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CN113185594B - 一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原、抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN113185594B CN202110464125.XA CN202110464125A CN113185594B CN 113185594 B CN113185594 B CN 113185594B CN 202110464125 A CN202110464125 A CN 202110464125A CN 113185594 B CN113185594 B CN 113185594B
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Abstract

本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原、抗体及其制备方法和应用，属于重组蛋白制备技术领域。一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原，所述免疫抗原为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区。一种抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗体，由所述免疫抗原免疫动物得到。本发明首次成功通过转染细胞的方式免疫小鼠制备抗柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白EtAQP2多克隆抗体，填补了目前市场上柔嫩艾美耳球虫EtAQP2抗体的空白，为柔嫩艾美耳球虫基因的功能鉴定和疫苗的研发奠定基础。

Description

一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原、抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于重组蛋白制备技术领域，具体涉及一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)属于顶复器门、类锥体纲、艾美耳科、艾美耳属(Eimeria)，是原虫中的一类，广泛寄生于两栖动物至哺乳动物。艾美耳球虫在畜牧业养殖中是最重要的病原之一，可导致禽、兔、猪、牛、羊等养殖业的重大经济损失。目前球虫病的预防和治疗仍然以抗球虫药物为主，然而长时间使用抗球虫药物，使鸡球虫对大多数抗球虫药物产生了抗药性，且药物在家禽体内的残留蓄积，引起食品安全问题并受到广泛关注。因此，球虫病的防控仍需发现新的药物靶标和新型高效药物，新药研发的基础可以基于对球虫的营养物质转运及生物化学代谢途径、以及药物靶标的生物学和有效性进行深入了解。
水孔蛋白是广泛存在于生物体内的水通道蛋白(aquaporins；AQP)，属于主要内在膜蛋白家族(Major Intrinsic Protein；MIP)，在生物体中起到调节水通透性，参与寄生虫渗透压适应、营养物质转运及代谢废物排出等重要过程。研究显示，在布氏锥虫和弓形虫中，水孔蛋白还参与抗寄生虫药物向虫体内的转运。根据这一特性，增加水孔蛋白对药物的通透性可以使抗寄生虫药物在虫体内快速大量富集，从而发挥抗寄生虫感染的作用。然而，目前还没有利用水孔蛋白制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物或相关生物制品的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原及其制备方法，所述免疫抗原能够免疫产生与抗柔嫩艾美耳球虫有较强特异性结合能力的多克隆抗体。
本发明提供了一种抗柔嫩艾美耳球虫的EtAQP2抗体和应用，与抗柔嫩艾美耳球虫具有较强特异性结合能力，为研究柔嫩艾美耳球虫基因的功能和疫苗研发奠定基础。
本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原，所述免疫抗原为柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区；
所述柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了所述柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)将柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区的编码基因克隆至哺乳动物表达载体中，得到重组表达载体；
2)将所述重组表达载体转染真核细胞，培养，诱导表达，得到柔嫩艾美尔球虫的免疫抗原。
优选的，所述哺乳动物表达载体的多克隆位点为BglII/SalI。
优选的，所述哺乳动物表达载体为pDisplay。
本发明提供了所述柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原或所述制备方法制备的免疫抗原在制备防控柔嫩艾美耳球虫感染的疫苗中的应用。
本发明提供了一种抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗体，由所述免疫抗原或所述制备方法制备的免疫抗原免疫动物得到。
本发明提供了一种基于免疫检测技术检测柔嫩艾美耳球虫的试剂盒，包括所述多克隆抗体。
优选的，所述免疫检测技术包括胶体金免疫检测、免疫沉淀检测、荧光免疫检测和/或酶联免疫检测。
