CN113136389A - 基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体而言，涉及基因GhCLCg‑1A和/或GhCLCg‑1D的基因工程应用，特别是基因GhCLCg‑1A和/或GhCLCg‑1D在调节植物细胞中Cl^‑和/或Na⁺和/或K⁺含量方面以及耐盐性方面中的应用，基因GhCLCg‑1A具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，基因GhCLCg‑1D具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明发现基因GhCLCg‑1A和/或GhCLCg‑1D在调节植物细胞中Cl^‑和/或Na⁺和/或K⁺含量的作用，并且，超表达GhCLCg‑1的转基因作物耐盐性显著增加。

Description

基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体而言，涉及基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用，特别是基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D在调节植物细胞中Cl^-和/或Na⁺和/或K⁺含量方面以及耐盐性方面中的应用。

背景技术

阴离子通道或转运蛋白在植物细胞适应非生物和生物胁迫、控制代谢以及维持电化学梯度和信号通路等发面发挥重要作用，并且在细胞质膜和细胞内室膜上高度协调地发挥作用。CLC(chloride channel)广泛存在原核和真核生物细胞中(主要分布在内膜系统)介导以Cl^-为代表的阴离子运输的重要通道(channel)或转运蛋白(transporter)。

氯离子(Cl^-)是植物细胞中除NO₃ ^-外的主要阴离子，是必需的微量元素之一。Cl^-可以促进植物的生长发育，并且对气孔运动、维持细胞渗透压、电荷平衡、细胞膨压和调节细胞内pH等方面也有影响。植物缺乏Cl^-导致植物的生长受到抑制，出现叶子黄化等症状。Cl^-虽然是植物必须的营养元素之一，但在植物遭受盐胁迫时，Cl^-的含量远远超过了植物正常生长发育所需要的水平。土壤中含有的氯主要以Cl^-形式存在，不易形成复合物。植物中的氯也主要以离子形式存在。由于环境污染和含氯肥料的不合理使用等因素导致土壤中Cl^-含量逐年增加。土壤中Cl^-含量过多会对植物造成毒害，引起植物离子中毒，抑制植物生长以及影响产量和品质。

植物中首先从烟草(Nicotiana tabacum)的cDNA中克隆出一个CLC(voltage-gated chloride channel)成员，命名为CLC-Nt1，该基因编码780个氨基酸并且含有多个跨膜结构域。与此同时，拟南芥(Arabidopsis thaliana)中也鉴定出4个CLC家族成员，分别命名为AtCLCa、AtCLCb、AtCLCc和AtCLCd。随后，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中又鉴定出3个CLC家族成员，并命名为AtCLCe、AtCLCf和AtCLCg。之后，在水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、油菜和茶树(Camellia sinensis)中均鉴定到CLC家族成员。

进化分析表明，拟南芥的CLC基因被分为两个亚组，其中AtCLCe和AtCLCf与原核生物的CLC基因亲缘关系较近，而AtCLCa-d和AtCLCg与真核生物的CLC基因亲缘关系较近。拟南芥7个CLC基因具有不同的亚细胞定位，其中AtCLCa、AtCLCb、AtCLCc和AtCLCg定位在液泡膜上；AtCLCe定位在叶绿体类囊体膜；AtCLCd和AtCLCf位于高尔基体膜。拟南芥7个CLC具有不同的定位，表明他们可能具有不同的功能。

AtCLCa和AtCLCb具有较高的相似性，均参与硝酸根离子(NO₃ ^-)的转运。一些研究数据表明，AtCLCc突变体生长在一定的外源硝酸盐浓度范围内时，与作为对照的野生型相比，突变体体内的NO₃ ^-浓度显著降低。但也有研究结果表明AtCLCc具有氯离子稳态的功能，该基因的突变体atclc-c与野生型相比对NaCl更敏感。AtCLCg对过量的氯离子具有耐受性。当AtCLCg的敲除突变体生长在含有一定浓度NaCl或KCl的培养基上，突变体的生物量显著降低，当恢复AtCLCg的表达后，恢复系的生物量可以达到野生型拟南芥的水平。最近的研究证明AtClCa-g主要在维管组织中表达，可能在长距离的离子运输中发挥作用。

在大豆中过表达GmCLC1，盐胁迫下转基因植株在根中积累了较多的Cl^-，降低了地上部的Cl^-含量。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，GEF1编码酵母中唯一已知的CLC蛋白，该蛋白位于高尔基体内侧并且与氯离子通道活性相关。将大豆GmCLC1转入酵母gef1突变体中，然后用不同的氯化物盐(MnCl₂、KCl、NaCl)处理，发现转GmCLC1基因的酵母的成活率明显提高。这表明GmCLC1具有与GEF1相似的氯离子转运功能。

我国是世界上较大的棉花生产国和消费国，棉花的生理和分子机制研究对棉花种植有很重要的意义。目前，虽然棉花的基因组序列测序已经完成，但是棉花中关于阴离子通道方面的研究还很欠缺，需要科研工作者的进一步探索。

发明内容

本发明从陆地棉遗传标准系TM-1中克隆出两个CLC家族成员，GhCLCg-1A和GhCLCg-1D。系统进化分析和氨基酸序列比对分析表明这两个基因与拟南芥AtCLCg亲缘关系密切；GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的基因结构显示这两个基因具有相同的外显子数目和保守结构域位置。在拟南芥叶片原生质体的液泡膜上观察到GhCLCg-1A-GFP和GhCLCg-1D-GFP融合蛋白的绿色荧光信号。这些结果表明这两个基因具有相同的功能，因此对其进行合并研究，命名为GhCLCg-1。实时荧光定量结果显示，在NaCl和KCl诱导下，GhCLCg-1在棉花的叶片中具有相同的显著诱导上调表达的表达模式，而且随着Cl^-浓度的增加，GhCLCg-1的表达量随之增加。转GhCLCg-1的超表达拟南芥与野生型拟南芥相比，在盐胁迫条件下Cl^-显著积累，并且耐盐性增强。利用VIGS技术降低GhCLCg-1的表达后，沉默植株的根、茎和叶片中积累了大量的Cl^-，尤其叶中的积累量最高，并且显著降低了沉默植株的耐盐性。

