CN110551732A - 一种卵形鲳鲹抗菌肽leap-2基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵形鲳鲹抗菌肽LEAP‑2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明公开了上述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP‑2基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了包含上述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP‑2基因的表达载体、制备重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP‑2蛋白的方法，以及所述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP‑2基因在制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的药物中的应用。

Description

一种卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因及应用。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)是一种基因编码，核糖体合成的小于10kDa，具有总净正电荷的小分子多肽。AMPs是生物体先天性免疫防御系统的重要组成部分，在免疫方面发挥重要作用。目前，在植物和动物中鉴定了数百种AMPs(参见http://aps.unmc.edu/AP/main.php)。基于氨基酸组成和蛋白质的二级结构，可将AMPs大致分为4类，即β-折叠、α-螺旋、环形(brevinin)和延伸肽。

肝脏表达抗菌肽2(LEAP-2)是一种小分子阳离子蛋白，主要在肝脏中表达，具有四个高度保守的半胱氨酸形成的两对二硫键，其在杀灭细菌中起关键作用。Krause A等首先从人的血液中分离得到LEAP-2，通过抑菌圈检测发现对革兰氏阳性菌(巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌)和革兰氏阴性菌都具有抑菌活性。在鱼类中，LEAP-2最初在虹鳟鱼中被鉴定出来。与哺乳动物只有LEAP-2的一个同源物不同，一些鱼类，如虹鳟鱼、大黄鱼和鲤鱼具有LEAP-2的多个同源物，即LEAP-2A，LEAP-2B和LEAP-2C。此外，LEAP-2除具有抑菌活性以外，还具有拮抗生长素释放肽代谢作用和解决代谢紊乱等作用。

卵形鲳鲹(Trachinotus Ovatus)是我国南方池塘和网箱养殖的主要品种，年产量已超过10万吨。然而，病害问题，特别是细菌类疾病，一直以来是困扰卵形鲳鲹养殖的重要问题，其严重制约了卵形鲳鲹养殖产业发展。目前对于卵形鲳鲹的细菌类疾病还没有有效药物，亟待开发一种安全、高效的抗菌剂。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因及其编码蛋白。

本发明的第二个目的在于提供含有所述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体及利用该载体转化的重组菌株。

本发明的第三个目的在于提供一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白的方法。

本发明的第四个目的在于提供所述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的应用。

本发明的第一个目的通过以下技术方案实现：

一种卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

如SEQ ID NO.3所示，所述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的cDNA的全长为1758bp，其全长是通过卵形鲳鲹转录组测序和基因组测序结果综合检索分析获得。

上述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

表达上述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的编码蛋白的抗菌肽成熟肽的基因序列是以卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的全长双链cDNA为模板，经PCR方法扩增获得，它来源于卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的成熟肽区域所对应的的基因片段，其为所述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的cDNA序列431bp至571bp(相当于第61至第106位氨基酸)的片段。

上述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的编码蛋白的氨基酸序列分析表明，卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2由106个氨基酸残基组成，其中前29个氨基残基为N端信号肽序列，中间31个氨基残基为前体肽序列，后46个氨基酸残基为成熟肽序列，成熟肽是由抗菌肽切除信号肽和前体肽形成的，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌均具有抑菌活性。革兰氏阴性菌包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维弧菌、大肠杆菌、美人鱼发光杆菌等；革兰氏阳性菌包括无乳链球菌、金黄葡萄球菌和芽孢杆菌等。

本发明的第二个目的通过以下技术方案实现：包含上述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体。

本发明所述的表达载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的表达载体的相应酶切位点(即EcoR I和Hind Ⅲ)之间，即构建含有卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体。

上述包含卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体优选由卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因与大肠杆菌表达载体pET-32a构建成的重组表达载体，命名为pET-32a/mleap-2。

本发明还包括由上述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体转化的重组菌株。利用所述的包括卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得重组的卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因。

其中所述的寄主细胞优选为大肠杆菌。该重组微生物由含有卵形鲳鲹LEAP-2基因的大肠杆菌表达载体pET-32a/mleap-2转化大肠杆菌BL21而得到的菌株，命名为pET-32a/mleap-2-BL21。

本发明的第三个目的通过以下技术方案实现：

一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白的方法，利用所述的包括卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，得到重组菌株，再将重组菌株培养至对数期后分离纯化，得到重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白。

其具体过程如下：

选取大肠杆菌重组菌株pET-32a/mLEAP-2-BL21接种在10mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，过夜，作为种子菌，次日再按1:100接种量接种于相同的培养基中，当重组菌生长进入对数期时，加100mM IPTG至最终浓度为0.1mM，220rpm振荡培养，当重组菌生长进入平台期后收集菌体，经分离纯化得到重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白。

