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CN105646683B - 成套耐盐蛋白质及相关生物材料在调控植物耐盐性中的应用 - Google Patents

成套耐盐蛋白质及相关生物材料在调控植物耐盐性中的应用 Download PDF

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CN105646683B CN201610115651.4A CN201610115651A CN105646683B CN 105646683 B CN105646683 B CN 105646683B CN 201610115651 A CN201610115651 A CN 201610115651A CN 105646683 B CN105646683 B CN 105646683B
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Abstract

本发明公开了成套耐盐蛋白质及相关生物材料在调控植物耐盐性中的应用。本发明公开的成套耐盐蛋白质由耐盐相关蛋白1和耐盐相关蛋白2组成，耐盐相关蛋白1为氨基酸序列是序列1的蛋白质；耐盐相关蛋白2为氨基酸序列是序列3的蛋白质。实验证明，耐盐相关蛋白1和耐盐相关蛋白2可以提高植物对NaCl模拟的盐环境的耐盐性，并且耐盐相关蛋白1和耐盐相关蛋白2在提高植物对NaCl模拟的盐环境的耐盐性中具有协同作用，可利用耐盐相关蛋白1与其编码基因以及耐盐相关蛋白2与其编码基因提高植物的耐盐性。

Description

成套耐盐蛋白质及相关生物材料在调控植物耐盐性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中成套耐盐蛋白质及相关生物材料在调控植物耐盐性中的应用。
背景技术
据估计，全球有超过6％的土地和近20％的耕地受到盐胁迫的影响，土壤的盐碱化问题日益威胁着人类赖以生存的有限土地资源。我国土壤盐碱化日益严重,对我国的粮食安全造成了严重威胁。农作物绝大部分品种是盐敏感的，土壤盐渍化阻滞作物生长导致减产甚至绝收。培育耐盐性作物品种具有成本低、见效快、长远持久的特点，是提高盐渍土壤作物产量水平和经济效益的有效方法。而耐盐基因的挖掘及耐盐种质的创制是耐盐育种的重要保障。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的耐盐性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了成套耐盐蛋白质在下述1)-3)中任一种中的应用：
1)调控植物耐盐性；
2)制备提高植物耐盐性产品；
3)培育耐盐性植物；
所述成套蛋白质由耐盐相关蛋白1和耐盐相关蛋白2组成，所述耐盐相关蛋白1名称为SRRP1，为如下A11)、A12)或A13)：
A11)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
A12)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的蛋白质；
A13)在A11)或A12)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述耐盐相关蛋白2名称为SRRP2，为如下A21)、A22)或A23)：
A21)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A22)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的蛋白质；
A23)在A21)或A22)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A11)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。为了使A21)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A12)中的SRRP1蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述A12)中的SRRP1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A12)中的SRRP1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述A22)中的SRRP2蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述A22)中的SRRP2蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A22)中的SRRP2蛋白质的编码基因可通过将序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述应用中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥。
为解决上述技术问题，本发明还提供了成套生物材料在所述1)-3)中任一种中的应用；所述成套生物材料由与SRRP1相关的生物材料和与SRRP2相关的生物材料组成；
