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CN113215193B - 小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法及其应用方法 - Google Patents

小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法及其应用方法 Download PDF

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CN113215193B CN202110290336.6A CN202110290336A CN113215193B CN 113215193 B CN113215193 B CN 113215193B CN 202110290336 A CN202110290336 A CN 202110290336A CN 113215193 B CN113215193 B CN 113215193B
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Abstract

本发明涉及一种小分子化合物Rocilinostat或Nexturastat A提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法，使用基因编辑系统进行基因编辑时，加入小分子化合物Rocilinostat或Nexturastat A处理细胞，Rocilinostat或Nexturastat A提高基因编辑系统中基因敲除和碱基编辑系统活性。以获得更高的基因编辑效率，解决在精确位点特异性基因编辑的低活性的问题，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，致病突变纠正、动物模型制备等研究。

Description

小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法及其 应用方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，涉及一种提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法及其应用方法。
背景技术
基因编辑技术是指使用核酸酶直接对DNA序列进行编辑，从而实现特定DNA片段的敲除、插入/缺失或替换等。目前，对基因编辑工具的开发和改造一直是21世纪生命科学领域科学家们的研究重点，新型的基因编辑工具层出不穷。规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated Protien 9，Cas9)是继锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)和转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectornucleases，TALEN)技术之后的新一代基因改造工具，此CRISPR/Cas9编辑系统，利用单链的向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引导有核酸酶切割活性的Cas9蛋白对特定靶点进行切割，实现基因敲除和定点修饰。
胞嘧啶碱基编辑器(CBE)是一种可以进行单个碱基C到T编辑的新型基因编辑工具，主要由具有催化功能的胞嘧啶脱氨酶和CRISPR/Cas9融合而成。其中胞嘧啶脱氨酶根据来源不同，分为以下几种：大鼠来源的rAPOBEC1(rat apolipoprotein B mRNA-editingenzyme catalytic polypeptide-like protein)，七鳃鳗来源的激活诱导性胞嘧啶脱氨酶(activationinducedcytidinedeaminase，AID)类似物(PmCDA1)[6]，人源的AID(hAID)，人源的APOBEC3A。早期的碱基编辑系统使用的CRISPR/Cas9是无核酸酶活性的dCas9，不对靶序列产生切割，现在常用的是有单链DNA切口酶活性的nCas9(D10A)，只对其中一条DNA产生切割而形成切口，这两种Cas9都保留有与单链引导RNA(single guide RNA，sgRNA)结合的能力，Cas9和sgRNA一起介导胞嘧啶脱氨酶在特定的靶序列产生碱基的转换。近期，又报道了一种可以实现腺嘌呤A到鸟嘌呤G的新型腺嘌呤碱基编辑工具腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。
CBE和ABE系统在进行碱基的编辑时，无需产生DSB，从而避免了细胞内非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)修复造成的随机插入/缺失(Insert/Deletion，Indel)，实现了更加安全的基因编辑，可以应用于人类细胞的编辑、基因突变动物模型的构建、作物的改良、小鼠胚胎的治疗等领域。
但现有基因敲除和碱基编辑系统效率的低下，存在在精确位点特异性基因编辑的低活性的问题。因此，提高基因敲除和碱基编辑系统的基因编辑活性，有助于实现目的基因的高精度编辑，能扩展基因编辑工具在基因治疗和动物育种等领域的应用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法的方法及其应用方法，该方法提高基因敲除和碱基编辑系统活性，获得更高的基因编辑效率，解决在精确位点特异性基因编辑的低活性的问题，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，致病突变纠正、动物模型制备等研究。
为达此目的，本发明提供一种小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法，使用基因编辑系统进行基因编辑时，加入小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或NexturastatA处理细胞，Ricolinostat或Nexturastat A提高基因编辑中基因敲除和碱基编辑系统活性。
优选地，所述基因编辑系统由基因敲除系统或碱基编辑系统的对应表达载体和靶向基因组DNA靶位点的sgRNA表达载体组成，所述碱基编辑系统为胞嘧啶碱基编辑器(CBE)或腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的表达载体，所述基因敲除系统为SpCas9。
优选地，使用SpCas9靶向切割目的基因DNA双链，诱发细胞内非同源末端连接(NHEJ)，进而使目的基因开放阅读框产生移码.
