CN102304536A - 两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物及制备方法 - Google Patents

Abstract

两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物及制备方法，涉及海洋鱼类与蟹类抗菌肽的基因工程表达。两种海洋动物抗菌肽基因包括拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因、连接肽和大黄鱼抗菌肽hepcidin基因。分别PCR扩增拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因和大黄鱼抗菌肽hepcidin基因，重叠PCR法获得联合多肽Scy-hepc的目的基因片段；将所得的融合基因Scy-hepc导入表达载体，构建携带融合基因Scy-hepc的重组表达载体；将所得的重组表达载体转入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化所得的表达产物，获得重组蛋白，即联合多肽Scy-hepc。

Description

两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物及制备方法

技术领域

本发明涉及海洋鱼类与蟹类抗菌肽的基因工程表达，具体涉及具有抗菌活性的拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin与大黄鱼抗菌肽Hepcidin在毕赤酵母GS115中的真核融合表达产物及制备方法。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptide)是先天性免疫的重要组分，广泛存在于生物界的各个门类，进化上相对保守，具有广谱的抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用。研究、开发与应用抗菌肽对解决海水养殖生产中面临的细菌耐药性和饲料中滥用抗生素造成的水产品药物残留及水环境污染等问题具有重要的科学意义和实际应用价值。从抗菌肽的未来开发应用角度而言，优化多种抗菌肽的重要抗菌结构域并重组表达，可获得新型的融合抗菌多肽，拓宽抗菌肽的抗菌谱，可能比单纯利用某一种抗菌肽具有更重要的实际应用价值。

拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin与大黄鱼抗菌肽Hepcidin均来源于海洋动物，且Scygonadin来自于无脊椎动物，在先天性免疫中发挥作用。而Hepcidin来自于低等脊椎动物，是鱼类先天免疫重要的效应因子。迄今，还未有关于这两种类型抗菌肽串联表达的研究报道。

Hepcidin是一种富含半胱氨酸的两性分子，可以通过二硫键形成稳定的β折叠结构和Loop结构，这种结构与Hepcidin的抗菌活性密切相关([1]Hunter H N，Fulton D B，Ganz T，Vogel HJ.The solution structure of human hepcidin，a peptide hormone with antimicrobial activity that isinvolved in iron uptake and hereditary hemochromatosis[J].J Biol Chem.，2002，277(40)：37597-37603)。在大肠杆菌原核表达体系中重组表达的Hepcidin很可能因为二硫键无法正确折叠加工而影响了Hepcidin的抗菌活性，进而影响了联合多肽Scy-hepc的抗菌功能。因而本实验使用毕赤酵母真核表达系统表达Scygonadin和Hepcidin的串联多肽Scy-hepc。

通过基因工程技术构建了Scygonadin基因及与大黄鱼抗菌肽Hepcidin基因联合的真核稳定表达菌株，优化其表达与纯化工艺，研究其基因表达产物的抗菌活性和抗菌谱，将为未来联合多肽产品的应用奠定基础，并为抗菌肽的产业化提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物及制备方法。

所述两种海洋动物抗菌肽基因包括拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因、连接肽和大黄鱼抗菌肽hepcidin基因；所述两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物可命名为Scy-hepc，所述拟穴青蟹阴离子抗菌肽scygonadin基因序列为：

ggccaggcac tcaacaaact tatgcctaaa atcgtcagcg ccataattta tatggtcggg     60

caacccaatg caggtgtcac ttttctgggc caccaatgtc tggtggagtc aacgaggcaa    120

ccagacgggt tttacaccgc aaagatgtcg tgtgcttcct ggactcatga taatcctatt    180

gttggggaag gaagaagccg ggttgaactt gaggcgctta aaggttccat cacaaacttt    240

gtccagacag catccaatta caagaagttc accatagatg aggtcgagga ctggattgct    300

tcttac                                                               306

所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因序列为：

gtcccagcca atgaagagca agagctggag cagcaaattt attttgctga tccagagatg     60

ccagtggaat catgcaagat gccgtattac atgcgtgaga atcgtcaggg cagccctgct    120

agatgcaggt tttgctgccg ttgctgtcct agaatgaggg gatgtggtat ctgctgcagg    180

ttc                                                                  183

所述连接肽的氨基酸序列可为：

Gly Gly Pro Gly Ser Gly

1               5

所述抗菌肽scygonadin和hepcidin基因的真核融合表达产物的氨基酸序列：

Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile

1               5                   10                  15

Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala Gly Val Thr Phe Leu Gly His Gln

