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CN113265344A - 一种选择性生产视黄醇的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种选择性生产视黄醇的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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CN113265344A CN202110545875.XA CN202110545875A CN113265344A CN 113265344 A CN113265344 A CN 113265344A CN 202110545875 A CN202110545875 A CN 202110545875A CN 113265344 A CN113265344 A CN 113265344A
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Abstract

本发明公开了一种选择性生产视黄醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。所述基因工程菌为以产β‑胡萝卜素的工程菌株为出发菌，导入β‑胡萝卜素15，15’‑双加氧酶编码基因以及醛还原酶编码基因或/和视黄醇脱氢酶编码基因，实现以细胞工厂选择性地生产视黄醇。为进一步提高视黄醇的产量，所述基因工程菌还导入了香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因、切除N端线粒体定位肽的NADH激酶的编码基因，同时其甲羟戊酸途径转录抑制因子基因被敲除，增加前体和辅酶的供应。本发明还提供了利用该基因工程菌生产视黄醇的方法，在发酵过程中添加亚铁离子和抗氧化剂，使视黄醇产量得到进一步提高。

Description

一种选择性生产视黄醇的基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程、代谢工程和微生物领域，特别涉及一种能实现视黄醇选择性生产的基因工程菌的构建方法和应用。
背景技术
维生素A(Vitamin A，VA)泛指具有类似视黄醇(Retinol)生物活性的物质，一般由4个连续的类异戊二烯单元侧链及一个β-紫罗兰酮环的20个碳结构组成，根据15位碳结合的基团不同可分为视黄醇(羟基)、视黄醛(醛基)、视黄酸(羧基)和视黄酯(酰基)。由于存在特殊的共轭双键系统，维生素A暴露于光、氧气和过渡金属离子后，易被氧化和异构化导致其降解。
维生素A作为人体必需维生素，在维持视觉功能，参与免疫系统，调控细胞增殖、分化，稳定上皮细胞形态功能等生理活动方面起到了重要作用。
市面上的商品化维生素A大多是化学合成。目前传统的维生素A化学合成方法主要有Roche和BASF两种工艺。两种VA化学合成途径存在的共性问题是对VA效价最高的全反式体的选择性不高。Roche路线合成的最终产物是全反式异构体和效价较高的13-顺式异构体，且顺式异构体占了80％的比例。BASF路线在合成分子的骨架阶段约有28％的11-顺式体，而全反式体只有70％，在后续的witting反应中C5醛酯带来的顺式异构体又会产生13-顺式体，因此最后必须进行额外的光学异构才能获得全反式体。
利用微生物异源合成生产维生素A是一种高效且有前景的方法。目前，以大肠杆菌(Selective retinol production by modulating the composition of retinoids frommetabolically engineered E.coli,Biotechnol Bioeng,2015)和酿酒酵母(Vitamin AProduction by Engineered Saccharomyces cerevisiae from Xylose via Two-Phasein Situ Extraction,ACS Synth Biol,2019)为宿主合成的维生素A，视黄醇的比例最高占总产量的88％，产量仅为76.56mg/L，而醇形式的维生素A在化妆品领域的应用价值远高于醛形式。
因此，如何利用微生物异源合成方式高效制备醇形式的维生素A是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够选择性生产视黄醇的基因工程菌，利用微生物异源合成方式高效制备醇形式的维生素A。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种选择性生产视黄醇的基因工程菌，所述基因工程菌为以产β-胡萝卜素的工程菌株为出发菌，其染色体上整合了β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因(β-carotene 15，15’-dioxygenase，BLH)以及醛还原酶(Aldehyde reductase)编码基因或/和视黄醇脱氢酶(Retinol dehydrogenase)编码基因；
或者，所述基因工程菌以产β-胡萝卜素的工程菌株为出发菌，宿主菌内含有包含了β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因以及醛还原酶编码基因或/和视黄醇脱氢酶编码基因的重组表达质粒。
所述出发菌产β-胡萝卜素的工程菌株采用本领域公知的具有产β-胡萝卜素功能的菌株，其中香叶基香叶基焦磷酸的缩合、八氢番茄红素的去饱和及异构化和番茄红素环化环节为本发明生产视黄醇必要途径。在此基础上，本发明利用基因整合技术或者导入重组表达质粒的方式，使得β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶(BLH)和醛还原酶(YBBO)，或者β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶(BLH)和视黄醇脱氢酶(ENV9)，或者β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶(BLH)、醛还原酶(YBBO)和视黄醇脱氢酶(ENV9)在产β-胡萝卜素的工程菌株内成功表达，参与到视黄醇的合成，实现以安全、高效的工程菌为细胞工厂选择性地生产视黄醇。
优选的，出发菌采用产β-胡萝卜素的工程菌株Ycarot-02，该菌株为公众可获得材料，其构建方法参考文献(Alleviation of metabolic bottleneck by combinatorialengineering enhanced astaxanthin synthesis in Saccharomyces cerevisiae，EnzymeMicrob Technol,2017)。
本发明通过基因克隆和密码子优化，获得了可以在酿酒酵母中成功表达的酶的编码基因片段。
进一步的，所述β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化并合成相应序列。所述醛还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该基因来源于大肠杆菌。所述视黄醇脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该基因克隆自产β-胡萝卜素的酿酒酵母基因组。
进一步的，所述基因工程菌还导入了香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体(CrtE03M)编码基因、切除N端线粒体定位肽的NADH激酶(tPOS5)的编码基因，同时其甲羟戊酸途径转录抑制因子(MOT3)基因被敲除。
为进一步提高视黄醇产量，本发明将香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因、截短的NADH激酶编码基因导入酿酒酵母，并敲除甲羟戊酸途径转录抑制因子基因，通过过表达香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体，敲除甲羟戊酸途径转录抑制因子及过表达截短的NADH激酶来分别增加视黄醇合成所需前体和辅酶(NADPH)，其中截短的NADH激酶为在NADH激酶基础上切除其N端的线粒体定位肽，使其能在胞质内发挥作用。
进一步的，所述香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述切除N端线粒体定位肽的NADH激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