优选地，使用CBE或ABE，将目的碱基C转换为T或A转换成G。
优选地，所述基因编辑系统为表达CRISPR/Cas9或单碱基编辑器蛋白的编码质粒。
优选地，一种权利要求1所述的小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法的应用方法，其包括以下步骤，
步骤1，构建SpCas9、CBE或ABE表达载体；利用PCR扩增CBE(包括APOBEC1-nCas9-UGI序列)，并连入真核表达载体px330，得到px330-CBE表达载体。
步骤2，构建特异性靶向基因组DNA靶位点的sgRNA；利用单链DNA退火得到sgRNA片段，并连入表达载体pJET-U6、px330-CBE或px330，得到相应的含sgRNA的表达载体；
步骤3，转染HEK-293细胞，在HEK-293细胞中转染引入SpCas9、ABE、CBE或CBE-NG表达载体和sgRNA表达载体，使其在基因组DNA靶位点发生基因编辑；
步骤4，转染后加入的Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或NexturastatA；
步骤5，对转染后的HEK-293细胞基因组DNA进行抽提；
步骤6，基因组DNA PCR产物高通量测序，利用针对靶位点序列的特异性引物进行PCR扩增，利用PCR产物构建高通量测序文库，并进行高通量测序。
优选地，所述基因组DNA的靶位点包括人的EMXI,FANCF,RNF2，HBB，HEK-Site3，HEK-Site4，ABCA4，ABE-Site3，ABE-Site8，ABE-Site12，ABE-Site14，ABE-Site17，ABE-Site19靶位点。
与现有的技术相比，本发明中，使用HDAC6抑制剂Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A提高基因敲除和碱基编辑系统活性，即提高SpCas9、ABE、CBE基因编辑器的活性。获得更高的基因编辑效率，解决在精确位点特异性基因编辑的低活性的问题，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，致病突变纠正、动物模型制备等研究。为基因编辑器在哺乳动物细胞中高效使用提供新的方法。
附图说明
图1为px330-CBE质粒模式图；
图2为pdonor-BFP-IRES-PURO质粒模式图；
图3为pdonor-ABCA4质粒模式图；
图4为Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A辅助的CBE碱基编辑系统与单独使用CBE的流式结果数据对比图；
图5为实施例4中Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A辅助的基因敲除与碱基编辑系统在内源性基因编辑活性的测试的高通量测序结果；
图6为px330-CBE-NG在ABCA4基因中进行修复的示意图及修复结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
本发明的参照图1至6所示，本发明所述的一种小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法。在使用基因编辑系统进行基因编辑时，加入小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A处理细胞，Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A提高基因编辑系统中基因敲除和碱基编辑系统活性。
所述基因编辑系统由基因敲除系统或碱基编辑系统的对应表达载体和靶向基因组DNA靶位点的sgRNA表达载体组成。所述碱基编辑系统包括胞嘧啶碱基编辑器(CBE)或腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的表达载体。所述基因敲除系统为SpCas9表达载体。所述SpCas9为CRISPR-Cas9为基础的基因敲除系统。其中，使用SpCas9靶向切割目的基因DNA双链，诱发细胞内非同源末端连接(NHEJ)，进而使目的基因开放阅读框产生移码。或者，使用CBE或ABE，将目的碱基C转换为T或A转换成G。
所述基因编辑系统可选用为表达CRISPR/Cas9或单碱基编辑器蛋白的编码质粒。使用HDAC6抑制剂Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A提高基因敲除和碱基编辑系统活性，获得更高的基因编辑效率，解决在精确位点特异性基因编辑的低活性的问题，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，致病突变纠正、动物模型制备等研究。为基因编辑器在哺乳动物细胞中高效使用提供新的方法。