            20                  25                  30

Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys

        35                  40                  45

Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His Asp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly

    50                  55                  60

Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe

65                  70                  75                  80

Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu

                85                  90                  95

Asp Trp Ile Ala Ser Tyr Gly Gly Pro Gly Ser Gly Val Pro Ala Asn

            100                 105                 110

Glu Glu Gln Glu Leu Glu Gln Gln Ile Tyr Phe Ala Asp Pro Glu Met

        115                 120                 125

Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met Arg Glu Asn Arg Gln

    130                 135                 140

Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg Cys Cys Pro Arg Met

145                 150                 155                 160

Arg Gly Cys Gly Ile Cys Cys Arg Phe

                165

所述两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物的制备方法包括以下步骤：

1)分别PCR扩增拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因和大黄鱼抗菌肽hepcidin基因，重叠PCR法获得联合多肽Scy-hepc的目的基因片段；

2)将步骤1)所得的融合基因Scy-hepc导入表达载体，构建携带融合基因Scy-hepc的重组表达载体；

3)将步骤2)所得的重组表达载体转入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

4)分离纯化步骤3)所得的表达产物，获得重组蛋白，即联合多肽Scy-hepc。

在步骤2)中，所述表达载体可选用pPIC9K等。

在步骤3)中，所述宿主细胞可为毕赤酵母GS115菌株等。

在步骤4)中，所述分离纯化的方法可为：先将重组表达产物进行离心，收集发酵上清液，透析后，再进行亲和层析。

本发明借助基因工程技术，利用pPIC9K毕赤酵母表达载体，高效表达出具有抗菌活性的拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin与大黄鱼抗菌肽Hepcidin的融合表达产物Scy-hepc，该重组蛋白具有广谱的抗菌活性，在毕赤酵母中串联表达此两种海洋动物抗菌肽基因的优点如下：

1.拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin与大黄鱼抗菌肽Hepcidin均是来自于海洋动物，Scygonadin作为无脊椎动物体内抗菌肽，主要在先天性免疫中发挥作用。而Hepcidin作为脊椎动物抗菌肽，是鱼类先天免疫重要的效应因子。其串联产物的药用开发对水产养殖业具有重要研究价值。

2.所述真核表达的联合多肽具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌如藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌和金黄色葡萄球菌，对革兰氏阴性菌如嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌都具有明显的抑制生长和杀灭作用，在抗病原微生物新药和动物饲料添加剂的开发中具有潜在应用价值。

3.真核表达的Scy-hepc对相同的被测菌株如嗜水气单胞菌、藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌的抗菌活性(MIC1.6～6.25μM)显著高于抗菌肽Scygonadin的抗菌活性(MIC7.5～60μM)([2]Peng H，Yang M，Huang W S，Ding J，Qu H D，Cai J J，Zhang N，Wang K J.Solubleexpression and purification of a crab antimicrobial peptide scygonadin in different expressionplasmids and analysis of its antimicrobial activity.Protein Expres Purif，2010，70：109-115)，与表达纯化的大黄鱼Hepcidin的抗菌活性相近(1.5～12μM)([3]王克坚，蔡灵蔡晶晶一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法申请号：201010505548.3)。然而大肠杆菌表达的大黄鱼Hepcidin蛋白的体外变性复性工艺较为复杂，不利于产业化。因此真核表达Scy-hepc联合多肽的表达纯化工艺可在抗菌肽产业化和商业化进程中发挥更大的作用。

附图说明

图1为PCR扩增联合多肽Scy-hepc目的基因片段。在图1中，M为DNA Marker DL2000，1为联合多肽Scy-hepc的PCR产物，2为scygonadin基因PCR产物，3为hepcidin基因的PCR产物，bp为碱基。