本发明提供了所述多克隆抗体在制备检测、鉴定或定位柔嫩艾美耳球虫的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原，本发明将SEQ ID NO:1 所示的柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区进行重组表达，得到的重组蛋白免疫动物后得到的抗血清能够产生与柔嫩艾美耳球虫以及重组柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2发生特异性结合，说明血清中含有与免疫抗原特异性结合能力的抗体。
本发明提供的多克隆抗体，填补了目前市场上柔嫩艾美耳球虫EtAQP2 抗体的空白，为柔嫩艾美耳球虫基因的功能鉴定和体外诊断试剂的研发奠定基础。
附图说明
图1为EtAQP2蛋白跨膜区的预测图；
图2为重组质粒pDisplay-EtAQP2-ECD的双酶切产物电泳图；其中M：DL10000相对分子质量标准；1：质粒pDisplay-EtAQP2-ECD酶切前；2：质粒pDisplay-EtAQP2-ECD使用BglII和SalI双酶切后；
图3为重组EtAQP2-ECD转染L929细胞后的免疫印迹实验图，使用的是标签HA抗体；其中M:蛋白质Marker；1：对照(未转染细胞)；2-6：转染后的细胞，大小在15KDa～25KDa之间，符合预期大小；
图4为重组EtAQP2-ECD转染L929细胞后的荧光显微镜检测，使用的是标签HA抗体和标签Myc抗体；其中图4A为HA标签抗体在未转染的 L929细胞中未检测到免疫荧光；图4B为HA标签抗体在L929细胞的细胞膜表面有明显特异性定位；图4C为MYC标签抗体在未转染的L929细胞中未检测到免疫荧光；图4D为MYC标签抗体在L929细胞的细胞膜表面有明显特异性定位；
图5为抗EtAQP2高免血清与L929细胞的细胞膜表面的特异性定位结果，一抗抗EtAQP2分别进行1:100和1:1000的稀释；
图6为间接免疫荧光对EtAQP2的虫体定位图，在虫体的整个表面发射绿色荧光。
具体实施方式
本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原，所述免疫抗原为柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区；所述柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区的氨基酸序列如SEQ IDNO:1(MYGSFAVGGEATAFLNPAVALGVNVARG VSGGPTDEVGLAFFAAASSSGAAALASGDWKTSLGAAFAAFFKTGTFPD P)所示。所述柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区的编码基因具有如核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ATGTACGGGAGCTTCGCAGTGGGGGGCGAA GCCACGGCCTTTCTGAACCCCGCAGTGGCCCTGGGCGTGAACGTCGCG CGGGGGGTCTCGGGGGGCCCCACGGACGAGGTTGGCCTCGCCTTCTTC GCTGCTGCTAGCAGCAGCGGCGCTGCAGCGCTCGCCTCCGGCGACTG GAAGACTTCTCTCGGAGCTGCTTTCGCCGCTTTTTTCAAAACGGGAAC TTTCCCAGACCCC)所示。
本发明提供了所述柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)将柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区的编码基因克隆至哺乳动物表达载体中，得到重组表达载体；
2)将所述重组表达载体转染真核细胞，培养，诱导表达，得到柔嫩艾美尔球虫的免疫抗原。
本发明将柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区的编码基因克隆至哺乳动物表达载体中，得到重组表达载体。
在本发明中，所述哺乳动物表达载体的多克隆位点优选为BglII/SalI。所述哺乳动物表达载体优选为pDisplay。所述pDisplay包含HA标签和myc表位，载体pDisplay的特点在于可以将相应的蛋白质引导至分泌途径并将其锚定在细胞质膜上。本发明对所述克隆的方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的克隆方法即可，例如酶切、连接、鉴定等。
得到重组表达载体，本发明将所述重组表达载体转染真核细胞，培养，得到柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原。
本发明对所述转染的方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的转染方法即可，例如利用转染试剂lipo2000进行转染。
在本发明中，培养后，优选对表达效果进行鉴定。所述鉴定的方法优选使用抗HA标签抗体通过蛋白质印迹法评估所得蛋白质(pDis-EtAQP2-ECD) 的表达，并使用HA标签抗体和Myc标签抗体通过荧光显微镜检测红色荧光蛋白的表达。当检测结果HA标签抗体在L929细胞的细胞膜表面有明显特异性定位，同时MYC标签抗体在L929细胞的细胞膜表面有明显特异性定位，这表明柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区在细胞膜表面有特异性定位，成功表达免疫抗原，且该免疫抗原表达在哺乳动物细胞膜表面。