CrtE03M基因、POS5基因均克隆自产β-胡萝卜素的酿酒酵母基因组，在POS5基因的基础上，重新设计引物，删去了N端线粒体定位肽，获得tPOS5编码基因。
所述甲羟戊酸途径转录抑制因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种构建所述选择性生产视黄醇的基因工程菌的方法，所述构建方法包括：以产β-胡萝卜素的工程菌株为出发菌，通过整合质粒分别将β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因、醛还原酶编码基因或/和视黄醇脱氢酶编码基因整合到产β-胡萝卜素的工程菌株染色体上，获得所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌；
或者以产β-胡萝卜素的工程菌株为宿主菌，导入包含了β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因以及醛还原酶编码基因或/和视黄醇脱氢酶编码基因的重组表达质粒。
本发明将β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶(BLH)以及内源视黄醇脱氢酶(ENV9)或/和外源醛还原酶(YBBO)的编码基因导入产β-胡萝卜素的工程菌株细胞内，使得相应的酶在产β-胡萝卜素的工程菌株中成功表达，构建了选择性生产视黄醇的基因工程菌。
进一步的，再利用基因整合或者导入重组表达质粒的方式，将香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因、截短的NADH激酶编码基因导入工程菌；并利用同源重组技术敲除甲羟戊酸途径转录抑制因子基因。
具体的，本发明提供了一种同时整合了BLH、YBBO、ENV9、CrtE03M、tPOS5，并敲除MOT3的重组菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因克隆到pUMRI-LPP1的PGAL1后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-LPP1-BLH；
(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的醛还原酶编码基因分别克隆到pUMRI-DPP1的PGAL2和PGAL7后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-DPP1-CrtE03M-YBBO；
(3)将甲羟戊酸途径转录抑制因子基因的上下游同源臂克隆到pUMRI21质粒中构建pUMRI-MOT3，再将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的切除N端线粒体定位肽的NADH激酶的编码基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的视黄醇脱氢酶编码基因分别克隆到pUMRI-MOT3的PGAL10和PGAL1后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-MOT3-tPOS5-ENV9；
(4)依次将重组质粒pUMRI-LPP1-BLH、pUMRI-DPP1-CrtE03M-YBBO、pUMRI-MOT3-tPOS5-ENV9转化到产β-胡萝卜素的工程菌株Ycarot-02中，筛选获得染色体中整合了β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因、醛还原酶编码基因、视黄醇脱氢酶编码基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因、切除N端线粒体定位肽的NADH激酶的编码基因，且甲羟戊酸途径转录抑制因子基因被敲除的重组菌，即为所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌。
所述质粒pUMRI-LPP1、pUMRI-DPP1、pUMRI21均为公众可获得材料。以PGAL1、PGAL10、PGAL2、PGAL7为启动子，通过pUMRI系列组装工具质粒，将上述基因片段逐步整合到宿主菌染色体上。
本发明还提供了所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌在制备视黄醇中的应用。视黄醇从本发明构建的基因工程菌株的发酵培养物中制备得到。
本发明还提供了一种视黄醇的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌扩大培养后，接种于含有亚铁离子的发酵培养基中，添加萃取剂和抗氧化剂，振荡培养，得到发酵液；
2)收集发酵液中的有机相，分离得到视黄醇。
步骤1)中，先将活化后的基因工程菌进行扩大培养，再将菌株接种于发酵培养基中，并添加萃取剂，进行两相发酵培养，产物视黄醇溶于有机相萃取剂中。
发酵培养基中添加亚铁离子提高β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶的活性，有助于菌株的生长和视黄醇的合成。优选的，YPD液体培养基中亚铁离子浓度为1.26～1.80mM。更为优选，YPD液体培养基中亚铁离子浓度为1.44mM。
优选的，所述萃取剂为十二烷，每50mL培养液中添加2.5～10.0mL；抗氧化剂为二丁基羟基甲苯(BHT)，每50mL培养液中添加0.25～1.0g。
本发明通过在培养过程中添加BHT作为抗氧化剂解决视黄醇易氧化、易异构的问题，实现了视黄醇的高产。
优选的，两相发酵的条件为：200～250rpm，28～30℃恒温摇床中避光培养72～84小时。
步骤2)中，经两相发酵培养，直接从上层有机相中获得高产量和纯度的视黄醇。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明构建了一种能够实现选择性合成视黄醇的基因工程菌，以产β-胡萝卜素的工程菌株为出发菌，将β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因以及醛还原酶编码基因或视黄醇脱氢酶编码基因导入产β-胡萝卜素的工程菌，相应酶在菌株内成功表达，参与视黄醇的合成。
为进一步提高视黄醇产量，将香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因、切除N端线粒体定位肽的NADH激酶的编码基因导入产β-胡萝卜素的工程菌株，并敲除甲羟戊酸途径转录抑制因子基因，通过增加前体和辅酶的供应提高视黄醇的产量。
(2)本发明提供了一种实现视黄醇高产的方法，在以十二烷为萃取剂的两相发酵过程中通过添加亚铁离子提高β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶的活性，以及添加抗氧化剂来抑制视黄醇氧化，使视黄醇产量得到进一步提高。利用本发明构建工程菌株在摇瓶两相发酵培养后合成视黄醇的产量，优于现有技术报道，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为pUMRI-MOT3质粒构建所需的骨架(A)及构建结果(B)。
图2为视黄醇选择性高产菌株构建涉及的整合位点，(A)为出发菌株产β-胡萝卜素的酿酒酵母的构建，(B)为本发明产视黄醇酿酒酵母Y03-43的构建。
图3为对BLH酶反应所需的辅因子Fe2+的浓度优化。
图4为选择性生产视黄醇菌株Y03-43的产物HPLC检测图谱，上中下的液相峰图曲线分别为实验组，视黄醛标准品组和视黄醇标准品组。
图5为视黄醇选择性高产菌株Y03-43和其他相关菌株的合成产物中视黄醇及视黄醛的占比情况。Y03为产β-胡萝卜素出发菌株中整合β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶(BLH)编码基因的菌株，Y03-33为在Y03菌株中仅整合醛还原酶(YBBO)编码基因的菌株，Y03-34为在Y03菌株中仅过表达视黄醇脱氢酶(ENV9)的菌株，Y03-251为在Y03菌株中过表达截短的NADH激酶(tPOS5)的菌株，Y03-252为在Y03菌株中过表达截短的NADH激酶(tPOS5)和香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体(CrtE03M)的菌株，Y03-42为在Y03菌株中过表达截短的NADH激酶(tPOS5)和香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体(CrtE03M)及视黄醇脱氢酶(ENV9)的菌株。