图2为pPIC9K载体双酶切前后电泳图谱。在图2中，1为酶切前pPIC9K载体，2为酶切后pPIC9K载体，M为DNA Marker DL2000。

图3为SDS-PAGE电泳分析pPIC9K-scy/hepc重组载体转化毕赤酵母GS115菌株后不同诱导时间的目的蛋白Scy-hepc蛋白表达量的变化(pH值为6.0，甲醇浓度为0.5％)。

图4为SDS-PAGE电泳分析pPIC9K-scy/hepc重组载体转化毕赤酵母GS115菌株后不同诱导时间的目的蛋白Scy-hepc蛋白表达量的变化(pH值为6.0，甲醇浓度为0.75％)。

图5为SDS-PAGE电泳分析pPIC9K-scy/hepc重组载体转化毕赤酵母GS115菌株后不同诱导时间的目的蛋白Scy-hepc蛋白表达量的变化(pH值为6.0，甲醇浓度为1％)。

图6为SDS-PAGE电泳分析pPIC9K-scy/hepc重组载体转化毕赤酵母GS115菌株后不同诱导时间的目的蛋白Scy-hepc蛋白表达量的变化(pH值为5.0，甲醇浓度为0.5％)。

图7为SDS-PAGE电泳分析pPIC9K-scy/hepc重组载体转化毕赤酵母GS115菌株后不同诱导时间的目的蛋白Scy-hepc蛋白表达量的变化(pH值为7.0，甲醇浓度为0.5％)。

图8为SDS-PAGE电泳分析目的蛋白Scy-hepc表达产物的纯化。在图8中，M为预染蛋白Marker SM0441(Fermentas公司)，1为上柱纯化前蛋白样品，2为流出组分，3-5为纯化的目的蛋白Scy-hepc。

在图3～7中，M为预染蛋白Marker SM0441(Fermentas公司)；诱导时间分别为0h，12h，24h，36h，48h。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1毕赤酵母重组表达质粒pPIC9K-scy/hepc的构建

1)拟穴青蟹scygonadin和大黄鱼hepcidin基因的获得

根据pPIC9K载体上多克隆位点，根据拟穴青蟹scygonadin的cDNA序列(Genbank登录号：AY864802)和大黄鱼hepcidin的cDNA序列(Genbank登录号：EF156401)设计scygonadin和hepcdin联合多肽的特异性上、下游引物。其中两个串联表达基因的连接肽(linker)为6个氨基酸序列为：GGPGSG，对应的密码子序列为(按照毕赤酵母密码子偏爱性^[4，5]进行了密码子优化)：5’GGTGGCCCAGGTTCCGGT3’。

F1：5′GGG

GGCCAGGCACTCAACAA3′，黑斜体表示引入的EcoR I酶切位点。

在拟穴青蟹scygonadin基因下游引物的5′端加入含有6个氨基酸的连接肽基因序列：

R1：5′

GTAAGAAGCAATCCAGT3′，黑斜体表示连接肽。

在大黄鱼hepcidin抗菌肽基因上游引物5′端加入连接肽基因序列：

F2：5′CAAGGTTCTCCAGCTCG3′，黑斜体表示连接肽。

在大黄鱼hepcidin抗菌肽基因下游引物5′端添加Not I酶切位点，终止密码子和6×His组氨酸标签，且6×His的密码子为CAC和CAT交替重复：

R2：5′CATTCA

GAACCTGCAGCAGATACCAC3′，黑斜体表示引入的Not I酶切位点，方框中为6×His序列。

以上引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。

2)以拟穴青蟹scygonadin cDNA和大黄鱼hepcidin cDNA重组pPMD18-T阳性质粒为扩增模板，分别以F1和R1、F2和R2为上、下游引物，Ex Taq酶(购自TaKaRa公司)进行PCR，扩增这两种目的基因片段，反应体系为：

混合均匀，在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应：

拟穴青蟹scygonadin基因PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec；进行30个循环后，72℃延伸7min；