上述小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法的应用方法，包括以下步骤：
步骤1，构建SpCas9、CBE或ABE表达载体；
步骤2，构建特异性靶向基因组DNA靶位点的sgRNA；利用单链DNA退火得到sgRNA片段，并连入表达载体pJET-U6、px330-CBE或px330，得到相应的含sgRNA的表达载体；
步骤3，转染HEK-293细胞，在HEK-293细胞中转染引入SpCas9、ABE、CBE或CBE-NG表达载体和sgRNA表达载体，使其在基因组DNA靶位点发生基因编辑；
步骤4，转染后加入的Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或NexturastatA；
步骤5，对转染后的HEK-293细胞基因组DNA进行抽提；
步骤6，基因组DNA PCR产物高通量测序，利用针对靶位点序列的特异性引物进行PCR扩增，利用PCR产物构建高通量测序文库，并进行高通量测序。
其中，所述基因组DNA的靶位点包括人的EMXI,FANCF,RNF2，HBB，HEK-Site3，HEK-Site4，ABCA4，ABE-Site3，ABE-Site8，ABE-Site12，ABE-Site14，ABE-Site17，ABE-Site19靶位点。
下面以具体实施例方式阐述：
本实施例的一种新型改造的基因组编辑工具，包括CBE蛋白表达载体或其转录翻译产物以及HDAC6抑制剂Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)和Nexturastat A，px330-CBE表达载体的CBE部分序列如SEQ ID NO.1所示。
上述改进具体为：SEQ ID NO.1CBE序列
上述实施例中，具体实验方法包括以下步骤：
1、构建CBE表达载体：利用PCR扩增CBE(包括APOBEC1-nCas9-UGI序列)，并连入真核表达载体px330，得到px330-CBE表达载体。
2、构建sgRNA表达载体：利用单链DNA退火得到sgRNA片段，并连入表达载体pJET-U6、px330-CBE或px330，得到相应的含sgRNA的表达载体；
3、转染HEK-293细胞；
4、抽提基因组DNA；
5、基因组DNA PCR产物高通量测序；
实施例1：px330-CBE表达载体的构建
(1)实验材料包括：
引物按常规方法、限制性内切酶、质粒重组试剂盒，质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，高保真DNA聚合酶以及基因组DNA抽提试剂盒。质粒pZHW-PBE，其包含的CBE序列为：SEQID NO.1。质粒px330、质粒pCMV-ABEmax、质粒pJET-U6。质粒pJET-U6为pJET1.2(CloneJETPCR Cloning Kit,Thermo Fisher Scientific)骨架上连接U6及scaffold片段(片段序列见SEQ ID NO.2)。转染试剂Turbofect以及T4 DNA连接酶。
具体的，SEQ ID NO.2U6-scaffold序列
本实施例，具体实施步骤：
步骤1：利用限制性核酸内切酶AgeI对质粒px330进行单酶切，得到骨架1；
步骤2：利用引物(序列AvrII-F、AvrII-R见表1)退火方法，得到双链DNA片段，将其连接至骨架1上得到含有AvrII酶切位点的px330-AvrII；
步骤3：将px330-AvrII和pZHW-PBE分别使用限制性核酸内切酶AvrII和SacI双酶切，将px330-AvrII酶切产生的4300bp左右片段和pZHW-PBE酶切产生的5200bp左右片段连接得到改造后的表达载体px330-CBE。
步骤4：sgRNA表达载体的构建：利用靶向特定位点的引物(引物序列见表1)，利用引物退火得到sgRNA片段，并连入表达载体px330-CBE(BsaI单酶切后骨架)，得到px330-CBE-sgRNA表达载体。
本实施例中CBE碱基编辑器的应用方法：
步骤1：包括构建针对某致病基因DNA靶点的sgRNA，在HEK-293细胞中共引入sgRNA和CBE表达载体，使其在靶位点发生碱基编辑；
步骤2：构建评估CBE编辑活性、效率的BFP报告系统，其利用的BFP基因序列为SEQID NO.3；
步骤3：构建CBE基因修复模板ABCA4细胞系，其利用的ABCA4基因序列为SEQ IDNO.4；
步骤4：对于处理后的HEK-293细胞基因组DNA进行抽提，然后利用针对靶点的特异性引物(序列见表1)进行PCR扩增，利用基因组DNA的PCR产物构建高通量测序DNA文库，并进行高通量测序。
上述改进具体为,SEQ ID NO.3BFP序列
SEQ ID NO.4ABCA4序列
实施例2：用于CBE活性测试的BFP报告系统的建立