图6为添加抗氧化剂BHT后，不同菌株合成视黄醇的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。若无特别说明，实施例中采用的实验方法为本领域常规技术手段，原料、试剂均为市售商品。
产β-胡萝卜素的工程菌株Ycarot-02为本课题组前期构建，其构建方法参考文献(Alleviation of metabolic bottleneck by combinatorial engineering enhancedastaxanthin synthesis in Saccharomyces cerevisiae，Enzyme Microb Technol,2017)。
实施例1.克隆视黄醇生物合成所需要的基因
1.大肠杆菌及酿酒酵母基因组DNA提取
1.1大肠杆菌BL21基因组DNA提取由试剂盒完成，具体步骤如下：
(1)取1mL过夜培养的大肠杆菌菌液，加入1.5mL离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入180μL溶菌酶溶液重悬菌液，37℃水浴30～60min。再加入20μLProteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴30min至细胞完全裂解。
(2)水浴过程中，每10min颠倒混匀一次，直至混合液变澄清透明，加入20μL的RNase，室温放置2～5min，去除RNA。
(3)加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀。
(4)加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。
(5)将吸附柱放入收集管内，用移液枪将溶液和悬浮物全部吸入吸附柱内，静置2min，再12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
(6)将吸附柱放回收集管内，加入500μL PW Solution，10000rpm离心30s，弃滤液。
(7)将吸附柱放回收集管内，加入500μL Wash Solution，10000rpm离心30s，弃滤液。
(8)空转，离去残留的Wash Solution。
(9)将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，加入75μL CE Buffer静置3min，12000rpm室温离心2min，收集得到的DNA溶液-20℃保存。
1.2酿酒酵母(产β-胡萝卜素的工程菌株Ycarot-02)基因组DNA提取由试剂盒完成，具体步骤如下：
(1)取1-3mL培养20-24h的酵母培养液，室温12000rpm离心5min。
(2)弃上清，加入480μL Buffer SE，10μL巯基乙醇，20μL溶壁酶，重悬沉淀，30℃孵育30min。
(3)室温12000rpm离心5min，弃上清，加入200μL Buffer YL和50mg玻璃珠(0.4-0.6mm)，旋涡震荡3-5min，静置，吸取上清至新的1.5mL离心管。
(4)加入25μL Proteinase K充分混匀，65℃震荡孵育30min。
(5)加入5μL RNase A上下重复颠倒离心管，室温孵育10min。
(6)加入220μL Buffer YDL和220μL纯乙醇，旋涡震荡20s。
(7)将吸附柱放入收集管内，用移液枪吸取全部的上清至吸附柱中，10000rpm离心1min，弃上清。
(8)将吸附柱放回收集管内，加入500μL Buffer HB，10000rpm离心30s，弃滤液。
(9)将吸附柱放回收集管内，加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm离心30s，弃滤液。
(10)重复上一步骤，空转，离去残留的DNA Wash Buffer。
(11)将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，加入75μL Elution Buffer，65℃静置3-5min，12000rpm室温离心1min，收集得到的DNA溶液-20℃保存加入。
2.在NCBI找到β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶(BLH)的蛋白序列，由基因合成公司以酿酒酵母为宿主进行密码子优化并合成相应序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.醛还原酶(YBBO)以大肠杆菌基因组为模板，视黄醇脱氢酶(ENV9)、NADH激酶(POS5)及香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体(CrtE03M)以酿酒酵母基因组为模板，采用高保真酶(Prime STARTM HS DNA polymerase)进行PCR扩增。
截短的NADH激酶(tPOS5)在NADH激酶(POS5)的基础上，重新设计引物，删去了N端线粒体定位肽。
醛还原酶(YBBO)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；视黄醇脱氢酶(ENV9)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体(CrtE03M)编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；截短的NADH激酶(tPOS5)基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，NADH激酶(POS5)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
引物设计如下表：
表1克隆视黄醇生物合成所需基因用到的引物
Figure BDA0003073631450000091
PCR反应体系(50μL)如下：
Figure BDA0003073631450000092
PCR程序如下：(1)预变性98℃，2min；(2)变性98℃，10s、退火55℃，20s、延伸72℃，1kb/min，30个循环；(3)延伸72℃，5min；(4)保存4℃，1min。
实施例2.构建pUMRI-MOT3质粒
构建pUMRI-MOT3质粒用到的转录抑制因子(MOT3)的上下游同源臂以酵母基因组为模板及pUMRI-MOT3质粒用到的骨架部分以pUMRI21质粒为模板，采用高保真酶PrimeSTARTM HS DNA polymerase)进行PCR扩增，三片段通过Gibson Assembly试剂盒连接。构建方式如图1所示。甲羟戊酸途径转录抑制因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
具体引物设计如下表：
表2 pUMRI-MOT3质粒构建所用到的引物
Figure BDA0003073631450000101
实施例3.构建视黄醇生物合成途径所需的质粒
1.酶切及胶回收
pUMRI系列整合质粒(pUMRI-LPP1、pUMRI-DPP1均由实验室构建且保藏，pUMRI-MOT3构建见实施例2)和PCR产物目的片段均通过Takara限制性内切酶进行双酶切，双酶切体系按照Takara限制性内切酶说明书，酶切后对体系进行DNA凝胶回收处理，具体步骤按照Axygen试剂盒说明书进行。
2.酶连
对酶切后的片段和质粒，使用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系(10μl)如下：
Figure BDA0003073631450000102
Figure BDA0003073631450000111
22℃，连接30min。
3.转化
将10μL的连接产物加入到大肠杆菌感受态溶液中，冰上放置15min后，42℃热击90s，并迅速置于冰浴中3min，加入1mL LB液体培养基，37℃摇床下复苏45min，然后离心，弃去部分上清，取适量涂到相应的抗性LB平板上，37℃培养箱放置15h。
具体的，按照下述方式进行酶切连接：
β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶(BLH)的目的片段克隆到pUMRI-LPP1的PGAL1后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-LPP1-BLH；
醛还原酶(YBBO)目的片段克隆到pUMRI-DPP1的PGAL7后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-DPP1-YBBO；
视黄醇脱氢酶(ENV9)目的片段克隆到pUMRI-DPP1的PGAL7后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-DPP1-ENV9。