大黄鱼hepcidin基因PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸30sec；进行30个循环后，72℃延伸7min；

反应结束后，将所有反应液进行2％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，得到拟穴青蟹scygonadin基因PCR产物长度约为320bp(参见图1)；大黄鱼hepcidin基因PCR产物长度约为200bp(参见图1)。

3)scygonadin和hepcidin联合多肽目的片段的获得：

以步骤2)中回收的两种PCR产物为模板，以拟穴青蟹scygonadin基因上游引物F1和大黄鱼hepcidin基因下游引物R2为上、下游引物，用Ex Taq酶扩增目的片段，反应体系为：

混合均匀，在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec；进行30个循环后，72℃延伸7min。

反应结束后，将所有反应液进行1.5％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，以上述扩增的两段PCR产物为模板，用特异的引物扩增联合多肽Scy-hepc目的基因片段，得到PCR产物约为520bp(参见图1)。

取2μg上述回收的Scy-hepc目的基因片段，用EcoR I和Not I限制性酶双酶切，37℃孵育5h，反应结束后，用1.5％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检测酶切效率；TaKaRa核酸共沉剂回收酶切后的Scy-hepc目的基因片段。处理后的Scy-hepc目的基因片段具有EcoR I和NotI的粘性末端。

4)pPIC9K载体的处理

将-80℃保存的带有pPIC9K的DH5α菌株划线于含50μg/mL的氨苄霉素的LB平板上，37℃培养过夜。次日挑取单克隆菌落，接种于5mL含50μg/mL的氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm/min培养8h至对数生长期，离心收集菌体，小量提取pPIC9K质粒。

取1-2μg上述纯化的pPIC9K载体，用EcoR I和Not I限制性酶双酶切，37℃孵育5h，酶切体系如下；反应结束后，用0.8％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检测酶切效率(参见图2)；载体酶切完全，用TaKaRa的核酸共沉剂回收酶切后的载体。

处理后的pPIC9K载体具有EcoR I和Not I的粘性末端。

3)pPIC9K-scy/hepc载体的构建、转化和鉴定

将经过一系列处理后具有EcoR I和Not I的粘性末端的pPIC9K载体与具有相同粘性末端Scy-hepc的基因片段进行连接，反应体系如下：

16℃孵育过夜；次日，取5μL连接反应液转化至50μL E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上培养过夜。次日挑取单菌落，以F1和R2为上下游引物，菌落PCR法鉴定阳性克隆菌，交由Invitrogen公司进行DNA核苷酸序列测定。结果显示连接正确，核苷酸的开放阅读框(ORF)连续编码，与预期要表达的氨基酸序列相符。真核重组表达载体pPIC9K-scy/hepc的特点是采用AOX1启动子，酵母信号肽α-factor因子引导目的蛋白Scy-hepc的分泌表达，并在C端带有6×His-Tag便于亲和层析纯化目的蛋白。

实施例2pPIC9K-scy/hepc重组质粒在毕赤酵母GS115中的诱导表达

1)pPIC9K-scy/hepc的线性化

测序正确的含表达载体的菌株划线培养，挑取单克隆摇菌培养，提取质粒后，10～20μg质粒由Sac I限制性内切酶线性化，反应体系如下：

用核酸共沉剂回收线性化后的pPIC9K-scy/hepc。再将其用电击法转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，并诱导表达。

2)联合多肽Scy-hepc的诱导表达

(1)Scy-hepc的诱导表达(不同诱导时间表达量的变化)：

①挑选若干个MD平板上生长的阳性克隆接种于6ml BMGY(pH6.0)培养基中，29℃，230rpm振荡培养约18h，至OD₆₀₀达2.0～6.0，室温1500～2000g离心收集细胞。

②等体积(6ml)BMMY(pH6.0)重悬细胞，28℃，230rpm振荡培养，诱导表达；在诱导过程中，每24h补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充BMMY使发酵液总体积保持不变。

③在培养0h、12h、24h、36h、48h、96h等时间点各取1ml发酵液，离心取上清，蛋白浓缩后，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白的表达。