本发明的第一方面提供了以下技术方案：

基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D在调节植物细胞中Cl^-和/或Na⁺和/或K⁺含量方面中的应用，所述基因GhCLCg-1A具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述基因GhCLCg-1D具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明从陆地棉遗传标准系TM-1中成功克隆出两个CLC基因，分别位于棉花A和D亚组，基因结构分析显示这两个基因具有相同的结构及相同位置的CLC家族特征保守结构。进一步与AtCLCg的氨基酸序列比对结果显示，GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的氨基酸序列与拟南芥AtCLCg相似性很高，均含有CLC家族的三个特征保守基序：GxGIPE、GKxGPxxH和PxxGxLF。其中，研究表明CLC家族具有三个特征保守基序，这些保守基序具有离子的选择性作用。比如，当GxGIPE基序中的x为P时，会优先选择NO₃ ^-，若x为S，则优先选择Cl^-。

亚细胞定位揭示了GhCLCg-1A和GhCLCg-1D位于液泡膜上，可能具有与AtCLCg相似的氯离子转运功能，参与氯离子胁迫响应。由于GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的保守基序为GSGIPE，且在液泡膜上表达，经试验表明GhCLCg-1A和GhCLCg-1D参与Cl^-的区隔化作用。

由于GhCLCg-1A和GhCLCg-1D具有相同的结构、功能和定位，且序列相似性为98.71％，后续研究无法将它们分开，因此将对这两个基因进行统一研究，重新命名为GhCLCg-1。

对该基因进行研究发现，相比于野生植株，沉默所述基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D植株的根中的Na⁺含量、K⁺含量和Na⁺/K⁺含量比值相对不变，根、茎和叶中Cl^-含量均积累显著，茎和叶片中的Na⁺含量和Na⁺/K⁺含量比值均相对增加明显，茎和叶片中的K⁺含量均相对不变。

相比于野生植株，超表达所述基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D植株中的Na⁺含量、K⁺含量和Cl^-含量相对增加，Na⁺/K⁺含量比值相对降低。

实时荧光定量RT-qPCR结果表明，用不同的氯化物处理棉花后，GhCLCg-1被诱导上调表达。GhCLCg-1在NaCl和KCl处理下的叶片中具有相同的表达模式，且表达量随着氯离子浓度的增加而上升。盐胁迫条件下超表达GhCLCg-1拟南芥增强耐盐性，并且积累了大量的Cl^-。棉花沉默株系TRV:GhCLCg-1盐胁迫条件下对盐敏感性增加，同时也增加了Cl^-的积累。这表明GhCLCg-1将过量的Cl^-区隔在液泡中从而降低对植物的毒害作用，增加植物的耐盐性。说明，基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D具有调控植物耐盐性的作用。

本发明提供的基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D可用于治理环境中的氯离子污染。如可通过在植物中超表达GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D基因，来增强植物对氯离子的耐受性，同时提高植物对氯离子的吸收能力。具体地，超表达GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D基因的植物可作为治理盐碱地的先锋植物。

进一步地，本发明的第二方面提供了基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D在培育或检测耐盐性转基因植物中的应用，所述基因GhCLCg-1A具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述基因GhCLCg-1D具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

研究发现，本发明缓解Cl^-毒害的机制可能主要包括两个方面：一方面是将Cl^-隔离到根的木薄壁组织细胞中，阻止Cl^-从根部运输到地上部；另一方面是根中柱细胞将Cl^-外排或把Cl^-区隔到液泡中，从根源上降低可用性的Cl^-含量。进一步研究发现，相比于野生植株，盐胁迫下，超表达基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D植株的根长相对明显增加。

其中，植物包括单子叶植物和双子叶植物；单子叶植物包括水稻、玉米、小麦等；双子叶植物包括拟南芥、棉花、大豆、烟草等。

本发明中，亚细胞定位验证了基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D表达的蛋白位于液泡膜，基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D通过在液泡膜上表达蛋白发挥作用。

本发明的第三方面提供了一种植物耐盐性能的检测方法，检测待检测样品的基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D存在或表达情况，来判断其耐盐性能；

所述基因GhCLCg-1A具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述基因GhCLCg-1D具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

即通过检测待测样品的基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的存在情况，如是否存在基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D；或基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的表达情况，来判断目标植物的耐盐情况。

其中，本发明检测待检测样品中是否含有基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D可以通过多种方式进行，如可以直接检测是否含有基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D本身，也可以检测由基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D产生的产物，产物包括直接产物或间接产物或次生产物等，产物可以是mRNA，也可以是蛋白，也可以是某种化合物等。

直接检测基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D，可采用基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的特异性引物对检测，也可以采用针对基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D设计的探针或芯片进行检测。进一步地，通过基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的引物对或探针或芯片对待检测样品进行检测。

本发明中涉及的针对基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的引物对或探针或芯片，按常规方法设计即可。

进一步地，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

即引物对SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3可以用来检测基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D；引物对SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5也可以，并且具有更高的灵敏性。

本发明检测基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D本身的方式并不限于此，任何在生物学上可实现的检测方式均在本发明的保护范围内。

同样地，检测由基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D产生的产物也可以通过多种手段进行，如ELISA检测试剂盒等。

进一步地，所述待检测样品包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。

进一步地，所述待检测样本包括以下材料中的任一种：叶、根、茎、胚根、胚芽、种子等。

其中，待检测样本取自的植物包括单子叶植物和双子叶植物；单子叶植物包括水稻、玉米、小麦等；双子叶植物包括拟南芥、棉花、大豆、烟草等。

本发明的第四方面还提供了一种赋予植物盐耐性的方法，制备含有或过表达基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的转基因植物；

所述基因GhCLCg-1A具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述基因GhCLCg-1D具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明采用常规的生物学方法制备含有或过表达基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的转基因植物。含有基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的转基因植物可通过多种方式进行，如常见的载体介导转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中；又如种质系统法，包括花粉管通道法、生殖细胞侵染法、胚囊和子房注射法；又如基因直接导入法，通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等，化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。过表达基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的转基因植物也可通过多种方式进行，基本同上，不同的是，在载体上增加增强基因转录的启动子。

