CN113272449B - 调整聚合物小珠以进行dna处理 - Google Patents
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Abstract
本文提供的系统、方法和组合物涉及制备包封生物分子的小珠以用于对所述生物分子执行顺序反应。一些实施方案包括在所述小珠内制备核酸反应，其中所述小珠包含允许所述分子扩散到所述小珠内或扩散到所述小珠外但同时保留所关注的其他分子的孔隙。
Description
技术领域
本文提供的系统、方法和组合物涉及聚合物小珠、将生物分子包封在聚合物小珠内的方法以及使用聚合物小珠对包封的生物分子进行分析(包括例如空间索引测序和核酸文库制备)的方法。
背景技术
检测生物样品中存在的特定核酸序列已被用于例如进行微生物鉴定和分类、诊断传染性疾病、检测和表征基因异常、鉴定与各种疾病(诸如癌症)相关联的基因变化、研究疾病的基因易感性或测量对各种类型的治疗的响应。检测生物样品上的核酸序列需要多个酶促反应以最终确定核酸序列或生成核酸文库。
由于在进行多种分析期间在单个细胞内限制并使用细胞内生物分子极具挑战性，因此在单个细胞上进行多个酶促反应是不可靠的。许多基于细胞的分析无法保护细胞内分子，从而导致进行分析期间生物分子的丢失。
发明内容
一些实施方案涉及用于进行多个共分析反应的聚合物小珠。在一些实施方案中，该聚合物小珠包含水凝胶聚合物前体、交联剂和设置在该聚合物小珠内的生物分子，其中该小珠包含允许一种或多种试剂扩散通过小珠而同时保留生物分子的孔隙。在一些实施方案中，该小珠是多孔水凝胶小珠或多孔中空小珠。在一些实施方案中，该小珠包含多个聚合物层，其中每个层具有不同的孔隙大小和孔隙密度。在一些实施方案中，基于电荷、pH或温度的变化来调整孔隙的大小。
一些实施方案涉及对包封在聚合物小珠内的生物分子进行多个顺序共分析的方法。在一些实施方案中，该方法包括获取包封生物分子的聚合物小珠，其中该聚合物小珠包含水凝胶聚合物前体、交联剂和设置在该聚合物小珠内的生物分子，其中该小珠包含允许一种或多种试剂扩散通过小珠而同时保留生物分子的孔隙。在一些实施方案中，该方法还包括顺序地使单个细胞与试剂接触以进行多个顺序共分析。在一些实施方案中，该方法还包括通过调节电荷、pH或温度来调整该聚合物小珠的孔隙的大小。在一些实施方案中，该聚合物小珠包含多个聚合物层，并且每个聚合物层具有不同大小的孔隙。在一些实施方案中，通过改变电荷、pH或温度来具体地调整每个聚合物层的孔隙大小。在一些实施方案中，所述多个顺序共分析包括裂解、DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、片段标签化、核酸扩增、核酸测序、DNA文库制备、使用测序的转座酶可及染色质分析(ATAC-seq)、邻近性保留转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增或顺序执行的它们的任何组合。
附图说明
图1A是示出通过流通池上文库制备和接种对长DNA进行空间索引的实施方案的示意图。
图1B是示出使用包封长DNA分子的聚合物小珠的空间索引的示意图。可在聚合物小珠上使用试剂以在流通池表面上空间生成文库。
图2是描绘将长DNA包封在聚合物小珠内并在该聚合物小珠内制备文库的方法的流程图，该文库可在流通池装置上簇集和测序。
图3是示出对包封在聚合物小珠内的长DNA进行DNA测序的工作流程的示意图，该长DNA包括约100kb的DNA片段(在片段标签化之前没有多重置换扩增(MDA)步骤(分图(a))或具有MDA步骤(分图(b)))和约10-20kb的DNA片段(分图(c))。
图4为是示出在没有MDA的情况下来自100kb DNA片段的长DNA水凝胶空间索引测序数据的选通读段的图。
图5示出了在具有MDA的情况下100kb DNA片段上的长DNA水凝胶空间索引的连锁读段(linked read)的线形图。
图6示出了在具有MDA的情况下10kb DNA片段上的长DNA水凝胶空间索引的连锁读段的线形图。
图7A和图7B描绘了包封在聚合物小珠内的长DNA的空间读段(spatial read)的线形图。图7A示出了包封在聚合物小珠内的细胞的空间读段，并且插入小图描绘了示出聚合物小珠内的细胞的显微图。图7B示出了包封在聚合物小珠内的长DNA片段的空间读段，并且插入小图描绘了示出包封在小珠内的片段的显微图。
图8描绘了示出对包封在聚合物小珠内的微生物物种的鉴别的显微图。聚合物小珠包封了各种微生物物种，并且进行空间阅读测序以鉴别微生物。
图9示出了显示包封在聚合物小珠内的长DNA的条码读段的分布的图。
图10A示出了显示包封在聚合物小珠内的大肠杆菌细胞的来自单次运行的短读段和连锁读段的图。如图所示，连锁读段跨越重复区域并且可改善从头序列组装。图10B示出了描绘空间连锁读段和间隙短读段的显微图。
图11A是示出分子基于孔隙大小和孔隙密度扩散到聚合物小珠内的示意图。图11B是示出分子扩散到聚合物小珠外的示意图。
图12是示出在聚合物小珠内保留核酸文库的示意图。
图13A和图13B示出了显示核酸根据核酸大小而扩散到聚合物小珠内的图。这些图表示小扩增子(220bp-1kbp)进入聚合物小珠内而较长的扩增子不扩散到聚合物小珠内。
图14描绘了多孔中空小珠的显微图，示出了在这些多孔中空小珠内对200个碱基对和5000个碱基对DNA片段进行的基于PCR的扩增。
图15示出了显示多层聚合物小珠的示意图，其中每一层具有不同的孔隙大小，并且可根据环境条件的变化单独调整每一层的孔隙大小。
图16A至图16C描绘了具有带有牺牲性聚丙烯酰胺核心物的稳定化壳的聚合物小珠。图16A示意性地描绘了聚合物小珠的结构，该聚合物小珠具有含N,N'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺(DHEBA)加上丙烯酸酯-PEG和过氧二硫酸钾(KPS)的壳。该核心物为与样品(细胞或DNA)混合的填料核心物，诸如PEG或聚丙烯酰胺。图16B描绘了围绕小珠的壳的形成。图16C示出了具有牺牲性聚丙烯酰胺核心物的DHEBA壳的显微照片。
图17A至图17C描绘了具有带有牺牲性琼脂糖核心物的稳定化壳的聚合物小珠。图17A示意性地描绘了具有与样品(细胞或DNA)混合的琼脂糖核心物的DHEBA壳的结构。图17B示出了具有琼脂糖核心物的DHEBA壳的显微图。图17C示出了具有琼脂糖核心物的DHEBA壳的温度熔融显微图。
图18A至图18C描绘了荧光引发的胶凝。如图18A所示，活细胞与胶凝起始物质FITC-AETC接触。FITC-AETC包被的细胞受到辐射和单体影响，从而在这些细胞周围形成凝胶小珠。图18B描绘了显微图，包括FITC-AETC处理细胞与未用FITC-AETC处理的对照细胞进行对比的激发显微图。图18C示出了在各种条件下FITC引发的细胞胶凝的显微图。
具体实施方式
在以下具体实施方式中参考了附图，这些附图形成该具体实施方式的一部分。在附图中，除非上下文另有规定，否则类似的符号通常标识类似的部件。具体实施方式、附图和权利要求书中所述的示例性实施方案并非意在进行限制。在不脱离本文所呈现的主题的实质或范围的情况下，可利用其他实施方案，并且可作出其他改变。将易于理解的是，如本文大体所述并且如附图所示，可按照多种不同的构型对本公开的各方面进行布置、取代、组合、分离和设计，所有这些构型在本文中均是明确设想的。
实施方案涉及用于将生物分子包封在聚合物小珠内并对包封的生物分子进行一次或多次分析的组合物、系统和方法。聚合物小珠将生物分子保留在小珠内，但允许较小的分子(诸如试剂)扩散到聚合物小珠内或扩散到聚合物小珠外，同时保留被分析的生物分子。如本文所公开的，该聚合物小珠包含孔隙，对孔隙的大小和密度进行调整以控制大小和扩散到聚合物小珠内或扩散到聚合物小珠外的分子。
在一个实施方案中，该聚合物小珠是包封或含有一个或多个生物分子的均匀多孔水凝胶基质。在另一个实施方案中，该聚合物小珠是具有多孔水凝胶壳和中空内部空间的中空小珠，其中生物分子包封在该中空内部空间内。在一些实施方案中，该聚合物小珠(无论是均匀多孔水凝胶基质还是中空小珠)可包含多个聚合物层，其中每个聚合物层是具有不同性质(诸如孔隙大小)的不同基质。在一些实施方案中，对每个聚合物层进行可控的调整以调节每个聚合物层的孔隙的大小，从而允许使用者以可控且逐步的方式控制分子扩散到聚合物小珠内或扩散到聚合物小珠外。在一些实施方案中，通过改变环境条件(诸如pH、电荷或温度)可控地调整每个聚合物层，由此环境条件的变化调整小珠或小珠壳的孔隙大小，并从而允许分子或试剂以可控且逐步的方式从小珠释放或进入小珠。
本文所述的实施方案包括用于对包封到聚合物小珠中的生物分子进行顺序反应的可靠且高通量的系统和方法。本文所述的方法和系统涉及对包封的生物分子进行一种或多种分析，包括例如裂解、DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、片段标签化、核酸扩增、核酸测序、DNA文库制备、使用测序的转座酶可及染色质分析(ATAC-seq)、邻近性保留转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增或顺序执行的它们的任何组合。