(2)毕赤酵母表达Scy-hepc最适甲醇诱导浓度的确定：

不同浓度的甲醇诱导对蛋白的表达量有很大的影响，在pH值6.0时，调整诱导剂甲醇的浓度至甲醇终浓度为0.5％、0.75％和1％，诱导表达96h，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白的表达。

(3)毕赤酵母表达Scy-hepc最佳pH值的确定：

在发酵表达外源蛋白的过程中，发酵液的pH值对外源蛋白的表达可能有影响，在大规模发酵时尤为明显；因此在进行大规模发酵前，在摇床水平上进行发酵表达Scy-hepc的pH值优化，将为Scy-hepc的大规模发酵表达提供必要参数。调整BMGY和BMMY培养基为不同的pH值(pH5.0、6.0和7.0)，终浓度为0.5％的甲醇诱导表达48h，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白的表达。

结果显示：以pPIC9K-scy/hepc重组质粒转化的毕赤酵母GS115后，甲醇诱导后与诱导前相比，在约24kDa位置出现1条蛋白质条带，与表达的目的蛋白Scy-hepc的理论分子量相当。在不同的甲醇浓度下诱导表达96h，发现目的蛋白Scy-hepc在pH6.0的条件下，0.75％甲醇诱导表达36h时可获得较高表达量，36h后蛋白的表达量略为降低。且目的蛋白Scy-hepc在pH5.0、6.0和7.0的条件下，蛋白的表达量无明显变化(参见图3～7)。

实施例3亲和层析法纯化目的蛋白Scy-hepc

1)上柱前样品的制备

pPIC9K-scy/hepc重组质粒转化的毕赤酵母GS115后，在pH6.0的条件下，0.75％甲醇诱导表达36h后，离心去沉淀，收集发酵上清液。4℃，PBS透析液(50mM磷酸缓冲液+50mMNaCl，pH9.0)透析毕赤酵母诱导表达上清液2～3次，离心，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤，待上柱纯化。

2)亲和层析纯化目的蛋白Scy-hepc

用镍离子螯合亲和层析柱亲和纯化，层析试剂为：

溶液A：20mM磷酸缓冲液+50mM NaCl+10mM咪唑，pH8.5；

溶液B：20mM磷酸缓冲液+500mM NaCl+1M咪唑，pH8.5；

用5～10个柱体积MilliQ水清洗预装柱(HisTrap^TM FF Crude 5ml)，5～10个柱体积溶液A平衡HisTrap层析柱，将过滤后的上清液以2mL/min全部上柱，同时收集流出组分；含20mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白；用30％溶液B(含300mM咪唑)洗脱目的蛋白Scy-hepc收集洗脱峰，取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定(参见图8)。将目的蛋白洗脱液装入处理好的透析带中，在磷酸盐缓冲液中透析，最后透析入超纯水中。

结果显示，分子量大小约24kDa的Scy-hepc蛋白能够特异性的与镍离子螯合亲和层析柱结合，在较高浓度的咪唑溶液(300mM)竞争洗涤后，融合表达产物被洗脱，纯度较高，用Bradford法计算纯品的产量约为14mg/L。

3)Scy-hepc重组蛋白抗菌活性鉴定

蛋白样品经过0.22μm过滤膜过滤除菌后，应用Bradford法测定BSA标准品得到蛋白浓度标准曲线，根据公式可以计算出Scygonadin重组蛋白的浓度。将蛋白溶液倍比稀释至1.6～50μM。

MIC(Minimum Inhibitory Concentration，最小抑菌浓度)的测定参照Bulet等的方法([6]Bulet P，Dimarcq J L，Hetru C，Lagueux M，Charlet M，Hegy G，Van Dorsselaer A，Hoffmann J A.A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution[J].JBiol Chem.，1993，268：14893-14897；[7]Wang K J，Cai J J，Cai L，Qu H D，Yang M，Zhang M.Cloning and expression of a hepcidin gene from a marine fish(Pseudosciaena crocea)and theantimicrobial activity of its synthetic peptide[J].Peptides.，2009，30(4)：638-646)，在96孔细胞培养板上进行。