其中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。比如，单子叶植物包括水稻、玉米、小麦等；双子叶植物包括大豆、棉花、拟南芥等。

本发明的提供的基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D还可以在植物种群遗传多样性研究中应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括如下方面：

(1)盐胁迫对植物影响的研究主要集中在Na⁺，较少研究Cl^-对植物的影响，本发明从陆地棉遗传标准系TM-1中克隆出的基因GhCLCg-1A和GhCLCg-1D，经过分析和实验，表明两者均是CLC家族成员，且表达产物位于液泡膜上，另外，研究表明，GhCLCg-1参与氯离子诱导的盐胁迫，将过量的Cl^-隔离到液泡中从而降低细胞质中Cl^-的毒害水平，增强植物的耐盐性。

(2)本发明试验表明，超表达GhCLCg-1的拟南芥在盐胁迫下明显积累了更多的Cl^-、Na⁺和K⁺，但是超表达拟南芥具有较低的Na⁺/K⁺比值，并且耐盐性显著增加。

(3)本发明试验还表明，盐胁迫条件下，沉默植株TRV:GhCLCg-1的耐盐性降低，与对照相比植株很快发生细胞凋亡、叶片脱落等现象，TRV:GhCLCg-1植株中积累了大量的Cl^-，尤其是叶片中Cl^-的积累量最大，然而叶片也是遭受盐胁迫毒害最严重的组织部位。结合超表达拟南芥离子含量和耐盐性增加的结果分析表明，TRV:GhCLCg-1沉默植株在盐胁迫条件下根中吸收的Cl^-无法运输并隔离在液泡中，从而导致叶片Cl^-含量显著增加并积累，但是由于叶中GhCLCg-1的功能也被破坏，从而大量的Cl^-积累在细胞质中，对植物造成伤害。

(4)本发明提供了基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用，特别是在调节植物细胞中Cl^-和/或Na⁺和/或K⁺含量方面以及耐盐性方面中的应用，其中，耐盐性方面应用包括培育耐盐性转基因植物或检测植物耐盐性方面中的应用。

(5)本发明提供的基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的表达产物位于液泡膜上，该基因可广泛应用于各种植物品种中，如单子叶植物包括水稻、玉米、小麦等；双子叶植物包括大豆、棉花、拟南芥等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物的条带图；

图2为本发明实施例1中GhCLCg-1A、GhCLCg-1D和拟南芥AtCLC的进化树示意图；

图3为本发明实施例1中GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的基因结构及与AtCLCg编码的氨基酸序列比对图；

图4为本发明实施例1中GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的亚细胞定位图；

图5为本发明实施例2中GhCLCg-1在不同种类氯化物及不同浓度处理下的表达模式柱形图，其中，(A)GhCLCg-1在200mM NaCl处理下根、茎和叶中的表达模式，(B)200mM KCl处理6h下叶片中GhCLCg-1的表达水平；(C)不同浓度NaCl(0mM、50mM、100mM、150mM和200mM)处理下6h叶中GhCLCg-1的表达模式；

图6为本发明实施例3中转基因拟南芥株系的目的基因条带检测图；

图7为本发明实施例3中T2代拟南芥阳性苗图片；

图8为本发明实施例3中超表达拟南芥耐盐性和表达量增加的图；

图9为本发明实施例3中野生型拟南芥和转基因拟南芥的Cl^-、Na⁺和K⁺含量变化柱形图；

图10为本发明实施例3中GhCLCg-1沉默植株的耐盐性和氯离子含量变化图；

图11为本发明实施例3中正常条件和盐胁迫下TRV:GhCLCg-1及TRV:00植株的阳离子含量变化柱形图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

一、材料及处理

棉花材料为陆地棉遗传标准系TM-1(Gossypium hirsutum,cv TM-1)。

棉花材料的种植：选取饱满的棉花种子用蒸馏水浸泡，置于30℃培养箱中过夜促进萌发。第二天挑选已经萌发露白的种子种入含有蛭石的方形塑料盆，覆盖地膜将其置于温室中，温度为23℃，光照时间为16h光照/8h黑暗循环，相对湿度为60％。待种子的子叶露出后揭去地膜，子叶展开后挑选长势一致的棉花幼苗用自来水冲洗干净，用泡沫棉包裹茎基部置入水培箱(含有霍格兰营养液)进行后期培养及处理。

棉花材料的处理：在棉花幼苗生长到两叶一心时期进行盐胁迫处理。向霍格兰营养液中分别加入50、100、150、200mmol/L的NaCl或KCl。在处理后0h、1h、3h、6h进行取样，将根、茎和真叶(至少3株)分开取样，用锡纸包裹做好标记后迅速置于液氮速冻，然后保存在-80℃冰箱用于后续实验。

拟南芥野生型(WT)种植：取适量拟南芥种子置于1.5mL离心管中，然后加入1mL75％的乙醇，用涡旋仪涡旋消毒5分钟，确保每粒种子均匀分布在酒精中。随后在无菌的超净工作台中用灭菌水冲洗种子5-8次，将洗好的种子均匀平铺在不含抗性的MS培养基上。在超净台中晾干种好的拟南芥平板中的水分，然后用封口膜封口后在4℃条件下倒置培养2天进行春化。春化完成后转移到拟南芥温室中正常培养生长，14天后将平板上的拟南芥小心用镊子夹取(避免伤根)，移植到塑料培养钵中(蛭石:营养土＝1:1)置于拟南芥温室进行后续生长和实验，温室温度为21℃，光照时间为16h光照/8h黑暗循环，相对湿度为50％。

二、涉及的引物

表1设计的引物

实施例1

一、基因克隆

1、总RNA提取：取-80℃冷冻保存的棉花材料根、茎和叶分别于液氮中研磨成粉末，各取100mg样品粉末装入2mL的RNase-Free离心管中。后续实验步骤按照天根公司RNA提取试剂盒(DP441)说明书进行。

