CN113214409B

CN113214409B - 一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体mtm及其应用

Info

Publication number: CN113214409B
Application number: CN202110620831.9A
Authority: CN
Inventors: 姬生跃; 李恒鑫; 孟春颜; 程磊; 战余铭; 侯佩; 刘小元; 王小媛; 周佰峰; 张宁
Original assignee: Zhongji High Tech Beijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhongji High Tech Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2041-06-03
Also published as: CN113214409A

Abstract

本发明公开了一种蜂毒素‑死亡素杂合肽突变体MTM及其应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种蜂毒素‑死亡素杂合肽突变体MTM在抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌活性中的应用。本发明首次利用枯草芽孢杆菌基因修饰的SamyX‑6His‑EDDIE‑MTM融合片段构建了高效的重组枯草芽孢杆菌BSMW表达系统，用于MTM的生物合成。从1L发酵上清液中可获得高达254.38mg的MTM。纯化的MTM的大小与预期分子量3.2kDa一致。MTM具有对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

Description

一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用。

背景技术

抗生素滥用导致的耐药性问题日益严重，寻找全新类型的替代药物是解决耐药性问题的关键。抗菌肽以其独特的优势有望成为抗生素的理想替代品，但抗菌肽的来源问题一直是其开发应用的瓶颈。基因工程技术的快速发展一定程度上促进了抗菌肽的研究和开发。但与传统的抗生素相比，抗菌肽在抑杀活性、稳定性、细胞毒性等方面存在短板，研究者需进一步探究抗菌肽的抗菌机理及构效关系，对已有抗菌肽进行结构改造或设计新抗菌肽分子，从而在保证抗菌肽来源的前提下最大限度提高抗菌肽的实际使用价值。

通常抗菌肽的获取途径有三种：从生物体提取；通过化学合成的方法获得；采用基因工程表达技术得到目标抗菌肽。但是天然抗菌肽是生物机体在外界因素诱导下产生的活性物质，在生物体内含量较低，因此从生物体直接提取效率较低，而且提取难度也很大，步骤烦琐，不易标准化生产，成本较高，难以保证提取物的纯度，很难实现规模化生产，而且对某些高等动植物及人类采用此种方法并不现实。随着多肽合成技术的不断提高，人工合成具有生物活性的肽类物质得以实现并快速发展。通常天然抗菌肽的相对分子质量较小，因此采用化学合成方法可以获得具有生物学活性的天然抗菌肽，但化学合成对技术要求严格，合成时间较长，而且价格昂贵成本高，难以实现大规模生产。现代基因工程技术的飞速发展为大规模生产抗菌肽提供了有效途径，弥补了上述两种获取方法的不足，是一种经济有效的获得抗菌肽的方法。

蜂毒肽(melittin)又叫蜂毒素，是蜂毒的主要活性成分，占蜂毒干重的50％，是蜂毒中主要发挥作用的物质。蜂毒肽可以抗菌、抗病毒、消炎、抗辐射，最近又有对其抗癌作用进行研究的报道。蜂毒肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的抑制作用，但它还有很强的溶血活性，限制了其临床应用。蜂毒肽具有破坏细胞膜、致死细胞的特性，因此要从原核和真核表达系统获得有活性的蜂毒肽，需要以融合蛋白形式表达。

死亡素(Thanatin)是从半翅目昆虫刺肩蝽(Podisus maculiventris)血淋巴中分离的具有广谱抗菌活性的昆虫抗菌肽，也是第一个生理浓度时对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌有抑制活性的抗菌肽。该肽具有杀细菌和杀真菌作用，具有迄今观察到的昆虫防御肽中最大的抗菌谱之一。

因此，提供一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM，其氨基酸序列如下：GIWAVLKVLTTWKPVPIIYCNRRTWKCQRM；SEQ ID NO.4。

进一步，所述的一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM在抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌活性中的应用。

进一步，含有所述的蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM的重组枯草芽孢杆菌BSMW的构建方法，具体步骤如下：

(1)将SamyX-6His-EDDIE-MTM与pDM030载体通过酶切连接，获得重组质粒pDM045；所述SamyX-6His-EDDIE-MTM的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)将重组质粒pDM045转化大肠杆菌DH5α，利用氯霉素筛选阳性克隆，通过测序对转化子进行验证；

(3)将步骤(2)验证正确的阳性克隆利用电穿孔法转化到枯草芽孢杆菌WB700，构建获得重组枯草芽孢杆菌BSMW。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用，首次利用枯草芽孢杆菌基因修饰的SamyX-6His-EDDIE-MTM融合片段构建了高效的重组枯草芽孢杆菌BSMW表达系统，用于MTM的生物合成。从1L发酵上清液中可获得高达254.38mg的MTM。纯化的MTM的大小与预期分子量3.2kDa一致。MTM具有对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性。在饲料添加剂、食品和化妆品防腐等领域，具有潜在的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明MTM抗菌肽二级结构图；