(1)构建px330-AAVS1载体，其包含靶向AAVS1位点的sgRNA(序列AAVS1-sgRNA-F、AAVS1-sgRNA-R见表1)。构建表达BFP且带有AAVS1位点同源臂的载体(pdonor-BFP-IRES-PURO)，其包含AAVS1同源臂、蓝色荧光蛋白(BFP)、IRES和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因。
(2)HEK-293细胞复苏：把冻存HEK-293细胞的管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动，待液体完全融化后(大约1～1.5min)，1000rpm，离心3min；取出用75％的酒精擦拭消毒后放置于超净工作台；弃上清，再加1ml细胞培养基重悬细胞，然后转移至装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使细胞均匀分布在培养皿中；标好细胞种类和日期、培养人姓名等，放到37℃，5％的CO2培养箱中培养，待细胞贴壁并长满之后可进行后续操作。
完全培养基的配制：DMEM(高糖)+10％FBS(胎牛血清)+1％Pen./Strep.(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)
(3)用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于6孔板，24h后进行细胞转染，实验组为pX330-AAVS1、pdonor-BFP-IRES-PURO载体共转染，阴性对照组为pX330、pdonor-BFP-IRES-PURO载体共转染，其余条件与实验组相同；转染后24h换液，48h后传代到10cm皿，用1μg/ml浓度的抗生素Puromycin进行筛选；10d后，在显微镜下挑取单克隆细胞，获得整合有BFP-IRES-PURO基因的单克隆HEK293-AAVS1-BFP细胞系。
(4)单克隆HEK293-AAVS1-BFP细胞扩大培养，该克隆BFP基因经过PCR检测(引物F1、R1、F2、R2序列如表1所示)，确定已敲入,即HEK293-AAVS1-BFP细胞。
参考附图4所示，实施例3：Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A辅助的CBE碱基编辑系统在特定位点效率的测定以及与单独使用CBE的对比
(1)sgRNA设计：在BFP基因序列的特定位点设计sgRNA，使BFP蛋白的第66位氨基酸(组氨酸)对应的碱基序列位于CBE的编辑窗口内，将其对应的引物(序列BFP-sgRNA-F、BFP-sgRNA-R见表1)退火后引入px330-CBE载体，得到px330-CBE-BFPsgRNA载体；
(2)HEK293-AAVS1-BFP细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为0.8×105个细胞/孔；
(3)细胞生长24h后利用转染试剂TurboFect(Thermo Fisher,#R0531)转染质粒px330-CBE-BFPsgRNA(250ng)；
(4)HEK-293细胞转染方法：将需要转染的质粒混入含有1.5μl转染试剂Turbofect的50μl DMEM，吹打混匀之后室温静置15min，缓慢沿培养皿侧壁加入含有0.5ml DMEM(Gibco,C11995500CP)+10％ FBS(Gibco,16000 044)培养基，和0.8×105个细胞/孔的HEK293-AAVS1-BFP细胞的24孔板中进行转染。
(5)实验组转染后加入终浓度为2.5mM的Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A，对照组加入相应体积的DMSO。
(6)转染后24h更换新鲜的培养基，并加入相应浓度的药物，48h后收集细胞，通过流式细胞术检测GFP绿色荧光细胞的比率，根据比率变化判断Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A对CBE在特定位点活性的促进作用。通过附图4中流式结果的柱状图可知，小分子Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A能提高碱基编辑活性提供。
参考附图5所示，实施例4：Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A辅助的基因敲除与碱基编辑系统在内源性基因编辑活性的测试