所述与SRRP1相关的生物材料为下述B11)至B17)中的任一种：
B11)编码SRRP1的核酸分子；
B12)含有B11)所述核酸分子的表达盒；
B13)含有B11)所述核酸分子的重组载体、或含有B12)所述表达盒的重组载体；
B14)含有B11)所述核酸分子的重组微生物、或含有B12)所述表达盒的重组微生物、或含有B13)所述重组载体的重组微生物；
B15)含有B11)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B12)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B16)含有B11)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B12)所述表达盒的转基因植物组织；
B17)含有B11)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B12)所述表达盒的转基因植物器官；
所述与SRRP2相关的生物材料为下述B21)至B27)中的任一种：
B21)编码SRRP2的核酸分子；
B22)含有B21)所述核酸分子的表达盒；
B23)含有B21)所述核酸分子的重组载体、或含有B22)所述表达盒的重组载体；
B24)含有B21)所述核酸分子的重组微生物、或含有B22)所述表达盒的重组微生物、或含有B23)所述重组载体的重组微生物；
B25)含有B21)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B22)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B26)含有B21)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B22)所述表达盒的转基因植物组织；
B27)含有B21)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B22)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，B11)所述核酸分子可为如下b11)-b13)中任一种：
b11)其编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b12)与b11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SRRP1的cDNA分子或基因组DNA分子；
b13)在严格条件下与b11)限定的核苷酸序列杂交，且编码SRRP1的cDNA分子或基因组DNA分子；
B21)所述核酸分子可为如下b21)-b23)中任一种：
b21)其编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；
b22)与b21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SRRP2的cDNA分子或基因组DNA分子；
b23)在严格条件下与b21)限定的核苷酸序列杂交，且编码SRRP2的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的蛋白质，序列4所示的DNA分子编码序列3所示的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SRRP1或SRRP2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SRRP1或SRRP2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SRRP1或SRRP2且具有SRRP1或SRRP2功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1或序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，B12)所述的含有编码或SRRP1的核酸分子的表达盒(SRRP1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SRRP1的DNA，该DNA不但可包括启动SRRP1基因转录的启动子，还可包括终止SRRP1基因转录的终止子。B22)所述的含有编码或SRRP2的核酸分子的表达盒(SRRP2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SRRP2的DNA，该DNA不但可包括启动SRRP2基因转录的启动子，还可包括终止SRRP2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述SRRP1基因表达盒的重组载体或含有所述SRRP2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