(1)菌悬液的准备：取被测细菌，划线于营养肉汤平板，培养12～16h；挑取2～3个克隆接种于MH斜面，继续培养12～16h，达到菌的对数生长期；10mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.2)冲洗新鲜制备的MH细菌斜面培养物，菌悬液调整稀释至OD₆₀₀＝0.1，取18μl OD₆₀₀＝0.1的菌悬液加入终体积为1ml的MH稀释培养基(PBS∶MH＝3∶2，V/V)中，该菌悬液为MIC工作浓度。

(2)每种被测菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样，每种菌重复3次：

①阳性对照组：加入50μL磷酸钠盐缓冲液和50μL菌悬液；

②空白对照组：加入50μL待测蛋白样品和50μL磷酸钠盐缓冲液；

③样品实验组：加入50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液；

(3)细菌最适培养24～48h后，观察MIC结果。取MIC终点以上未长菌的培养液，接种于营养肉汤平板上，培养后平板上基本无菌生长的被测蛋白最低浓度为该蛋白的MBC(Minimum Bactericidal Concentration，最小杀菌浓度)([7]Wang K J，Cai J J，Cai L，Qu H D，Yang M，Zhang M.Cloning and expression of a hepcidin gene from a marine fish(Pseudosciaenacrocea)and the antimicrobial activity of its synthetic peptide[J].Peptides.，2009，30(4)：638-646)。MBC的定义：使99.9％微生物致死的药物最低浓度。

对8种细菌的抗菌实验结果显示，真核表达的抗菌肽Scy-hepc具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性和阴性菌都具有较好的抑杀菌活性(参见表1)。

表1 Scy-hepc真核重组表达产物的抗菌活性

在表1中，CGMCC No.：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心菌种编号；MIC：最小抑菌浓度，用(a)-(b)表示，(a)表示肉眼可见菌体生长的最高浓度，(b)表示不见菌体生长的最小浓度；MBC：最小杀菌浓度，用(c)-(d)表示，(c)表示菌体可生长的最高浓度，(d)能够杀死99.9％菌体的最小浓度。

值得关注的是，真核表达的Scy-hepc对水产致病菌如嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌等具有显著的抗菌活性(MIC1.6～3.2μM)。真核表达的Scy-hepc对相同的被测菌株如嗜水气单胞菌、藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌的抗菌活性(MIC1.6～6.25μM)显著高于抗菌肽Scygonadin的抗菌活性(MIC7.5～60μM)([2]Peng H，Yang M，Huang W S，Ding J，Qu H D，Cai J J，ZhangN，Wang K J.Soluble expression and purification of a crab antimicrobial peptide scygonadin indifferent expression plasmids and analysis of its antimicrobial activity.Protein Expres Purif，2010，70：109-115)，且与表达纯化的大黄鱼Hepcidin的抗菌活性相近(1.5～12μM)([3]王克坚，蔡灵蔡晶晶一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法中国专利，申请号：201010505548.3)。但大肠杆菌表达的大黄鱼Hepcidin蛋白的体外变性复性工艺较为复杂，不利于产业化。

综合蛋白表达纯化工艺、抗菌活性等因素，以及宿主菌毕赤酵母的高稳定、高分泌、利于目的蛋白的纯化等优点，认为pPIC9K-scy/hepc真核表达载体适宜于进行工业化大规模发酵，可以考虑作为抗病原微生物新药和动物饲料添加剂等的侯选表达载体。

本发明旨在获得拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin和大黄鱼抗菌肽Hepcidin的联合多肽Scy-hepc的基因工程表达产品，并对其抗菌活性进行鉴定，以期开发抗病原微生物的新药物或作为动物饲料添加剂使用。本发明获得了联合多肽Scy-hepc的毕赤酵母表达重组子pPIC9K-scy/hepc，经诱导表达条件优化，在毕赤酵母中成功重组表达获得Scy-hepc的基因工程产品，确认了Scy-hepc的广谱性抗菌活性，为其作为抗病原微生物新药物和动物饲料添加剂的开发奠定了基础。