(1)sgRNA设计：根据后续实验要求设计sgRNA，在内源性基因序列的不同位点(EMXI,FANCF,RNF2，HBB，HEK-Site3，HEK-Site4)将其对应的引物(相应序列见表1，SpCas9与CBE所用的sgRNA序列相同)退火后引入px330或px330-CBE载体，得到px330-sgRNA或px330-CBE-sgRNA载体；ABE的相应内源性位点(ABE-Site3，ABE-Site8，ABE-Site12，ABE-Site14，ABE-Site17，ABE-Site19)，将其对应的引物(相应序列见表1)退火后引入pJET-U6载体，得到pJET-U6-sgRNA载体；
(2)HEK293细胞计数后接种于12孔板，每孔的细胞密度为1.8×105个细胞/孔；
(3)细胞生长24h后利用转染试剂TurboFect(Thermo Fisher,#R0531)转染各位点对应的质粒px330-sgRNA或px330-CBE-sgRNA(750ng)；对于ABE系统，利用转染试剂TurboFect(Thermo Fisher,#R0531)转染各位点对应的质粒pCMV-ABEmax(500ng)或pJET-U6-sgRNA(250ng)；
(4)HEK-293细胞转染方法：将需要转染的质粒按比例混合好后，再混入含有3μl转染试剂Turbofect的100μl DMEM，吹打混匀之后室温静置15min，缓慢沿培养皿侧壁加入含有1ml DMEM(Gibco,C11995500CP)+10％ FBS(Gibco,16000 044)培养基，和1.8×105个细胞/孔的HEK293细胞的12孔板中进行转染。
(5)实验组转染后加入终浓度为2.5mM的Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A，对照组加入相应体积的DMSO。
(6)转染后24h更换新鲜的培养基，并加入相应浓度的药物，72h后收集细胞。
(7)细胞基因组DNA提取：使用Vazyme公司DNA抽提试剂盒。
(8)DNA高通量测序：设计扩增12个内源基因位点EMXI,FANCF,RNF2，HBB，HEK-Site3，HEK-Site4、ABE-Site3，ABE-Site8，ABE-Site12，ABE-Site14，ABE-Site17，ABE-Site19的引物(引物序列如表1所示)，进行两轮高保真DNA聚合酶PCR，可完成第二代DNA测序技术的建库过程，将建库样品进行高通量测序，可用Hi-TOM在线软件自动解析出多样品多靶位点的详细变异信息。附图5为高通量测序结果。
实施例5：HEK293-ABCA4细胞系的建立
(1)构建重组载体pdonor-ABCA4：
通过PCR扩增突变型ABCA4基因部分序列(如4所示)，克隆到载体pdonor-BFP-IRES-PURO上，得到重组pdonor-ABCA4载体。
(2)构建整合有突变型ABCA4基因的单克隆HEK293细胞系：
步骤1：HEK293细胞计数后接种于12孔板，每孔的细胞密度为1.6×105个细胞/孔；
步骤2：24h后进行细胞转染，实验组为px330-AAVS1、pdonor-ABCA4载体共转染，阴性对照组为px330、pdonor-ABCA4载体共转染，其余条件与实验组相同；
步骤3：转染后24h换液，48h后传代到10cm皿；
步骤4：5d后，在显微镜下挑取单克隆细胞，获得整合有突变型ABCA4基因的单克隆HEK293-ABCA4细胞系。
参考图6所示，实施例6：Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或NexturastatA对CBE-NG在Stargardt病致病基因的原位修复的促进作用。(见附图6a.本例示意图；6b.单克隆Sanger测序检测结果；6c.高通量测序统计结果)；
(1)CBE-NG表达载体的构建：使用引物(序列NG-F、NG-R见表1)扩增px330-SpCas9-NG(购自Addgene网站，#117919)上900bp左右片段。使用限制性内切酶PshAI和SacI将px330-CBE质粒双酶切，得到8200bp左右的骨架。将扩增后的片段与骨架利用ClonExpressII One Step Cloning Kit进行infusion连接得到改造后的表达载体px330-CBE-NG。
(2)sgRNA设计：在突变型ABCA4基因序列的点突变附近设计2条sgRNA序列(ABCA4-site1、ABCA4-site2)，将其对应的引物(序列ABCA4-site1-sgRNA-F、ABCA4-site1-sgRNA-R、ABCA4-site2-sgRNA-F、ABCA4-site2-sgRNA-F见表1)退火后引入px330-CBE-NG载体，得到px330-CBE-NG-sgRNA载体；
(2)HEK293-ABCA4细胞计数后接种于12孔板，每孔的细胞密度为1.8×105个细胞/孔；
(3)细胞生长24h后利用转染试剂TurboFect(Thermo Fisher,#R0531)转染2个位点对应的质粒px330-CBE-NG-sgRNA(750ng)；