B13)所述重组载体可含有序列2所示的用于编码SRRP1的DNA序列；进一步B13)所述重组载体具体可为将表达载体pGFPGUS的BglⅡ和PmlⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的SRRP1基因，保持载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为SRRP1:pGFPGUS。与表达载体pGFPGUS相比，SRRP1:pGFPGUS为将表达载体pGFPGUS的GUS基因及其两端的DNA片段替换为SRRP1基因得到的重组载体，SRRP1:pGFPGUS中SRRP1基因的表达由35S启动，表达序列1所示的蛋白质。
B23)所述重组载体可含有序列4所示的用于编码SRRP2的DNA序列；进一步B23)所述重组载体具体可为将表达载体pCAMBIA3301的NcoⅠ和BglⅡ识别序列间的DNA片段替换为序列4所示的SRRP2基因，保持载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为SRRP2:pCAMBIA3301。SRRP2:pCAMBIA3301中SRRP2基因的表达由35S启动，表达序列3所示的蛋白质。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述细菌具体可为农杆菌(如农杆菌GV3101)或大肠杆菌。
上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1-H4在所述1)-3)中任一种中的应用：
H1、SRRP2；
H2、SRRP1；
H3、所述与SRRP2相关的生物材料；
H4、所述与SRRP1相关的生物材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了植物耐盐产品，所述植物耐盐产品含有下述任一种：
P1、所述成套耐盐蛋白质；
P2、SRRP2；
P3、SRRP1；
P4、所述成套生物材料；
P5、所述与SRRP2相关的生物材料；
P6、所述与SRRP1相关的生物材料。
所述成套耐盐蛋白质、SRRP2或SRRP1，或所述成套生物材料、所述与SRRP2相关的生物材料或所述与SRRP1相关的生物材料。
上述产品中，所述植物抗病剂可以以所述成套耐盐蛋白质、SRRP2、SRRP1、所述成套生物材料、所述与SRRP2相关的生物材料或所述与SRRP1相关的生物材料作为活性成分，还可以将所述成套耐盐蛋白质、SRRP2、SRRP1、所述成套生物材料、所述与SRRP2相关的生物材料或所述与SRRP1相关的生物材料与其它耐盐物质进行组合得到的组合物作为活性成分。
上述产品中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育具有耐盐性的转基因植物的方法。所述培育具有耐盐性的转基因植物的方法包括向受体植物中导入SRRP2的编码基因和/或SRRP1的编码基因得到耐盐性高于所述受体植物的耐盐性的转基因植物。
在本发明的实施例中，所述SRRP2的编码基因(即序列4所示的DNA分子)通过含有SRRP2基因表达盒的SRRP2基因重组表达载体导入目的植物中。所述SRRP2基因表达盒中，启动SRRP2基因转录的启动子为35S启动子。所述SRRP1的编码基因(即序列2所示的DNA分子)通过含有SRRP1基因表达盒的SRRP1基因重组表达载体导入目的植物中。所述SRRP1基因表达盒中，启动SRRP1基因转录的启动子为35S启动子
上述方法中，其中所述SRRP1基因和所述SRRP2基因均可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述SRRP1基因和所述SRRP2基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述SRRP1基因表达载体和所述SRRP2基因表达载体均可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
所述方法还包括从导入序列1所示的SRRP1的编码基因和/或序列3所示的SRRP2的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因植物。
上述方法中，所述SRRP2的编码基因可为所述B21)所述核酸分子；所述SRRP1的编码基因可为所述B11)所述核酸分子。
上述方法中，所述受体植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥。
本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述SRRP1基因和/或所述SRRP2基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明中，所述耐盐性具体可体现在对NaCl模拟的盐环境的耐受能力上，如在NaCl模拟的盐环境中的种子萌发率、种子相对萌发率、种子发芽势、种子相对发芽势、耐盐指数、根长和/或叶片叶绿素含量。所述种子相对萌发率可为种子在NaCl模拟的盐环境中的萌发率与种子在非盐环境中萌发率的比值。所述种子相对发芽势可为种子在NaCl模拟的盐环境中的发芽势与种子在非盐环境中发芽势的比值。所述耐盐指数可为所述植物幼苗在NaCl模拟的盐环境中的根长与在非盐环境中的根长的比值。