一个实施方案是一种方法，包括将生物分子包封在聚合物小珠内、将包封生物分子的聚合物小珠上样到流通池装置上、制备核酸文库、在该流通池装置的表面上释放所制备的文库以及对释放的文库进行簇集和测序。在一些实施方案中，该生物分子是细胞、蛋白质、核酸、DNA、RNA或它们的任何衍生物或类似物。
在一些实施方案中，制备文库包括聚合物小珠内分离的DNA的片段标签化。包封的DNA的标签化将较长的DNA序列切割成较短的片段标签化片段，然后将其用于在流通池的表面上产生DNA簇。簇是长DNA的片段标签化片段的产物，其各自可例如使用SBS测序进行测序。来自单个长DNA分子的一组簇在本文中被称为“长DNA岛”。在一些实施方案中，单个聚合物小珠可包封单个长DNA分子或多个长DNA分子。每个长DNA分子产生单个长DNA岛。单个聚合物小珠内的所有长DNA岛的簇在本文中被称为“簇云”。因此，簇云表示单个聚合物小珠内的所有簇，并且可包括许多长DNA岛(每个长DNA岛表示单个长DNA分子)，并且每个长DNA岛包括多个簇。
小珠可包含在存在生物分子如核酸(诸如长DNA分子)或含核酸的来源的情况下进行混合的水凝胶聚合物和交联剂，这些水凝胶聚合物和交联剂然后形成包封该生物分子的聚合物小珠。在一些实施方案中，该核酸来源是细胞。
在一些实施方案中，小珠孔隙允许小于1000碱基对的分子的扩散，例如小于100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000碱基对或更小的分子，或者由前述值中任两个值限定的范围内的量的分子，但保留大于上述值的化合物(或不允许化合物扩散)。因此，在一些实施方案中，聚合物小珠保留(或不允许化合物扩散)大于100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000碱基对或更大的分子，或者由前述值中任两个值限定的范围内的量的分子。
一些实施方案包括使用包封生物分子的小珠进行核酸反应的方法，所述核酸反应包括例如长DNA分子的高通量空间索引。如图1A所示，长DNA分子的文库制备可通过将来自单一长DNA分子的簇作为“簇块”簇集并接种在表面上来容易地进行，然后可对其进行阅读和空间映射。如本文所用，术语“长DNA”可包括大于300个碱基对的DNA片段。如本文所用，长DNA片段是指长度大于1kb、2.5kb、5kb或更长，诸如10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、60kb、70kb、80kb、90kb、100kb、200kb、300kb、400kb或500kb或更长的DNA，包括由前述值中任两个值限定的范围内的量的DNA。
一些实施方案包括使用单个小珠将基因组样品片段化成一系列长DNA片段的方法。然后可将该单个小珠粘附至流通池上的一个特定位置，在那里沉积长DNA片段，使得这些长DNA片段中的每个长DNA片段在流通池表面上彼此邻近定位。该流通池可用于核苷酸测序系统(诸如ILLUMINA HISEQ系统)内以确定来自每个长DNA片段的核苷酸序列。由于DNA片段彼此邻近地设置在流通池表面上，因此该系统可使用该空间位置数据来更有效地重建初始基因组DNA的最终核苷酸序列。该系统可沉积直接来自单个细胞、长DNA片段或染色体的空间上协同定位的读段。在一些实施方案中，这些方法允许低输入、无PCR的文库制备工作流程。在一些实施方案中，可在不需要分子条码标记的情况下执行这些方法。
一些实施方案涉及制备包封生物分子的聚合物小珠的方法。在一些实施方案中，包封长DNA的聚合物小珠可用于处理细胞基因组并在小珠内进行DNA文库制备。在一些实施方案中，该包封长DNA片段的聚合物小珠包封单个细胞，其可用于处理细胞基因组DNA并用于在小珠内进行全DNA文库制备。
在一些实施方案中，可对聚合物小珠的孔隙大小进行工程改造以允许酶、化学品和较小引物(<50bps)的扩散，同时保留较大的核酸(>300bps)，使得可在处理期间将长DNA片段和所产生的DNA文库保留在聚合物小珠内。在一些实施方案中，特定引物可在聚合物小珠基质内进行化学连接以杂交和处理特定基因组DNA。然后可将来自单个细胞的DNA文库释放到特定区域(例如在流通池表面上)以用于文库接种。随后，这导致源自包封的长DNA片段的“DNA簇”在流通池上的空间分布，从而简化后处理期间的读段比对。
如本文所用，术语聚合物小珠是指多孔水凝胶小珠或多孔中空小珠。在一些实施方案中，将聚合物小珠制备成多孔水凝胶小珠。多孔水凝胶小珠是在整个小珠中具有相对均匀的多孔基质的小珠。如本文所述，多孔水凝胶小珠包封生物分子，并包含允许分子扩散到该多孔水凝胶小珠内或扩散到该多孔水凝胶小珠外的孔隙。还可基于环境条件(诸如pH、温度或电荷)的变化调整孔隙以改变孔隙的大小，从而允许分子以可控方式扩散到该多孔水凝胶小珠内或扩散到该多孔水凝胶小珠外。在一些实施方案中，多孔水凝胶小珠可包含一种或多种类型的聚合物，每种聚合物具有不同的孔隙大小和孔隙密度，并且每种聚合物被单独调整以使得不同大小的分子能基于环境条件的变化而扩散。
在一些实施方案中，该聚合物小珠被制备成多孔中空小珠。多孔中空小珠是具有多孔聚合物壳但具有中空内部的小珠。如本文所述，多孔中空小珠将生物分子包封在中空内部中。该聚合物壳的孔隙允许分子扩散到该中空内部内或扩散到该中空内部外，并且可基于环境条件诸如pH、温度或电荷的变化对其进行调整以改变孔隙的大小，从而允许分子以可控方式扩散到该中空内部内或扩散到该中空内部外。在一些实施方案中，多孔中空小珠包含多个多孔聚合物壳，每个壳具有不同的孔隙大小和孔隙密度，并且基于环境条件的变化对每个壳进行单独地调整以允许不同大小的分子的扩散。例如，如图15所示，多孔中空小珠可具有中空内部(或中空核心物)，该中空内部具有多个聚合物壳。图15描绘了具有三个多孔聚合物壳的多孔中空小珠，它们在图15中被称为聚合物1、聚合物2和聚合物3。分子保留在多孔中空小珠内，并且第一聚合物的调整导致第一分子扩散通过聚合物壳。第二聚合物的调整导致第二分子扩散通过聚合物壳。本领域技术人员将认识到，图15所描绘的示例是示例性的，并且多个多孔聚合物壳可用于控制分子扩散到多孔中空小珠内或扩散到多孔中空小珠外。例如，多孔中空小珠可包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个不同的聚合物壳，每个聚合物壳具有特定的孔隙大小和孔隙密度，并且每个聚合物壳能够被调整以控制分子扩散到该多孔中空小珠内或扩散到该多孔中空小珠外。
如本文所用，术语“试剂”描述可用于与样品反应、与样品相互作用、稀释样品或添加到样品中的试剂或两种或更多种试剂的混合物，并且可包括用于核酸反应的试剂，包括例如缓冲液、化学品、酶、聚合酶、大小小于50个碱基对的引物、模板核酸、核苷酸、标记物、染料或核酸酶。在一些实施方案中，该试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如Tn5)、引物(例如P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液或二价阳离子。
包封生物分子的聚合物小珠
一个实施方案包括包含水凝胶聚合物和生物分子的小珠。如本文所用，术语“水凝胶”是指当有机聚合物(天然的或合成的)通过共价键、离子键或氢键交联以产生包埋水分子的三维开放晶格结构而形成凝胶时所形成的物质。在一些实施方案中，水凝胶可以是生物相容性水凝胶。如本文所用，术语“生物相容性水凝胶”是指形成对活细胞无毒并且允许氧和营养物质充分扩散到包埋的细胞以保持活力的凝胶的聚合物。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包含60％-90％的流体(诸如水)和10-30％的聚合物。在某些实施方案中，水凝胶的水含量为约70％-80％。
可通过使亲水性生物聚合物或合成聚合物交联来制备水凝胶。因此，在一些实施方案中，水凝胶可包含交联剂。如本文所用，术语“交联剂”是指当与适当的基础单体反应时可形成三维网络的分子。可包含一种或多种交联剂的水凝胶聚合物的示例包括但不限于透明质酸盐、脱乙酰壳多糖、琼脂、肝素、硫酸盐、纤维素、藻酸盐(包括硫酸藻酸盐)、胶原、葡聚糖(包括硫酸葡聚糖)、果胶、角叉菜胶、聚赖氨酸、明胶(包括A型明胶)、琼脂糖、(甲基)丙烯酸酯-低聚乳酸-PEO-低聚乳酸-(甲基)丙烯酸酯、PEO-PPO-PEO共聚物(普朗尼克)、聚(磷腈)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、PL(G)A-PEO-PL(G)A共聚物、聚(乙烯亚胺)、聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、马来酰亚胺(MAL)、PEG/MAL、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯或它们的组合。因此，例如，组合可包括聚合物和交联剂，例如聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy)、PEG/聚环氧丙烷(PPO)或N,N'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺(DHEBA)。
