CN113125384A - 探头，循环肿瘤细胞检测设备及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种探头，制备该探头的方法，以及使用该探头的循环肿瘤细胞检测设备。所述探头，包括光线纤芯、光纤包层、纳米金薄膜和反射镜，所述光纤包层包裹所述光线纤芯的外周壁，所述纳米金薄膜包裹所述光纤包层的外周壁，所述反射镜封闭所述光线纤芯的一端且所述反射镜的反射面朝向所述光线纤芯，所述光线纤芯的周壁上设有光栅，所述纳米金薄膜的外侧表面修饰有疟原虫蛋白VAR2CSA。光纤纤芯中传输的光纤纤芯导模通过光栅时，由于满足相位匹配条件可激发包层模式。疟原虫蛋白VAR2CSA捕获CTC时会影响包层模式，使得纤芯导模能量的变化，因此可以从输出光谱中读出待测样品中是否含有CTC。
Description
技术领域
本发明涉及检测设备技术领域，特别涉及一种能够识别循环肿瘤细胞的探头，制备该探头的方法，以及使用该探头的循环肿瘤细胞检测设备。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)。美国食品药品监督管理局(Foodand Drug Administration，FDA)最早批准的CTC临床检测设备是强生诊断公司(JanssenDiagnostics)的CellSearchTM，第一代CTC检测技术，属于流式正向富集荧光标记技术，其特点或局限性是只能检测上皮来源的CTC，其标志物是EpCAM、DAPI，细胞角蛋白以及CD45。因而CellSearch仅被批准用于转移性乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。另外的一个缺点就是特异性不够，因为炎症也可能会使上皮细胞进入血液。
第二代CTC检测技术是免疫磁珠负向富集技术，要结合PCR或FISH技术一起使用，除第一代技术的局限性外，更由于附加的检测手段而使得结果的可靠性更难判定。
即使是国内最新的CTC检测手段，也存在其自身的局限性。肿瘤细胞的代谢具有依赖或成瘾性，一部分依赖于糖酵解，另外一部分依赖于谷氨酰胺代谢。因而基于糖酵解代谢特征的正电子发射断层-X线计算机断层组合系统(PET-CT)检测技术原理的CTCell明效TM只适用于依赖于糖酵解的肿瘤。
发明内容
本发明目的在于提供一种探头，制备该探头的方法，以及使用该探头的循环肿瘤细胞检测设备，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
为解决上述技术问题所采用的技术方案是提供一种探头，包括光线纤芯、光纤包层、纳米金薄膜和反射镜，所述光纤包层包裹所述光线纤芯的外周壁，所述纳米金薄膜包裹所述光纤包层的外周壁，所述反射镜封闭所述光线纤芯的一端且所述反射镜的反射面朝向所述光线纤芯，所述光线纤芯的周壁上设有光栅，所述纳米金薄膜的外侧表面修饰有疟原虫蛋白VAR2CSA。
光纤纤芯中传输的光纤纤芯导模通过光栅时，由于满足相位匹配条件，光纤纤芯导模中的部分能量被耦合到光纤包层，激发包层模式。而激发的包层模式将部分能量耦合到纳米金薄膜，激发表面等离子波。而表面等离子波由于能量集中，对纳米金薄膜表面附近的变化极其敏感。当修饰在纳米金薄膜表面的疟原虫蛋白VAR2CSA捕获CTC时会使纳米金薄膜表面附近发生变化，表面等离子波受到影响，进而能够影响纤芯导模与包层模式的耦合效率，从而实现探测功能。
在本发明的一些实施方式中，所述光栅的延伸方向与所述光线纤芯的轴线具有夹角θ，15°≤θ≤25°。该夹角范围能够适配水溶液中生物样品的测量参数，超出则会明显降低检测精度。
在本发明的一些实施方式中，所述光栅的长度为1～2cm。过短的光栅长度会使光谱深度不足，过长的光栅长度则会由于太长而影响实验操作，增加操作难度。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米金薄膜的厚度为45～55nm。过厚的金薄膜会降低其表面等离子体共振的激发成功率。
在本发明的一些实施方式中，所述反射镜由200～250nm的金膜镀成。反射镜的金膜过薄会降低反射率，造成能量损耗，降低探头性能。
本发明另一方面提供了上述探头的制备方法，其中包括将疟原虫蛋白VAR2CSA修饰于纳米金薄膜的外侧表面的步骤：
1)清洁纳米金薄膜；