本发明的第四个目的通过以下技术方案实现：所述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因在制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明编码了卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的cDNA的核苷酸序列，并将该基因构建重组表达载体和该表达载体重组菌株，利用该重组菌株获得大量表达的重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白，该重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白能进一步应用于制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的药物中，有效解决目前卵形鲳鲹养殖过程中的病害问题。

附图说明

以下通过附图对本发明作进一步的说明。

图1卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2成熟肽基因的合成PCR扩增产物电泳图。

图2经诱导的卵形鲳鲹pET-32a/mLEAP-2-BL21的SDS-PAGE凝胶电泳图(依次为未诱导的菌液，菌液诱导4h，6h，8h，蛋白Marker，诱导16h，18h，24h)。

图3His抗体的免疫印迹结果图。

图4纯化的重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。

图5重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白活性检测结果图(A芽孢杆菌，B无乳链球菌，C美人鱼发光杆菌，D哈维弧菌)。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因全长获得

本发明的卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因全长是利用本实验室完成的卵形鲳鲹转录组测序和全基因组测序结果综合筛选分析获得，其中转录组在NCBI编号为PRJNA406847，基因组在GenBank中的编号GCA_900607315.1。通过对比GenBank数据库，发现其与其他鱼类的LEAP-2基因具有较高的同源性。

使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和BLASTX程序分析起始密码子和终止密码子；利用NCBI网站上的BLASTP程序进行相似性搜索分析，预测LEAP-2基因的开放阅读框。

采用HiPure Universal RNA Mini Kit(MAGEN)试剂盒提取卵形鲳鲹各组织总RNA，按照PrimeScript^TM Reverse Transcriptase Kit(TaKaRa)的说明书反转录得到的双链cDNA模板。反应分为两个阶段，包括：①cDNA第一条链合成：反应条件为42℃，2min，4℃冷却；②双链cDNA合成：以合成cDNA第一条链为模板，反应条件为37℃，15min；85℃，5s；4℃冷却。

该卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的cDNA核苷酸序列如下所示：

其中方框图内为卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2的N端信号肽DNA序列，加粗部分为卵形鲳鲹抗菌肽的前体肽DNA序列，下划线部分为卵形鲳鲹抗菌肽的成熟肽DNA序列。

其编码蛋白的氨基酸序列如下所示：

经氨基酸序列分析表明，该编码蛋白由106个氨基酸残基组成，其中前29个氨基残基为N端信号肽序列，中间31个氨基残基为前体肽序列，后46个氨基酸残基为成熟肽序列，成熟肽是由抗菌肽切除信号肽和前体肽形成的。

实施例2

利用PCR技术扩增卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因成熟肽序列

根据获得卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2的cDNA全序列和pET-32a载体质粒(抗氨苄)序列，设计两对引物对卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因成熟肽序列进行巢式PCR技术扩增，第一对引物的上游引物为5’-ACTGAGGAGGATAGCTCGGATG-3’，下游引物为5’-CCTGATGTGCCTTTTCTTGGAT-3’；第二对引物中上游引物是在第431位碱基起20个碱基前加入EocR I的限制酶切位点以及3个保护碱基(5’-CCGGAATTCATGACCCCGCTGTGGAGAAT-3’)，下游引物是在第552位碱基起20个碱基前加入HindⅢ的限制酶切位点以及3个保护碱基(5’-CCCAAGCTTCTAATAGTTTACGGGCTCTG-3’)。经PCR方法扩增卵形鲳鲹抗菌肽第61位至第106位氨基酸序列相应的DNA序列，即为卵形鲳鲹抗菌肽成熟肽相应序列。

PCR扩增条件为：94℃预变性2min；然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸45S，共35个循环；最后72℃10min。

PCR扩增产物的电泳图如图1，PCR扩片段大小约138bp。

实施例3

含卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的大肠杆菌表达载体的构建

上述实施例2扩增得到的PCR产物经EocR I和HindⅢ酶切后，酶切产物用AxyGen公司PCR产物纯化试剂盒回收，分离纯化约297bp的卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因片段；表达载体pET-32a同样用EocR I和HindⅢ酶切后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化后，与297bp的卵形鲳鲹抗菌肽基因片段按1：3混合，用T4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌BL21中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选重组质粒进行测序鉴定，测序序列正确表明卵形鲳鲹抗菌肽基因已克隆入大肠杆菌表达载体pET-32a中，重组质粒命名为pET-32a/mleap-2。

实施例4

高效表达卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2的大肠杆菌重组菌株pET-32a/mleap-2-BL2的构建

用热激法将pET-32a/mleap-2转化大肠杆菌BL21，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pET-32a/mleap-2的重组转化子pET-32a/mleap-2-BL21，最后通过测序进行验证。

实施例5

利用大肠杆菌重组菌株pET-32a/mleap-2-BL21生产重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白