鉴于所述免疫抗原能够免疫动物产生抗血清，经检测所述抗血清中具有与柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2或柔嫩艾美耳球虫特异性结合的多克隆抗体，本发明提供了所述柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原或所述制备方法制备的免疫抗原在制备防控柔嫩艾美耳球虫感染的疫苗中的应用。
本发明提供了一种抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗体，由所述免疫抗原或所述制备方法制备的免疫抗原免疫动物得到。
本发明对所述免疫动物的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的免疫动物方法即可。所述动物优选为小鼠。每只小鼠免疫剂量优选为3×104个细胞。所述免疫的时间包括3次免疫，每次免疫间隔优选7d。所述多克隆抗体与抗原的结合特异性优选采用间接免疫荧光法进行，具体包括以下步骤：将重组表达有EtAQP2-ECD蛋白的细胞进行固定，洗涤、封闭，洗涤，添加鼠源多克隆抗体，孵育，洗涤，加荧光标记的山羊抗鼠抗体孵育，洗涤，荧光观察。抗EtAQP2高免血清在虫体的表面发射绿色荧光，而阴性血清不能识别柔嫩艾美耳球虫子孢子。说明制备的抗EtAQP2高免血清可以与柔嫩艾美尔球虫的膜蛋白EtAQP2特异性结合。
本发明提供了一种基于免疫检测技术检测柔嫩艾美耳球虫的试剂盒，包括所述多克隆抗体。所述免疫检测技术优选包括胶体金免疫检测、免疫沉淀检测、荧光免疫检测和/或酶联免疫检测。所述免疫检测技术的原理优选包括竞争法、夹心法或间接法等。
基于本发明实验结果证明高免血清与重组EtAQP2-ECD蛋白的特异性，本发明提供了所述多克隆抗体在制备检测、鉴定或定位柔嫩艾美耳球虫的试剂或试剂盒中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗柔嫩艾美耳球虫的EtAQP2抗体及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
柔嫩艾美耳球虫EtAQP2多抗的制备
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞与实验动物
L929细胞(小鼠成纤维细胞)，BALB/c鼠，1日龄黄雏鸡，饲养于无球虫环境中。
1.1.2实验试剂
pDisplay载体和L929细胞均由本实验室自行保存，DH5α感受态购自北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶BglII和SalI购自NEB公司，标签HA单克隆抗体、Myc单克隆抗体、FITC标记的山羊抗鼠IgG、Alexa fluor594山羊抗鼠抗体均购自Abcam，转染试剂lipo2000购自invitrogen。
1.2方法
1.2.1柔嫩艾美耳球虫EtAQP2蛋白跨膜区的预测
EtAQP2蛋白在胞膜结构示意图见图1，TMHMM预测结果显示EtAQP2 含有7个跨膜区，4个胞内区和4个胞外区。EtAQP2蛋白的胞外区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：MYGSFAVGGEATAFLNPAVALGVNVARGVSG GPTDEVGLAFFAAA SSSGAAALASGDWKTSLGAAFAAFFKTGTFPD (SEQ ID NO:1)。
EtAQP2蛋白的胞外区DNA序列如SEQ ID NO:2所示：
ATGTACGGGAGCTTCGCAGTGGGGGGCGAAGCCACGGCCTTTCTG AACCCCGCAGTGGCCCTGGGCGTGAACGTCGCGCGGGGGGTCTCGGG GGGCCCCACGGACGAGGTTGGCCTCGCCTTCTTCGCTGCTGCTAGCAG CAGCGGCGCTGCAGCGCTCGCCTCCGGCGACTGGAAGACTTCTCTCGG AGCTGCTTTCGCCGCTTTTTTCAAAACGGGAACTTTCCCAGACCCC (SEQ ID NO:2)。
1.2.2人工合成EtAQP2膜外区并构建质粒pDisplay-EtAQP2-ECD
使用限制性内切酶BglII和SalI对构建的重组质粒pDisplay-EtAQP2-ECD进行双酶切鉴定。双酶切体系为质粒DNA 10μl、BglII 1μl、SalI:1μl、NEBuffer 3.1(10×)2μl、ddH2O 6μl，混匀做好标记，37℃水浴2h，70℃水浴10min中止反应。电泳检测酶切效果。
重组质粒鉴定成功后，转化DH5α感受态中，涂板37℃倒置过夜后，挑单菌落于液体LB培养基中，提取质粒，测其浓度与纯度备用。
质粒pDisplay-EtAQP2-ECD的双酶切鉴定电泳图如图2所示，与泳道1 完整的质粒相比，泳道2通过限制性内切酶BglII和SalI切割后呈2条带，其中目的DNA的大小为250bp左右。
1.2.3L929细胞的培养与转染
L929细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM basic培养基中，以3×106/ 板的密度接种在6cm细胞培养板上，使其在转染时密度达到90％左右，转染时DNA与转染试剂lipo2000的比例为1:2。对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基稀释1μg DNA，混匀；使用50μl无血清培养基稀释2μl脂质体核酸转染试剂，室温孵育5min，在30min内同稀释的DNA混合，保温时间过长会降低活性。将稀释的DNA和稀释的脂质体核酸转染试剂(总体积 100μl)轻轻混匀，并在室温15-25℃孵育20min，使得DNA-脂质体复合物形成。将其复合物加入到细胞培养板每个孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在 37℃，5％培养箱培养24-48h，进行转基因表达分析。