2、cDNA合成：使用诺唯赞公司HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(R312-01)反转录试剂进行cDNA的合成。

3、基因克隆(RT-PCR)：以反转录得到的第一链cDNA为模板，用TaKaRa公司的高保真酶KOD-Plus-Neo(Code No.KOD-401)进行目的基因的扩增。由于参考序列显示GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的序列具有很高的相似性，因此对这两个基因设计了一对特异性引物，如表1所示。

表2基因克隆PCR体系

表3基因克隆PCR反应程序

5、PCR反应结束用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1所示，GhCLCg-1的PCR产物均位于2000-3000bp的Maker之间，与GhCLCg-1A/D参考序列长度相似。

使用诺唯赞公司的胶回收试剂盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(DC301)对目的条带进行回收。

6、PCR产物连接克隆载体：在200μL干净的离心管中分别加入PCR胶回收产物4μL，pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 1μL，轻轻混匀后于25℃(PCR仪控温)反应30min。反应结束后置于冰上。

7、转化大肠杆菌感受态，在无菌环境挑取多个单克隆在500μLLB+Kan液体培养基中，37℃、200rpm培养6h至菌液浑浊。分别以菌液为模板进行PCR以及测序，测序得到两种不同基因序列的菌液，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，分别得到含有GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的阳性菌。

二、构建GhCLCg-1A、GhCLCg-1D与拟南芥CLC的进化树

根据GhCLCg-1A/D的测序结果对CDS序列进行氨基酸序列翻译，然后与拟南芥7个AtCLC的氨基酸序列共同构建系统发育树。

表4所用到的CLC基因信息

结果如图2所示。表明GhCLCg-1A和GhCLCg-1D位于第一个分支，且进化树显示与拟南芥AtCLCg距离最近，表明GhCLCg-1A和GhCLCg-1D与AtCLCg亲缘关系最近，可能会有相似Cl^-转运功能。

三、GhCLCg-1A/D的基因结构和氨基酸序列比对

根据GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的保守域，利用TBtools软件绘制基因结构(图3A)。用DNAMAN 9.0软件对GhCLCg-1A、GhCLCg-1D和AtCLCg氨基酸序列进行比对。

结果表明GhCLCg-1A和GhCLCg-1D具有相同的基因结构。它们均由7个外显子和6个内含子组成，并且在相同的位置上含有CLC家族的特征结构域Voltage_CLC和CBS domain。结果表明GhCLCg-1A和GhCLCg-1D基因结构相同并且同属于CLC家族成员，可能具有相同的功能。

GhCLCg-1A和GhCLCg-1D在进化关系上与拟南芥AtCLCg相近。因此，利用GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的氨基酸序列与AtCLCg的氨基酸序列进行多重序列比对。结果表明(图3B)GhCLCg-1A和GhCLCg-1D均编码773个氨基酸，并且与AtCLCg的氨基酸序列相似性高达91.13％。氨基酸序列比对结果表明，GhCLCg-1A和GhCLCg-1D具有与AtCLCg相同的保守基序：GxGIPE、GKxGPxxH和PxxGxLF。这三个保守基序是CLC具有阴离子选择作用的基础，且第一个保守基序GxGIPE中的x为S，根据前人研究表明GhCLCg-1A和GhCLCg-1D可能具有与拟南芥AtCLCg类似的选择运输氯离子的功能。

四、GhCLCg-1A/D的亚细胞定位

(1)载体线性化：把pCAMBIA2300(35S:GFP)载体用BamHI和SmaI限制性内切酶进行线性化。

(2)载体酶切反应完成后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检验，并在紫外灯下切下目的条带进行胶回收。

(3)根据载体和基因序列设计含有酶切位点序列，但不含基因的终止密码子的载体同源引物，见表1中亚细胞定位引物，然后进行PCR扩增反应和目的条带的胶回收。

(4)用诺唯赞公司的同源重组酶(

Ultra One Step Cloning Kit)将扩增产物连接到pCAMBIA2300(35S:GFP)载体上，基因扩增胶回收产物3μL，载体胶回收产物2μL，同源重组酶5μL，轻轻混匀后，50℃反应5min。

(5)将连接产物转入冻融状态的大肠杆菌中。

(6)其余步骤同上述大肠杆菌转化和阳性克隆检测。上游引物为HP158，下游引物为基因的下游载体连接引物。

(7)测序正确即获得GhCLCg-1A-GFP和GhCLCg-1D-GFP融合表达载体。

2、GhCLCg-1A-GFP和GhCLCg-1D-GFP的大肠杆菌的质粒提取，使用诺唯赞质粒提取试剂盒(Fast Pure Endo Free Plasmid Maxi Kit,DC202-01)。

3、拟南芥原生质体制备与转化：使用Coolaber公司的拟南芥原生质体制备及转化试剂盒(PPT101)操作。

4、亚细胞定位结果观察：使用激光共聚焦显微镜对原生质体进行观察拍照。

将GhCLCg-1A-GFP和GhCLCg-1D-GFP的绿色荧光融合表达质粒与液泡膜标记蛋白δ-TIP-RFP的质粒共同转入拟南芥的原生质体，然后用激光共聚焦显微镜进行观察和拍照。图4显示，转35S:GFP和δ-TIP-RFP的原生质体作为阴性对照，发现35S:GFP的荧光信号在整个细胞内都可以观察到，包括细胞核，而δ-TIP-RFP的红色荧光信号只在液泡膜位置观察到一个圆环，并且绿色和红色荧光信号没有完全重合。GhCLCg-1A-GFP和GhCLCg-1D-GFP的绿色荧光信号与液泡膜标记蛋白δ-TIP-RFP的红色荧光信号完全融合，形成黄色的圆环，表明GhCLCg-1A和GhCLCg-1D均位于液泡膜上。