实验证明，SRRP1和SRRP2可以提高植物对NaCl模拟的盐环境的耐盐性，并且SRRP1和SRRP2在提高植物对NaCl模拟的盐环境的耐盐性中具有协同作用：
1、35S:SRRP1和35S:SRRP2可以提高植物在NaCl模拟的盐胁迫环境中的相对于非盐环境的萌发率与发芽势，35S:SRRP1和35S:SRRP2的联用可以进一步提高植物在NaCl模拟的盐胁迫环境中的相对于非盐环境的萌发率与发芽势：在播种第3天，转SRRP1基因的35S:SRRP1、转SRRP2的35S:SRRP2和转SRRP1与SRRP2的35S:SRRP1+35S:SRRP2的相对于非盐环境的萌发率分别为野生型的7.43、7.74和10.03倍，随着播种时间的延长，该这些倍数关系逐渐降低；35S:SRRP1+35S:SRRP2的相对于非盐环境的萌发率萌发率分别为35S:SRRP1和35S:SRRP2的1.35和1.30倍，随着播种时间的延长，该这些倍数关系也逐渐降低。
2、35S:SRRP1和35S:SRRP2可以提高植物的耐盐指数，35S:SRRP1和35S:SRRP2的联用可以进一步提高植物的耐盐指数：35S:SRRP1、35S:SRRP2和35S:SRRP1+35S:SRRP2的耐盐指数分别为WT的1.25、1.27和1.58倍；35S:SRRP1+35S:SRRP2的耐盐指数分别为35S:SRRP1和35S:SRRP2的1.27和1.25倍。
3、35S:SRRP1和35S:SRRP2可以提高植物在NaCl模拟的盐胁迫环境中的叶绿素含量，35S:SRRP1和35S:SRRP2的联用可以进一步提高植物在NaCl模拟的盐胁迫环境中的叶绿素含量：在盐环境中，35S:SRRP1、35S:SRRP2和35S:SRRP1+35S:SRRP2均比野生型耐盐，野生型植物失绿严重；在盐环境中，35S:SRRP1、35S:SRRP2和35S:SRRP1+35S:SRRP2的叶绿素平均含量分别为WT的1.23、1.25和1.62倍，35S:SRRP1+35S:SRRP2的叶绿素平均含量分别为35S:SRRP1和35S:SRRP2的1.31和1.29倍。
实验证明，可利用SRRP1与其编码基因以及SRRP2与其编码基因提高植物的耐盐性。
附图说明
图1为35S:SRRP1的苗期耐盐性实验结果。其中，35S:TaSRRP1表示35S:SRRP1，35S:TaSRRP2表示35S:SRRP2；Col-0表示野生型拟南芥(WT)，L1-1表示35S:SRRP1-1，L1-2表示35S:SRRP1-2，L1-3表示35S:SRRP1-3。
图2为35S:SRRP2的苗期耐盐性实验结果。其中，35S:TaSRRP1表示35S:SRRP1，35S:TaSRRP2表示35S:SRRP2；Col-0表示野生型拟南芥(WT)，L2-1表示35S:SRRP2-1，L2-2表示35S:SRRP2-2，L2-3表示35S:SRRP2-3。
图3为35S:SRRP1+35S:SRRP2的苗期耐盐性实验结果。其中，35S:TaSRRP1表示35S:SRRP1，35S:TaSRRP2表示35S:SRRP2；Col-0表示野生型拟南芥(WT)，L12-1表示35S:SRRP1+35S:SRRP21，L12-2表示35S:SRRP1+35S:SRRP2-2，L12-3表示35S:SRRP1+35S:SRRP2-3。
图4为不同转基因拟南芥的苗期耐盐性结果。其中，35S:TaSRRP1表示35S:SRRP1，35S:TaSRRP2表示35S:SRRP2；Col-0表示野生型拟南芥(WT)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的表达载体pGFPGUS为文献(王敏娟,侯文胜,王庆钰,等.过表达GmNHX1基因提高大豆根系的耐盐性.大豆科学,2011,30(06):889-894)中的pGFPGUSPlus，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的表达载体pCAMBIA3301(Zhiyong Ni,Zheng Hu,Qiyan Jiang,HuiZhang.GmNFYA3,a target gene of miR169,is a positive regulator ofplanttolerance to drought stress.PMB,82,113–129,2013；Zhiyong Ni,Zheng Hu,Qiyan Jiang,Hui Zhang.Overexpression of gma-MIR394a confers tolerancetodrought in transgenic Arabidopsis thaliana,Biochemical andBiophysicalResearch Communications,427,330–335,2012)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的拟南芥(Arabidopsis thaliana)为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0型)。
实施例1、耐盐相关蛋白1和耐盐相关蛋白2可以提高拟南芥的耐盐性