使用通用引物T7测序结果表明，EtAQP2胞外区已整合到质粒pDisplay 中，没有碱基突变，EtAQP2胞外区的编码基因如SEQ ID NO：3所示，具体序列如下：GAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACG GTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTAT CCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCACTGGTTCTTTCCGCCTC AGAAGCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCC CAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCCAGAATAGAAT GACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAG GACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAG GGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGCTGA TCTCGAGCGGCCGCCTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCATGATGAGG ATGATAAGGGAGATGATGGTGAGCACCACCAGGGCCAGGATGGCTGA GATCACCACCACCTTAAAGGGCAAGGAGTGTGGCACCACGATGACCTC CTGCGTGTCCTGGCCCACAGCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTT TGTTCGTCGACAGGATCAGGAAATGTGCCCGTCTTGAAGAATGCTGCA AATGCTGCTCCAAGGGAAGTCTTCCAATCTCCTGATGCAAGTGCTGCT GCTCCTGATGATGATGCGGCCGCGAAGAATGCAAGTCCCACTTCATCT GTAGGTCCTCCTGACACTCCTCTTGCCACGTTCACTCCAAGTGCCACT GCAGGGTTAAGAAATGCTGTTGCTTCTCCTCCCACTGCAAATGATCCAT ACATAGATCTGGCCGGCTGGGCCCCAGCATAATCTGGAACATCATATGG ATAGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTGGATATCCCCAAGCCGAATTCCAGCACA CTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTGGGTCT CCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGTAAGCAGTGGGTTC TCTAGTTAGCCAGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGC CTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAA AGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATGG GGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCAT TGATGTACTGCCAAAACCGCATCACCATGGTAATAGCGATGACTAATAC GTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCATGTACTGGGC ATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTA CTTGGCATATGATACACTTGATGGACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTA AATACTCCACCCATTGACGTCAATGG。
1.2.4Western-Blotting方法检测EtAQP2-ECD表达情况
(1)将上述转染成功的细胞用细胞刮轻轻刮下，使用Minute TM质膜蛋白和细胞组分分离试剂盒提取细胞的总膜蛋白，加入蛋白上样缓冲液沸水加热10min变性，静置为室温后进行SDS-PAGE，按照胶的大小裁剪一张硝酸纤维素膜，在湿转缓冲液中浸湿，在转膜夹子的阴极依次放入滤纸，硝酸纤维素膜，SDS-PAGE凝胶，滤纸。每层都注意赶尽气泡，接通电源，调至恒流200mA，转膜3h左右。
(2)转膜结束后打开胶板取出硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉进行封闭，室温封闭1h或4℃过夜。
(3)标签HA一抗浓度为1：1000，用一抗稀释液稀释，室温1h或4℃过夜孵育。加入PBST洗膜3次，每次10min。
(4)二抗HRP标记的山羊抗鼠浓度为1:6000，用封闭缓冲液进行稀释，室温1h孵育。加入PBST洗膜5次，每次10min。
(5)取反应底物A、B液各500μl，混合均匀，滴在平摊的保鲜膜上，将硝酸纤维素膜覆盖在底物上，注意不要有气泡，放置3-5min。进行扫膜。
使用标签HA抗体，结果如图3所示，M:蛋白质Marker；1：对照(未转染细胞)；2-6：转染后的细胞，大小在15KDa～25KDa之间，符合预期大小，说明EtAQP2-ECD在L929细胞中成功得以表达。
1.2.5L929细胞转染pDisplay-EtAQP2-ECD质粒的荧光显微镜检测
将转染成功后的细胞用PBS-4％多聚甲醛固定20min，用PBS洗净后分别与标签抗体HA/myc37℃孵育1h，用PBS冲洗三次后，将细胞与Alexa fluor594山羊抗鼠抗体(Invitrogen)一起37℃孵育1h，然后PBS洗三次。采用荧光显微镜观察并获取图像。
L929细胞转染pDisplay-EtAQP2-ECD质粒的荧光显微镜检测结果如图4 所示，图4A可见HA标签抗体在未转染的L929细胞中未检测到免疫荧光；图4B可见HA标签抗体在L929细胞的细胞膜表面的特异性定位；图4C可见MYC标签抗体在未转染的L929细胞中未检测到免疫荧光；图4D可见 MYC标签抗体在L929细胞的细胞膜表面的特异性定位，因此，与未转染的细胞相比，标签HA抗体和MYC抗体在L929细胞的细胞膜表面均有特异性定位，说明EtAQP2-ECD在L929细胞中成功得以表达，并表达在细胞膜表面。
实施例2
收集实施例1制备的细胞膜表面表达EtAQP2-ECD的L929细胞，计数并免疫BALB/c鼠，使用CPG佐剂，每只小鼠免疫3×104个细胞，第14天和第21天以同样的方式加强免疫，收取高免血清。
实施例3
抗EtAQP2高免血清的鉴定
利用间接免疫荧光进行检测。包括：将转染pDisplay-EtAQP2-ECD质粒的L929细胞用PBS-4％多聚甲醛固定20min，PBS洗3次，用10％的BSA-PBS 液进行封闭，37℃孵育1h，PBS洗3次，每次5min；将收集实施例2制备的鼠抗EtAQP2高免血清分别进行1:100和1:1000稀释，同时稀释阴性血清作对照，37℃孵育1h；PBS洗3次，每次5min；将细胞与Alexa fluor594山羊抗鼠抗体一起37℃孵育1h，PBS洗三次；滴加10μg/ml的DAPI工作液，室温下避光复染15min。PBS洗3次；用LeicaTCS SP2AOBS激光共聚焦荧光显微镜，观察拍照。
抗EtAQP2高免血清的鉴定结果如图5所示，将获得的抗EtAQP2高免血清分别进行1:100和1:1000稀释，与阴性血清相比，抗EtAQP2在L929 细胞的细胞膜表面有明显的特异性定位，说明获得的高免血清能够与重组 EtAQP2-ECD蛋白特异性结合，制备EtAQP2抗体成功。
实施例3
间接免疫荧光对EtAQP2的虫体定位
收集柔嫩艾美耳球虫卵囊，提取子孢子，用上述同样的方法进行间接免疫荧光实验，即子孢子作为包被抗原被固定后进行间接免疫荧光检测，其中一抗为鼠抗EtAQP2，浓度为1:1000，二抗为FITC标记的山羊抗鼠，浓度为1:2000。
本发明对所述柔嫩艾美耳球虫的子孢子的获取方法没有特殊限定，采用常规获取方法即可，本发明对所述柔嫩艾美耳球虫的来源没有特殊限定，采用常规来源即可。
间接免疫荧光对EtAQP2的虫体定位结果如图6所示，抗EtAQP2高免血清在虫体的表面发射绿色荧光，而阴性血清不能识别柔嫩艾美耳球虫子孢子。说明制备的抗EtAQP2高免血清可以与柔嫩艾美耳球虫的膜蛋白EtAQP2 特异性结合。验证了本发明制备的多克隆抗体Anti-EtAQP2成功获得并有极好的特异性。
本发明首次成功通过转染细胞的方式免疫小鼠制备柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白EtAQP2多克隆抗体，填补了目前市场上柔嫩艾美耳球虫EtAQP2 抗体的空白，为柔嫩艾美耳球虫基因的功能鉴定和疫苗的研发奠定基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原、抗体及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Tyr Gly Ser Phe Ala Val Gly Gly Glu Ala Thr Ala Phe Leu Asn
1 5 10 15
Pro Ala Val Ala Leu Gly Val Asn Val Ala Arg Gly Val Ser Gly Gly
20 25 30
Pro Thr Asp Glu Val Gly Leu Ala Phe Phe Ala Ala Ala Ser Ser Ser
35 40 45
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Ser Gly Asp Trp Lys Thr Ser Leu Gly Ala
50 55 60
Ala Phe Ala Ala Phe Phe Lys Thr Gly Thr Phe Pro Asp Pro
65 70 75
<210> 2
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtacggga gcttcgcagt ggggggcgaa gccacggcct ttctgaaccc cgcagtggcc 60
ctgggcgtga acgtcgcgcg gggggtctcg gggggcccca cggacgaggt tggcctcgcc 120
ttcttcgctg ctgctagcag cagcggcgct gcagcgctcg cctccggcga ctggaagact 180
tctctcggag ctgctttcgc cgcttttttc aaaacgggaa ctttcccaga cccc 234