截短的NADH激酶(tPOS5)目的片段克隆到pUMRI-MOT3的PGAL10后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-MOT3-tPOS5；
香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体(CrtE03M)的目的片段克隆到pUMRI-DPP1的PGAL2后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-DPP1-CrtE03M；
香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体(CrtE03M)的目的片段克隆到pUMRI-DPP1的PGAL2后面的多克隆位点，醛还原酶(YBBO)目的片段克隆到pUMRI-DPP1的PGAL7后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-DPP1-CrtE03M-YBBO；
截短的NADH激酶(tPOS5)目的片段克隆到pUMRI-MOT3的PGAL10后面的多克隆位点，视黄醇脱氢酶(ENV9)目的片段克隆到pUMRI-MOT3的PGAL1后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-MOT3-tPOS5-ENV9。
实施例4.视黄醇选择性高产酿酒酵母的构建
将实施例3制备的重组质粒pUMRI-LPP1-BLH转化到产β-胡萝卜素的工程菌株Ycarot-02中，使得BLH整合到产β-胡萝卜素的工程菌株染色体中，得到Y03。
将重组质粒pUMRI-DPP1-YBBO转化到Y03中，使得YBBO整合到Y03染色体中，得到Y03-33；
将重组质粒pUMRI-DPP1-ENV9转化到Y03中，使得ENV9整合到Y03染色体中，得到Y03-34；
将重组质粒pUMRI-MOT3-tPOS5转化到Y03中，使得tPOS5整合到Y03染色体中，同时对MOT3进行敲除，得到Y03-251；
将重组质粒pUMRI-DPP1-CrtE03M转化到Y03-251，使得CrtE03M整合到Y03-251染色体中，得到Y03-252。
将重组质粒pUMRI-DPP1-CrtE03M、pUMRI-MOT3-tPOS5-ENV9依次转化到Y03中，使得CrtE03M、tPOS5、ENV9整合到Y03染色体中，同时对MOT3进行敲除，得到Y03-42。
将实施例3制备的重组质粒pUMRI-DPP1-CrtE03M-YBBO、pUMRI-MOT3-tPOS5-ENV9依次转化到Y03中，将CrtE03M、YBBO、tPOS5、ENV9整合到Y03中，同时对MOT3进行敲除，获得Y03-43，参见图2(B)。
具体转化方法如下：
1.酿酒酵母感受态制备：从YPD平板上挑取β-胡萝卜素生产酵母菌株的单菌落接种到5mL YPD试管中，30℃，220rpm过夜培养，按2％的接种量转接到50mL YPD摇瓶中，30℃，220rpm培养4-5h，OD600达到约2.0左右。
2.酿酒酵母化转步骤：
(1)将ssDNA置于100℃金属浴中加热5min后，迅速放入冰中冷却备用。
(2)取45mL感受态酵母菌液于50mL灭菌离心管中，在4000rpm，20℃下离心5min，弃上清。
(3)用20mL无菌水清洗一次，离心弃上清，再用1mL无菌水重悬，按100μL每管分装于1.5mL灭菌离心管中，离心弃上清。
(4)在离心管中依次加入如下化转体系(360μL)：
Figure BDA0003073631450000121
Figure BDA0003073631450000131
(5)充分混匀，42℃金属浴中放置40min。
(6)12000rpm离心30s，弃上清，加入1mL YPD液体培养基复苏2h。
(7)12000rpm离心1min，弃上清，加1ml无菌水重悬浮，取100ul涂布于相应抗性平板。
实施例5.亚铁离子浓度的优化
从划线的平板中挑取工程菌Y03-43的单菌落接种于5mL YPD培养基中，待试管中液体浑浊后，将菌株培养于50mL的YPD液体培养基中，在培养基中添加终浓度为0.00mM、0.18mM、0.72mM、1.08mM、1.26mM、1.44mM、1.80mM的硫酸亚铁离子，220rpm，30℃恒温摇床中避光培养84小时。
如图3所示，在1.44mM条件下的工程菌的生长情况最为理想，且总类视黄醇的合成能力最高。
实施例6.基因工程菌的两相发酵培养及产物的提取与分析
1.从划线的平板中挑取工程菌的单菌落接种于5mL YPD培养基中，待试管中液体浑浊后，将菌株培养于50mL添加1.44mM亚铁离子的YPD液体培养基中。以2.5mL添加1％(w/v)二丁基羟基甲苯(BHT)的十二烷为萃取剂，进行两相发酵，220rpm，30℃恒温摇床中避光培养84小时。
2.收集酵母发酵液至离心管中，4000rpm离心5min，取有机相层转移到棕色1.5mL离心管中，用丙酮稀释一定倍数后，用0.22μm有机系滤头过滤，进HPLC检测。产物峰与标准品视黄醇和视黄醛相对应，制作标准品曲线后，确定其产量。
3.通过HPLC检测酿酒酵母中视黄醇的条件如下：
液相分析仪器为岛津LC-20AT，色谱柱为YMC-Pack ODS-AQ的C18-H柱，柱温40℃，检测波长352nm，以95％甲醇和5％乙腈为流动相，流速为0.6mL/min。
结果如图4和5所示，Y03-33的产物中视黄醇为106.24mg/L，视黄醛为3.69mg/L，Y03-34的产物中视黄醇为83.63mg/L，视黄醛为46.51mg/L，Y03-43的产物中视黄醇为122.03mg/L，视黄醛为9.51mg/L。如图6所示，Y03-43在不添加BHT的条件下能生产122.03mg/L视黄醇，在添加BHT的条件下能生产401.65mg/L视黄醇，占总维生素A的99.86％。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种选择性生产视黄醇的基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggtttaa tgttaattga ttggtgtgct ttagctttag ttgtttttat tggtttacct 60
catggtgctt tagatgctgc aatttcattt tctatgattt cttcagctaa aaggattgca 120
aggttagcag gtattttgtt gatttatttg ttgttagcaa ctgcattttt tttaatttgg 180
tatcaattac cagcattttc tttgttgatt tttttgttaa tttcaattat tcattttggt 240
atggcagatt ttaatgcatc accatctaaa ttgaaatggc ctcatattat tgctcatggt 300
ggtgttgtta cagtttggtt gccattaatt caaaaaaatg aagttactaa attgttttca 360
attttgacta atggtcctac tcctattttg tgggatattt tgttgatttt ttttttgtgt 420
tggtctattg gtgtttgttt acatacttat gaaactttga gatcaaaaca ttataatatt 480
gcatttgaat taattggttt gattttttta gcatggtatg cacctccatt agttacattt 540
gctacatatt tttgttttat tcattctagg aggcattttt catttgtttg gaaacaatta 600
caacacatgt catctaaaaa aatgatgatt ggttctgcta ttattttatc atgtacttct 660
tggttgattg gtggtggtat ttattttttt ctcaattcta aaatgattgc atcagaagct 720
gctttacaaa cagtttttat tggtttagca gctttgacag ttccacacat gattttaatt 780
gattttattt ttagaccaca ttcttcaagg attaaaatta aaaattaa 828
<210> 2
<211> 810
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
atgactcata aagcaacgga gatcctgaca ggtaaagtta tgcaaaaatc ggtcttaatt 60