实施例2

GhCLCg-1A/D在盐处理下的表达模式

GhCLCg-1A和GhCLCg-1D具有选择氯离子的保守结构域，通过实时荧光定量RT-qPCR技术，检测GhCLCg-1A和GhCLCg-1D在棉花盐胁迫下的表达模式。由于GhCLCg-1A和GhCLCg-1D基因序列相似性很高，荧光定量引物无法单独设计，因此本研究设计了一对如表1所示的GhCLCg-1A和GhCLCg-1D共同的特异性荧光定量引物检测GhCLCg-1的表达水平。

实时荧光定量结果显示(图5A)：在200mM NaCl处理后棉花的根、茎和叶的0、1、3、6h均检测到GhCLCg-1的表达水平。根中200mMNaCl处理后3h，GhCLCg-1比对照组显著上调表达；200mM NaCl处理后GhCLCg-1在茎中的1h和6h表达水平比对照组显著上升；叶片中GhCLCg-1在200mM NaCl处理后均显著上调表达，且在6h时，NaCl处理后的GhCLCg-1的表达量比对照组提高了约5倍。

植物受到盐害后，叶片首先表现出胁迫症状。研究表明在200mMNaCl处理6h的叶片中表达量上升的倍数最高。

考虑到GhCLCg-1作为CLC家族成员，可能具有氯离子转运功能，因此用不同的氯化物进行处理。以200mM KCl处理下的棉花的叶片作为研究对象。图5B结果显示叶片中GhCLCg-1在200mM KCl和200mMNaCl处理下具有相同的表达模式，在处理后的1h、3h和6h下均上调表达，且在6h时表达倍数最高。荧光定量结果(图5C)显示GhCLCg-1的表达量与氯离子浓度呈正相关，表达量随氯离子浓度的增加而上升。这些结果表明GhCLCg-1参与盐胁迫下对氯离子的响应。

实施例3

通过超表达和基因沉默进行耐盐性分析验证上述基因功能。

一、GhCLCg-1超表达拟南芥

1、超表达载体构建：超表达载体同亚细胞定位载体一致，由于该载体含有GFP标签，可以进行亚细胞定位和超表达拟南芥实验。由于GhCLCg-1A和GhCLCg-1D同源性很高，因此构建了转GhCLCg-1A的转基因拟南芥，用来研究GhCLCg-1A和GhCLCg-1D的功能。

2、拟南芥种植：参见拟南芥野生型(WT)种植。

3、拟南芥遗传转化：

(1)拟南芥盛花期进行转化，转化前两天剪去果荚，只留花序。

(2)菌液准备：

①取-80℃存放的GhCLCg-1A-GFP的农杆菌，在含有Kan和Rif的LB固体培养基上进行活化，28℃48h。

②挑选单克隆菌体于500μL Kan和Rif抗性的LB培养基中在28℃200rpm摇床里培养14h，至菌液浑浊。

③菌液扩大培养：在超净工作台中取500μL浑浊菌液加入到100mL灭菌的玻璃锥形瓶(含有Kan和Rif的LB培养基50mL)，28℃200rpm摇床里培养14h，至菌液颜色变为橙黄色。

④重悬液配制：配制1L重悬液需要4.43g MS粉末、50g蔗糖、10μL6-BA(1g/L)，玻璃棒混匀，用NaOH或HCl调节pH＝5.7，加入表面活性剂Sweet-77200μL混匀。

⑤将橙黄色菌液转移到50mL灭菌离心管中，5000rpm 5min，弃上清。用重悬液重悬菌体，调节OD₆₀₀＝1.2，室温避光静置3h。

(3)拟南芥侵染和收获：将生长一个月的拟南芥剪去果夹，留下的花序浸泡在GhCLCg-1A-GFP菌体重悬液中1min，侵染结束的拟南芥黑暗条件下培养24h，然后恢复正常生长条件。侵染完成7天后进行第二次侵染，步骤同上，但不需要剪果荚。二次侵染后的拟南芥正常生长至种子成熟并收获种子(标记为T0)。

4、筛选拟南芥转化阳性苗：

(1)将收获的T0代种子清除杂质后在37℃培养箱中干燥7天以完成后熟。然后进行拟南芥下一代的繁殖。拟南芥种植参见拟南芥野生型(WT)种植，将种子涂布在含有Kan抗生素的MS培养基上。两周左右挑选绿苗，即阳性苗，进行移植到土壤中，培养至成熟收获，种子标记为T1代。重复至收获T3代拟南芥种子。

由于转基拟南芥带有卡那霉素抗性，将T1代收获的种子种植在含有Kan的MS培养基上，T2代拟南芥幼苗会发性状分离，图6表明，T2代拟南芥绿苗：黄花苗约为3:1。将T2代阳性苗(绿苗)移植到土壤中进行生长至种子收获，将T2的种子继续培养获得20株T3代稳定转化的拟南芥。

(2)阳性苗DNA提取：T1代种子生长1个月左右，每株幼苗均取200mg叶片，然后进行DNA提取，使用百泰克公司核酸提取试剂盒(DP3111)，具体步骤如下：

①在液氮中将叶片磨成粉末，取50mg到新的2mL离心管中，向管中加入50μLBufferP1(65℃水浴预热)和4μL RNase A，剧烈涡旋混匀5min，使其变为匀浆。室温放置10min。

②加130μL的BufferP2,涡旋混匀1min，12000rpm离心3min。

③吸取上清到分离柱A中，12000rpm离心1min，收集滤液。

④转移滤液到新的2mL离心管中，加入1.5倍体积的BufferP3立刻轻柔混匀。

⑤将混合物加入吸附柱AC(吸附柱放在收集管中)12000rpm离心1min，弃滤液。

⑥加入700μL漂洗液WB(已按瓶身说明加入所需体积的无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液。

⑦加500μL漂洗液WB，12000rpm离心1min，弃废液。

⑧吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心3min。

⑨吸附柱AC放到新的1.5mL离心管，AC柱中间部位悬空滴加50μLEB(65℃水浴中预热)，室温放置5分钟，12000rpm离心1min收集DNA，-20℃存放。

(3)PCR验证阳性拟南芥：以拟南芥DNA为模板，引物用HP158和GhCLCg-1-G-R，按照表2和表3菌液PCR加样和反应程序进行，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行观察。其中PCR反应阴性对照为水。