本实施例提供了两个来自济麦19(宋建民,刘建军,刘爱峰,李豪圣,吴祥云,赵振东。济麦19面团流变学和淀粉特性与面条品质分析，麦类作物学报，2004,24(1)：15-17)的蛋白质，分别为耐盐相关蛋白1(以下简称SRRP1)和耐盐相关蛋白2(以下简称SRRP2)，SRRP1的氨基酸序列如序列表中序列1所示，SRRP1由序列2所示的DNA分子(SRRP1基因)编码；SRRP2的氨基酸序列如序列表中序列3所示，SRRP1由序列4所示的DNA分子(SRRP2基因)编码。
一、转基因植物的获得
1、重组载体与重组菌的获得
将表达载体pGFPGUS的BglⅡ和PmlⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的SRRP1基因，保持载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为SRRP1:pGFPGUS。与表达载体pGFPGUS相比，SRRP1:pGFPGUS为将表达载体pGFPGUS的GUS基因及其两端的DNA片段替换为SRRP1基因得到的重组载体，SRRP1:pGFPGUS中SRRP1基因的表达由35S启动，表达序列1所示的蛋白质SRRP1。
将表达载体pCAMBIA3301的NcoⅠ和BglⅡ识别序列间的DNA片段替换为序列4所示的SRRP2基因，保持载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为SRRP2:pCAMBIA3301。SRRP2:pCAMBIA3301中SRRP2基因的表达由35S启动，表达序列3所示的蛋白质SRRP2。
将SRRP1:pGFPGUS、pGFPGUS、SRRP2:pCAMBIA3301和pCAMBIA3301分别导入农杆菌GV3101中，分别得到含有SRRP1:pGFPGUS、pGFPGUS、SRRP2:pCAMBIA3301和pCAMBIA3301的重组菌，将其分别命名为GV3101-SRRP1:pGFPGUS、GV3101-pGFPGUS、GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301和GV3101-p3301。
2、转基因拟南芥的获得
2.1转SRRP1基因拟南芥的获得
利用步骤1的GV3101-SRRP1:pGFPGUS采用农杆菌介导的拟南芥蘸花侵染法(Clough SJ,Bent AF.1998.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J,16:735-743)转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)，具体方法如下：
将GV3101-SRRP1:pGFPGUS活化，然后吸取1ml菌液加入40ml含有Kan(50mg/l)和Rif(50mg/l)的LB培养基中，28℃，230rpm摇床上培养至OD600达0.8左右。将菌液转移至50ml离心管内，3000rpm，离心5min，去上清液。配制侵染液(1/2MS培养基含5％蔗糖，500μl/lSilwetl-77。pH调为5.8)。向收集菌体的离心管中加入约30ml侵染液，缓慢混匀，重悬菌液。将初花的拟南芥花序浸泡在侵染液内1min左右。暗条件下处理约12h后，置于拟南芥适宜环境内，一周后，重复侵染一次。
将得到的转SRRP1基因拟南芥命名为35S:SRRP1。将T1代35S:SRRP1种子在MS培养基上经20mg·L-1的PPT除草剂和50mg·L-1的潮霉素抗性筛选，选择T3代不再发生潮霉素抗性性状分离的株系，共三个株系，分别命名为35S:SRRP1-1、35S:SRRP1-2和35S:SRRP1-3。
利用RT-PCR检测35S:SRRP1-1、35S:SRRP1-2和35S:SRRP1-3中目的基因的表达情况，用野生型拟南芥作为对照。所用引物为：SRRP1-RT-F:5'-AGGACCAGACCGCCAGCAC-3'；SRRP1-RT-R:5'-GCCCATGCCCAGCGTGTT-3'。以拟南芥AtUBQ3基因作为内参，引物为AtUBQ3-F：5'-CGGAAAGACCATTACTCTGGA-3'；AtUBQ3-R：5'-CAAGTGTGCGACCATCCTCAA-3'。结果显示，35S:SRRP1-1、35S:SRRP1-2和35S:SRRP1-3中的SRRP1基因均有表达。
按照上述农杆菌介导法转化拟南芥方法，将GV3101-SRRP1:pGFPGUS替换为GV3101-pGFPGUS，其他步骤均不变，得到转空载体pGFPGUS拟南芥，将其命名为At-pGFPGUS。
2.2转SRRP2基因拟南芥的获得
按照步骤2.1农杆菌介导法转化拟南芥方法，将GV3101-SRRP1:pGFPGUS替换为GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301，其他步骤均不变，得到转SRRP2基因拟南芥。
将得到的转SRRP2基因拟南芥命名为35S:SRRP2。将T1代35S:SRRP2种子在MS培养基上经20mg·L-1的PPT除草剂和50mg·L-1的潮霉素抗性筛选，选择T3代不再发生潮霉素抗性性状分离的株系，共三个株系，分别命名为35S:SRRP2-1、35S:SRRP2-2和35S:SRRP2-3。