在一些实施方案中，交联剂在水凝胶聚合物中形成二硫键，从而连接水凝胶聚合物。在一些实施方案中，水凝胶聚合物形成具有孔隙的水凝胶基质或聚合物壳。这些孔隙能够将足够大的分子(例如长DNA片段)保留在聚合物小珠内，但允许小材料(诸如试剂)通过这些孔隙，从而进出聚合物小珠。在一些实施方案中，通过改变聚合物浓度与交联剂浓度的比率来对孔隙大小进行精调。在一些实施方案中，聚合物与交联剂的比率为30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20或1:30，或者由前述比率中的任两个比率限定的范围内的比率。在一些实施方案中，可将另外的功能诸如DNA引物或带电化学基团接枝到聚合物基质以满足不同应用的要求。
此外，在一些实施方案中，可通过改变聚合物小珠所处的环境条件(包括通过改变pH、电荷或温度)来调整、调节、改变、改进、修改或定制孔隙的大小或密度。可通过对环境进行增量变化来以可控方式调节孔隙，从而允许分子以可控方式扩散。
如本文所用，术语“孔隙率”是指由开放空间(例如孔隙或其他开口)组成的水凝胶的分数体积(无量纲)。因此，孔隙率测量材料中的空隙空间，并且是空隙体积相对于总体积的分数，为0％到100％(或0到1)之间的百分比。水凝胶的孔隙率可在0.5至0.99、约0.75至约0.99或约0.8至约0.95的范围内。
水凝胶可具有任何孔隙大小。如本文所用，术语“孔隙大小”是指孔隙的横截面的直径或有效直径。术语“孔隙大小”还可指基于对多个孔隙的测量值的孔隙的横截面的平均直径或平均有效直径。非圆形的横截面的有效直径等于具有与非圆形的横截面相同的横截面积的圆形横截面的直径。在一些实施方案中，当水凝胶水化时可溶胀。孔隙的大小然后可根据水凝胶中的水含量而改变。在一些实施方案中，水凝胶的孔隙可以具有足够大小的孔隙以将生物分子保留在聚合物小珠内但允许试剂通过，并且可如本文所述对其进行调整以允许分子以可控的方式通过。
在一些实施方案中，交联剂是可逆交联剂。在一些实施方案中，该可逆交联剂能够使水凝胶聚合物可逆地交联，并且能够在存在切割剂(cleaver)的情况下解交联。在一些实施方案中，可通过还原剂的存在、通过升高的温度或通过电场来切割交联剂。在一些实施方案中，该可逆交联剂可以是N,N'-双(丙烯酰)胱胺，其为用于聚丙烯酰胺凝胶的可逆交联剂，其中二硫键可在存在合适还原剂的情况下断裂。在一些实施方案中，使交联剂与还原剂接触切割交联剂的二硫键，从而分解聚合物小珠。聚合物小珠降解并释放内容物，诸如保留在其中的核酸。在一些实施方案中，通过将温度升高至大于50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃来切割交联剂。在一些实施方案中，通过使聚合物小珠与还原剂接触来切割交联剂。在一些实施方案中，还原剂包括膦化合物、水溶性膦、含氮膦及其盐和衍生物、二硫赤藓糖醇(DTE)、二硫苏糖醇(DTT)(分别为2,3-二羟基-1,4-二硫醇丁烷的顺式异构体和反式异构体)、2-巯基乙醇或β-巯基乙醇(BME)、2-巯基乙醇或氨基乙硫醇、谷胱甘肽、巯基乙醇酸盐或巯基乙酸、2,3-二巯基丙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟甲基)膦(THP)或对-[三(羟甲基)膦]丙酸(THPP)。
在一些实施方案中，升高温度以增强扩散或与还原剂接触使交联剂降解，从而从聚合物小珠中释放出包封的生物分子或由其衍生的分子。
在一些实施方案中，交联剂的交联在聚合物小珠内建立孔隙。在一些实施方案中，聚合物小珠中的孔隙的大小是可调控的，并被配制以包封生物分子(诸如大于约5000个碱基对的DNA片段)，但允许较小粒子(诸如试剂)或小于约50个碱基对的较小的核酸(诸如引物)通过孔隙，如图1B所示。在一些实施方案中，这些试剂包括用于处理生物分子或由其衍生的分子的试剂，诸如用于从细胞分离核酸、用于对核酸进行扩增、条码标记或测序或用于制备核酸文库的试剂。在一些实施方案中，这些试剂包括例如溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如Tn5)、引物(例如P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液或二价阳离子。
在一些实施方案中，长DNA包括基因组DNA、病毒核酸、细菌核酸或哺乳动物核酸。在一些实施方案中，聚合物小珠包含长DNA的来源，包括例如细胞。在一些实施方案中，该细胞是单细胞，包括原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。在一些实施方案中，该细胞是细菌细胞。因此，如图7A和图7B所示，该方法可在长DNA片段上或在细胞上进行，这些长DNA片段或细胞中的任一者或两者用聚合物小珠包封。
在一些实施方案中，该聚合物小珠是牺牲性聚合物小珠，其具有由壳包封的牺牲性核心物。如本文所用，术语“牺牲性”具有其按照本说明书所理解的普通含义，并且是指用于制备或组装小珠但可在后续阶段溶解或丢弃的小珠或小珠的一部分。在一些实施方案中，牺牲性聚合物小珠包含与样品(诸如细胞或DNA)接触的聚合物材料(诸如琼脂糖或聚丙烯酰胺)，从而形成聚合物小珠。然后可用由具有不同熔融特性的不同聚合物材料构成的壳包封该聚合物小珠，诸如包含N,N'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺(DHEBA)、丙烯酸酯-PEG或KPS或它们的组合的壳。在包封之后，可将包封的聚合物小珠置于足以移除内小珠的条件下，从而留下壳。这些条件可包括例如温度、pH的变化或还原剂的添加。
在另一些实施方案中，本文所述的聚合物小珠中的任何聚合物小珠均可包含连接到该聚合物材料的荧光材料。该荧光材料可包括例如异硫氰酸荧光素(FITC)或任何其他荧光化合物，其可结合至聚合物材料(诸如丙烯酸酯聚合物)以形成荧光聚合物材料，诸如FITC-丙烯酸酯聚合物(FITC-AETC)。连接至聚合物材料的荧光材料可与细胞接触而引发荧光胶凝，从而形成围绕细胞的荧光聚合物小珠。在一些实施方案中，其中具有细胞的聚合物小珠可以荧光成像，无需染色。
制作聚合物小珠的方法
本文提供的一些实施方案涉及制作包封生物分子的小珠的方法。在一些实施方案中，该聚合物小珠是如本文所述的多孔水凝胶小珠或如本文所述的多孔中空小珠。
在一些实施方案中，通过涡旋辅助乳化来制备聚合物小珠。如本文所用，涡旋辅助乳化是指在容器中(诸如在管、小瓶或反应容器中)涡旋具有长DNA片段或长DNA片段的来源的水凝胶聚合物。可例如通过手动或机械涡旋或摇动来混合组分。在一些实施方案中，手动混合导致包封的生物分子具有以下大小的直径：2μm、3μm、4μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm或150μm，或者由前述值中任两个值限定的范围内的值。在一些实施方案中，小珠的大小是不均匀的，因此小珠的大小包括各种直径的小珠。
在一些实施方案中，通过微流体液滴生成来制备小珠。如图1B所示，微流体液滴生成包括使用微流体装置来辅助凝胶乳液生成。在一些实施方案中，该微流体装置包括微通道，这些微通道被配置成产生期望大小的聚合物小珠并且被配置成每个小珠包封选定量的生物分子。在一些实施方案中，该微流体装置具有50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm或200μm的高度，或者由前述值中任两个值限定的范围内的高度。在一些实施方案中，该微流体装置包括一个或多个通道。在一些实施方案中，该微流体装置包括用于水性流的通道和用于不混溶流体的通道。在一些实施方案中，所述一个或多个通道的宽度相同。在一些实施方案中，所述一个或多个通道的宽度不同。在一些实施方案中，所述一个或多个通道的宽度是20μm、30μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、105μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、135μm、140μm、145μm或150μm，或者由前述值中任两个值限定的范围内的宽度。在一些实施方案中，该水性通道的宽度为75μm。在一些实施方案中，该不混溶流体通道的宽度为78μm。本领域的技术人员将认识到，宽度可变化以对小珠的大小进行精调。除了微流体装置的大小和通道的宽度之外，水性通道和不混溶流体通道的流速也可影响聚合物小珠的大小。