图2附图为本发明pDM045质粒构建过程示意图；

图3附图为本发明经IPTG诱导的重组枯草芽孢杆菌BSMW菌株的菌量；

图4附图为本发明SamyX-Eddie-MTM融合基因转录量；

图5附图为本发明MTM累积产量；

图6附图为本发明重组BSMW菌株发酵液中MTM的SDS-PAGE和Westernblot分析；

其中，A为重组BSMW菌株发酵液中MTM的Tricine-SDS-PAGE分析；B为重组BSMW菌株发酵液中MTM的Westernblot分析；A和B中，泳道1：蛋白Marker，#P7702，NewEnglandBiolabs，USA；泳道2：重组枯草芽孢杆菌BSMW培养液经IPTG诱导后继续培养8h的发酵液处理样品；泳道3，枯草芽孢杆菌WB700培养液经IPTG处理后继续培养8h的发酵液处理样品；

图7附图为本发明重组MTM的电喷雾电离质谱分析。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1杂合肽突变体MTM的设计，理化性质和结构预测

(1)杂合肽突变体MTM的设计

从抗菌肽数据库(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)中获得蜂毒素和死亡素的原始多肽序列。蜂毒素由26个氨基酸组成，一级结构为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ；SEQID NO.1。死亡素由21个氨基酸组成，一级结构为GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM；SEQ ID NO.2。生物公司根据杂合肽(M-T)序列GIGAVLKVLTTGKPVPIIYCNRRTGKCQRM(SEQ ID NO.3)合成核苷酸序列，插入到pDM030载体，转化枯草芽孢杆菌WB700菌株，生产杂合肽(M-T)。然后利用抗菌肽分子设计方法经多轮试验得到蜂毒素-死亡素杂合肽突变体(MTM)，杂合肽突变体包含30个氨基酸，对3个位点(加粗和下划线)进行了定点突变，杂合肽突变体氨基酸序列如下：

(2)MTM的理化性质和结构预测

通过使用在线工具(多肽参数分析：https://web.expasy.org/protparam/)，可以预测原始肽以及设计的杂化肽的二级结构，分子量和等电点。二级结构预测基于GOR(http://npsa-Pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_gor4.html)和HNN方法(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)。MTM二级结构图见图1。

杂合肽突变体MTM的等电点和分子量见表1。

表1 MTM的理化性质

实施例2构建重组菌株

pDM030载体是一种来源于pGJ222质粒(枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建；毕台飞，胡雄斌等；西北农林科技大学学报，第39卷第11期)，经采用Pgrac启动子替代PGJ222质粒的Pglv启动子而得到，能在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制的穿梭载体，含有启动子Pgrac以及氯霉素和壮观霉素抗性基因和β-半乳糖苷酶基因。载体用EcoR I和SacI酶切。北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成了含有SamyX信号肽及EcoR I和Sac I位点的SamyX-6His-EDDIE-MTM的702bp融合片段，其核苷酸序列如下：

gaattcatggtttcaattagaagatcatttgaagcatatgttgatgatatgaatattattacagttcttattccggcacatcatcatcatcatcatatggaacttaatcattttgaacttctttataaaacaaataaacaaaaaccggttggcgttgaagaaccggtttatgatacaacaggcagaccgctttttggcgatccgtcagaagttcatccgcaatcaacacttaaacttccgcatgatagaggcgaagatgatattgaaacaacacttagagatcttccgagaaaaggcgattgcagatcaggcaatcatcttggcccggtttcaggcatttatattaaaccggggccggtttattatcaagattatatggggccggtttatcatagagcaccgcttgaattttttgatgaaacacaatttgaagaaacaacaaaaagaattggcagagttacaggctcagatggcaaactttatcatatttatgttgaagttgatggcgaaattcttcttaaacaagcaaaaagaggcacaccgagaacacttaaatggacaagaaatacaacaaattgcccgctttgggttacatcatgcggcatttgggcagttcttaaagttcttacaacatggaaaccggttccgattatttattgcaatagaagaacatggaaatgccaaagaatgtaataagagctc；SEQ ID NO.5。

通过置换pDM030载体中的β-半乳糖苷酶基因，将其克隆到pDM030载体中，获得重组质粒pDM045。重组质粒pDM045为含有操纵子的诱导表达质粒，该操纵子包括IPTG诱导的Pgrac启动子和编码SamyX-6His-EDDIE-MTM的融合片段。其中，SamyX-6His-EDDIE-MTM的氨基酸序列如下：