选取大肠杆菌重组菌株pET-32a/mleap-2-BL21，将其接种在10mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm的条件下振荡培养过夜，作为种子菌，次日再按1:100接种量接种于LB液体培养基中，当重组菌生长进入对数期时(A600＝0.5～0.6)，加100mMIPTG至终浓度为0.8mM，在37℃，220rpm的条件下振荡诱导培养8h后收菌。

取少量诱导培养后的菌加2×电泳上游缓冲液，煮沸5min后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图2，显示经诱导的pET-32a/mleap-2-BL21在约23kDa的位置上出现新的融合蛋白带，而未经诱导的菌则不出现此带。

利用常规方法进行免疫印迹(Western blot)分析，抗体为组氨酸标签抗体(His抗体),结果如图3所示：His抗体能识别用大肠杆菌重组菌株pET-32a/mleap-2-BL21表达的融合抗菌肽蛋白，这些结果证明得到的蛋白是重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白。

实施例6

重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白的纯化和活性检测

采用上述实施例5中的方法，将大肠杆菌重组菌株pET-32a/mleap-2-BL21基因工程菌进行扩大培养，10,000g离心10min后收集菌体，经超声波破碎后，利用His-BindPurification Kit Protocol纯化重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图4所示，结果表明获得了纯度较高的重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白。

琼脂扩散法检测体外抑菌活性：取芽孢杆菌、无乳链球菌、美人鱼发光杆菌、哈维弧菌菌种，分别涂布在营养琼脂培养基上，37在培养16～18h活化，再用接种棒分别从四种菌的营养琼脂培养基上取菌，用三步分区稀释法在固体营养琼脂培养基上划线，37，培养16～18h，分别挑取3个单菌落于LB培养基中，37℃培养16～18h活化增菌，取0.1mL置于LB琼脂平板上，用灭菌的L形曲玻棒均匀涂布，在涂有细菌的平板培养基表面放置3个牛津杯，3个牛津杯内分别加入30μL等量重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白、作为对照组的pET-32a蛋白和PBS。铺好后将平板正置温箱内37℃培养16～18h，检测结果如图5，重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白周围出现明显的抑菌圈，表明重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白对革兰氏阴性菌(美人鱼发光杆菌、鳗弧菌)、革兰氏阳性菌(无乳链球菌、芽孢杆菌)均具有抑菌活性。

实施例7

重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白最小抑菌浓度检测

选取革兰氏阳性菌(无乳链球菌、金黄葡萄球菌、芽孢杆菌)、革兰氏阴性菌(溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维弧菌、鳗弧菌、美人鱼发光杆菌、大肠杆菌)以及真菌(酵母菌)，分别取新鲜活化的各种菌的悬液，用LB液体培养基稀释至1×10⁶CFU/mL，然后依次加入96孔板的第1～12孔，每孔100μL。配制质量浓度分别为3000μg/mL、1500μg/mL、625μg/mL、312.5μg/mL、156.25μg/mL、78.13μg/mL、39.06μg/mL、19.53μg/mL、9.77μg/mL、4.88μg/mL和2.44μg/mL的重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白溶液，然后取各浓度的重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白溶液100μL分别加入到第2～11孔中，即各孔中重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白的浓度分别为1500μg/mL、625μg/mL、312.5μg/mL、156.25μg/mL、78.13μg/mL、39.06μg/mL、19.53μg/mL、9.77μg/mL、4.88μg/mL和2.44μg/mL、1.22μg/mL。其中，在第11孔添加等量空白LB液体培养基，第12孔添加等量200μL/mL卡那霉素溶液，分别作为阴性对照和阳性对照。37℃培养20h后，用酶标仪测定各孔600nm处吸光度值。结果如表1所示，显示重组卵形鲳鲹抗菌肽蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌均有抑菌效果，且最小抑菌活性浓度均为312.5μg/mL。

表1

需要指出的是，上述实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是限制，本领域技术人员在与本发明技术方案的相当的含义和范围内的任何调整或改变，都应认为是包括在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一种卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaggaga aacgattttt cgcccaaaga aaaacagcag tggcgctgtg cattgtgctg 60

ttaatgctgg ctcagcaggt gtgtgcaggt ccactggcct ctcggttgca gtccagctct 120

gaacagggtg cagattcaag gggggaacac agcgtccaca cactgaggag gatagctcgg 180

atgaccccgc tgtggagaat catgaacagc aaaccattcg gtgcttactg ccaaaacaac 240

tatgagtgct ccacagggct ctgcagggcg ggacactgct ccaccaccca ccgttctccc 300

tcagagcccg taaactatta g 321

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Glu Lys Arg Phe Phe Ala Gln Arg Lys Thr Ala Val Ala Leu