在一些实施方案中，水相通道中溶液的流速为1μL/min、2μL/min、5μL/min、10μL/min、20μL/min、30μL/min、40μL/min、50μL/min、60μL/min、70μL/min、80μL/min、90μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min或150μL/min，或者由前述值中任两个值限定的范围内的速率。在一些实施方案中，不混溶流体在不混溶流体通道中的流速为20μL/min、30μL/min、50μL/min、80μL/min、100μL/min、150μL/min、160μL/min、170μL/min、180μL/min、190μL/min、200μL/min、225μL/min、250μL/min、275μL/min、300μL/min、325μL/min、350μL/min、375μL/min或400μL/min，或由前述值中任两个值限定的范围内的速率。在一些实施方案中，水相中的溶液包含水凝胶聚合物、交联剂和生物分子，该溶液以小于不混溶流体的流速流动通过水性通道并流入不混溶流体(诸如载体油)中，从而形成液滴。在一些实施方案中，该不混溶流体是油，诸如矿物油、烃油、硅油、聚二甲基硅氧烷油、四甲基乙二胺(TEMED)或它们的混合物。在一些实施方案中，含有生物分子的水凝胶液滴以均匀的大小分布配制。在一些实施方案中，通过调节该微流体装置的大小、所述一个或多个通道的大小或所述水性溶液或不混溶流体中的任一者或两者的流速来对聚合物小珠的大小进行精调。在一些实施方案中，所得的聚合物小珠具有2μm至150μm范围内的直径，例如2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm或150μm，或由上述值中任两个值限定的范围内的直径。
在一些实施方案中，可通过在小珠形成之前使水凝胶聚合物与流体改性剂诸如与醇(包括异丙醇)接触来进一步控制包封生物分子的聚合物小珠的大小和均匀度。
在一些实施方案中，可通过稀释或浓缩输入的样品内的长DNA片段来控制包封在小珠内的长DNA片段的量。包含长DNA片段的样品与水凝胶聚合物混合，并且对包含长DNA片段的水凝胶聚合物进行涡旋辅助乳化或微流体液滴生成，如本文所述。
在一些实施方案中，聚合物小珠可被官能化并用于核酸的纯化。在一些实施方案中，用核苷酸使这些聚合物小珠官能化。在一些实施方案中，该核苷酸是寡核苷酸或polyT核苷酸。在一些实施方案中，该核苷酸结合至聚合物小珠，并且官能化的小珠可用于所关注核苷酸的靶向捕集。
在一些实施方案中，可用具有与聚合物小珠不同的特性(诸如不同的熔融温度、不同的孔隙大小或不同的溶解特性)的聚合物壳来包封聚合物小珠。在一些实施方案中，该聚合物壳可包含DHEBA材料。
处理包封在聚合物小珠内的生物分子的方法
一些实施方案包括如图2所示处理小珠内的生物分子的方法，该图描绘了在聚合物小珠中制备和处理生物分子的流程图。在第一步中，将DNA样品(诸如来自基因组数据或细胞)包封在聚合物小珠内。在一些实施方案中，长DNA片段保留在该聚合物小珠内，而试剂能够通过该聚合物小珠的孔隙。在一些实施方案中，这些试剂可包括裂解剂、核酸纯化剂、片段标签化剂、PCR剂或用于处理生物分子或由其衍生的分子的其他试剂。因此，聚合物小珠通过允许试剂进出该聚合物小珠的屏障同时保留将长DNA片段保留在小珠内来为该聚合物小珠内的长DNA片段的受控反应提供微环境。一旦将DNA包封进小珠中，该过程转到下一步骤，在该步骤中可将样品上样到流通池中以通过文库制备过程产生长DNA片段。
如本文所用，术语“片段标签化”是指通过转座体复合物修饰DNA，该转座体复合物包含与含有转座子端序列的接头复合的转座酶。片段标签化导致DNA的片段化和接头与双链体片段的两条链的5'端的连接同时发生。在移除转座酶的纯化步骤后，可将另外的序列加到已衔接片段的端，例如通过PCR、连接或本领域技术人员已知的任何其他合适的方法。
在一些实施方案中，全DNA文库制备可通过穿过多孔水凝胶进行多次试剂交换同时将gDNA及其文库产物保留在水凝胶基质内而在结合至流通池的聚合物小珠内无缝地完成。水凝胶可耐受高达95℃的高温数小时以支持不同的生化反应。
在该过程的下一步骤中，对来自先前文库制备的包封长DNA片段的聚合物小珠进行处理以从该小珠中释放、纯化和分离长DNA片段。因此，例如，聚合物小珠与裂解缓冲液接触。如本文所用，“裂解”意指对细胞壁或病毒颗粒的扰动或改变，从而有利于接近或释放细胞RNA或DNA。细胞壁的完全破坏或破裂都不是裂解的必要要求。术语“裂解缓冲液”是指包含至少一种裂解剂的缓冲液。典型的酶促裂解剂包括但不限于溶菌酶、葡萄糖酶、消解酶、溶细胞酶、蛋白酶K、蛋白酶E以及病毒内溶素和外溶素。因此，例如，可通过向聚合物小珠中引入裂解剂(诸如溶菌酶和蛋白酶K)在小珠中进行细胞的裂解。来自细胞的gDNA现在包含于小珠内。在一些实施方案中，在裂解处理后，分离的核酸保留在聚合物小珠内并可用于进一步处理。
如本文所用，除非另外指明，否则本文所用的术语“分离的”、“待分离”、“分离、”“纯化的”、“待纯化”、“纯化”及其语法等同术语是指减少来自样品或来自材料从其分离的来源(例如细胞)的至少一种污染物(诸如蛋白质和/或核酸序列)的量。因此，纯化导致“富集”，例如样品中所需蛋白质和/或核酸序列的量增加。
在一些实施方案中，在聚合物小珠内对包封的核酸进行全部或部分测序。可根据任何合适的测序方法对包封的核酸进行测序，诸如直接测序，包括边合成边测序、边连接边测序、杂交测序、纳米孔测序等。
本文提供的一些实施方案涉及对长DNA片段能够实现的边合成边测序(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板(例如，目标核酸或其扩增子)的延伸，以确定该模板中核苷酸的序列。基础化学过程可以是聚合反应(例如，由聚合酶催化的)。在特定的基于聚合酶的SBS具体实施方案中，以依赖于模板的方式将荧光标记的核苷酸添加至引物(从而使引物延伸)，使得对添加至该引物的核苷酸的顺序和类型的检测可用于确定该模板的序列。
一种或多种扩增的包封核酸可进行SBS或涉及试剂在循环中重复递送的其他检测技术。例如，为了启动第一SBS循环，可使一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等可流入/通过容纳一个或多个扩增核酸分子的聚合物小珠。可检测引物延伸导致标记的核苷酸掺入的那些位点。任选地，核苷酸可进一步包括可逆终止属性，一旦将核苷酸添加至引物，该可逆终止属性终止进一步的引物延伸。例如，可将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加至引物，使得随后的延伸直到递送解封闭剂以除去该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可将解封闭剂递送至流通池(在检测发生之前或之后)。可在各个递送步骤之间进行洗涤。然后可将循环重复n次以使引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可容易地适于与通过本公开的方法产生的扩增子一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台描述于例如以下文献：Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)，WO 04/018497；美国专利号7,057,026；WO 91/06678；WO07/123744；美国专利号7,329,492；美国专利号7,211,414；美国专利号7,315,019；美国专利号7,405,281和US 2008/0108082，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文。
可使用利用循环反应的其他测序程序，诸如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测当特定核苷酸掺入新生核酸链中时无机焦磷酸盐(PPi)的释放(Ronaghi等人，AnalyticalBiochemistry 242(1)，84-9(1996)；Ronaghi，Genome Res.11(1)，3-11(2001)；Ronaghi等人，Science，281(5375)，363(1998)；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可通过被腺苷三磷酸(ATP)硫酸化酶立即转化为ATP成来进行检测，并且可通过荧光素酶产生的光子来检测所产生的ATP水平。因此，可经由发光检测系统监测测序反应。用于基于荧光的检测系统的激发辐射源并非焦磷酸测序程序所必需的。可适于将焦磷酸测序应用于根据本公开产生的扩增子的有用的流体系统、检测器和程序描述于例如以下文献：WIPO专利申请序列号PCT/US11/57111、US 2005/0191698A1、美国专利号7,595,883和美国专利号7,244,559，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文。
