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CN113088463A - 一种具有益生特性的嗜酸乳杆菌及其应用 - Google Patents

一种具有益生特性的嗜酸乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有益生特性的嗜酸乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）为保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌LA85，其属于人源乳酸菌，具有较高的抵抗胃肠道胁迫的能力，对条件致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，对常见抗生素药物敏感，不具有耐药性，且该菌株具有生长速率快，生长周期短，活菌数量高，可有效调节机体免疫反应，能够用于制备免疫调节药物和用于食品领域。

Description

一种具有益生特性的嗜酸乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有益生特性的嗜酸乳杆菌及其应用。
背景技术
人类胃肠道中含有大量有益的细菌群落，它们对维持人体健康起着重要的作用。正常、稳定、有益的肠道微生物菌群具有多种生物学功能，如提高营养物质的消化和吸收，调节肠道微生物群的平衡，稳定肠道屏障的完整性，防御肠道病原菌粘附和侵袭，刺激宿主细胞和体液免疫反应。影响肠道菌群组成最常用的方法是饮食益生菌，多年来，许多种类的微生物被使用，它们主要由乳酸细菌和双歧杆菌组成，但也包括芽孢杆菌和真菌。传统的益生菌，如乳酸细菌和双歧杆菌，在预防疾病和促进人体健康方面均表现出积极的作用，具有较高的理论研究和产品应用价值。
益生菌是指活体微生物，当摄入足够数量时，给宿主带来健康益处。通过研究益生菌在模拟胃肠道中的存活情况、对病原菌生长的抑制能力、对药物的敏感性以及对胃肠道的黏附能力，进一步认识益生菌益生作用的机制及其在不同领域的应用价值。
乳酸菌是应用最广、时间最长、种类最多的一类益生菌，其中应用较为广泛的是乳酸杆菌，而嗜酸乳杆菌是乳酸杆菌家族中极为重视和研究开发的菌株之一，在乳制品工业中有广泛的历史应用，能够大量分泌乳酸、乙酸等酸性物质，能在酸性较强的胃液中生长繁殖，被称为胃部环境的“移动消毒车”，对维持胃肠道的生理功能有重要作用。嗜酸乳杆菌是乳酸菌的主要商业物种，因其风味和益生作用而被广泛添加到商业酸奶和乳制品配方，以及有益生作用的膳食补充剂中，是最常用的膳食乳酸菌品种之一，具有较高的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有益生特性的嗜酸乳杆菌LA85及其应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有益生特性的嗜酸乳杆菌LA85，其分类命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus，该菌株于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21802。
所述的嗜酸乳杆菌LA85具有以下特征：
(1)菌落形态：圆形、浅灰色、不透明，菌落较小，边缘不规则，表面凸起不湿润；
(2)菌体形态：革兰氏阳性杆菌，有短杆、长杆形态，两端钝圆，不产芽孢；
(3)生长特点：培养基最适pH为6.0，最适温度为37℃，生长快，4h进入对数生长期，10h进入稳定期。
所述的嗜酸乳杆菌LA85具有以下益生特性：
(1)在pH2.5的人工胃液中处理3h，其存活率为99.07％；
(2)在pH8.0的人工肠液中处理3h，其存活率为98.93％；
(3)对常见的条件致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长有很强的抑制作用；
(4)对常见抗生素药物表现出不同程度的敏感性，不具备耐药性。
本发明所述的嗜酸乳杆菌LA85可以调节小鼠体内免疫相关的细胞因子水平，其具有免疫调节功能，可用于制备免疫调节药物。
一种免疫调节药物，包含所述的嗜酸乳杆菌LA85。
所述的嗜酸乳杆菌LA85还可用于食品领域，如保健食品、含活性乳酸菌的食品或发酵食品等。所述的保健食品包括但不限于发酵食品或微生态制剂。
一种食品，包含所述的嗜酸乳杆菌LA85。