1 5 10 15

Cys Ile Val Leu Leu Met Leu Ala Gln Gln Val Cys Ala Gly Pro Leu

20 25 30

Ala Ser Arg Leu Gln Ser Ser Ser Glu Gln Gly Ala Asp Ser Arg Gly

35 40 45

Glu His Ser Val His Thr Leu Arg Arg Ile Ala Arg Met Thr Pro Leu

50 55 60

Trp Arg Ile Met Asn Ser Lys Pro Phe Gly Ala Tyr Cys Gln Asn Asn

65 70 75 80

Tyr Glu Cys Ser Thr Gly Leu Cys Arg Ala Gly His Cys Ser Thr Thr

85 90 95

His Arg Ser Pro Ser Glu Pro Val Asn Tyr

100 105

<210> 3

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccacagctg agtttgctga gtcaggctga cttgaagaga cctccagcaa aactgcgact 60

aataaaccaa acttcataca accgccagac ttgctccttg gactggttga gtcctaaaga 120

ggttcctaag gtgctggaga tcagaaaacc ggcccggtcc aggtcagatt tcagcagcag 180

gtcacagagg ggaagagagt ctcatcacca aacacctgag ggcattgaac tgtaccataa 240

gagcgtgaag atgcaggaga aacgattttt cgcccaaaga aaaacagcag tggcgctgtg 300

cattgtgctg ttaatgctgg ctcagcaggt gtgtgcaggt ccactggcct ctcggttgca 360

gtccagctct gaacagggtg cagattcaag gggggaacac agcgtccaca cactgaggag 420

gatagctcgg atgaccccgc tgtggagaat catgaacagc aaaccattcg gtgcttactg 480

ccaaaacaac tatgagtgct ccacagggct ctgcagggcg ggacactgct ccaccaccca 540

ccgttctccc tcagagcccg taaactatta gacgtccctg gacacaacca gcgtgtttac 600

atgggtgtac agccgtaatc cttattaggg gttctgatga ctgggatatg aactaatcca 660

gtcttttata aaaatcttac tttcgtattt atatgtgcca atacgtttct gattatatct 720

aaatgttttt atggattaac acagcaggta gttatatcca agaaaaggca catcaggggg 780

taagttcact gctccacctg aaacatttta gaaagtgaga actatcacct aaatgaagat 840

aataggaggt gaactgaggc aatgggtaaa gtgcaaacat gtaagcaggg ggatcattga 900

gagtttatac ttgatatttt ccatgatagc ttttgataca atcaatgaga aacgttttca 960

actggggtgc gaacaacttg tatttgtact gctgtggacc aaaatctttt tagccttgat 1020

ctcaaagttg agacagtgat ttataatgaa aacaaaagac aacatctttt ttttttaaat 1080

ctcagacact ctgtcctgcc agttactgta gccttgaact agtttccaga aatgatacga 1140

cgtcagcttg gtgtctgcat agcttaaaaa caatcaggtt ttattgttga cagccagtcg 1200

cttatcttat gacgacagtg tttcaaaaac tattattaac agtttaaaaa ttagctgcgc 1260

aacttttgaa cctgtcacca gacattgaaa cagatctgga tataactggt cacttcacag 1320

aagtatcaca gatatttttt ttggcagtga gtctctatcg gttgtgttat ttttgtaaca 1380

gataatgata cacagagtag gtagcggttc aaagcaaaga gaagactctg tgccttttgg 1440

aaacgcttga cctttaaata tttccacact gcgtcatgct cgataagtca taatttagct 1500

gtgtgctgag aaagtcttat cattccactg atattgggct gcagggacac acagacgctt 1560

cccttttacc aagagaatta tttggttcag tttgctaatg tcctgccaga gacatgtaat 1620

attaacatat ttaatgtttg gagattcagt gttttcaatt atcgccatta cgaccaatat 1680

gaacatctat gaattactat taataaggct gtaaagacgc attttcacaa attagtcata 1740

gctcaaactg aaaataaa 1758

Claims (9)

1.一种卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包含权利要求1所述卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体。

4.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求1所述的卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因。

5.权利要求4所述的重组菌株的制备方法，其特征在于，所述菌株由权利要求3所述的卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体转化寄主细胞，形成含有卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的重组菌株。

6.如权利要求5所述的重组菌株的制备方法，其特征在于，所述的寄主细胞为大肠杆菌BL21，形成的重组菌株为pET-32a/mLEAP-2-BL21。

7.一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白的方法，其特征在于，利用所述的包括卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，得到pET-32a/mLEAP-2-BL21重组菌株，再将pET-32a/mLEAP-2-BL21重组菌株培养至对数期后分离纯化，得到重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白。

8.权利要求1所述的卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2基因在制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的药物中的应用。

9.重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白在制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的药物中的应用。