图7显示转基因拟南芥株系含有目的基因条带，阴性对照和对照组中均没有目的条带。说明GhCLCg-1成功整合到拟南芥基因组中，成功获得T1代转基因株系。

(4)超表达拟南芥T3代胁迫处理：随机选取3个超表达拟南芥株系和野生型WT株系进行功能验证。种植方式参见拟南芥野生型(WT)种植，其中MS培养基分为两种，一种是普通MS培养基，作为对照处理组；另一种是含有100mM NaCl的MS培养基，作为盐胁迫处理组。每个培养基上均含有3个超表达株系(OE1、OE2和OE3)和WT株系。培养基竖直放置培养21天后进行生长状况观察和拍照。

图8A中观察到3个转基因株系(OE1、OE2和OE3)和野生型(WT)在MS培养基上长势一致，根长以及地上部长势没有表现出显著差异；在含有100mM NaCl的MS培养基上，过表达拟南芥株系的叶片比WT的大，且转基因拟南芥根的生长显著比WT快，根长较长。

(5)转基因拟南芥表达量检测：分别提取野生型(WT)和(4)中转基因拟南芥的总RNA，并反转录为第一链cDNA，以拟南芥内源表达基因AtUBQ5作为内参，利用RT-PCR验证超表达拟南芥株系中GhCLCg-1的表达量(GhCLCg-1引物为GhCLCg-1-Q-F和GhCLCg-1-Q-R；AtUBQ5引物为AtUBQ5-F和AtUBQ5-R)。

对转基因拟南芥进行GhCLCg-1的表达量分析(图8B)，转基因拟南芥的基因表达水平明显增加，且在WT中检测不到GhCLCg-1的表达。这些结果表明超表达拟南芥株系的耐盐性增加，GhCLCg-1在参与植物的盐胁迫调控中发挥重要作用。

(6)拟南芥根长测定：分别取生长在MS和MS+100mM NaCl培养基上21天的拟南芥，WT、OE1、OE2、OE3分开取样，每个株系随机用电子游标卡尺测量9株拟南芥的根长，并分为三组，计算根长的平均值。

图8C对根长进行量化分析，表明转基因拟南芥显著增加了盐胁迫条件下的根长。

(7)拟南芥离子含量测定：取样，105℃杀青5min，75℃烘干至恒重。

钠离子和钾离子含量测定：使用电感耦合等离子体发光色谱仪(ICP)对钠离子和钾离子含量测定，仪器型号为ICAP7400。取烘干样品粉末过100目尼龙筛。称取过筛后的植物粉末0.1g，用硝酸、氢氟酸、双氧水在微波消解仪上进行充分消解，使用赶酸仪赶酸后用去离子水定容。溶液过0.45μm微孔滤膜后即可进样测试钠离子和钾离子含量。(每个样品三次生物学重复)。

氯离子含量测定：使用离子色谱法进行测定，仪器为ICS-5000。分别称植物样品粉末0.1g，放进50mL经5％的稀硝酸浸洗烘干的玻璃三角瓶中，加入去离子水15mL后沸水浴10min。放置冷却至室温，然后用滤纸过滤于25mL的容量瓶内，用ddH₂O冲洗3次残渣，最后用蒸馏水定容至50mL。溶液过0.45μm微孔滤膜后即可用离子色谱仪进行氯离子含量的测定。

培养基生长21的拟南芥进行表型观察后，测定OE1、OE2、OE3和WT植株内的离子含量。图9中，在MS培养基上生长的野生型拟南芥和转基因拟南芥的Cl^-、Na⁺和K⁺含量没有显著差异；在含有100mM NaCl的培养基上生长的拟南芥，转基因拟南芥3个株系的Cl^-、Na⁺和K⁺含量明显高于WT，而Na⁺/K⁺比值显著低于WT。表明转GhCLCg-1基因拟南芥体内可以积累更多的氯离子，并且将多余的离子隔离到液泡中，从而减轻盐胁迫对植物造成的伤害。

二、病毒诱导GhCLCg-1在棉花中沉默

1、进行VIGS载体构建和操作，获得TRV:GhCLCg-1重组质粒和植株。

2、沉默植株处理：VIGS注射后，棉花幼苗生长至两叶一心时，分别对TRV:00(空载)和沉默目的基因的植株进行200mM NaCl处理。向霍格兰营养液中加入相应质量的NaCl，同时以不含NaCl的霍格兰营养液的作为对照处理。处理后3天进行基因沉默植株和对照植株的表型观察和拍照。

3、沉默植株钠离子和钾离子含量测定同上，氯离子含量测定同拟南芥氯离子含量测定。

取烘干样品粉末过100目尼龙筛。称取过筛后的植物粉末0.1g，用硝酸、氢氟酸、双氧水在微波消解仪上进行充分消解，使用赶酸仪赶酸后用去离子水定容。溶液过0.45μm微孔滤膜后即可进样测试钠离子和钾离子含量。(每个样品三次生物学重复)。

利用VIGS技术降低棉花中GhCLCg-1的表达，进一步验证GhCLCg-1在盐胁迫下发挥的作用。VIGS注射10天后，阳性对照TRV:CLA出现白化叶片(图10A)，说明基因已经被有效沉默。对TRV:00和TRV:GhCLCg-1植株分别提取根、茎和叶的RNA进行GhCLCg-1沉默效率鉴定，实时荧光定量结果显示TRV:GhCLCg-1植株的根、茎和叶中的GhCLCg-1的表达量与对照TRV:00相比均显著降低(图10B)，表明GhCLCg-1的表达量被有效沉默。

200mM NaCl处理TRV:00和TRV:GhCLCg-1植株3天后观察到(图10C)，TRV:GhCLCg-1植株与对照TRV:00相比，叶片萎缩，出现绿斑，叶缘干枯和叶片凋落的症状。对TRV:GhCLCg-1和TRV:00植株进行氯离子含量测定，图10D说明正常生长环境下棉花植株中Cl^-含量在TRV:GhCLCg-1和TRV:00中没有表现出显著差异，而TRV:GhCLCg-1在200mM NaCl处理后的根、茎和叶中均积累了大量的Cl^-。表明降低GhCLCg-1的表达后，植株体内积累了更多的Cl^-在细胞质中，导致植株受到胁迫危害。

