光素标记链霉亲和素中进行结合反应，固相载体表面涂敷了具有生物相容性的多糖复合物，可有效抵抗非特异性结合，信号的放大是通过在惰性的多糖基质表面形成层层叠叠的Cy5-SA分子层而实现的。这种循环标记反应可不断重复而进一步放大信号。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (2)
1.一种检测血液中降钙素原的试剂盒，其特征在于，包括包被捕获抗体的固相载体、生物素标记的检测抗体、荧光素标记链霉亲和素、洗涤缓冲液；
所述固相载体为石英针；
所述固相载体上涂覆有多糖复合物，多糖复合物为含质量分数0.5～2.5％壳聚糖、0.1～0.5％甘油，0.5～1.5％聚乙二醇1000的去离子水溶液；
所述洗涤缓冲液为含0.15～0.35M的NaCl、0.05～0.1％vol的曲拉通X-100、3～6g/L的十二烷基肌氨酸钠的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液浓度为0.01M，pH为7.4。
2.一种检测血液中降钙素原的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)包被捕获抗体的固相载体：将石英针的下端在多糖复合物中浸泡1-3分钟，4℃冷冻干燥，将降钙素原捕获抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，将干燥后的石英针下端部放置于降钙素原捕获抗体溶液中，24℃反应2小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液洗涤3次，再置于封闭液中封闭8-12h，封闭液为含有1％BSA、0.1％酪蛋白、3％蔗糖的Tris-Hcl缓冲液，制得包被捕获抗体的固相载体；
(2)生物素标记的检测抗体：将降钙素原检测抗体用0.01M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：生物素＝1:3-1:8的比例添加生物素，24℃反应8-12小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液透析16-24小时，换液3次，制得生物素标记的检测抗体；
(3)洗涤缓冲液：称量3.58g Na2HPO4·12H2O，0.4g KCl，0.54g KH2PO4，加800mL双蒸水溶解，调节pH值为7.4，定溶至1000mL，制得PBS缓冲液，根据下述浓度计算并称取配制1L洗涤缓冲液所需各原料的量：0.35M的NaCl、0.1％vol的曲拉通X-100、4g/L的十二烷基肌氨酸钠，称量完毕后置于上述制备的PBS缓冲液中溶解，并混合均匀，即得洗涤缓冲液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910761050.4A CN110441531B (zh) | 2019-08-17 | 2019-08-17 | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910761050.4A CN110441531B (zh) | 2019-08-17 | 2019-08-17 | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110441531A CN110441531A (zh) | 2019-11-12 |
| CN110441531B true CN110441531B (zh) | 2022-08-23 |
Family
ID=68436293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910761050.4A Active CN110441531B (zh) | 2019-08-17 | 2019-08-17 | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110441531B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111579800A (zh) * | 2020-05-18 | 2020-08-25 | 巴迪泰（广西）生物科技有限公司 | 超敏降钙素原检测试剂及其制备方法及使用方法 |
| CN113671171A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-11-19 | 安徽惠邦生物工程有限公司 | 信号放大量子点荧光免疫探针及其制备方法和应用 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5091694A (en) * | 1989-01-31 | 1992-02-25 | Tokyo Electron Limited | Quartz probe apparatus |
| US5164299A (en) * | 1990-03-20 | 1992-11-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of a mixture of conjugated and unconjugated solid phase binding reagent to enhance the performance of assays |
| DE19826617C1 (de) * | 1998-06-17 | 1999-12-09 | Univ Magdeburg Tech | Verfahren zur Herstellung von Immunosensoren |
| CN1475578A (zh) * | 2002-08-12 | 2004-02-18 | 王鹤尧 | 一种新的基因芯片固相载体的制备方法 |
| US7179660B1 (en) * | 2000-03-06 | 2007-02-20 | Dade Behring Marburg Gmbh | Carriers coated with polysaccharides, their preparation and use |
| CN104246500A (zh) * | 2012-04-16 | 2014-12-24 | 万迈医疗仪器有限公司 | 宽范围发光免疫分析 |
| CN105392363A (zh) * | 2013-03-01 | 2016-03-09 | A·S·戈尔兹伯勒 | 样品的固定和稳定化 |
| CN106486336A (zh) * | 2015-08-31 | 2017-03-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种氢氟酸刻蚀毛细管制备石英针的方法 |
| CN108700571A (zh) * | 2016-02-23 | 2018-10-23 | 田中贵金属工业株式会社 | 麦醇溶蛋白检测用免疫层析分析装置、免疫层析分析试剂盒以及免疫层析分析方法 |
| CN109133659A (zh) * | 2018-07-17 | 2019-01-04 | 王晓飞 | 快速批量制备可变锥度石英针的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19748489A1 (de) * | 1997-11-03 | 1999-05-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren |
| DE102006020866A1 (de) * | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Siemens Ag | Analyseeinheit, Biosensor und Verfahren für den Nachweis oder die Konzentrationsbestimmung eines Analyten |
-
2019
- 2019-08-17 CN CN201910761050.4A patent/CN110441531B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5091694A (en) * | 1989-01-31 | 1992-02-25 | Tokyo Electron Limited | Quartz probe apparatus |
| US5164299A (en) * | 1990-03-20 | 1992-11-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of a mixture of conjugated and unconjugated solid phase binding reagent to enhance the performance of assays |
| DE19826617C1 (de) * | 1998-06-17 | 1999-12-09 | Univ Magdeburg Tech | Verfahren zur Herstellung von Immunosensoren |
| US7179660B1 (en) * | 2000-03-06 | 2007-02-20 | Dade Behring Marburg Gmbh | Carriers coated with polysaccharides, their preparation and use |
| CN1475578A (zh) * | 2002-08-12 | 2004-02-18 | 王鹤尧 | 一种新的基因芯片固相载体的制备方法 |
| CN104246500A (zh) * | 2012-04-16 | 2014-12-24 | 万迈医疗仪器有限公司 | 宽范围发光免疫分析 |
| CN105392363A (zh) * | 2013-03-01 | 2016-03-09 | A·S·戈尔兹伯勒 | 样品的固定和稳定化 |
| CN106486336A (zh) * | 2015-08-31 | 2017-03-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种氢氟酸刻蚀毛细管制备石英针的方法 |
| CN108700571A (zh) * | 2016-02-23 | 2018-10-23 | 田中贵金属工业株式会社 | 麦醇溶蛋白检测用免疫层析分析装置、免疫层析分析试剂盒以及免疫层析分析方法 |
| CN109133659A (zh) * | 2018-07-17 | 2019-01-04 | 王晓飞 | 快速批量制备可变锥度石英针的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110441531A (zh) | 2019-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3258270B1 (en) | Cardiac troponin i ultra-sensitive detection reagent kit, and ultra-sensitive detection method therefor | |
| CN109975557B (zh) | Il-6/pct联合检测时间分辨检测试剂盒及方法 | |
| US20230048869A1 (en) | Freeze-dried preparation of chemiluminescent immune microspheres, and preparation method and application thereof | |
| US20050244904A1 (en) | Diagnostics based on signal peptide detection | |
| JP4685034B2 (ja) | 医療診断目的のためのエンドセリン形成の測定方法、ならびに、このような方法を実施するための抗体およびキット | |
| CN112014577B (zh) | 一种提高gpc3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法 | |
| US10451624B2 (en) | Reagent kit used for detecting lipoprotein-associated phospholipase A2, and preparation method and application for reagent kit | |
| CN111766390A (zh) | 脂联素化学发光免疫检测试剂盒 | |
| EP3258266A1 (en) | Reagent kit used for detecting gastrin-17, and preparation method and application for reagent kit | |
| CN111007269A (zh) | 总ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN110441531B (zh) | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 | |
| CN113640511B (zh) | 一种磁微粒电化学发光试剂盒 | |
| CN110907654A (zh) | 一种游离雌三醇定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN109085343B (zh) | 一种测定抗Jo-1抗体的试剂盒及检测方法 | |
| CN112255419A (zh) | 一种中期因子Midkine生物分析方法及检测试剂盒 | |
| CN108267594A (zh) | 一种基于双分子荧光互补技术的st2检测试剂盒、制备及使用方法 | |
| JPH07198721A (ja) | 免疫測定用緩衝液 | |
| CN111190018A (zh) | 一种检测白细胞介素6含量的试剂盒 | |
| CN115453126B (zh) | 一种pivka-ⅱ检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN108226529A (zh) | 一种基于双分子荧光互补技术的NT-proBNP检测试剂盒、制备及使用方法 | |
| CN118011015B (zh) | 一种维生素k2发光免疫检测方法及维生素k2检测试剂盒 | |
| CN209878780U (zh) | 胃蛋白酶原i检测试剂盒 | |
| CN117538522A (zh) | 一种磁珠试剂、检测特发性炎症性肌病自身抗体的体外诊断试剂盒及使用方法 | |
| CN119936413A (zh) | 一种氨基末端脑利钠肽前体电化学发光检测试剂盒 | |
| CN119936412A (zh) | 一种降钙素原电化学发光检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |