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CN113166707A - 集菌法 - Google Patents

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CN113166707A CN201980069907.4A CN201980069907A CN113166707A CN 113166707 A CN113166707 A CN 113166707A CN 201980069907 A CN201980069907 A CN 201980069907A CN 113166707 A CN113166707 A CN 113166707A
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Abstract

本发明提供一种操作简便且可高效地对微生物进行集菌的手段。即，一种标本中的选自由革兰氏阳性菌(其中，不包括支原体)、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法，其特征在于，向标本中添加选自由白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白及明胶组成的组中的一种以上的蛋白质，回收所得到的聚集体。

Description

集菌法
技术领域
本发明涉及微生物的集菌法。
背景技术
微生物污染是用于饮食品、药品、再生医疗等的试剂的重要管理指标之一。因此，已知有使用高压釜或过滤器进行灭菌从而避免微生物污染的方法。然而，在灭菌困难的情况下需要对它们进行无菌处理，最终检查无微生物污染。此外，即使实施了灭菌处理，也需要确认灭菌处理的效果足够充分。另一方面，即使混入了微量的极小的微生物，也很难准确地检测到。此外，当有大量标本时，对所有标本进行检测也不现实。因此，需要一种可有效地对微生物进行集菌或分离的方法。
例如，作为简便且高效地采集细胞的方法，已知将与细胞表面的糖结合的被称为MDP1的蛋白质用作聚集促进剂，其无需离心分离即可使细胞沉淀。并且，还报道了添加固定有抗体的颗粒等固体支撑物的方法(例如，参考专利文献1)。
此外，已知有添加微生物提取蛋白、且将细胞悬液的pH值调节为1至5从而使细菌聚集，从细菌悬液中分离出细菌细胞的方法(例如，参考专利文献2)。
然而，在专利文献1的方法中，MDP1是牛分歧杆菌(Mycobacterium Bovis，BCG)的蛋白质，存在提纯MDP1的过程繁杂的问题。此外，在专利文献2的方法中，微生物提取蛋白中不仅会混入各种蛋白质(包括DNAse、RNAse等酶)，还会混入DNA、RNA等掺杂物，有可能对集菌后的微生物检测造成影响，且在需要进一步调节细胞悬液的pH值的点上也较繁杂。
因此，寻求一种无需繁杂操作即可高效地对微生物进行集菌的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2010-104250号公报
专利文献2：日本特开昭50-135275号公报
发明内容
本发明要解决的技术问题
因此，本发明的技术问题在于提供一种操作简便且可高效地对微生物进行集菌的手段。
解决技术问题的技术手段
鉴于该状况，本申请的发明人为了解决所述技术问题反复进行了认真研究，结果发现通过向标本中添加选自特定的5种容易获得且结构等明确的蛋白质、优选进一步添加水不溶性载体，选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物高效地形成聚集体从而能够进行集菌，进而完成了本发明。
即，本发明涉及以下的[1]～[10]。
[1]一种标本中的选自由革兰氏阳性菌(其中，不包括支原体)、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法，其特征在于，向标本中添加选自由白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白及明胶组成的组中的一种以上的蛋白质，回收所得到的聚集体。
[2]根据所述[1]所述的方法，其为革兰氏阳性菌(其中，不包括支原体)和/或革兰氏阴性菌的集菌法。
[3]根据所述[1]或[2]所述的方法，其中，向标本中添加所述蛋白质后的pH值大于5.0且为11.0以下。
[4]根据所述[1]～[3]所述的方法，其中，标本为选自由无菌水、生理盐水、液体培养基、生物试剂、培养上清液、缓冲液及林格氏液组成的组中的液体标本。
[5]根据所述[1]～[4]中任一项所述的方法，其为革兰氏阳性菌的集菌法。
[6]根据所述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，革兰氏阳性菌为选自由葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、梭菌属、棒状杆菌属及芽孢杆菌属组成的组中的一种以上。
[7]根据所述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，革兰氏阳性菌为选自由金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及生孢梭菌组成的组中的一种以上。
[8]根据所述[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，进一步向标本中添加水不溶性载体。
[9]一种选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的测定方法，其特征在于，使通过所述[1]～[8]中任一项所述的方法进行了集菌的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行聚合酶链式反应。
[10]一种选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的测定方法，其特征在于，对通过所述[1]～[8]中任一项所述的方法进行了集菌的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行增菌。
发明效果
由于本发明的方法添加选自特定的5种容易获得且已知蛋白质中的蛋白质，因此与不添加时相比，可极高效地对选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行集菌。此外，通过使用本发明的方法，能够从标本中，对作为日本药局方(第十七次修订)4.06中规定的无菌试验法中需确认(validation)的供试菌株的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物有效地进行集菌。
此外，本发明的方法不需要根据检测日调整微生物，制备微生物蛋白或微生物提取蛋白，并且，不需要确认用于制备这些微生物所需的溶剂及试剂中未混入选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物，因此非常方便。
进一步，由于本发明的方法任意使用乳胶颗粒等水不溶性载体，因此即使是少量的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物，分离后的聚集体也不易扩散并同时易于用肉眼确认，从而容易去除通过集菌使菌沉淀后的上清液。
并且，由于本发明的方法损伤细菌的可能性小，因此能够对集菌后的细菌进行培养等，由此也能够使用培养后的菌落供试于其他试验。
并且，本发明的方法不会混入来自细胞的DNA、RNA、DNA水解酶、RNA水解酶及其他蛋白质，因此集菌后的核酸扩增反应操作变得容易。
具体实施方式
以下，以优选的实施方案为中心对本发明进行具体说明。另外，本发明并不受这些实施方案的任何限定。
在本发明中，“选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌”，是指分离并浓缩标本中所含有的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物。通过对选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行集菌，能够容易地进行后续实施的无菌试验。
本发明的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法是对通过向标本中添加选自由白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白及明胶组成的组中的一种以上的蛋白质而形成的聚集体进行回收的方法。
在本发明中，革兰氏阳性菌是指会被革兰氏染色且被染成靛蓝色或深紫色的细菌。革兰氏阳性菌通常是细胞壁厚、无外膜的菌，具有肽聚糖层厚的特征。革兰氏阳性菌根据形状可分为革兰氏阳性球菌及革兰氏阳性杆菌。另外，虽然出于方便而将支原体分类为革兰氏阳性菌，但其不具有细胞壁而不能进行革兰氏染色，因此并不包括在本发明中的革兰氏阳性菌中。
革兰氏阳性球菌包括葡萄球菌属[例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等]、肠球菌属[例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)等]、链球菌属[例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)等]等，但并不限定于此。
革兰氏阳性杆菌包括梭菌属[例如生孢梭菌(Clostridium sporogenes)等]、棒状杆菌属[例如肾棒状杆菌(Corynebacterium renale)等]、芽孢杆菌属[例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等]等，但并不限定于此。
这些革兰氏阳性菌中，优选以选自金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及生孢梭菌中的一种以上为对象。这些细菌是日本药局方(第十七次修订)4.06中规定的无菌试验法中需确认的供试菌株，通过实施本发明的集菌法，能够确保用于无菌试验的试剂的无菌性。
在本发明中，革兰氏阴性菌是指在革兰氏染色中由结晶紫引起的染色被洗去的细菌。革兰氏阴性菌通常具有被脂多糖类覆盖的外膜，具有肽聚糖层薄的细胞壁。革兰氏阴性菌根据形状可分为革兰氏阴性球菌及革兰氏阴性杆菌。
革兰氏阴性球菌包括奈瑟菌属[例如脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)等]、韦荣氏球菌属[小韦荣球菌(Veillonella parvola)等]，但并不限定于此。
革兰氏阴性杆菌包括埃希氏菌属[例如大肠杆菌(Echerichia coli)等]、沙门氏菌属[例如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)等]、肠杆菌属[例如阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等]、拟杆菌属[例如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)等]、假单胞菌属[例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)等]，但并不限定于此。
本发明的真菌包括念珠菌属[例如白念珠菌(Candida albicans)等]、曲霉属[例如巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)]等，但并不限定于此。
在本发明中，对于革兰氏阴性菌及真菌，即使不添加蛋白质也能进行集菌，但通过本发明的添加所述蛋白质的方法，能够进一步提高集菌效率。因此，能够从试样中对作为无菌试验中需确认的供试菌株的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌及巴西曲霉进行集菌，可用于确保该试剂的无菌性。
在本发明中，标本是指用于试验是否感染选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的试样，优选为液态。例如，作为标本，有水(无菌水、蒸馏水等)、生理盐水、液体培养基(例如用于培养真核细胞等细胞的培养基，例如，RPMI1640、DMEM、α-MEM、HANKS等)、生物试剂、培养上清液、缓冲液(例如调节为规定pH值的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、HEPPS缓冲液、TAPS缓冲液、磷酸缓冲液(PBS)等)、林格氏液等。标本也可以是细胞悬液上清液或培养细胞后的培养上清液。
本发明中使用的蛋白质是选自白蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、灵长类血清白蛋白、兔血清白蛋白、啮齿类血清白蛋白、马类血清白蛋白、山羊血清白蛋白、绵羊血清白蛋白、狗血清白蛋白、豚鼠血清白蛋白、鸡血清白蛋白、猪血清白蛋白等动物白蛋白)、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白(例如商品名称：Block Ace(DS Pharma BiomedicalCo.，Ltd.制造))及明胶中的一种以上。从在对选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物集菌后进行PCR(聚合酶链式反应)时避免混入菌的角度出发，优选使用无菌的蛋白质。这些蛋白质可以使用一种或组合使用两种以上。
本发明的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法中，向标本中添加所述蛋白质并对所得到的聚集体进行回收。具体而言，首先，向离心管中加入标本及所述蛋白质。为了确保聚集，可以搅拌或放置任意时间(例如1秒～60分钟)。所得到的聚集体的回收例如可以通过离心分离而进行。离心分离中，离心力没有特别限定，例如为3,000～30,000G，优选为5,000～28,000G，更优选为14，000～25,000G。离心分离时间没有特别限定，例如为10秒～120分钟，优选为1分钟～60分钟，更优选为10分钟～30分钟。离心分离时的温度没有特别限定，例如为4～35℃，优选为7～30℃，更优选为10～25℃。通过进行离心分离，选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的聚集体沉淀在离心管下部。然后去除上清液，能够以残渣的形式得到选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的聚集体。根据需要，可以重复进行两次以上该离心分离及去除上清液的工序。
另外，为了获得所述聚集体，可以对标本任意实施物理处理和/或化学处理。作为物理处理，可列举出加热处理、超声波照射处理、冷冻、熔融处理等。作为化学处理，可列举出化学试剂处理，例如使用消化酶、表面活性剂、溶菌剂等的改性处理等。
所述蛋白质的用量只要是能使选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物充分聚集的量，则没有特别限定，例如相对于1ml标本优选为0.1～500mg，更优选为0.2～100mg，进一步优选为2～20mg。
标本中添加所述蛋白质后的pH值没有特别限定，以得到活菌为目的的情况下，优选为选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物不发生改性的范围，例如大于5.0且为11.0以下，更优选为5.1至10.0，进一步优选为6.0～8.0的范围，更进一步优选为6.8～7.4的范围。此外，例如能够在4～35℃、优选在7～30℃、更优选在10～25℃的条件下进行蛋白质的添加、以及选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的聚集体的回收。
在本发明中，除了所述蛋白质之外，还能够添加水不溶性载体。作为水不溶性载体，只要是能够通过与所述蛋白质同时使用而使选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物聚集的物质，则没有特别限定。例如可列举出聚苯乙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-(甲基)丙烯酸缩水甘油酯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯酯丙烯酸酯等的乳胶颗粒(例如有机高分子乳胶颗粒)、物理吸附用或经由羧基的化学键合用等的实施了处理加工的乳胶颗粒、着色纤维素颗粒、二氧化硅颗粒、金胶体颗粒等。就选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的聚集性这一点而言，优选上述水不溶性载体中的乳胶颗粒、特别优选有机高分子乳胶颗粒。通过添加水不溶性载体，能够分辨出离心分离后的菌体的聚集体，因此能够防止在去除上清液时去除菌体。
水不溶性载体的形状没有特别限定，但从使选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物充分聚集的角度出发，优选球形或近似球形。
水不溶性载体的粒径没有特别限定，但从可视性及实验的简便性出发，例如优选平均粒径为10～2,000nm，更优选为50～1,500nm，进一步优选为100～1,000nm。水不溶性载体的粒径例如可以使用电子显微镜(TEM)法测定。
水不溶性载体的用量只要是能够使选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物充分聚集的量，则没有特别限定，例如相对于1ml标本为0.0005～10mg，优选为0.001～1mg，进一步优选为0.002～0.1mg。
对于所述蛋白质与水不溶性载体的重量比，从选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的聚集性的点出发，例如优选所述蛋白质:水不溶性载体＝1:1～50,000:1，更优选为10:1～10,000:1，进一步优选为200:1～1,000:1。
本发明还涉及一种使含有通过上述方法进行了集菌的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的残渣进行聚合酶链式反应(PCR)，从而测定选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的方法。
该方法能够使用含有通过上述方法得到的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的聚集体的残渣，用市售的试剂盒(例如细菌DNA提取试剂盒(Mitsui Chemicals，Inc.制造)等)通过公知的方法进行DNA提取，通过公知的PCR法或其变形法(例如实时PCR)，用公知的条件进行选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的检测试验。此时，通过使用以选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的保守区域为对象的引物及探针，能够检测选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物，也可以使用以欲检测的微生物特有的区域为对象的引物及探针，由此鉴定选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物。
本发明还涉及一种针对标本，含有所述蛋白质、优选进一步含有水不溶性载体的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌用试剂盒。该试剂盒所含的蛋白质及水不溶性载体如上所述。该试剂盒中也可以适当地增添对上述操作进行说明的手册。
本发明进一步能够在保持作为集菌对象的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的增殖能力的状态下进行集菌，因此能够将已进行了集菌的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物用于各种检测。也能够将已进行了集菌的例如选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物接种于平板培养基、液体培养基等进行增菌，用于已进行了集菌的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的数量测定、生化检验等鉴定试验、或者药物敏感性试验等。
实施例
下面列举实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不受这些实施例的任何限制。
实施例1蛋白质和水不容性载体所带来的集菌效果
使用羊血琼脂培养基(商品名称：Nissui plate羊血琼脂培养基，NissuiPharmaceutical Co.，Ltd.制造)，将预培养的金黄色葡萄球菌(S.aureus)混悬于生理盐水中，制备浊度为1.0麦氏单位(McFarland 1.0)的菌悬液。然后，以将菌悬液稀释103倍后的稀释液为稀释菌液，将0.1ml的稀释菌液添加至24.9ml的生理盐水中。并向其中添加350μl的30％(w/v)BSA溶液(来自牛血清的BSA溶液，不含脂肪酸，Wako Pure ChemicalCorporation制造)及2.5μl的10％(w/v)乳胶溶液(粒径为315nm的聚苯乙烯类乳胶颗粒(IMMUTEX(注册商标，JSR Life Sciences，LLC制造)))。搅拌该溶液后，进行离心分离(20,000G、15分钟、10℃)，去除上清液，得到1ml的试验液。将该试验液稀释10倍后得到菌液，并将10μl该菌液接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，培养过夜(37℃，有氧条件)。另外，作为比较对象，将菌悬液稀释106倍后以100μl接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，其未进行集菌。
此外，使用细菌核酸DNA提取试剂盒(Mitsui Chemicals，Inc.制造)从试验液中提取DNA，使用Yeast-made Taq DNA聚合酶(Mitsui Chemi cals，Inc.制造)、正向引物：agagtttgatcMtggctcag(SEQ ID NO:1)、反向引物：ctttacgcccaRtRaWtccg(SEQ ID NO:2)、探针：6FAM-tNttaccgcggctgctggcacg-BHQ(SEQ ID NO:3)实施实时PCR。反应在95℃下进行5秒后，以95℃、5秒及60℃、30秒为一个循环，进行45个循环。
将培养试验的结果示于表1。
[表1]
Figure BDA0003033360630000101
由表1的结果可知，单独添加BSA时、以及组合添加BSA和乳胶时，与单独添加乳胶时或添加生理盐水时相比，表现出了与未集菌的数值相近的菌落数。因此，通过添加BSA能够有效地对作为革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌进行集菌。此外，通过在BSA的基础上添加乳胶，能够分辨出离心分离时的沉淀物，容易去除上清液。
接着，将PCR的结果示于表2。
[表2]
Figure BDA0003033360630000111
从表2的结果可知，在PCR中，单独添加BSA时、以及组合添加BSA和乳胶时，也表现出了与未浓缩的Cq值相近的值。因此，通过添加BSA并浓缩，能够充分地对作为革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌进行集菌。另一方面，添加生理盐水时或单独添加乳胶时，Cq值增高，集菌不充分。
实施例2革兰氏染色性与集菌效果的关系
使用羊血琼脂培养基(商品名称：Nissui Plate羊血琼脂培养基，NissuiPharmaceutical Co.，Ltd.制造)或巧克力琼脂培养基(商品名称：Nissui Plate巧克力琼脂培养基EXII，Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.制造)，将预培养的肾棒状杆菌(C.renale)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitis)及大肠杆菌(E.coli)混悬于生理盐水中，制备浊度为1.0麦氏单位的菌悬液。然后，以将菌悬液稀释103倍后的稀释液为稀释菌液，将0.1ml的稀释菌液添加至24.9ml的生理盐水中。并向其中添加350μl的30％(w/v)BSA溶液(不含脂肪酸，Wako Pure Chemical Corporation制造)。搅拌该溶液后，进行离心分离(20,000G、15分钟、10℃)，去除上清液，得到1ml的试验液。将把该试验液稀释10倍后的菌液(其中，肾棒状杆菌使用试验液)接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)或巧克力琼脂培养基(与所述巧克力琼脂培养基相同)，培养过夜(37℃，有氧条件)。此时，关于脑膜炎奈瑟菌，使用Anaero Pack·CO2(SUGIYAMA-GEN Co.，Ltd.制造)，在37℃的条件下进行培养。另外，作为比较对象，将菌悬液稀释106倍后以100μl接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，其未进行集菌。
此外，使用细菌DNA核酸提取试剂盒(Mitsui Chemicals，Inc.制造)从试验液中提取DNA，使用Yeast-made Taq DNA聚合酶(Mitsui Chemi cals，Inc.制造)、正向引物：agagtttgatcMtggctcag(SEQ ID NO:1)、反向引物：ctttacgcccaRtRaWtccg(SEQ ID NO:2)、探针：6FAM-tNttaccgcggctgctggcacg-BHQ(SEQ ID NO:3)实施实时PCR。反应在95℃下进行5秒后，以95℃、5秒及60℃、30秒为一个循环，进行45个循环。
将培养试验的结果示于表3。
[表3]
Figure BDA0003033360630000121
由表3的结果可知，作为革兰氏阳性杆菌的肾棒状杆菌在生理盐水中未能进行集菌，与之相比，通过添加BSA可进行集菌。另一方面，作为革兰氏阴性球菌的脑膜炎奈瑟菌及作为革兰氏阴性杆菌的大肠杆菌即使不添加BSA也能进行集菌，但通过添加BSA，集菌率得以提高。
下面，将PCR结果示于表4。
[表4]
Figure BDA0003033360630000131
由表4的结果可知，在PCR中，作为革兰氏阳性杆菌的肾棒状杆菌在添加了BSA时的Cq值也低于添加了生理盐水时。另一方面，作为革兰氏阴性球菌的脑膜炎奈瑟菌及作为革兰氏阴性杆菌的大肠杆菌在添加了BSA时的Cq值稍稍低于添加了生理盐水和未集菌时。
实施例3基于蛋白质种类的集菌效果
使用羊血琼脂培养基(商品名称：Nissui Plate羊血琼脂培养基，NissuiPharmaceutical Co.，Ltd.制造)，将预培养的金黄色葡萄球菌(S.aureus)混悬于生理盐水中，制备浊度为1.0麦氏单位的菌悬液。然后，以将菌悬液稀释103倍后的稀释液为稀释菌液，将0.1ml的稀释菌液添加至24.9ml的生理盐水中。并向其中分别添加350μl的30％(w/v)BSA溶液(不含脂肪酸，Wako Pure Chemical Corporation制造)、明胶或乳蛋白(商品名称：Block Ace，DS Pharma Biomedical Co.，Ltd.制造)。搅拌各溶液后，进行离心分离(20,000G、15分钟、10℃)，去除上清液，得到1ml的试验液。将把该试验液稀释10倍后的菌液接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，培养过夜(37℃，有氧条件)。另外，作为比较对象，将菌悬液稀释106倍后以100μl接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，其未进行集菌。
另外，使用细菌DNA核酸提取试剂盒(Mitsui Chemicals，Inc.制造)从试验液中提取DNA，使用Yeast-made Taq DNA聚合酶(Mitsui Chemi cals，Inc.制造)、正向引物：agagtttgatcMtggctcag(SEQ ID NO:1)、反向引物：ctttacgcccaRtRaWtccg(SEQ ID NO:2)、探针：6FAM-tNttaccgcggctgctggcacg-BHQ(SEQ ID NO:3)实施实时PCR。反应在95℃下进行5秒后，以95℃、5秒及60℃、30秒为一个循环，进行45个循环。
将培养试验的结果示于表5。
[表5]
Figure BDA0003033360630000141
由表5的结果可知，与添加了生理盐水时相比，单独添加了BSA、单独添加了乳蛋白(Block Ace)、单独添加了明胶时表现出与未集菌的数值相近的菌落数。
将PCR结果示于表6。
[表6]
Figure BDA0003033360630000142
由表6的结果可知，在PCR中，明胶也表现出与BSA同等的Cq值。因此作为蛋白质，不仅是在使用BSA时，在使用明胶时也能有效地对作为革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌进行集菌。
实施例4使用了水不溶性载体的集菌试验
使用羊血琼脂培养基(商品名称：Nissui Plate羊血琼脂培养基，NissuiPharmaceutical Co.，Ltd.制造)，将预培养的肾棒状杆菌(C.renale)及粪肠球菌(E.faecalis)分别混悬于生理盐水中，制备1.0麦氏单位的菌悬液。然后，以将菌悬液稀释103倍后的稀释液为稀释菌液，将0.1ml的稀释菌液添加至24.9ml的生理盐水中。并向其中添加350μl的30％(w/v)BSA溶液及作为水不溶性载体的2.5μl的10％(w/v)乳胶溶液。搅拌该溶液后，进行离心分离(20,000G、15分钟、10℃)，去除上清液，得到1ml的试验液。将该试验液稀释10倍后，以90μl接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，培养过夜(37℃，有氧条件)。另外，作为比较对象，将菌悬液稀释105倍后以100μl接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，其未进行集菌。
此外，使用细菌DNA核酸提取试剂盒(Mitsui Chemicals,Inc.制造)从试验液中提取DNA，使用Yeast-made Taq DNA聚合酶(Mitsui Chemi cals，Inc.制造)、正向引物：agagtttgatcMtggctcag(SEQ ID NO:1)、反向引物：ctttacgcccaRtRaWtccg(SEQ ID NO:2)、探针：6FAM-tNttaccgcggctgctggcacg-BHQ(SEQ ID NO:3)实施实时PCR。反应在95℃下进行5秒后，以95℃、5秒及60℃、30秒为一个循环，进行45个循环。
将培养试验的结果示于表7。
[表7]
Figure BDA0003033360630000151
由表7的结果可知，对作为革兰氏阳性杆菌的肾棒状杆菌进行集菌时，组合添加了BSA和乳胶时，回收率为未实施集菌的理论值的97％。另一方面，添加了生理盐水时，为理论值的0％。因此，组合添加了BSA和乳胶时，肾棒状杆菌的集菌率极高。
此外，对作为革兰氏阳性球菌的粪肠球菌进行集菌时，组合添加了BSA和乳胶时，回收率为未实施集菌的理论值的90％。另一方面，添加了生理盐水时，回收率为理论值的10％。因此可知由于BSA和乳胶的组合，粪肠球菌的集菌率极高。
并且，在任一试验中，通过在BSA的基础上添加乳胶，能够分辨出离心分离时的沉淀物，容易去除上清液。
下面，将PCR的结果示于表8。
[表8]
Figure BDA0003033360630000161
由表8的结果可知，在PCR中，组合添加了BSA和乳胶进行集菌时，也表现出与未实施集菌的理论值的Cq相近的值，集菌率充分。另一方面，仅添加了生理盐水时，Cq值增高，集菌不充分。
实施例5集菌时的pH值所带来的影响
使用羊血琼脂培养基(商品名称：Nissui Plate羊血琼脂培养基，NissuiPharmaceutical Co.，Ltd.制造)，将预培养的金黄色葡萄球菌(S.aureus)悬浮于生理盐水中，制备浊度为1.0麦氏单位的菌悬液。然后，以将菌悬液稀释103倍后的稀释液为稀释菌液，将0.1ml的稀释菌液分别添加至24.9ml的pH6.0、pH7.0、pH8.0的0.01M磷酸钠缓冲液中。并向其中添加350μl的30％(w/v)BSA溶液(来自牛血清的BSA溶液，不含脂肪酸，Wako PureChemical Corporation制造)。搅拌该溶液后，进行离心分离(20，000G、15分钟、10℃)，去除上清液，得到1ml的试验液。将该试验液稀释10倍后得到菌液，将10μl该菌液接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，培养过夜(37℃，有氧条件)。另外，作为比较对象，将菌悬液用生理盐水稀释106倍后以100μl接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，其未进行集菌。
此外，使用细菌DNA核酸提取试剂盒(Mitsui Chemicals，Inc.制造)从试验液中提取DNA，使用Yeast-made Taq DNA聚合酶(Mitsui Chemi cals，Inc.制造)、正向引物：agagtttgatcMtggctcag(SEQ ID NO:1)、反向引物：ctttacgcccaRtRaWtccg(SEQ ID NO:2)、探针：6FAM-tNttaccgcggctgctggcacg-BHQ(SEQ ID NO:3)实施实时PCR。反应在95℃下进行5秒后，以95℃、5秒及60℃、30秒为一个循环，进行45个循环。
将培养试验的结果示于表9。
[表9]
Figure BDA0003033360630000171
此外，测定3次添加BSA后的pH值。将测定结果与其平均值一同示于表10。
[表10]
Figure BDA0003033360630000172
由表9可知，添加BSA时，在pH6.0、pH7.0、pH8.0中的任一pH范围内，均能对作为革兰氏阳性球菌的金黄色葡萄球菌进行集菌，并可进行培养。另外，由表10的结果确认到，添加BSA后，pH值几乎没有变化。
下面，将PCR的结果示于表11。
[表11]
Figure BDA0003033360630000181
由表11的结果可知，向pH6.0、pH7.0、pH8.0的各磷酸钠缓冲液中添加BSA时，表现出了与未进行集菌时相近的Cq值。另一方面，添加了未添加BSA的标本液时，Cq值表现出比未进行集菌时更高的值，集菌不充分。
实施例6生孢梭菌的结果
使用羊血琼脂培养基(商品名称：Nissui Plate羊血琼脂培养基，NissuiPharmaceutical Co.，Ltd.制造)，将预培养的生孢梭菌(C.sporogenes)混悬于生理盐水中，制备浊度为1.0麦氏单位的菌悬液。然后，以将菌悬液稀释103倍后的稀释液为稀释菌液，将0.1ml的稀释菌液添加至24.9ml的生理盐水中。并向其中添加350μl的30％(w/v)BSA溶液(来自牛血清的BSA溶液，不含脂肪酸，Wako Pure Chemical Corporation制造)。搅拌该溶液后，进行离心分离(20,000G、15分钟、10℃)，去除上清液，得到1ml的试验液。将该试验液稀释10倍后得到菌液，将10μl该菌液接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，使用Aneromate-P(アネロメイト-P)“Nissui”(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.制造)培养过夜(37℃)。另外，作为比较对象，将菌悬液用生理盐水稀释106倍后以100μl接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养相同)，其未进行集菌。
此外，使用细菌DNA核酸提取试剂盒(Mitsui Chemicals,Inc.制造)从试验液中提取DNA，使用Yeast-made Taq DNA聚合酶(Mitsui Chemi cals,Inc.制造)、正向引物：agagtttgatcMtggctcag(SEQ ID NO:1)、反向引物：ctttacgcccaRtRaWtccg(SEQ ID NO:2)、探针：6FAM-tNttaccgcggctgctggcacg-BHQ(SEQ ID NO:3)实施实时PCR。反应在95℃下进行5秒后，以95℃、5秒及60℃、30秒为一个循环，进行45个循环。
将培养试验的结果示于表12。
[表12]
Figure BDA0003033360630000191
由表12的结果可知，对作为革兰氏阳性杆菌的生孢梭菌进行集菌时，添加了BSA时，回收率为未实施集菌的理论值的151％。另一方面，添加了生理盐水时，为理论值的57％。因此，组合添加BSA及乳胶时，生孢梭菌的集菌率极高。
下面，将PCR的结果示于表13。
[表13]
Figure BDA0003033360630000192
由表13的结果可知，在PCR中，添加BSA进行集菌时，也表现出与未实施集菌的理论值的Cq值相近的值，集菌率充分。另一方面，仅添加了生理盐水时，Cq值增高，集菌不充分。
实施例7酸性范围的pH所带来的影响
使用羊血琼脂培养基(商品名称：Nissui Plate羊血琼脂培养基，NissuiPharmaceutical Co.,Ltd.制造)，将预培养的金黄色葡萄球菌(S.aureus)混悬于生理盐水中，制备浊度为1.0麦氏单位的菌悬液。然后，以将菌悬液稀释103倍后的稀释液为稀释菌液，将0.1ml的稀释菌液分别添加至24.9ml的pH4.3的0.01M柠檬酸钠缓冲液中。并向其中添加350μl的30％(w/v)BSA溶液(来自牛血清的BSA溶液，不含脂肪酸，Wako Pure ChemicalCorporation制造)。搅拌该溶液后，进行离心分离(20,000G、15分钟、10℃)，去除上清液，得到1ml的试验液。将该试验液稀释10倍后得到菌液，将10μl该菌液接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，培养过夜(37℃、有氧条件)。另外，作为比较对象，将菌悬液用生理盐水稀释106倍后以100μl接种至羊血琼脂培养基(与所述羊血琼脂培养基相同)，其未进行集菌。
此外，使用细菌DNA核酸提取试剂盒(Mitsui Chemicals,Inc.制造)从试验液中提取DNA，使用Yeast-made Taq DNA聚合酶(Mitsui Chemi cals，Inc.制造)、正向引物：agagtttgatcMtggctcag(SEQ ID NO:1)、反向引物：ctttacgcccaRtRaWtccg(SEQ ID NO:2)、探针：6FAM-tNttaccgcggctgctggcacg-BHQ(SEQ ID NO:3)实施实时PCR。反应在95℃下进行5秒后，以95℃、5秒及60℃、30秒为一个循环，进行45个循环。
将培养试验的结果示于表14。
[表14]
Figure BDA0003033360630000201
此外，测定3次添加BSA后的pH值。将测定结果与其平均值一同示于表15。
[表15]
Figure BDA0003033360630000202
由表14可知，无论是否添加BSA，只要是pH4.3的pH值范围，均能对作为革兰氏阳性球菌的金黄色葡萄球菌进行集菌。另外，由表15的结果确认到，添加BSA后，pH值几乎没有变化。
下面，将PCR的结果示于表16。
[表16]
Figure BDA0003033360630000211
由表16的结果可知，无论是否添加BSA，pH4.3的柠檬酸钠缓冲液均表现出与未进行集菌时相近的Cq值。
实施例8白念珠菌的集菌
将两个BioBall550(商品名称：BioBall550，bioMérieux Japan Ltd.制造)添加到25ml的生理盐水中，制备相当于1100CFU/25ml的菌悬液。然后添加350μl的30％(w/v)BSA溶液(来自牛血清的BSA溶液，不含脂肪酸，Wako Pure Chemical Corporation制造)及作为水不溶性载体的2.5μl的10％(w/v)乳胶溶液。搅拌该溶液后，进行离心分离(20,000G、15分钟、10℃)，去除上清液，得到1ml的试验液。将100μl该试验液接种至羊血琼脂培养基(商品名称：Nissui Plate羊血琼脂培养基，Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd.制造)，培养过夜(37℃、有氧条件)。
将培养试验的结果示于表17。
[表17]
Figure BDA0003033360630000212
由表17的结果可知，对作为显示革兰氏阳性的真菌的白念珠菌进行集菌时，添加了BSA及乳胶时，回收率为理论值的80.5％，比加入生理盐水时的65.9％更加优异。
<110> 日水制药株式会社（Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.）
<120> 集菌法
<130> KHP212110207.6
<150> JP2018-200476
<151> 2018-10-25
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
ctttacgccc artrawtccg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> 尚未归类的特征（misc_feature）
<222> (1)..(1)
<223> 6FAM-dt
<220>
<221> 尚未归类的特征（misc_feature）
<222> (2)..(2)
<223> n 为 a, c, g, 或 t
<220>
<221> 尚未归类的特征（misc_feature）
<222> (22)..(22)
<223> dg-BHQ
<400> 3
nnttaccgcg gctgctggca cn 22

Claims (10)

1.一种标本中的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法，其特征在于，向标本中添加选自由白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白及明胶组成的组中的一种以上的蛋白质，回收所得到的聚集体，所述革兰氏阳性菌不包括支原体。
2.根据权利要求1所述的集菌法，其为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的集菌法，所述革兰氏阳性菌不包括支原体。
3.根据权利要求1或2所述的集菌法，其中，向标本中添加所述蛋白质后的pH值大于5.0且为11.0以下。
4.根据权利要求1～3所述的集菌法，其中，标本为选自由无菌水、生理盐水、液体培养基、生物试剂、培养上清液、缓冲液及林格氏液组成的组中的液体标本。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的集菌法，其为革兰氏阳性菌的集菌法。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的集菌法，其中，革兰氏阳性菌为选自由葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、梭菌属、棒状杆菌属及芽孢杆菌属组成的组中的一种以上。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的集菌法，其中，革兰氏阳性菌为选自由金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及生孢梭菌组成的组中的一种以上。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的集菌法，其中，进一步向标本中添加水不溶性载体。
9.一种选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的测定方法，其特征在于，使通过权利要求1～8中任一项所述的方法进行了集菌的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行聚合酶链式反应。
10.一种选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的测定方法，其特征在于，对通过权利要求1～8中任一项所述的方法进行了集菌的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行增菌。
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