2)用11-巯基十一烷酸溶液浸泡纳米金薄膜，使纳米金薄膜表面形成一层巯基化合物的自组装单层膜，然后冲洗去除多余的11-巯基十一烷酸溶液；
3)以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液浸泡纳米金薄膜，活化自组装单层膜上的羧基，然后冲洗去除多余的混合溶液；
4)将纳米金薄膜浸泡于疟原虫蛋白VAR2CSA溶液中1～4h，即得。
在本发明的一些实施方式中，步骤2所述11-巯基十一烷酸溶液的浓度为4～6mmol/L，所用溶剂为无水乙醇。通过先用无水乙醇冲刷5～15min，再用去离子水冲刷的方式，去除未反应的11-巯基十一烷酸溶液。
在本发明的一些实施方式中，步骤3所述混合溶液是由浓度约为50mmmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与浓度约为50mmmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺溶液按(1～3):1的体积比混合而成。通过使用缓冲溶液冲刷的方式去除未反应的混合溶液。所述缓冲溶液可选用磷酸盐缓冲液，PBS(phosphate buffer saline)。
在本发明的一些实施方式中，步骤4所述疟原虫蛋白VAR2CSA溶液的浓度为1μmol/L。
本发明第二方面还提供了一种循环肿瘤细胞检测设备，其安装有如上所述的探头。由于该探头疟原虫蛋白VAR2CSA捕获CTC时会影响纤芯导模与包层模式的耦合效率，使得纤芯导模能量的变化，因此可以从输出光谱中读出待测样品中是否含有CTC。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
提供了一种利用疟原虫蛋白VAR2CSA的生物型探头，能够利用其与CTC多糖特异性结合的方法直接捕获CTC，无需如现有技术般以EpCAM、DAPI、细胞角蛋白、CD45等标志物进行识别，可以检测不同种类的CTC，且提高了检测的准确性。探针基于光纤光栅表面等离子体共振，并以疟原虫蛋白VAR2CSA作为生物探针的循环肿瘤细胞检测方法，具有快速检测、原位检测的优点。所述循环肿瘤细胞检测设备在完成检测以后，可以通过生物分子竞争的方式，将CTC从探头上剥离，而不会对探头造成损伤，使探头可以重复使用。
附图说明
图1是实施例1所述探头的结构示意图；
图2是实施例2检测样品的光谱图；
附图标号分别为：1.光纤包层，2.光纤纤芯，3.光栅，4.纳米金薄膜，5.反射镜，6.光纤纤芯导模，7.包层模式，8.疟原虫蛋白VAR2CSA，9.循环肿瘤细胞CTC，10.表面离子波。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，探头的制备
选取能够提高光敏性的掺锗光纤作为光纤纤芯2，以相位掩膜板法制备光纤纤芯2上的光栅3。以准分子激光器发出的紫外激光通过反射镜5、柱面镜后照射到相位掩膜板，调整好相位掩膜板的倾斜角度，便可以将倾斜光栅3写入到光纤纤芯2中。
通过磁控溅射法对光纤包层1表面镀上纳米金薄膜4。首先，利用真空泵将镀膜腔抽真空，使真空度达到10-3Pa；其次，向镀膜腔里充氩气，并控制真空度为5Pa左右，两个电极两端加0.8kV的电场，使氩气电离，被电离的粒子轰击金属靶材，使其原子脱靶后吸附在光纤包层1表面。为了使镀在光纤包层1表面的薄膜更加的均匀，在镀膜的同时将光纤绕自身光轴匀速旋转从而保证金原子均匀的附着。镀膜过程一般40～50秒。
反射镜5的制备可以采用镀上纳米金薄膜4相同的镀膜方法，适当延长镀膜时长至10分钟左右，保证反射镜5具有足够厚度。
对覆膜后的光纤进行疟原虫蛋白VAR2CSA 8修饰。1)用无水乙醇对镀了金纳米薄膜的探头进行清洗，除去探头表面的灰尘等污染物。2)用无水乙醇配制浓度为5mmol/L的11-十一巯基烷酸溶液，然后将探头在其中浸泡12h，使金膜表面形成一层巯基化合物的自组装单层膜(SAM)，然后用无水乙醇冲刷探头10min，将金膜表面没形成自组装膜的11-十一巯基烷酸分子清除掉，再用去离子水清洗探头20min，除掉残留的乙醇及11-十一巯基烷酸分子。3)用去离子水配制浓度为50mmol/L的EDC与NHS溶液，再将其按比例EDC:NHS＝3:1混合，然后将探头浸泡于混合溶液1h，活化巯基化合物自组装膜上的羧基，再用缓冲液冲洗探头10min，将残留的EDC及NHS冲洗干净。