MVSIRRSFEAYVDDMNIITVLIPAHHHHHHMELNHFELLYKTNKQKPVGVEEPVYDTTGRPLFGDPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYMGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSCGIWAVLKVLTTWKPVPIIYCNRRTWKCQRM；SEQ ID NO.6。

重组质粒pDM045的构建过程见图2。

将重组质粒pDM045转化大肠杆菌DH5α，以5μg/ml浓度的氯霉素筛选阳性克隆。通过北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序对转化子进行验证，并使用电穿孔法将验证后的pDM045转化到枯草芽孢杆菌WB700菌株，从而构建了重组枯草芽孢杆菌BSMW。

实施例3MTM的生物合成

从含50μg/ml壮观霉素的LB琼脂中筛选出重组枯草杆菌BSMW阳性克隆；将阳性克隆在含有50ml LB液体培养基的250ml摇瓶中培养，培养温度为37℃，搅拌速度为225转/分。接种后12h，当重组菌达到对数生长后期时，在培养液中添加IPTG溶液，最终浓度为100μM，然后进行24h的培养。以枯草芽孢杆菌WB700菌株为平行对照，同等条件下进行处理。

(1)总RNA的提取及荧光定量PCR：

发酵开始后每隔3h收集培养物，直到36h。使用SV总RNA分离试剂盒(#Z3100；Promega，美国)提取细菌总RNA。使用逆转录系统试剂盒(#A3500；Promega，美国)将提取的总RNA反转录成cDNA。随后使用实时PCR试剂盒(#DRR041S；Takara，日本)进行实时PCR。用引物AEM-up/AEM-down扩增SamyX-6His-EDDIE-MTM基因。

其中，AEM-up/AEM-down的引物序列如下：

AEM-up：5’-CCGGCACATCATCATCATCA-3’；SEQ ID NO.7；

AEM-down：5’-GGAACCGGTTTCCATGTTGTAA-3’；SEQ ID NO.8；

PCR反应程序如下：在50℃下反应2min，在95℃下反应10min，然后在95℃下反应42s，在49℃下反应60s，在72℃下反应30s，共35个循环。反应在IQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad，美国)中进行。

(2)IPTG诱导与MTM生物合成量

同时摇床培养2瓶枯草芽孢杆菌BSMW菌株，其中1瓶在开始培养12h之后进行IPTG诱导处理，另一瓶作为平行对照，不进行IPTG诱导处理。2瓶都在开始培养12h后达到对数生长后期。开始培养18h后，经IPTG诱导的重组枯草芽孢杆菌BSMW菌株的菌量与未经IPTG诱导的枯草芽孢杆菌BSMW菌株相比显著下降(图3)。

在对数生长后期进行IPTG诱导后，启动子Pgrac有效地促进了编码SamyX-Eddie-MTM的融合基因的转录(图4)。在IPTG诱导后可检测到MTM的表达，在重组菌生长20h后，从1L发酵培养基中可检测到254.38mg MTM的最大表达水平；但是，重组菌在IPTG诱导后8h开始下降，培养36h后约下降至最大值的一半(图5)。

实施例4westernblot

将枯草芽孢杆菌BSMW培养液经IPTG诱导后继续培养8小时的发酵液离心10分钟，上清液与4×Laemmli负载缓冲液3：1混合，在沸水中加热5min。处理后的样品用10％凝胶进行Tris tricine十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)，电转移到PVDF膜上进行蛋白免疫印迹分析。小鼠抗Eddie单克隆抗体(MAb)和小鼠抗MTM单克隆抗体(MAb)由中国北京CwBiotech公司制备和纯化。在与适当的HRP偶联二抗孵育后，使用ChemiDocXRS成像系统和QuantityOne分析软件(Bio-Rad，美国)检测信号。

Tricine-SDS-PAGE对重组枯草杆菌BSMW菌株胞外总蛋白的分析表明，MTM的分子量为3.2kDa左右(图6A)。Western blot分析证实了Tricine-SDS-PAGE分析的结果，证明在培养上清液中存在MTM(图6B)。

实施例5MTM的纯化

将枯草芽孢杆菌BSMW培养液经IPTG诱导后继续培养8小时的发酵液以7000×g离心10min，上清液经0.22-μm孔过滤器(Nucleopore，Costar)过滤。用反相高效液相色谱系统(反相高效液相色谱法，美国安捷伦)，半制备Zorbax300SB-C8柱(250mm×9.4mm，5μm粒径，300A孔径)(美国安捷伦)对滤后样品进行处理。色谱柱在0.1％(v/v)三氟乙酸和10％乙腈中平衡，然后以0％～60％的乙腈梯度线性展开，流速为1.0ml/min。利用MTM标准品(上海楚肽生物科技有限公司合成)，纯化并收集MTM样品。用电喷雾电离质谱(美国安捷伦)测定纯化的MTM的分子量。电喷雾电离质谱分析表明，MTM分子量为3273.996(图7)，与理论预测值的3274.01一致，也与Tricine-SDS-PAGE分析的结果一致。