accggatgtt ccagtggaat tggcctggaa agcgcgctcg aattaaaacg ccagggtttt 120
catgtgctgg caggttgccg gaaaccggat gatgttgagc gcatgaacag catgggattt 180
accggcgtgt tgatcgatct ggattcacca gaaagtgttg atcgcgcagc cgacgaggtg 240
atcgccctga ccgataattg tctgtatggg atctttaaca atgccggatt cggcatgtat 300
ggcccccttt ccaccatcag ccgtgcgcag atggaacagc agttttccgc caactttttc 360
ggcgcacacc agctcaccat gcgcctgtta cccgcgatgt taccgcacgg tgaagggcgt 420
attgtgatga catcatcggt gatgggatta atctccacgc cgggtcgtgg cgcttacgcg 480
gccagtaaat atgcgctgga ggcgtggtca gatgcactgc gcatggagct gcgccacagc 540
ggaattaaag tcagcctgat cgaacccggt cccattcgta ctcgcttcac cgacaacgtc 600
aaccagacgc aaagtgataa accagtcgaa aatcccggca tcgccgcccg ctttacgttg 660
ggaccggaag cggtggtgga caaagtacgc catgctttta ttagcgagaa gccgaagatg 720
cgctatccgg tgacgctggt gacctgggcg gtaatggtgc ttaagcgcct gctgccgggg 780
cgcgtgatgg acaaaatatt gcaggggtga 810
<210> 3
<211> 993
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(S. cerevisiae)
<400> 3
atgttagacc cacgaatatt gccatactac gacccggctg tggagaggaa gattgctgta 60
gtaacaggcg gaaatacggg tattgggtgg tatactgtct tgcatttgta tttgcatggg 120
tttgtcgttt atatttgtgg gagaaactct cacaagattt cgaaagcaat ccaggagata 180
ctggcagaag caaagaagag gtgccatgaa gatgacgacg gttcaagccc aggcgcgggc 240
ccaggtccaa gcattcagcg tctagggtca ctgcactata tccatttgga tttgacagac 300
ttaaaatgtg tggagagagc ggcacttaaa attctcaagc tggaagacca catagacgtg 360
cttgttaaca atgcagggat tatggcggtg cccttagaaa tgacgaagga cggatttgaa 420
gtgcaattgc agactaacta catttcgcac ttcatcttca cgatgagatt attgccttta 480
ctgcgccatt gtcgtggcag gatcatttcc ctgtcctcga taggccatca tctagagttc 540
atgtactgga aactgagcaa gacgtgggat tacaaaccta atatgctttt cacatggttt 600
aggtacgcga tgagtaaaac cgcgctaatc caatgcacga agatgttggc catcaaatac 660
cctgacgttc tttgtctctc cgttcatccg ggtctggtga tgaacacaaa cttattcagt 720
tattggacaa ggttacccat cgtcggtatt ttcttttggc tgttgttcca ggtcgtaggg 780
ttctttttcg gcgtatcgaa cgaacaaggt tcactagctt ctttgaagtg tgcattggac 840
ccgaatttat ctgtcgaaaa agataacggg aagtacttca ccacgggggg taaagaatct 900
aaatcgagct acgtttctaa caatgtcgac gaagcggcat cgacttggat ctggaccgtt 960
catcaactaa gagaccgtgg tttcgatata taa 993
<210> 4
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggattacg cgaacatcct cacagcaatt ccactcgagt ttactcctca ggatgatatc 60
gtgctccttg aaccgtatca ttacctagga aagaaccctg gaaaagaaat tcgatcacaa 120
ctcatcgagg ctttcaacta ttggttggat gtcaagaagg aggatctcga ggtcatccag 180
aacgttgttg gcatgctaca taccgctagc ttattaatgg acgatgtgga ggattcatcg 240
gtcctcaggc gtgggtcgcc tgtggcccat ctaatttacg ggattccgca gacaataaac 300
actgcaaact acgtctactt tctggcttat caagagatct tcaagcttcg cccaacaccg 360
atacccatgc ctgtaattcc tccttcatct gcttcgcttc aatcatccgt ctcctctgca 420
tcctcctcct cctcggcctc gtctgaaaac gggggcacgt caactcctaa ttcgcagatt 480
ccgttctcga aagatacgta tcttgataaa gtgatcacag acgagatgct ttccctccat 540
agagggcaag gcctggagct attctggaga gatagtctga cgtgtcctag cgaagaggaa 600
tatgtgaaaa tggttcttgg aaagacggga ggtttgttcc gtatagcggt cagattgatg 660
atggcaaagt cagaatgtga catagacttt gtccagcttg tcaacttgat ctcaatatac 720
ttccagatca gggatgacta tatgaacctt cagtcttctg agtatgccca taataagaat 780
tttgcagagg acctcacaga aggaaaattc agttttccca ctatccactc gattcatgcc 840
aacccctcat cgagactcgt catcaatacg ttgcagaaga aatcgacctc tcctgagatc 900
cttcaccgct gtgtaaacta catgcgcaca gaaacccact cattcgaata tactcaggaa 960
gtcctcaaca ccttgtcagg tgcactcgag agagaactag gaaggcttca aggagagttc 1020
gcagaagcta actcaaagat tgatcttgga gacgtagagt cggaaggaag aacggggaag 1080
aacgtcaaat tggaagcgat cctgaaaaag ctagccgata tccctctgtg a 1131
<210> 5
<211> 1197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgagtacgt tggattcaca ttccctaaag ttacagagcg gctcgaagtt tgtaaaaata 60
aagccagtaa ataacttgag gagtagttca tcagcagatt tcgtgtcccc accaaattcc 120
aaattacaat ctttaatctg gcagaaccct ttacaaaatg tttatataac taaaaaacca 180