4)将探头浸泡于配制好的浓度为1μmol/L的疟原虫蛋白VAR2CSA溶液2h，金膜表面自组装膜SAM上的羧基将与疟原虫蛋白VAR2CSA上的自由氨基结合，将疟原虫蛋白固定在金膜表面上，形成生物探针。具有疟原虫蛋白VAR2CSA 8的生物型探头，能够利用其与循环肿瘤细胞CTC 9多糖特异性结合的方法直接捕获CTC。光纤纤芯2中传输的光纤纤芯导模6通过光栅3时，由于满足相位匹配条件，光纤纤芯导模6中的部分能量被耦合到光纤包层1，激发包层模式7。而激发的包层模式7将部分能量耦合到纳米金薄膜4，激发表面等离子波10。而结合有循环肿瘤细胞CTC 9的疟原虫蛋白VAR2CSA 8影响光纤纤芯导模6与包层模式7的耦合效率，从而实现探测功能。
实施例2，CTC检测设备的验证
为了验证探头对于CTC检测的可行性，分别对阴性样本(只有正常细胞的样品溶液)和阳性样本(CTC浓度为1个/10mL的样品溶液)进行了测试。将实施例1制作好的探头分别插入到阴性样本及阳性样本中，每30秒记录一个光谱，记录半个小时，实验结果如图2所示。实验结果显示，当样品溶液中只有正常细胞时，探头的输出光谱是基本不变的；而当样品溶液中含有少量CTC，光谱图在表面等离子波吸收区的光谱发生了明显的变化(见图2光谱图中的波谷)。实验结果证明，探头可以检测CTC浓度为1个/10mL样品溶液，标定模式(如图2中箭头所示处)强度的变化值大于0.2dB(远大于探头本身的测量误差0.02dB)。健康人的血液中不含CTC的，一般患者10毫升的血液中的CTC含量仅为1-10，所以我们的探头精度可以满足实际测量要求。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (10)
1.一种探头，其特征在于，包括光线纤芯、光纤包层、纳米金薄膜和反射镜，所述光纤包层包裹所述光线纤芯的外周壁，所述纳米金薄膜包裹所述光纤包层的外周壁，所述反射镜封闭所述光线纤芯的一端且所述反射镜的反射面朝向所述光线纤芯，所述光线纤芯的周壁上设有光栅，所述纳米金薄膜的外侧表面修饰有疟原虫蛋白VAR2CSA。
2.根据权利要求1所述的探头，其特征在于：所述光栅的延伸方向与所述光线纤芯的轴线具有夹角θ，15°≤θ≤25°。
3.根据权利要求1所述的探头，其特征在于：所述光栅的长度为1～2cm。
4.根据权利要求1所述的探头，其特征在于：所述纳米金薄膜的厚度为45～55nm。
5.根据权利要求1所述的探头，其特征在于：所述反射镜由200～250nm的金膜镀成。
6.权利要求1所述探头的制备方法，其特征在于，包括疟原虫蛋白VAR2CSA修饰于纳米金薄膜的外侧表面的步骤：
1)清洁纳米金薄膜；
2)用11-巯基十一烷酸溶液浸泡纳米金薄膜，使纳米金薄膜表面形成一层巯基化合物的自组装单层膜，然后冲洗去除多余的11-巯基十一烷酸溶液；
3)以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液浸泡纳米金薄膜，活化自组装单层膜上的羧基，然后冲洗去除多余的混合溶液；
4)将纳米金薄膜浸泡于疟原虫蛋白VAR2CSA溶液中1～4h，即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述11-巯基十一烷酸溶液的浓度为4～6mmol/L，所用溶剂为无水乙醇。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述混合溶液是由浓度约为50mmmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与浓度约为50m mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺溶液按(1～3):1的体积比混合而成。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述疟原虫蛋白VAR2CSA溶液的浓度为1μmol/L。
10.一种循环肿瘤细胞检测设备，其特征在于，包括如权利要求1至5任一项所述探头。
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