实施例6抗菌活性

从美国类型培养库(美国马里兰州罗克维尔)获得大肠杆菌ATCC 25922、沙门氏菌ATCC 14028、金黄色葡萄球菌ATCC 29213及其相应耐药菌株(耐氨苄西林菌株、耐恩诺沙星菌株、耐甲氧西林菌株为本实验室分离获得)作为指示菌株。应用微量二倍稀释法，研究生物合成的MTM对指示菌株的抗菌活性，结果见表2。表2结果显示，生物合成的MTM对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌表现出了很好的抑菌活性。

表2

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中基高科（北京）生物技术有限公司

<120> 一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln

20 25

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly

1 5 10 15

Lys Cys Gln Arg Met

20

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Lys Pro Val Pro

1 5 10 15

Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys Gln Arg Met

20 25 30

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Gly Ile Trp Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Trp Lys Pro Val Pro

1 5 10 15

Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Trp Lys Cys Gln Arg Met

20 25 30

<210> 5

<211> 702

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gaattcatgg tttcaattag aagatcattt gaagcatatg ttgatgatat gaatattatt 60

acagttctta ttccggcaca tcatcatcat catcatatgg aacttaatca ttttgaactt 120

ctttataaaa caaataaaca aaaaccggtt ggcgttgaag aaccggttta tgatacaaca 180

ggcagaccgc tttttggcga tccgtcagaa gttcatccgc aatcaacact taaacttccg 240

catgatagag gcgaagatga tattgaaaca acacttagag atcttccgag aaaaggcgat 300

tgcagatcag gcaatcatct tggcccggtt tcaggcattt atattaaacc ggggccggtt 360

tattatcaag attatatggg gccggtttat catagagcac cgcttgaatt ttttgatgaa 420

acacaatttg aagaaacaac aaaaagaatt ggcagagtta caggctcaga tggcaaactt 480

tatcatattt atgttgaagt tgatggcgaa attcttctta aacaagcaaa aagaggcaca 540

ccgagaacac ttaaatggac aagaaataca acaaattgcc cgctttgggt tacatcatgc 600

ggcatttggg cagttcttaa agttcttaca acatggaaac cggttccgat tatttattgc 660

aatagaagaa catggaaatg ccaaagaatg taataagagc tc 702

<210> 6

<211> 228

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Met Val Ser Ile Arg Arg Ser Phe Glu Ala Tyr Val Asp Asp Met Asn

1 5 10 15

Ile Ile Thr Val Leu Ile Pro Ala His His His His His His Met Glu

20 25 30

Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Asn Lys Gln Lys Pro Val

35 40 45

Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Thr Gly Arg Pro Leu Phe Gly

50 55 60

Asp Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Asp

65 70 75 80

Arg Gly Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro Arg Lys

85 90 95

Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly Ile Tyr

100 105 110

Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Met Gly Pro Val Tyr

115 120 125

His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Thr Gln Phe Glu Glu Thr

130 135 140

Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His

145 150 155 160

Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Gln Ala Lys Arg

165 170 175

Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Thr Arg Asn Thr Thr Asn Cys Pro

180 185 190

Leu Trp Val Thr Ser Cys Gly Ile Trp Ala Val Leu Lys Val Leu Thr

195 200 205

Thr Trp Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Trp Lys

210 215 220

Cys Gln Arg Met

225

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ccggcacatc atcatcatca 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ggaaccggtt tccatgttgt aa 22

Claims

1.一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM在制备抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌活性的试剂中的应用，其特征在于，所述蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM的氨基酸序列如下：GIWAVLKVLTTWKPVPIIYCNRRTWKCQRM。

2.表达权利要求1中所述的蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM的重组枯草芽孢杆菌BSMW的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将SamyX-6His-EDDIE-MTM与pDM030载体通过酶切连接，获得重组质粒pDM045；所述SamyX-6His-EDDIE-MTM的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

（2）将重组质粒pDM045转化大肠杆菌DH5α，利用氯霉素筛选阳性克隆，通过测序对转化子进行验证；

（3）将步骤（2）验证正确的阳性克隆利用电穿孔法转化到枯草芽孢杆菌WB700，构建获得重组枯草芽孢杆菌BSMW。