利用RT-PCR检测35S:SRRP2-1、35S:SRRP2-2和35S:SRRP2-3中目的基因的表达情况，用野生型拟南芥作为对照。所用引物为：SRRP2-RT-F:5'-ACGCCGCACAGTACACCAA-3'；SRRP2-RT-R:5'-CCAAACGAGTAAAGGAAGCAAAT-3'。以拟南芥AtUBQ3基因作为内参，引物为步骤2.1中的AtUBQ3-F和AtUBQ3-R。结果显示，35S:SRRP2-1、35S:SRRP2-2和35S:SRRP2-3中的SRRP2基因均有表达。
按照上述农杆菌介导法转化拟南芥方法，将GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301替换为GV3101-pCAMBIA3301，其他步骤均不变，得到转空载体pCAMBIA3301拟南芥，将其命名为At-pCAMBIA3301。
2.3转SRRP1基因和SRRP2基因拟南芥的获得
利用步骤1的GV3101-SRRP1:pGFPGUS和GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301采用农杆菌介导法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)，具体方法如下：
将GV3101-SRRP1:pGFPGUS和GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301分别活化。吸取1mlGV3101-SRRP1:pGFPGUS菌液加入40ml含有Kan(50mg/l)和Rif(50mg/l)的LB培养基中，28℃，230rpm摇床上培养至OD600达0.8左右，将菌液转移至50ml离心管内，3000rpm，离心5min，去上清液，得到GV3101-SRRP1:pGFPGUS菌体；吸取1ml GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301菌液加入40ml含有Kan(50mg/l)和Rif(50mg/l)的LB培养基中，28℃，230rpm摇床上培养至OD600达0.8左右，得到GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301菌体。配制侵染液(1/2MS培养基含5％蔗糖，500μl/l Silwetl-77。pH调为5.8)。将GV3101-SRRP1:pGFPGUS菌体和GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301菌体混合后用30ml侵染液，缓慢重悬，得到农杆菌侵染液。将初花的拟南芥花序浸泡在农杆菌侵染液内1min左右。暗条件下处理约12h后，置于拟南芥适宜环境内，一周后，重复侵染一次。
将得到的转SRRP1基因和SRRP2基因的拟南芥命名为35S:SRRP1+35S:SRRP2。将T1代35S:SRRP1+35S:SRRP2种子在MS培养基上经20mg·L-1的PPT除草剂和50mg·L-1的潮霉素抗性筛选，选择T3代不再发生潮霉素抗性性状分离的株系，共三个株系，分别命名为35S:SRRP1+35S:SRRP2-1、35S:SRRP1+35S:SRRP2-2和35S:SRRP1+35S:SRRP2-3。
利用RT-PCR检测35S:SRRP1+35S:SRRP2-1、35S:SRRP1+35S:SRRP2-2和35S:SRRP1+35S:SRRP2-3中目的基因的表达情况，用野生型拟南芥作为对照。所用引物为：步骤2.1的SRRP1-RT-F与SRRP1-RT-R，步骤2.2的SRRP2-RT-F与SRRP2-RT-R。以拟南芥AtUBQ3基因作为内参，引物为步骤2.1中的AtUBQ3-F和AtUBQ3-R。结果显示，35S:SRRP1+35S:SRRP2-1、35S:SRRP1+35S:SRRP2-2和35S:SRRP1+35S:SRRP2-3中的SRRP1基因和SRRP2基因均有表达。
按照上述方法，将GV3101-SRRP1:pGFPGUS替换为GV3101-pGFPGUS，并将GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301替换为GV3101-pCAMBIA3301，其他步骤均不变，得到转空载体pGFPGUS和pCAMBIA3301拟南芥，将其命名为At-pGFPGUS+pCAMBIA3301。
二、转基因拟南芥耐盐性的检测
通过检测步骤一的转SRRP1基因拟南芥、转SRRP2基因拟南芥和转SRRP1基因和SRRP2基因拟南芥在盐胁迫下的萌发率、根长、叶绿素含量，检测转基因拟南芥的耐盐性，实验重复三次。
1、萌发率实验
分别在NaCl-MS培养基(NaCl-MS培养基为向MS培养基中添加NaCl得到的NaCl浓度为150mM的固体培养基)中点种消毒后的野生型拟南芥(WT)和步骤一的各转基因拟南芥(35S:SRRP1-1、35S:SRRP1-2、35S:SRRP1-3、At-pGFPGUS、35S:SRRP2-1、35S:SRRP2-2、35S:SRRP2-3、At-pCAMBIA3301、35S:SRRP1+35S:SRRP2-1、35S:SRRP1+35S:SRRP2-2、35S:SRRP1+35S:SRRP2-3和At-pGFPGUS+pCAMBIA3301)种子，每个株系拟南芥50粒种子，3个重复，并将在MS固体培养基中生长的各株系作为相应拟南芥的对照。