tggactccat ccacaagaga agcgatggtt gaattcataa ctcatttaca tgagtcatac 240
cccgaggtga acgtcattgt tcaacccgat gtggcagaag aaatttccca ggatttcaaa 300
tctcctttgg agaatgatcc caaccgacct catatacttt atactggtcc tgaacaagat 360
atcgtaaaca gaacagactt attggtgaca ttgggaggtg atgggactat tttacacggc 420
gtatcaatgt tcggaaatac gcaagttcct ccggttttag catttgctct gggcactctg 480
ggctttctat caccgtttga ttttaaggag cataaaaagg tctttcagga agtaatcagc 540
tctagagcca aatgtttgca tagaacacgg ctagaatgtc atttgaaaaa aaaggatagc 600
aactcatcta ttgtgaccca tgctatgaat gacatattct tacatagggg taattcccct 660
catctcacta acctggacat tttcattgat ggggaatttt tgacaagaac gacagcagat 720
ggtgttgcat tggccactcc aacgggttcc acagcatatt cattatcagc aggtggatct 780
attgtttccc cattagtccc tgctatttta atgacaccaa tttgtcctcg ctctttgtca 840
ttccgaccac tgattttgcc tcattcatcc cacattagga taaagatagg ttccaaattg 900
aaccaaaaac cagtcaacag tgtggtaaaa ctttctgttg atggtattcc tcaacaggat 960
ttagatgttg gtgatgaaat ttatgttata aatgaggtcg gcactatata catagatggt 1020
actcagcttc cgacgacaag aaaaactgaa aatgacttta ataattcaaa aaagcctaaa 1080
aggtcaggga tttattgtgt cgccaagacc gagaatgact ggattagagg aatcaatgaa 1140
cttttaggat tcaattctag ctttaggctg accaagagac agactgataa tgattaa 1197
<210> 6
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ser Thr Leu Asp Ser His Ser Leu Lys Leu Gln Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Phe Val Lys Ile Lys Pro Val Asn Asn Leu Arg Ser Ser Ser Ser Ala
20 25 30
Asp Phe Val Ser Pro Pro Asn Ser Lys Leu Gln Ser Leu Ile Trp Gln
35 40 45
Asn Pro Leu Gln Asn Val Tyr Ile Thr Lys Lys Pro Trp Thr Pro Ser
50 55 60
Thr Arg Glu Ala Met Val Glu Phe Ile Thr His Leu His Glu Ser Tyr
65 70 75 80
Pro Glu Val Asn Val Ile Val Gln Pro Asp Val Ala Glu Glu Ile Ser
85 90 95
Gln Asp Phe Lys Ser Pro Leu Glu Asn Asp Pro Asn Arg Pro His Ile
100 105 110
Leu Tyr Thr Gly Pro Glu Gln Asp Ile Val Asn Arg Thr Asp Leu Leu
115 120 125
Val Thr Leu Gly Gly Asp Gly Thr Ile Leu His Gly Val Ser Met Phe
130 135 140
Gly Asn Thr Gln Val Pro Pro Val Leu Ala Phe Ala Leu Gly Thr Leu
145 150 155 160
Gly Phe Leu Ser Pro Phe Asp Phe Lys Glu His Lys Lys Val Phe Gln
165 170 175
Glu Val Ile Ser Ser Arg Ala Lys Cys Leu His Arg Thr Arg Leu Glu
180 185 190
Cys His Leu Lys Lys Lys Asp Ser Asn Ser Ser Ile Val Thr His Ala
195 200 205
Met Asn Asp Ile Phe Leu His Arg Gly Asn Ser Pro His Leu Thr Asn
210 215 220
Leu Asp Ile Phe Ile Asp Gly Glu Phe Leu Thr Arg Thr Thr Ala Asp
225 230 235 240
Gly Val Ala Leu Ala Thr Pro Thr Gly Ser Thr Ala Tyr Ser Leu Ser
245 250 255
Ala Gly Gly Ser Ile Val Ser Pro Leu Val Pro Ala Ile Leu Met Thr
260 265 270
Pro Ile Cys Pro Arg Ser Leu Ser Phe Arg Pro Leu Ile Leu Pro His
275 280 285
Ser Ser His Ile Arg Ile Lys Ile Gly Ser Lys Leu Asn Gln Lys Pro
290 295 300
Val Asn Ser Val Val Lys Leu Ser Val Asp Gly Ile Pro Gln Gln Asp
305 310 315 320
Leu Asp Val Gly Asp Glu Ile Tyr Val Ile Asn Glu Val Gly Thr Ile
325 330 335
Tyr Ile Asp Gly Thr Gln Leu Pro Thr Thr Arg Lys Thr Glu Asn Asp
340 345 350
Phe Asn Asn Ser Lys Lys Pro Lys Arg Ser Gly Ile Tyr Cys Val Ala
355 360 365
Lys Thr Glu Asn Asp Trp Ile Arg Gly Ile Asn Glu Leu Leu Gly Phe
370 375 380
Asn Ser Ser Phe Arg Leu Thr Lys Arg Gln Thr Asp Asn Asp
385 390 395
<210> 7
<211> 1245
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(S. cerevisiae)
<400> 7
atgtttgtca gggttaaatt gaataaacca gtaaaatggt ataggttcta tagtacgttg 60
gattcacatt ccctaaagtt acagagcggc tcgaagtttg taaaaataaa gccagtaaat 120
aacttgagga gtagttcatc agcagatttc gtgtccccac caaattccaa attacaatct 180
ttaatctggc agaacccttt acaaaatgtt tatataacta aaaaaccatg gactccatcc 240
acaagagaag cgatggttga attcataact catttacatg agtcataccc cgaggtgaac 300
gtcattgttc aacccgatgt ggcagaagaa atttcccagg atttcaaatc tcctttggag 360
aatgatccca accgacctca tatactttat actggtcctg aacaagatat cgtaaacaga 420
acagacttat tggtgacatt gggaggtgat gggactattt tacacggcgt atcaatgttc 480