本研究还对TRV:GhCLCg-1和TRV:00植株的Na⁺和K⁺含量进行测定，另外还计算了Na⁺/K⁺的比值。图11显示在正常生长条件下(Mock)，对照TRV:00和基因沉默株系TRV:GhCLCg-1中的Na⁺和K⁺含量及Na⁺/K⁺不存在差异显著性。在200mM NaCl处理3天后，TRV:GhCLCg-1植株与TRV:00相比，茎和叶中明显积累了更多的Na⁺，且相应的Na⁺/K⁺也显著增加；但是根中的Na⁺水平没有差异，说明GhCLCg-1的功能主要是对于Cl^-进行吸收和运输。

K⁺含量在盐胁迫处理下TRV:GhCLCg-1和TRV:00植株的根中显著降低，说明植物在遭受NaCl盐胁迫后，根吸收了大量的Na⁺，影响植物对K⁺的吸收，从而增加Na⁺/K⁺，降低了植株的耐盐性。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用

<130> 2021

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2325

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 1

atgtcagagg atgcgccacc gttccaaacc caagatcatg actctctcac cattccttta 60

ctctctcacc agcagcgatc cattaattcc acctctcagg tcgccatcgt tggcgccaac 120

gtctgcccca tcgaaagcct cgattatgag attgcggaga atgatttctt caaacaagac 180

tggagggcac gtggaaaggt ccagattttt caatatattt tcatgaaatg gcttctctgt 240

tttttgattg gcggtttcgt cagtctcgtt ggtttcttca ataatctcgc cgttgagaat 300

atcgccggcg ttaagttcgt catcacttct aacatgatgc ttgctcaaag gtactggatg 360

gcatttctag tgttttctct atcgaatttg gctctaactc tctttgccgc catcattacg 420

gcgtttattt ctcccgccgc tgctggttcc ggtataccgg aagtgaaggc ttacttgaat 480

ggcgtagatg ctccgggaat actttcaata cgaactttaa tagttaagat tgtgggaagc 540

attgctgcag tgtcttcttc tctgctggtc ggaaaggcag ggcccatggt gcatactggt 600

tcatgcattg cagcattgtt cggacaaggt gggtcgagaa gatatggttt aacatggaag 660

tggcttcgtt tctttaaaaa tgacagagac cgacgagatc ttgtaacatg tggatcggca 720

gctggaattg ctgctgcttt ccgtgccccg gtcggaggtg tgctgtttgc tcttgaagaa 780

atggcatctt ggtggagaag ttcccttctt tggagagctt tctttacgac tgctgtggtt 840

gcaatcgtac ttcgagccct aattgatgtt tgtttaagtg gcaagtgtgg gctatttggt 900

aaagggggtt tgataatgtt tgacgtctat tcagcaaatg tttcgtatca cctagccgat 960

gtgcctcctg ttcttgctct tggagttatt gggggcatat tgggaagttt ctataatttc 1020

cttttagtta aggttctcaa agtttataac ctcattaacg agaaaggcat tttttataaa 1080

atttttattg cttgcacgat ctccattttt acatcgtgtc tgctttttgg attaccatgg 1140

cttgtatctt gccaatcatg cccctcagat gcatctgaag actgtcccac gataggccga 1200

tctggtaact ataagaaatt tcagtgcccc tctggtcact acaatgatct tgcaagcctc 1260

attttcaaca caaatgatga tgctatcagg aatcttttta gcaagaatac tgacactgag 1320

tttcagctct caacaatgct catatttttt gtcacctgct tcattctaag tatttttagc 1380

tacgggattg ttgctccagc agggctattt gtacctgtga tagtaactgg agcatcttat 1440

gggcgtttca tcggaatgtt aattggttct tggggaaatc ttagtcatgg tctttatgct 1500

gtacttggtg cggcttcatt tcttggtgga tctatgagga tgacagtctc cttgtgtgtt 1560

ataattctgg aattgaccaa taatctatta ctgttgccat taataatggt ggttctcctt 1620

gtttccaaga ctgtagcgga tgcatttaat ggcaatgttt atgaccttat tatgaaagta 1680

aaaggttttc catacctaga aactcatgct gaaccttata tgagacagct aaccgttgct 1740

gatgttgtct ctggcccgct tcagctgtgt catggaattg agaaggtcgg taatatcgta 1800

cacatcctca aaaccacaat gcatcacggg tttccagtta ttgatgagtc tccacattct 1860

gaatccccag ttttgtatgg tttgatcctt cgggctcatc ttattgcact gctaaagaag 1920

aaagcgttct tgtgcacccc tgtgcagtta ggtgctgatg cttttagaca tttctcgtca 1980

gatgactttg caaagaaggg cttaggtaat gttgacaaga tagaagacat agaattgaca 2040

gatgaggaga tggacatgtt cctggattta caccctttta ccaatgcttc accgtacaca 2100

gttgtggaga cgatgtcact agctaaggct ctcatacttt tccgtgaagt tggtctgcga 2160

cacctacttg tcatacccaa gatctctagc agagcaccag tggtgggcat attgacaagg 2220

catgatttca tgccggaaca catattaggt ttgcatccat cgttggtaag gagcaggtgg 2280

aaaagattga ggtttcaatt ccccctttta ctgaaaatat tctag 2325

<210> 2

<211> 2325

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 2

atgtcagagg atgcgccacc gttccaaacc caagaacatg actctctcac cattccttta 60

ctctctcacc agcagcgatc cattaattcc acctctcagg tcgccatcgt tggcgccaac 120

gtctgcccca tcgaaagcct cgattatgag attgtggaga atgatttctt caaacaagac 180

tggagggcac gtggaaaggt ccagattttt caatatattt tcatgaaatg gcttctctgt 240

tttttgcttg gcggtttcgt cagtctcgct ggtttcttca ataatctcgc cgttgagaat 300

atcgccggcg ttaagttcgt catcacttct aacatgatgc ttgctcaaag gtactggatg 360

gcatttctag tgttttctct atcgaatttg gctctaactc tctttgccgc catcattacg 420

gcgtttattt ctcccgccgc tgccggttcc ggtataccgg aagtgaaggc ttacttgaac 480

ggcgtagatg ctccgggaat actttcaata cgaactttaa tagttaagat tgtgggaagc 540

attgctgcag tgtcttcttc tctgctggtc ggaaaggcag ggcccatggt gcatactggt 600

tcatgcattg cagcattgtt tggacaaggt gggtcgagaa gatatggttt aacatggaag 660