<210> 3
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 60
ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 120
cactggttct ttccgcctca gaagccatag agcccaccgc atccccagca tgcctgctat 180
tgtcttccca atcctccccc ttgctgtcct gccccacccc accccccaga atagaatgac 240
acctactcag acaatgcgat gcaatttcct cattttatta ggaaaggaca gtgggagtgg 300
caccttccag ggtcaaggaa ggcacggggg aggggcaaac aacagatggc tggcaactag 360
aaggcacagt cgaggctgat ctcgagcggc cgcctaacgt ggcttcttct gccaaagcat 420
gatgaggatg ataagggaga tgatggtgag caccaccagg gccaggatgg ctgagatcac 480
caccacctta aagggcaagg agtgtggcac cacgatgacc tcctgcgtgt cctggcccac 540
agcattcaga tcctcttctg agatgagttt ttgttcgtcg acaggatcag gaaatgtgcc 600
cgtcttgaag aatgctgcaa atgctgctcc aagggaagtc ttccaatctc ctgatgcaag 660
tgctgctgct cctgatgatg atgcggccgc gaagaatgca agtcccactt catctgtagg 720
tcctcctgac actcctcttg ccacgttcac tccaagtgcc actgcagggt taagaaatgc 780
tgttgcttct cctcccactg caaatgatcc atacatagat ctggccggct gggccccagc 840
ataatctgga acatcatatg gatagtcacc agtggaacct ggaacccaga gcagcagtac 900
ccatagcagg agtgtgtctg tctccatggt ggatatcccc aagccgaatt ccagcacact 960
ggcggccgtt actagtggat ccgagctcgg taccaagctt gggtctccct atagtgagtc 1020
gtattaattt cgataagcca gtaagcagtg ggttctctag ttagccagag agctctgctt 1080
atatagacct cccaccgtac acgcctaccg cccatttgcg tcaatggggc ggagttgtta 1140
cgacattttg gaaagtcccg ttgattttgg tgccaaaaca aactcccatt gacgtcaatg 1200
gggtggagac ttggaaatcc ccgtgagtca aaccgctatc cacgcccatt gatgtactgc 1260
caaaaccgca tcaccatggt aatagcgatg actaatacgt agatgtactg ccaagtagga 1320
aagtcccata aggtcatgta ctgggcataa tgccaggcgg gccatttacc gtcattgacg 1380
tcaatagggg gcgtacttgg catatgatac acttgatgga ctgccaagtg ggcagtttac 1440
cgtaaatact ccacccattg acgtcaatgg 1470

Claims (8)

1.一种柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原，其特征在于，所述免疫抗原为柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区；
所述柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将柔嫩艾美耳球虫水通道蛋白2的胞外区的编码基因克隆至哺乳动物表达载体中，得到重组表达载体；
2)将所述重组表达载体转染真核细胞，培养，诱导表达，得到柔嫩艾美耳球虫的免疫抗原。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述哺乳动物表达载体的多克隆位点为BglII/SalI。
4.根据权利要求2或3所述制备方法，其特征在于，所述哺乳动物表达载体为pDisplay。
5.一种抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述免疫抗原或权利要求2～4任意一项所述制备方法制备的免疫抗原免疫动物得到。
6.一种基于免疫检测技术检测柔嫩艾美耳球虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述多克隆抗体。
7.根据权利要求6所述基于免疫检测技术检测柔嫩艾美耳球虫的试剂盒，其特征在于，所述免疫检测技术包括胶体金免疫检测、免疫沉淀检测、荧光免疫检测和/或酶联免疫检测。
8.权利要求5所述多克隆抗体在制备检测、鉴定或定位柔嫩艾美耳球虫的试剂或试剂盒中的应用。
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