一些实施方案可利用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如，可通过携带荧光团的聚合酶与γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用或者用零模波导(ZMW)来检测核苷酸掺入。用于基于FRET的测序的技术和试剂描述于例如以下文献中：Levene等人，Science 299，682-686(2003)；Lundquist等人，Opt.Lett.33，1026-1028(2008)；Korlach等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)，这些文献的公开内容以引用方式并入本文。
一些SBS实施方案包括检测在核苷酸掺入延伸产物时释放的质子。例如，基于对释放的质子的检测进行的测序可使用电检测器和可商购获得的相关技术。此类测序系统的示例是焦磷酸测序(例如，可从Roche的子公司454Life Sciences商购获得的平台)，使用γ-磷酸标记的核苷酸的测序(例如，可从Pacific Biosciences商购获得的平台)和使用质子检测的测序(例如，可从Life Technologies子公司Ion Torrent商购获得的平台)或以下文献中所述的测序方法和系统：US 2009/0026082 A1、US 2009/0127589A1、US 2010/0137143A1或US 2010/0282617 A1，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文。本文所阐述的使用动力学排除来扩增靶核酸的方法可容易地应用至用于检测质子的底物。更具体地讲，本文所阐述的方法可用于产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
另一种测序技术是纳米孔测序(参见例如Deamer等人，Trends Biotechnol.18,147-151(2000)；Deamer等人，Acc.Chem.Res.35:817-825(2002)；Li等人，Nat.Mater.2:611-615(2003)，这些文献的公开内容以引用方式并入本文)。在一些纳米孔实施方案中，靶核酸或从靶核酸移除的单独核苷酸穿过纳米孔。当核酸或核苷酸穿过纳米孔时，可通过测量该孔隙的电导率的波动来识别每种核苷酸类型(美国专利号7,001,792；Soni等人，Clin.Chem.53，1996-2001(2007)；Healy，Nanomed.2，459-481(2007)；Cockroft等人，J.Am.Chem.Soc.130，818-820(2008)，这些文献的公开内容以引用方式并入本文)。
可应用于根据本公开的检测的基于阵列的表达和基因分型分析的示例性方法描述于以下文献中：美国专利号7,582,420、6,890,741、6,913,884或6,355,431或者美国专利公布号2005/0053980A1、2009/0186349A1或US2005/0181440A1，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文。
在如本文所述的分离核酸、扩增和测序的方法中，将各种试剂用于核酸分离和制备。此类试剂可包括例如溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如Tn5)、引物(例如P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液或二价阳离子。这些试剂穿过聚合物小珠的孔隙，而生物分子或由其衍生的分子保留在聚合物小珠内。本文所阐述的方法的优点在于它们提供了用于在聚合物小珠内处理核酸的包封的微环境。这使得能够进行单细胞处理以快速且有效地加工靶核酸。
接头可包括测序引物位点、扩增引物位点和索引。如本文所用，“索引”可包括可用作分子标识符和/或条码以标记核酸和/或识别核酸来源的核苷酸序列。在一些实施方案中，索引可用于识别单个核酸或核酸亚群。在一些实施方案中，可在聚合物小珠内制备核酸文库。在一些实施方案中，包封在聚合物小珠内的单个细胞可用于单个细胞的组合索引，例如使用邻近性保留转座(CPTSeq)方法。在一些实施方案中，来自单个细胞的DNA可通过如下方式进行条码标记：在进行WGA扩增后用携带条码标记的转座子的另一小珠包封单个细胞，并且通过使凝胶基质与还原剂接触来使其溶解(例如)以释放基因组DNA以进行条码标记。
本文所述的“空间索引”方法和技术的实施方案缩短了数据分析并简化了从单个细胞和长DNA分子制备文库的过程。用于单细胞测序的现有方案要求进行细胞的有效物理分离，并对每个分离的细胞进行唯一条码标记并将所有物质汇合在一起进行测序。合成长读段的当前方案也要求进行繁琐的条码标记步骤，并且将每个条码标记的片段汇合在一起以进行测序并允许进行数据分析以区分来自每个条码标记细胞的遗传信息。在这些过程中，可能存在材料的丢失，这导致序列信息遗漏。本文所述的实施方案不仅缩短了该过程，而且提高了单细胞的数据分辨率。此外，本文提供的实施方案简化了新生物体的基因组的组装。本文所述的实施方案可用于揭示罕见的遗传变异和突变的共现。在一些实施方案中，限定在聚合物小珠中直至释放的DNA文库提供了通过控制释放过程和水凝胶制剂来控制在表面上释放的片段的大小的机会。
在一些实施方案中，所述表面是流通池装置。在一些实施方案中，该流通池是具有孔、槽或图案的定制流通池装置。在一些实施方案中，该流通池包括图案化表面。在一些实施方案中，该图案化表面包括孔。在一些实施方案中，这些孔的直径为约10μm至约50μm，诸如10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm，或者由上述值中任两个值限定的范围内的值，并且其中这些孔的深度为约0.5μm至约1μm，诸如深度为0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm，或者由上述值中任两个值限定的范围内的值。在一些实施方案中，这些孔由疏水材料组成。在一些实施方案中，该疏水材料包括无定形含氟聚合物，诸如CYTOP、或/>
在一些实施方案中，可使用接头序列中的引物位点来扩增文库，并可使用接头序列中的测序引物位点来对其进行测序。在一些实施方案中，这些接头序列可包括索引以识别核酸的来源。引物二聚体的形成会降低后续扩增步骤的效率。为了提高后续扩增步骤的效率，可从连接产物中移除未连接的单链接头。
在一些实施方案中，可制备模型系统以确定聚合物小珠的孔隙率。如图11A和图11B所示，聚合物小珠可包封链霉亲和素化合物(图11A和图11B中描绘为SA)，从而将该链霉亲和素化合物保留在小珠内。在一些实施方案中，将连接至特定大小的扩增子的生物素化合物与聚合物小珠混合(图11A)。足够大小的生物素连接的扩增子能够扩散到聚合物小珠中并与该小珠内的链霉亲和素缀合，从而将该生物素连接的扩增子保留在小珠内。相反地，过大的生物素连接的扩增子将不会通过聚合物小珠，并且没有扩增子保留在小珠内。类似地，可制备链霉亲和素与生物素连接的扩增子缀合的聚合物小珠，并且试剂可通过以进行反应，诸如PCR(图11B)。大小足够的片段扩散到聚合物小珠外，而过大的片段不会扩散穿过聚合物小珠，而是保留在小珠内。
用聚合物小珠制备核酸文库
本文提供的系统、方法和组合物的一些实施方案包括其中接头连接至靶核酸的方法。这些接头可包括测序引物结合位点、扩增引物结合位点和索引。例如，接头可包括P5序列、P7序列或其互补序列。如本文所用，P5序列包括由SEQ ID NO:1(AATGATACGGCGACCACCGA)定义的序列，P7序列包括由SEQ ID NO:2(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)定义的序列。在一些实施方案中，P5或P7序列还可包括间隔区多核苷酸，其长度可为1至20个核苷酸，诸如1至15或1至10个核苷酸，诸如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一些实施方案中，该间隔区包括10个核苷酸。在一些实施方案中，该间隔区是聚T间隔区，诸如10T间隔区。间隔区核苷酸可包括在多核苷酸的5'端，其可通过与该多核苷酸的5'端的键而附接至合适的载体。可通过存在于该多核苷酸的5'端的含硫亲核物质(诸如硫代磷酸酯)来实现附接。在一些实施方案中，该多核苷酸将包括聚T间隔区和5'硫代磷酸酯基团。因此，在一些实施方案中，P5序列为5'硫代磷酸酯-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3'(SEQ ID NO:3)，并且在一些实施方案中，P7序列为5'硫代磷酸酯-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'(SEQ ID NO:4)。
索引可用于识别核酸分子的来源。在一些实施方案中，可对接头进行修饰以防止串联体的形成，例如通过添加防止接头在一端或两端延伸的封端基团。3'封端基团的示例包括3'-间隔区C3、双脱氧核苷酸和与底物的附接。5'封端基团的示例包括去磷酸化的5'核苷酸和与底物的附接。
接头包括核酸，诸如单链核酸。接头可包括长度小于、大于或等于约5个核苷酸、10个核苷酸、20个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸或前述大小中的任两者形成的范围内的大小的短核酸。在一些实施方案中，接头具有足够的大小以穿过聚合物小珠的孔隙。靶核酸包括DNA，诸如基因组或cDNA；RNA，诸如mRNA、sRNA或rRNA；或DNA和RNA的杂交体。可从包封在聚合物小珠内的单个细胞分离核酸。核酸可包含磷酸二酯键，并且可包括其他类型的主链，包括例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺以及肽核酸主链和键。核酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄原胶、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤，以及碱类似物诸如硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)和硝基吲哚(包括5-硝基吲哚)。在一些实施方案中，核酸可包含至少一种混杂碱基。混杂碱基可与不止一种不同类型的碱基进行碱基配对，并且例如当包含在用于在复杂核酸样品(诸如基因组DNA样品)中的随机杂交的寡核苷酸引物或插入序列中时，其可以是有用的。混杂碱基的一个示例包括可与腺嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶配对的肌苷。其他示例包括次黄嘌呤、5-硝基吲哚、无环的5-硝基吲哚、4-硝基吡唑、4-硝基咪唑和3-硝基吡咯。可使用可与至少两种、三种、四种或更多种类型的碱基进行碱基配对的混杂碱基。
一个示例性方法包括使靶核酸的5'端去磷酸化以防止在后续连接步骤中形成串联体；使用连接酶将第一接头连接至该去磷酸化靶标的3'端，其中该第一接头的3'端被封闭；使该连接的靶标的5'端重新磷酸化；使用单链连接酶将第二接头连接至该去磷酸化靶标的5'端，其中该第二接头的5'端是非磷酸化的。
另一个示例包括用5'核酸外切酶部分酶切核酸以形成具有单链3'突出端的双链核酸。包含3'封端基团的接头可连接至具有3'突出端的双链核酸的3'端。可将具有3'突出端与连接的接头的双链核酸去杂交以形成单链核酸。可将包含非磷酸化的5'端的接头连接至单链核酸的5'端。
使核酸(诸如核酸的5'核苷酸)去磷酸化的方法包括使核酸与磷酸酶接触。磷酸酶的示例包括小牛肠磷酸酶、虾碱性磷酸酶、南极磷酸酶和APEX碱性磷酸酶(Epicentre)。
连接核酸的方法包括使核酸与连接酶接触。连接酶的示例包括T4RNA连接酶1、T4RNA连接酶2、RtcB连接酶、甲烷杆菌RNA连接酶和TS2126 RNA连接酶(CIRCLIGASE)。
使核酸(诸如核酸的5'核苷酸)磷酸化的方法包括使核酸与激酶接触。激酶的示例包括T4多核苷酸激酶。
本文提供的实施方案涉及在聚合物小珠中制备核酸文库，使得该核酸文库在单个反应体积中制备。
本文提供的系统和方法的实施方案包括试剂盒，其含有用于制备包封生物分子的聚合物小珠的水凝胶聚合物、交联剂或微流体装置中的任何一者或多者，并且还包括可用于处理生物分子或由其衍生的分子的组分，包括用于细胞裂解、核酸扩增和测序或用于核酸文库制备的试剂，包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如Tn5)、引物(例如P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液或二价阳离子，如本文所述且用于生物分子或由其衍生的分子的相应处理。
如图12所示，制备包封细胞的聚合物小珠。将聚合物小珠暴露于用于细胞裂解和片段标签化的试剂。用洗涤剂(诸如SDS)处理聚合物小珠会导致碎裂，小分子可扩散到聚合物小珠外。在一些实施方案中，细胞生物分子的可保留性可受到最小阈值限度的限制，超过该最小阈值限度酶进入细胞的双向进入将受到限制。
另选地，在一些实施方案中，执行文库制备方法以增加基因组分子的物理大小，使得它们包含在聚合物小珠内，这克服了阈值限制。因此，如图12所示，在gDNA文库制备期间，片段标签化的gDNA片段通过Tn5结合保持在一起，从而防止其扩散到聚合物小珠之外。然而，在SDS处理后，Tn5被释放，如果所得文库片段太小，其可能会扩散出去。为了防止这种情况，具有突出的转座子端的Tn5酶可用于片段标签化。可在突出的5'或3'转座子端上执行化学过程以增加文库元件的大小或使得能够与小珠或其他生物分子结合。多种转座子设计和修饰可用于增加文库片段的物理大小。
例如，具有3'突出端的转座子可用于使DNA片段标签化。3'突出端可用作酶的底物。末端转移酶(TdT)可用于以独立于模板的方式添加一定数目的碱基。例如，TdT可用于向转座子添加100-300个碱基。如果TdT转座子延伸不足，则拉长的转座子可杂交至存在于聚合物小珠中的低聚结合小珠、互补扩增子或多聚腺苷酸尾细胞mRNA。如果与寡核苷酸杂交，则可进行延伸反应。例如，如果ssDNA质粒退火，则可进行滚环扩增(RCA)反应以增加转座子端的大小。杂交的寡核苷酸可另选地连接至转座子端。可进行扩增子的连续连接(诸如在循环连接组件(CLA)中)以将能够扩散到聚合物小珠中的较小片段组装成DNA的长段。
将经修饰的碱基添加至转座子也可用作结合另外的分子的靶标。经修饰的碱基可在片段标签化前存在于转座子中，或在片段标签化后酶促添加。例如，TdT可用于添加经修饰的碱基地高辛-11-UTP，其随后可被抗DIG抗体结合。其他修饰包括生物素和5mC，它们可分别与链霉亲和素和5mC抗体结合。
在一些实施方案中，可通过滚环扩增来进行来自相同聚合物小珠的gDNA片段和cDNA的同时索引和文库元件的额外扩增。
实施例
实施例1—聚合物小珠的制备
以下实施例展示了使用微流体液滴生成器制备包封长DNA片段的聚合物小珠的实施方案。
使用液滴生成器来生成聚合物小珠。将包含长DNA片段的样品与聚合物前体混合，然后将该混合物上样至卡盒上的样品贮存器中。在2分钟内，从每个通道(每个卡盒8个通道用于8个独立样品处理)生成约50,000个含有长DNA的聚合物小珠。将长DNA聚合物小珠上样至流通池上，在那里聚合物小珠卡在其中(100μm高通道和120μm聚合物小珠直径)以用于免手动文库制备。将酶和试剂(包括核酸文库制备酶和试剂)引入流通池中，从而接触嵌入聚合物小珠内的长DNA并通过片段标签化切割长DNA分子以形成DNA文库。然后将文库从小珠接种到流通池上。在库接种期间，将油上样以填充小珠之间的空隙，并且加热流通池以加速使库扩散到流通池表面上。在存在油的情况下，每个片段标签化的文库的接种发生在紧靠每个聚合物小珠的覆盖区地方(对于120μm直径的聚合物小珠，文库接种限于大约120μm直径的区域)。
该实施例展示了长DNA分子可上样并捕获在聚合物小珠(直径约120μm)中，并且对嵌入聚合物小珠内的这些长DNA分子进行文库制备。因此，来自特定长DNA分子的所有DNA文库都储存在相同的聚合物小珠内。然后将库从聚合物小珠释放到流通池表面以将它们作为一组接种在流通池表面。从长DNA分子释放的簇聚集在一起作为流通池上的“簇块”。来自单个长DNA分子的单块内部的簇以更高的准确性和更少的支架间隙(scaffolding gap)简化了基因组的重建。
实施例2—长DNA空间索引
以下实施例展示了在具有或不具有MDA的情况下包封在聚合物小珠内的100kb长DNA片段的选通读段的实施方案。
通过在存在约100kb Corriell基因组DNA的情况下混合聚合物并用微液滴生成器形成聚合物小珠来制备聚合物小珠。通过将所形成的包封DNA片段的聚合物小珠置于流通池装置上并使流通池与试剂接触，对DNA进行空间索引测序。未进行MDA。小珠被降解并在流通池装置上形成簇。如图5所示，每个长DNA岛的平均簇为约33个，平均长DNA岛大小为64000个碱基对，并且每个小珠具有约405个长DNA岛。