ggaaatacgc aagttcctcc ggttttagca tttgctctgg gcactctggg ctttctatca 540
ccgtttgatt ttaaggagca taaaaaggtc tttcaggaag taatcagctc tagagccaaa 600
tgtttgcata gaacacggct agaatgtcat ttgaaaaaaa aggatagcaa ctcatctatt 660
gtgacccatg ctatgaatga catattctta cataggggta attcccctca tctcactaac 720
ctggacattt tcattgatgg ggaatttttg acaagaacga cagcagatgg tgttgcattg 780
gccactccaa cgggttccac agcatattca ttatcagcag gtggatctat tgtttcccca 840
ttagtccctg ctattttaat gacaccaatt tgtcctcgct ctttgtcatt ccgaccactg 900
attttgcctc attcatccca cattaggata aagataggtt ccaaattgaa ccaaaaacca 960
gtcaacagtg tggtaaaact ttctgttgat ggtattcctc aacaggattt agatgttggt 1020
gatgaaattt atgttataaa tgaggtcggc actatataca tagatggtac tcagcttccg 1080
acgacaagaa aaactgaaaa tgactttaat aattcaaaaa agcctaaaag gtcagggatt 1140
tattgtgtcg ccaagaccga gaatgactgg attagaggaa tcaatgaact tttaggattc 1200
aattctagct ttaggctgac caagagacag actgataatg attaa 1245
<210> 8
<211> 1486
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(S. cerevisiae)
<400> 8
atgaatgcgg accatcacct gcaacagcag cagcaacagc gacaacagca tcaacaacaa 60
cagcatcaac aacaacagca tcagcatcag catcaacagc agcagcacac gatattacaa 120
aatgtgtcga acactaacaa tatcggcagc gattcgctgg cgtcacagcc tttcaacacg 180
actactgttt cctctaacaa ggacgacgtt atggtgaact ctggggcaag agaacttcca 240
atgcccttac atcagcagca gtatatatac ccttactatc agtatacaag taataacagt 300
aacaacaata atgtgacggc tggtaacaat atgtctgcgt cgccgattgt ccataacaac 360
agcaacaaca gcaacaacag caatatttct gcttctgatt acactgtcgc aaacaacagt 420
actagcaata ataacaataa taataataat aacaacaata ataacaataa tattcaccca 480
aaccagttta ctgcggccgc aaatatgaac tcaaatgctg cagcggctgc ttattactcc 540
ttccccactg cgaatatgcc aataccgcaa caggatcaac aatatatgtt caatcctgct 600
tcatacataa gccattacta ttcagcagtt aacagcaata acaatggtaa taacgccgct 660
aacaatggca gcaacaactc ttctcactca gccccagccc cggcccccgg tccaccccat 720
caccggccat aaaggccatc accatcatag taatacacac aacaacctca acaatggtgg 780
tgctgtaaat acaaacaacg ctcctcagca ccatccaacg ataataacgg atcaatttca 840
attccaacta caacaaaacc cttctccaaa tttgaatctc aatattaacc cggcacaacc 900
tctgcatcta cctcctggtt ggaaaataaa cactatgccg caaccacgtc ctacgacagc 960
acctaaccat ccccctgcgc cggtgccttc ttcgaaccct gtggcctcga acttggttcc 1020
tgccccatca tcagaccata aatatatcca tcaatgccaa ttttgtgaga agtctttcaa 1080
aagaaaatca tggttgaaaa ggcacctatt gtcacactcg caacaaagac attttctatg 1140
cccttggtgc ttaagcaggc agaagagaaa agataatctt ttacagcata tgaaactcaa 1200
gcatacaaat tatttattag acgaactcaa gaaaaacaac atcatcttta actacaacaa 1260
ttcttcctcc tctaataata acaacgacaa taataataat aataacagca atagcgctag 1320
cggcagtggc ggtgccggtg ccgcggcggc agcagcaaca gctcccgaaa atgaagatgg 1380
aaacggttac gatacaaaca tcaagacttt aatcaatgat ggtgtactga ataaggacga 1440
cgttaaacgt gttttgaata accttattgt tagtcacaac aaatag 1486

Claims (10)

1.一种选择性生产视黄醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为以产β-胡萝卜素的工程菌株为出发菌，其染色体上整合了β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因以及醛还原酶编码基因或/和视黄醇脱氢酶编码基因；
或者，所述基因工程菌以产β-胡萝卜素的工程菌株为出发菌，宿主菌内含有包含了β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因以及醛还原酶编码基因或/和视黄醇脱氢酶编码基因的重组表达质粒。
2.如权利要求1所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌，其特征在于，所述β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述醛还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述视黄醇脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1或2所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还导入了香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因、切除N端线粒体定位肽的NADH激酶的编码基因，同时其甲羟戊酸途径转录抑制因子基因被敲除。
4.如权利要求3所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌，其特征在于，所述香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述切除N端线粒体定位肽的NADH激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述甲羟戊酸途径转录抑制因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.如权利要求1所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：以产β-胡萝卜素的工程菌株为出发菌，通过整合质粒分别将β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因、醛还原酶编码基因或/和视黄醇脱氢酶编码基因整合到产β-胡萝卜素的工程菌株染色体上，获得所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌；