(4)HEK-293细胞转染方法：将需要转染的质粒按比例混合好后，再混入含有3μl转染试剂Turbofect的100μl DMEM，吹打混匀之后室温静置15min，缓慢沿培养皿侧壁加入含有1ml DMEM(Gibco,C11995500CP)+10％ FBS(Gibco,16000 044)培养基，和1.8×105个细胞/孔的HEK293细胞的12孔板中进行转染。
(5)实验组转染后加入终浓度为2.5mM的Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A，对照组加入相应体积的DMSO。
(6)转染后24h更换新鲜的培养基，并加入相应浓度的药物，72h后收集细胞。
(7)细胞基因组DNA提取：使用Vazyme公司DNA抽提试剂盒。
(8)DNA高通量测序：根据诺禾致源公司提供的说明书，设计引物(ABCA4-On-F、ABCA4-On-R序列见表1)扩增ABCA4基因位点，进行两轮高保真DNA聚合酶PCR，可完成第二代DNA测序技术的建库过程，将建库样品进行高通量测序，可用公司提供的Hi-TOM在线软件自动解析出多样品多靶位点的详细变异信息。
(9)同时将基因组DNA的PCR产物(引物ABCA4-F、ABCA4-R序列见表1)通过T4 DNA连接酶(NEB)连接到pJET载体上，并进行转化，第二天挑取20个左右的单克隆，进行Sanger测序。
表1.引物序列汇总
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法，其特征在于：所述方法为非治疗目的的方法，使用基因编辑系统进行基因编辑时，加入小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A处理细胞，所述小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat A均可以提高基因编辑系统中基因敲除和碱基编辑系统活性；
所述基因编辑系统由基因敲除系统或碱基编辑系统的对应表达载体和靶向基因组DNA靶位点的sgRNA表达载体组成，所述碱基编辑系统为胞嘧啶碱基编辑器(CBE)或腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的表达载体，所述基因敲除系统为SpCas9表达载体。
2.根据权利要求1所述的小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法，其特征在于:使用SpCas9靶向切割目的基因DNA双链，诱发细胞内非同源末端连接(NHEJ)，进而使目的基因开放阅读框产生移码。
3.根据权利要求1所述的小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法，其特征在于:使用CBE或ABE，将目的碱基C转换为T或A转换成G。
4.根据权利要求1所述的小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法，其特征在于:所述基因编辑系统为表达CRISPR/Cas9或单碱基编辑器蛋白的编码质粒。
5.一种权利要求1所述的小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法的应用方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤1，构建SpCas9、CBE或ABE表达载体；
步骤2，构建特异性靶向基因组DNA靶位点的sgRNA，利用单链DNA退火得到sgRNA片段，并连入表达载体pJET-U6、px330-CBE或px330，得到相应的含sgRNA的表达载体；
步骤3，转染HEK-293细胞，在HEK-293细胞中转染引入SpCas9、ABE、CBE
或CBE-NG表达载体和sgRNA表达载体，使其在基因组DNA靶位点发生基因编辑；
步骤4，转染后加入Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或NexturastatA；
步骤5，对转染后的HEK-293细胞基因组DNA进行抽提；
步骤6，基因组DNA PCR产物高通量测序，利用针对靶位点序列的特异性引物进行PCR扩增，利用PCR产物构建高通量测序文库，并进行高通量测序。
6.根据权利要求5所述的一种小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法的应用方法，其特征是：所述基因组DNA的靶位点包括人的EMXI,FANCF,RNF2，HBB，HEK-Site3，HEK-Site4，ABCA4，ABE-Site3，ABE-Site8，ABE-Site12，ABE-Site14，ABE-Site17，ABE-Site19靶位点。
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