tggcttcgtt tctttaaaaa tgacagagac cgacgagatc ttgtaacatg tggatcagca 720

gctggaattg ctgctgcttt ccgtgccccg gtcggaggtg tgctgtttgc tcttgaagaa 780

atggcatctt ggtggagaag tgcccttctt tggagagctt tctttacgac tgctgtggtt 840

gcaatcatac ttcgagccct aattgatgtt tgtttaagtg gcaagtgtgg gctatttggt 900

aaagggggtt tgataatgtt tgacgtctat tcagcaaatg tttcgtatca cctagccgat 960

gtacctcctg ttcttgctct tggagttatt gggggcatat tgggaagttt ctataatttc 1020

cttttagtta agattctcaa agtatacaac ctcgttaacg agaaaggcac tttttataaa 1080

atttttattg cttgcacgat ctccattttt acatcgtgtc tgctttttgg attaccatgg 1140

cttgtatctt gccaatcatg cccctcagat gcatctgaag actgtcccac gataggccga 1200

tctggtaact ataagaaatt tcagtgcccc cctggtcact acaatgatct tgcaagcctc 1260

attttcaaca caaatgatga tgctatcagg aatcttttta gcaagaatac tgactctgag 1320

tttcagctct caacaatgct catatttttt gtcacctgct tcattctaag tatttttagc 1380

tacgggattg ttgctccagc agggctattt gtacctgtga tagtaactgg agcatcttat 1440

gggcgtttca tcggaatgtt aattggttct tggggaaatc ttagtcatgg tctttatgct 1500

gtacttggtg cggcttcatt tcttggtgga tctatgagga tgacagtctc cttgtgtgtt 1560

ataattctgg aattgaccaa taatctatta ctgttgccat taataatggt ggttctcctt 1620

gtttccaaga ctgtagcgga tgcatttaat ggcaatgttt atgaccttat catgaaagta 1680

aaaggttttc catacctaga aactcatgct gaaccttata tgagacagct aaccgttgct 1740

gatgttgtct ctggcccgct tcagctctgt catggaattg agaaggtcgg taatatcgta 1800

cacatcctca aaaccacaat gcatcacggg tttccagtta ttgatgagtc tccacattct 1860

gaatccccag ttttgtatgg tttgatcctc cgtgctcatc ttattgcact gctaaagaag 1920

aaagcgttct tgtgcacccc tgtgcagtta ggtgctgatg cttttaggca tttctcatca 1980

gatgattttg caaagaaggg cttaggtaat gttgacaaga tagaagacat agaattgaca 2040

gatgaggaga tggagatgtt cctggattta caccctttta ccaacgcttc accgtacaca 2100

gttgtggaca cgatgtcact agctaaggct ctcatacttt tccgtgaagt tggtctgcga 2160

cacctacttg tcatacccaa gatctccagc agagcaccag tggtgggcat attgacaagg 2220

catgatttca tgccggaaca catattaggt ttgcatccat cgttggtaag gagcaggtgg 2280

aaaagattga ggtttcaatt ccccctttta ctgaaaatat tctag 2325

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgtcagagg atgcgccacc 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ctagaatatt ttcagtaaaa ggggg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tcatgactct ctcaccattc cttta 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aatctcataa tcgaggcttt cgatg 25

Claims (10)

1.基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D在调节植物细胞中Cl^-和/或Na⁺和/或K⁺含量方面中的应用，所述基因GhCLCg-1A具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述基因GhCLCg-1D具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，相比于野生植株，沉默所述基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D植株的根、茎和叶中的Cl^-积累量显著增加，根中的Na⁺含量、K⁺含量和Na⁺/K⁺含量比值相对不变，茎和叶片中的Na⁺含量和Na⁺/K⁺含量比值均相对增加明显，茎和叶片中的K⁺含量均相对不变。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，相比于野生植株，超表达所述基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D植株中的Na⁺、K⁺和Cl^-含量相对增加，Na⁺/K⁺含量比值相对降低。

4.基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D在培育或检测耐盐性转基因植物中的应用，所述基因GhCLCg-1A具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述基因GhCLCg-1D具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，相比于野生植株，盐胁迫下，超表达GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D基因植株的根长相对明显增加。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；

所述单子叶植物包括水稻、玉米、小麦；

所述双子叶植物包括拟南芥、棉花、大豆、烟草；

进一步地，所述基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D表达的蛋白位于液泡膜。

7.一种植物耐盐性能的检测方法，其特征在于，检测待检测样品的基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D存在或表达情况，来判断其耐盐性能；

所述基因GhCLCg-1A具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述基因GhCLCg-1D具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的植物耐盐性能的检测方法，其特征在于，通过基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的引物对或探针或芯片对待检测样品进行检测。

进一步地，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示。

9.根据权利要求7-8任一项所述的植物耐盐性能的检测方法，其特征在于，所述待检测样品包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料；

进一步地，所述待检测样本包括以下材料中的任一种：叶、根、茎、胚根、胚芽、种子。

10.一种赋予植物盐耐性的方法，其特征在于，制备含有或过表达基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的转基因植物；

所述基因GhCLCg-1A具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述基因GhCLCg-1D具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列；

进一步地，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；

所述单子叶植物包括水稻、玉米、小麦；

所述双子叶植物包括大豆、棉花、拟南芥。

Images