或者以产β-胡萝卜素的工程菌株为宿主菌，导入包含了β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因以及醛还原酶编码基因或/和视黄醇脱氢酶编码基因的重组表达质粒。
6.如权利要求5所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因克隆到pUMRI-LPP1的PGAL1后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-LPP1-BLH；
(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的醛还原酶编码基因分别克隆到pUMRI-DPP1的PGAL2和PGAL7后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-DPP1-CrtE03M-YBBO；
(3)将甲羟戊酸途径转录抑制因子基因的上下游同源臂克隆到pUMRI21质粒中构建pUMRI-MOT3，再将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的切除N端线粒体定位肽的NADH激酶的编码基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的视黄醇脱氢酶编码基因分别克隆到pUMRI-MOT3的PGAL10和PGAL1后面的多克隆位点，获得重组质粒pUMRI-MOT3-tPOS5-ENV9；
(4)依次将重组质粒pUMRI-LPP1-BLH、
pUMRI-DPP1-CrtE03M-YBBO、pUMRI-MOT3-tPOS5-ENV9转化到产β-胡萝卜素的工程菌株Ycarot-02中，筛选获得染色体中整合了β-胡萝卜素15，15’-双加氧酶编码基因、醛还原酶编码基因、视黄醇脱氢酶编码基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶突变体编码基因、切除N端线粒体定位肽的NADH激酶的编码基因，且甲羟戊酸途径转录抑制因子基因被敲除的重组菌，即为所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌。
7.如权利要求1-4任一项所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌在制备视黄醇中的应用。
8.一种视黄醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将权利要求1-4任一项所述的选择性生产视黄醇的基因工程菌扩大培养后，接种于含有亚铁离子的发酵培养基中，添加萃取剂和抗氧化剂，振荡培养，得到发酵液；
2)收集发酵液中的有机相，分离得到视黄醇。
9.如权利要求8所述的视黄醇的制备方法，其特征在于，发酵培养基中亚铁离子浓度为1.26～1.80mM；所述萃取剂为十二烷，每50mL培养液中添加2.5～10.0mL；所述抗氧化剂为二丁基羟基甲苯，每50mL培养液中添加0.25～1.0g。
10.如权利要求8所述的视黄醇的制备方法，其特征在于，两相发酵的条件为：200～250rpm，28～30℃恒温摇床中避光培养72～84小时。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755356A (zh) * 2021-10-19 2021-12-07 浙江大学 一种胞外分泌生育三烯酚的基因工程菌及其应用
CN114196560A (zh) * 2021-12-21 2022-03-18 浙江大学 一种分阶段多层次调控异源合成的基因工程菌及构建方法
CN114574378A (zh) * 2022-04-11 2022-06-03 浙江大学 一种高效生产视黄酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN114717210A (zh) * 2022-04-08 2022-07-08 四川农业大学 一种杨树香叶基香叶醇还原酶及其编码基因与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001048162A2 (en) * 1999-12-24 2001-07-05 Syngenta Participations Ag Method for the production of vitamin a
CN111108194A (zh) * 2017-09-25 2020-05-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 视黄醇的生产
WO2020111890A1 (ko) * 2018-11-30 2020-06-04 한국생산기술연구원 바이오레티놀을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 바이오레티놀의 생산방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001048162A2 (en) * 1999-12-24 2001-07-05 Syngenta Participations Ag Method for the production of vitamin a
CN111108194A (zh) * 2017-09-25 2020-05-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 视黄醇的生产
WO2020111890A1 (ko) * 2018-11-30 2020-06-04 한국생산기술연구원 바이오레티놀을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 바이오레티놀의 생산방법
CN113490744A (zh) * 2018-11-30 2021-10-08 比奥斯普拉希有限公司 用于产生生物视黄醇的微生物和使用其产生生物视黄醇的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QIONGYUE HU等: "Selective biosynthesis of retinol in S.cerevisiae", 《BIORESOURCES AND BIOPROCESSING》 *
QIONGYUE HU等: "Selective biosynthesis of retinol in S.cerevisiae", 《BIORESOURCES AND BIOPROCESSING》, 12 March 2022 (2022-03-12), pages 1 - 14 *
汪之顼等: "β-胡萝卜素转化为维生素A的机制、调节和生物学意义", 《国外医学卫生学分册》 *
汪之顼等: "β-胡萝卜素转化为维生素A的机制、调节和生物学意义", 《国外医学卫生学分册》, vol. 30, no. 5, 31 December 2003 (2003-12-31), pages 283 - 287 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755356A (zh) * 2021-10-19 2021-12-07 浙江大学 一种胞外分泌生育三烯酚的基因工程菌及其应用
CN114196560A (zh) * 2021-12-21 2022-03-18 浙江大学 一种分阶段多层次调控异源合成的基因工程菌及构建方法
CN114196560B (zh) * 2021-12-21 2024-02-09 浙江大学 一种分阶段多层次调控异源合成的基因工程菌及构建方法
CN114717210A (zh) * 2022-04-08 2022-07-08 四川农业大学 一种杨树香叶基香叶醇还原酶及其编码基因与应用
CN114574378A (zh) * 2022-04-11 2022-06-03 浙江大学 一种高效生产视黄酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN114574378B (zh) * 2022-04-11 2023-09-22 浙江大学 一种生产视黄酸的基因工程菌及其构建方法和应用

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