播种后，4℃放置3d后置于温室(22℃)正常培养，培养条件为相对湿度80％，温度20～24℃，光照强度80～200μmol/(m2·s)，光周期为16h光照和8h黑暗。当种子幼根已经穿出种皮记为萌发，每天统计种子的萌发率(在发芽试验初期，在规定的日期内正常发芽的种子数占供试种子数的百分率也叫种子发芽势。在盐胁迫下，拟南芥的发芽势为拟南芥种子在发芽第三天的萌发率)。结果发现，野生型拟南芥(WT)、At-pGFPGUS、At-pCAMBIA3301和At-pGFPGUS+pCAMBIA3301的萌发率基本无差异。将在MS固体培养基中生长的相应的拟南芥作为对照，计算各拟南芥的相对萌发率，各拟南芥的平均相对萌发率如表2所示，转基因拟南芥与野生型拟南芥平均相对萌发率间的倍数关系如表3所示，35S:SRRP1+35S:SRRP2平均相对萌发率与35S:SRRP1和35S:SRRP2的倍数关系如表4所示。使用SPSS统计软件17.0(SPSSInc.，USA)对数据进行学生t测验分析。
表2、转基因拟南芥的平均相对萌发率(％)
表3、转基因拟南芥平均相对萌发率与野生型拟南芥的倍数关系
表4、35S:SRRP1+35S:SRRP2平均相对萌发率与35S:SRRP1和35S:SRRP2的倍数关系
结果显示，在播种第3天，35S:SRRP1、35S:SRRP2和35S:SRRP1+35S:SRRP2的平均相对萌发率(即平均相对发芽势)分别为WT的7.43、7.74和10.03倍，随着播种时间的延长，该这些倍数关系逐渐降低；35S:SRRP1+35S:SRRP2的平均相对萌发率分别为35S:SRRP1和35S:SRRP2的1.35和1.30倍，随着播种时间的延长，该这些倍数关系也逐渐降低。表明，35S:SRRP1和35S:SRRP2可以提高拟南芥在NaCl模拟的盐胁迫环境中的发芽势，35S:SRRP1和35S:SRRP2的联用可以进一步提高拟南芥在NaCl模拟的盐胁迫环境中的发芽势。
2、根长实验
分别在MS培养基中点种消毒后的野生型拟南芥(WT)和步骤一的各转基因拟南芥(35S:SRRP1-1、35S:SRRP1-2、35S:SRRP1-3、At-pGFPGUS、35S:SRRP2-1、35S:SRRP2-2、35S:SRRP2-3、At-pCAMBIA3301、35S:SRRP1+35S:SRRP2-1、35S:SRRP1+35S:SRRP2-2、35S:SRRP1+35S:SRRP2-3和At-pGFPGUS+pCAMBIA3301)种子，每个株系拟南芥50粒种子。
播种5天后，各拟南芥各取6株转移至100mM NaCl-MS培养基(100mM NaCl-MS培养基为向MS培养基中添加NaCl得到的NaCl浓度为100mM的固体培养基)中，在正常条件下竖直培养7天，培养条件为相对湿度80％，温度20～24℃，光照强度80～200μmol/(m2·s)，光周期为16h光照和8h黑暗，测量幼苗的根长，共6个重复。
将在MS固体培养基中播种5天后又在正常条件下竖直培养7天的各拟南芥作为相应拟南芥的对照。依据下列公式计算耐盐指数，各拟南芥的平均耐盐指数如表5所示：
使用SPSS统计软件17.0(SPSS Inc.，USA)对数据进行学生t测验分析。
表5、转基因拟南芥的根长平均耐盐指数
拟南芥 平均耐盐指数
35S:SRRP1 0.75
35S:SRRP2 0.76
35S:SRRP1+35S:SRRP2 0.95
WT 0.60
结果发现，野生型拟南芥(WT)、At-pGFPGUS、At-pCAMBIA3301和At-pGFPGUS+pCAMBIA3301的耐盐指数基本无差异。结果显示，35S:SRRP1、35S:SRRP2和35S:SRRP1+35S:SRRP2的耐盐指数分别为WT的1.25、1.27和1.58倍；35S:SRRP1+35S:SRRP2的耐盐指数分别为35S:SRRP1和35S:SRRP2的1.27和1.25倍。表明，35S:SRRP1和35S:SRRP2可以提高拟南芥的耐盐指数，35S:SRRP1和35S:SRRP2的联用可以进一步提高拟南芥的耐盐指数。
3、苗期耐盐实验
分别在MS培养基中点种消毒后的野生型拟南芥(WT)和步骤一的各转基因拟南芥(35S:SRRP1-1、35S:SRRP1-2、35S:SRRP1-3、At-pGFPGUS、35S:SRRP2-1、35S:SRRP2-2、35S:SRRP2-3、At-pCAMBIA3301、35S:SRRP1+35S:SRRP2-1、35S:SRRP1+35S:SRRP2-2、35S:SRRP1+35S:SRRP2-3和At-pGFPGUS+pCAMBIA3301)种子。
播种10天后，各株系各取45株转移至营养土与蛭石(1:1)混合土中，每盆移栽5株，正常培养浇水45d后，在托盘底部浇灌350mM NaCl，但土壤吸收盐溶液饱和后，去除盐溶液，正常条件下培养，培养条件为相对湿度80％，温度20～24℃，光照强度80～200μmol/(m2·s)，光周期为16h光照和8h黑暗，观察植物在盐胁迫下的表型，盐胁迫8天后测定植株叶绿素含量。