通过在存在约100kb Corriell基因组DNA的情况下混合聚合物并用微液滴生成器形成聚合物小珠来制备第二组聚合物小珠。通过将所形成的包封DNA片段的聚合物小珠置于流通池装置上并使流通池与试剂接触，对DNA进行空间索引测序。在片段标签化之前进行MDA。小珠被降解并在流通池装置上形成簇。如图6所示，每个长DNA岛的平均簇增加到约85个，平均长DNA岛大小为58000个碱基对，并且每个小珠具有约166个长DNA岛。
通过在存在约10kb Corriell基因组DNA的情况下混合聚合物并用微液滴生成器形成聚合物小珠来制备第三组聚合物小珠。通过将所形成的包封DNA片段的聚合物小珠置于流通池装置上并使流通池与试剂接触，对DNA进行空间索引测序。在片段标签化之前进行MDA。小珠被降解并在流通池装置上形成簇。如图7所示，每个长DNA岛的平均簇为约57个，平均长DNA岛大小为10461个碱基对，并且每个小珠具有约85个长DNA岛。
实施例3—微生物物种的复杂混合物的宏基因组学
以下实施例展示了识别包封在水凝胶内的单细胞微生物的实施方案。
如本文所述使用微流体微液滴生成器制备聚合物小珠。将聚合物材料与含有多种微生物的样品混合，所述多种微生物包括格氏乳杆菌(L.gasseri)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、普通拟杆菌(B.vulgatus)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、无乳链球菌(S.agalactiae)和痤疮丙酸杆菌(P.acnes)。然后包封的细胞被裂解并进行文库制备，此时聚合物小珠被降解，文库沉积在表面上。如图9所示，每个微生物由于其在流通池装置上的空间区室化而能够被识别。因此，包封和随后的核酸反应使得能够在微型宏基因组分析中使用读段区室化对复杂混合物中的微生物物种进行菌株级识别。
实施例4—流通池上空间索引
以下实施例展示了流通池上空间索引的实施方案。
获得流通池装置并且用200μl PR2(掺入缓冲液)洗涤。用于处理的小珠也用PR2洗涤。在PR2中制备稀释的水凝胶。稀释度增加导致水凝胶之间的间距增大。将水凝胶嵌入流通池上，并避免将气泡引入流通池中。使200μl PR2流过流通池以确保小珠保持固定以通过该过程。使100μl RSB流过流通池。
通过混合25μl片段标签化试剂、23μl RSB和2μl酶来制备片段标签化混合物。将片段标签化混合物引入窄通道以移除入口上的任何可能的气泡。然后使该片段标签化混合物缓慢流至入口。密封流通池并在55℃下温育10分钟。
通过混合25μl片段标签化缓冲液、25μl RSB和10μl终止缓冲液来制备终止缓冲液混合物。使该终止缓冲液混合物缓慢流到流通池上而不引入任何气泡，并在室温下温育5分钟。温育后，使200μl PR2流过该装置。
通过混合175μl RSB和75μl NPM来制备NPM。使NPM混合物缓慢流到流通池装置上而不引入任何气泡，并在室温下温育3分钟。使200μl含表面活性剂的油流到流通池装置上。显微照片显示水凝胶被NPM混合物和油包围。密封流通池并在72℃下温育3分钟以进行间隙填充反应。
使20μl-30μl含有表面活性剂的油和含有DTT的油(29/2的比率)流到流通池装置上，并且密封该装置。起始温度释放过程为：90℃持续3分钟，60℃持续5分钟，40℃持续2分钟以及20℃持续2分钟。用400μl PR2和200μl CLM(切割混合物)洗涤流通池。然后用400μlPR2洗涤流通池。在需要Phix接种的情况下，制备2-3pM浓度的Phix，并且使Phix文库流到装置上并在室温下温育5分钟。用200μl PR2洗涤流通池。使用于第1次延伸的100-200μl AMX流动并在50℃下温育5分钟。用PR2洗涤流通池，并且进行24个或30个循环的扩增。
实施例5—gDNA片段和cDNA的同时索引
以下实施例展示了来自相同聚合物小珠的gDNA片段和cDNA的同时索引的实施方案。
将聚合物小珠制备成中空聚合物壳，其中包封有细胞。将约25个至50个聚合物小珠分布到微量滴定板的孔中并用细胞裂解缓冲液处理以破坏细胞膜，然后用带索引的Y接头转座体进行gDNA转座，该Y接头转座体由在两条链的5'端磷酸化的转座子形成。添加末端转移酶(TdT)以将多个Ts添加到非转移链的3'端，从而允许与mRNA的多聚腺苷酸尾杂交。
gDNA和转座子的非转移链之间的间隙通过填充和连接反应进行，并且cDNA合成通过MMLV逆转录酶(RT)进行。MMLV RT还将几个额外的dCMPs碱基添加到cDNA分子的3'端，其与模板切换引物(TSP)的3'端处的寡聚G序列进行碱基配对。在模板切换反应中退火的TSP被延伸并且其序列被转移到新合成的cDNA的3'端。形成的gDNA-cDNA杂交体含有三个不同的共同序列，其中两个序列在链的两端，另一个在链的中间，从而分离杂交分子的gDNA和cDNA部分。这些共同序列用于gDNA和cDNA文库制备。
在副反应中，观察到mRNA的延伸和转座子的3'端处的模板切换，但这些活动不影响结果。在RNAse H处理和短暂洗涤后，将聚合物小珠的内容物热变性并进行环连接反应。在该反应期间，具有磷酸化5'端的所有单链DNA分子自连接成环，其成为滚环扩增(RCA)的模板。除了gDNA-cDNA杂交体之外，还在RCA反应中环连接和扩增了单独的片段标签化的DNA以及产生自退火至游离浮动转座体的mRNA的cDNA分子。长串联体包含多个拷贝的起始分子，增加了分析的灵敏度，并且保留在聚合物小珠内。
长度大约为1kbp的dsDNA可通过用于15％PEG-MAL中空聚合物小珠的聚合物小珠。简而言之，将链霉亲和素包被的小珠(约直径为10μm)包封在聚合物小珠内。此后，不同大小的生物素酰化扩增子扩散到聚合物小珠中。在可变的扩增子大小范围(例如220bp至5000bp)内确定代表分子大小界限的阈值扩散限度，如图13A至图13B所示。
类似地，为了测试聚合酶链反应的相容性和基因组产物的可保留性，设计了一种容纳模型，其中将结合了扩增子的聚合物小珠(使用生物素-链霉亲和素缀合化学过程)上样到聚合物小珠中。这些大小可变的扩增子在小珠上的线性扩增不仅表明聚合物小珠是PCR相容的，而且还能够针对200bp和5kbp扩增的DNA片段确定分子的保留性。200bp的产物可扩散到周围的聚合物小珠中，而5kbp的产物保留在聚合物小珠内(图14)。
除了可增大产物大小以保留小分子的生物分子分析之外，聚合物小珠还可由多层聚合物构成，所述多层聚合物可基于电荷、pH、温度或其他环境因素而具有分子的受控扩散(图15)。此类系统的示例可包括诸如离子和非离子聚合物(包括藻酸盐、聚乙二醇、N-异丙基丙烯酰胺、N,N'-二甲基丙烯酰胺或本文所述的其他聚合物)之类的材料。
实施例6—具有牺牲性核心物的聚合物小珠
以下实施例展示了制备具有牺牲性核心物的聚合物小珠的实施方案。
用样品(细胞或DNA)制备具有牺牲性聚合物的核心物。该核心物包含与样品混合以形成聚合物小珠的填料，诸如PEG或聚丙烯酰胺，如图16A所示。将小珠用50％异丙醇(IPA)缩合，并与带有KPS/TEMED的DHEBA/丙烯酰胺混合(图16B)。结果为用DHEBA壳包封的聚合物小珠。该DHEBA壳在用于去杂交和接种的温度下不稳定，导致核心物在高温下从DHEBA壳中释放。此外，用还原剂诸如DTT处理DHEBA聚合物小珠并在水中膨胀，得到DHEBA-丙烯酰胺壳。图16C描绘了对应于图16B所示的示意图的DHEBA聚合物小珠的显微图。
另一个实施方案是具有带琼脂糖核心物的DHEBA壳的聚合物小珠，如图17A所示。以类似于聚丙烯酰胺核心物小珠的方式制备该琼脂糖核心物小珠。使用本文所述的方法将细胞或DNA的样品与琼脂糖混合以形成聚合物小珠。琼脂糖小珠可被官能化并用于纯化样品，诸如DNA。使聚合物小珠与DHEBA接触，其包封了聚合物小珠，如图17B所示。UV可用于引发DHEBA壳围绕聚合物小珠的构造。琼脂糖核心物受到温度或化学酶切以使该核心物熔融，从而产生中空的DHEBA壳，如图17C所示。
实施例7—聚合物小珠的荧光引发胶凝
以下实施例展示了使用荧光引发胶凝法制备聚合物小珠的实施方案。
获得样品，诸如细胞或DNA。使该样品与具有结合了异硫氰酸荧光素(FITC)的丙烯酸酯聚合物(FITC-AETC)的聚合物接触，该聚合物包被样品。使结合了FITC-AETC的样品与辐射诸如光辐射和单体接触，这在聚合物凝胶内产生结合了FITC的细胞，如图18A中示意性地示出。由于细胞表面上的FITC相互作用，所得细胞可在不染色的情况下成像，如图18B和18C所示。未包被在FITC-AETC中的对照样品未显示出激发。本文所述的荧光素引发的胶凝可在溶液中进行。当在溶液中进行时，在本体溶液液滴的中心引发聚合。以210mM的量添加三乙醇胺(TEA)以引发胶凝。还添加0.05％NaHSO3。