本发明根据拟穴青蟹抗菌肽scygonadin的cDNA序列和大黄鱼抗菌肽hepcidin的cDNA序列特征，构建真核重组表达载体pPIC9K-scy/hepc，Sac I线性化后，转化毕赤酵母GS115菌株，诱导表达并纯化获得Scy-hepc的重组蛋白，鉴定重组蛋白抗菌活性，研究发现Scy-hepc蛋白具有高效抗菌活性：对被测革兰氏阳性菌如藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌和金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌如嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和施氏假单胞菌等具有明显抑制生长作用和杀菌作用。其中，对水产致病菌嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌具有较强的抗菌活性(MIC1.6～3.2μM)。

Claims (9)

1.两种海洋动物抗菌肽基因，其特征在于包括拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因、连接肽和大黄鱼抗菌肽hepcidin基因；所述两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物命名为Scy-hepc。

2.如权利要求1所述的两种海洋动物抗菌肽基因，其特征在于拟穴青蟹阴离子抗菌肽scygonadin基因序列为：

ggccaggcac tcaacaaact tatgcctaaa atcgtcagcg ccataattta tatggtcggg     60

caacccaatg caggtgtcac ttttctgggc caccaatgtc tggtggagtc aacgaggcaa    120

ccagacgggt tttacaccgc aaagatgtcg tgtgcttcct ggactcatga taatcctatt    180

gttggggaag gaagaagccg ggttgaactt gaggcgctta aaggttccat cacaaacttt    240

gtccagacag catccaatta caagaagttc accatagatg aggtcgagga ctggattgct    300

tcttac                                                               306。

3.如权利要求1所述的两种海洋动物抗菌肽基因，其特征在于所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因序列为：

gtcccagcca atgaagagca agagctggag cagcaaattt attttgctga tccagagatg     60

ccagtggaat catgcaagat gccgtattac atgcgtgaga atcgtcaggg cagccctgct    120

agatgcaggt tttgctgccg ttgctgtcct agaatgaggg gatgtggtat ctgctgcagg    180

ttc                                                                  183。

4.如权利要求1所述的两种海洋动物抗菌肽基因，其特征在于所述连接肽的氨基酸序列为：

Gly Gly Pro Gly Ser Gly

1               5。

5.如权利要求1所述的两种海洋动物抗菌肽基因，其特征在于所述抗菌肽scygonadin和hepcidin基因的真核融合表达产物的氨基酸序列为：

Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile

1               5                   10                  15

Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala Gly Val Thr Phe Leu Gly His Gln

            20                  25                  30

Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys

        35                  40                  45

Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His Asp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly

    50                  55                  60

Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe

65                  70                  75                  80

Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu

                85                  90                  95

Asp Trp Ile Ala Ser Tyr Gly Gly Pro Gly Ser Gly Val Pro Ala Asn

            100                 105                 110

Glu Glu Gln Glu Leu Glu Gln Gln Ile Tyr Phe Ala Asp Pro Glu Met

        115                 120                 125

Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met Arg Glu Asn Arg Gln

    130                 135                 140

Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg Cys Cys Pro Arg Met

145                 150                 155                 160

Arg Gly Cys Gly Ile Cys Cys Arg Phe

                165。

6.如权利要求1所述的两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别PCR扩增拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因和大黄鱼抗菌肽hepcidin基因，重叠PCR法获得联合多肽Scy-hepc的目的基因片段；

2)将步骤1)所得的融合基因Scy-hepc导入表达载体，构建携带融合基因Scy-hepc的重组表达载体；

3)将步骤2)所得的重组表达载体转入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

4)分离纯化步骤3)所得的表达产物，获得重组蛋白，即联合多肽Scy-hepc。

7.如权利要求6所述的两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述表达载体选用pPIC9K。

8.如权利要求6所述的两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115菌株。

9.如权利要求6所述的两种海洋动物抗菌肽基因的真核融合表达产物的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述分离纯化的方法为：先将重组表达产物进行离心，收集发酵上清液，透析后，再进行亲和层析。

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