叶绿素含量的测定方法如下：80％丙酮萃取叶绿素，使用DU800分光光度计(Fμllerton，CA，USA)测量663和645nm的吸光率。叶绿素含量计算公式Chl＝(0.0802×A663+0.202×A645)/W，单位为mg/g，其中A663，A645分别是叶绿素溶液在波长663nm和645nm处的吸光值。每个株系测定5个植株，W为植株重量。结果如图1、图2、图3和图4以及表6所示。使用SPSS统计软件17.0(SPSS Inc.，USA)对数据进行学生t测验分析。
表6、转基因拟南芥的在不同处理下的叶绿素平均含量(mg/g)
转基因拟南芥 叶绿素平均含量
35S:SRRP1 0.74
35S:SRRP2 0.75
35S:SRRP1+35S:SRRP2 0.97
WT 0.60
从图1-图4可以看出35S:SRRP1、35S:SRRP2和35S:SRRP1+35S:SRRP2均比WT耐盐，盐胁迫条件下野生型拟南芥失绿严重。野生型拟南芥(WT)、At-pGFPGUS、At-pCAMBIA3301和At-pGFPGUS+pCAMBIA3301的叶绿素含量基本无差异；35S:SRRP1、35S:SRRP2和35S:SRRP1+35S:SRRP2的叶绿素平均含量分别为WT的1.23、1.25和1.62倍；35S:SRRP1+35S:SRRP2的叶绿素平均含量分别为35S:SRRP1和35S:SRRP2的1.31和1.29倍。表明，35S:SRRP1和35S:SRRP2可以提高拟南芥在NaCl模拟的盐胁迫环境中的叶绿素含量，35S:SRRP1和35S:SRRP2的联用可以进一步提高拟南芥在NaCl模拟的盐胁迫环境中的叶绿素含量。
结果表明，SRRP1和SRRP2可以提高拟南芥对NaCl模拟的盐环境的耐盐性，并且SRRP1和SRRP2在提高拟南芥对NaCl模拟的盐环境的耐盐性中具有协同作用。

Claims (9)

1.成套耐盐蛋白质在下述1）-3）中任一种中的应用：
1）调控植物耐盐性；
2）制备提高植物耐盐性产品；
3）培育耐盐性植物；
所述成套蛋白质由耐盐相关蛋白1和耐盐相关蛋白2组成，所述耐盐相关蛋白1为氨基酸序列是序列1的蛋白质；
所述耐盐相关蛋白2为氨基酸序列是序列3的蛋白质。
2.成套生物材料在权利要求1中所述1）-3）中任一种中的应用；所述成套生物材料由与权利要求1中所述耐盐相关蛋白1相关的生物材料和与权利要求1中所述耐盐相关蛋白2相关的生物材料组成；
所述与权利要求1中所述耐盐相关蛋白1相关的生物材料为下述B11）至B15）中的任一种：
B11）编码权利要求1中所述耐盐相关蛋白1的核酸分子；
B12）含有B11）所述核酸分子的表达盒；
B13）含有B11）所述核酸分子的重组载体、或含有B12）所述表达盒的重组载体；
B14）含有B11）所述核酸分子的重组微生物、或含有B12）所述表达盒的重组微生物、或含有B13）所述重组载体的重组微生物；
B15）含有B11）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B12）所述表达盒的转基因植物组织；
所述与权利要求1中所述耐盐相关蛋白2相关的生物材料为下述B21）至B25）中的任一种：
B21）编码权利要求1中所述耐盐相关蛋白2的核酸分子；
B22）含有B21）所述核酸分子的表达盒；
B23）含有B21）所述核酸分子的重组载体、或含有B22）所述表达盒的重组载体；
B24）含有B21）所述核酸分子的重组微生物、或含有B22）所述表达盒的重组微生物、或含有B23）所述重组载体的重组微生物；
B25）含有B21）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B22）所述表达盒的转基因植物组织。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
B11）所述核酸分子为其编码序列是序列表中序列2的DNA分子；
B21）所述核酸分子为其编码序列是序列表中序列4的DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
5.植物耐盐产品，其特征在于：所述植物耐盐产品含有下述任一种：
P1、权利要求1中所述成套耐盐蛋白质；
P2、权利要求2或3中所述成套生物材料。
6.根据权利要求5所述产品，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
7.一种培育具有耐盐性的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1中所述耐盐相关蛋白2的编码基因和所述耐盐相关蛋白1的编码基因得到耐盐性高于所述受体植物的耐盐性的转基因植物。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于：权利要求1中所述耐盐相关蛋白2的编码基因为权利要求2或3中所述B21）所述核酸分子；权利要求1中所述耐盐相关蛋白1的编码基因为权利要求2或3中所述B11）所述核酸分子。
9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于：所述受体植物为双子叶植物或单子叶植物。
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植物耐盐性的分子生物学研究进展;卢青;《生物学杂志》;20081105;第17卷(第4期);全文 *

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