本文所述的实施方案、实施例和附图提供了用于在从裂解到文库生成的过程中将生物分子保留在物理上受限的空间中的组合物、方法和系统。一些实施方案提供了用于在受限空间中释放到流通池的表面的源于单个长DNA分子或单个细胞的文库。一旦来自单个区室中的单个DNA分子或单个细胞的文库被释放到流通池表面，来自每个区室的文库就彼此紧邻地接种。
如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
以上描述公开了本发明的几种方法和材料。本发明易于在方法和材料上进行修改，以及在制造方法和设备上进行改变。考虑到本公开或本文公开的本发明的实践，这些修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。因此，并非意图将本发明限制于本文所公开的具体实施方案，而是其涵盖了落入本发明的真实范围和精神内的所有修改形式和替代形式。
本文引用的所有参考文献，包括但不限于公开和未公开的申请、专利和参考文献，均全文以引用方式并入本文，并且据此成为本说明书的一部分。在以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾的情况下，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
序列表
<110> ILLUMINA公司
<120> 调整聚合物小珠以进行DNA处理
<130> ILLINC.422WO
<150> 62/704,028
<151> 2018-10-26
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 2
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<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 3
tttttttttt aatgatacgg cgaccaccga 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 4
tttttttttt caagcagaag acggcatacg a 31
Claims (34)
1.一种用于进行多个共分析反应的聚合物小珠，所述聚合物小珠包含：
水凝胶聚合物前体；
交联剂；和
生物分子，所述生物分子设置在所述聚合物小珠内，其中所述小珠为多孔中空小珠，并且包含多个聚合物层，其中每个聚合物层包含不同的孔隙大小和不同的孔隙密度，以允许试剂扩散通过所述小珠同时保留所述生物分子的孔隙。
2.根据权利要求1所述的小珠，其中基于电荷、pH或温度来调整所述孔隙的大小。
3.根据权利要求1所述的小珠，其中所述小珠直径为50μm至150μm。
4.根据权利要求1所述的小珠，其中所述水凝胶聚合物包含聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯、PEG/马来酰亚胺(PEG/MAL)、丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BACy)、N,N'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺(DHEBA)、PEG/聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素或胶原。
5.根据权利要求1所述的小珠，其中所述交联剂包括双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯。
6.根据权利要求1所述的小珠，其中所述生物分子是核酸。
7.根据权利要求6所述的小珠，其中所述核酸是50,000个碱基对或更大的长DNA分子。
8.根据权利要求1所述的小珠，其中所述试剂包括酶、化学品和大小小于50个碱基对的引物。
9.根据权利要求1所述的小珠，其中所述试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶、转座酶、引物、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液或二价阳离子。
10.根据权利要求9所述的小珠，其中所述聚合酶为Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶或Bsu聚合酶。
11.根据权利要求9所述的小珠，其中所述转座酶为Tn5。
12.根据权利要求9所述的小珠，其中所述引物为P5和P7接头序列。
13.根据权利要求1所述的小珠，其中所述小珠还包含包封所述小珠的稳定化壳。
14.根据权利要求13所述的小珠，其中所述稳定化壳包含N,N'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺(DHEBA)、丙烯酸酯-PEG和过氧二硫酸钾(KPS)。
15.根据权利要求1所述的小珠，所述小珠还包含结合至所述水凝胶聚合物前体的荧光化合物。
16.根据权利要求15所述的小珠，其中所述荧光化合物是异硫氰酸荧光素(FITC)。
17.一种对包封在聚合物小珠内的生物分子进行多个顺序共分析的方法，所述方法包括：
获取根据权利要求1所述的包封生物分子的聚合物小珠；以及
顺序地使单个细胞与试剂接触以进行多个顺序共分析。
18.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括通过调节电荷、pH或温度来调整所述聚合物小珠的孔隙的大小。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述聚合物小珠包含多个聚合物层，并且其中每个聚合物层具有不同大小的孔隙，并且其中通过改变电荷、pH或温度来具体地调整所述每个聚合物层的孔隙大小。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个顺序共分析包括裂解、DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、或顺序执行的它们的任何组合。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个顺序共分析包括片段标签化、核酸扩增、核酸测序、使用测序的转座酶可及染色质分析(ATAC-seq)、邻近性保留转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增或顺序执行的它们的任何组合。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个顺序共分析包括DNA文库制备。
23.根据权利要求17所述的方法，其中包封生物分子的所述聚合物小珠接种在固体载体上。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述固体载体是蚀刻的表面、孔、流通池装置、微流体通道、小珠或柱。
25.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物分子是核酸。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述核酸是50,000个碱基对或更大的长DNA分子。
27.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括在进行片段标签化反应之前对包封在所述聚合物小珠内的核酸进行核酸扩增反应。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括多重置换扩增(MDA)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述片段标签化反应包括使生物分子与包含接头序列和转座体的转座酶混合物接触。
30.根据权利要求22所述的方法，所述方法还包括将所述DNA文库接种在固体载体上。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述接种包括切割所述小珠以从所述小珠释放所述DNA文库。
32.根据权利要求31所述的方法，其中通过使所述小珠与切割混合物接触或通过将所述小珠加热至约90℃来切割所述小珠以释放所述DNA文库。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述切割混合物包含二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(3-羟丙基)膦(THP)。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述固体载体是流通池装置。
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