本发明的有益效果在于：本发明所提供的嗜酸乳杆菌LA85属于人源乳酸菌，其具有较高的抵抗胃肠道胁迫的能力，对条件致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，对常见抗生素药物敏感，不具有耐药性，且该菌株具有生长速率快，生长周期短，活菌数量高，可有效调节机体免疫反应。
附图说明
图1为嗜酸乳杆菌LA85在MRS平板培养基上的菌落形态图。
图2为嗜酸乳杆菌LA85经革兰氏染色后的菌体形态图。
图3为嗜酸乳杆菌LA85在MRS培养基中的生长曲线及pH曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
实施例1嗜酸乳杆菌LA85的分离筛选与鉴定
(1)菌株的分离筛选
菌株分离自健康人体粪便，具体分离筛选方法如下：
取健康人体粪便样品1g至9mL生理盐水中，充分振荡分散样品，取100μL样品梯度稀释，选取10-1、10-2、10-3菌液各100μL均匀涂布于MRS平板，置于厌氧条件下，37℃培养36～48h后，挑选疑似菌落，对其镜检观察并进行初步筛选和纯化培养。
MRS培养基配方(g/L)：蛋白胨10、牛肉浸粉5、酵母粉5、葡萄糖20、无水乙酸钠5、柠檬酸氢二铵2、吐温80 1、K2HPO4 2、MgSO4 0.2、MnSO4 0.05，pH6.5，121℃高压灭菌20min，固体MRS培养基中加入1.5％的琼脂粉。
(2)菌株的形态学和16S rDNA鉴定
形态学鉴定包括菌株在平板培养基上的菌落形态以及革兰氏染色后显微镜下的菌体形态。
本发明的嗜酸乳杆菌LA85的菌落和菌体形态见图1和2。菌落呈圆形、浅灰色、不透明，边缘整齐，直径约1～2mm，表面干燥凸起。菌体形态为革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列。
对筛选的目的菌株液体扩培，收集菌体，提取基因组DNA，采用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT扩增其16S rDNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。将获得的目的片段进行测序分析，测序结果在NCBI数据库中进行比对分析，鉴定所得菌株为嗜酸乳杆菌，其分类命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus，该菌株已于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.21802，菌株编号为LA85。
实施例2嗜酸乳杆菌LA85生长曲线和pH曲线
将嗜酸乳杆菌LA85活化后种子液以2％(V/V)接种量转接至10mL的新鲜MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，定时取样，测定培养液的OD600和pH，每个样品3组重复，以培养时间为横坐标，OD600或pH值为纵坐标，绘制菌株生长曲线和pH曲线(见图3)。嗜酸乳杆菌LA85在4h进入对数生长期，10h进入稳定期，发酵周期短。pH曲线在0-10h缓慢下降，10h后pH维持在4.0左右。
实施例3嗜酸乳杆菌LA85对人工胃肠液耐受性
人工胃液配方：配制0.85％生理盐水，用稀盐酸调节pH至2.5，然后加入0.3％胃蛋白酶，充分溶解后用微孔滤膜过滤除菌备用。
人工肠液配方：配制0.85％生理盐水，用氢氧化钠调节pH至8.0，然后加入0.1％胰蛋白酶，充分溶解后用微孔滤膜过滤除菌备用。
活化实验菌株至稳定期，以2％(V/V)比例分别转入上述配制的人工胃液和人工肠液中，每个处理3组重复，测定处理液中活菌数，然后置于37℃孵育3h后，再次测定处理液中活菌数，采用公式存活率(％)＝(logN3/logN0)×100％计算菌株存活率，其中N3为人工胃液/肠液处理3h后的活菌数，N0为处理0h的活菌数。嗜酸乳杆菌LA85在人工胃液和人工肠液中的耐受结果见表1。由表1可知，该菌株在人工胃液、肠液中处理3h后保持非常高的存活率，表明该菌株具有良好的耐受胃肠液的能力。
表1嗜酸乳杆菌LA85对人工胃液、人工肠液耐受存活率
Figure BDA0002980431000000041
实施例4嗜酸乳杆菌LA85对病原菌的抑制能力
指示菌悬液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别在平板培养基上活化，37℃培养24h，挑取菌苔至生理盐水制备菌悬液，调整菌液浓度至108-1010CFU/mL。
嗜酸乳杆菌LA85发酵液制备：将嗜酸乳杆菌LA85按1％(V/V)接种至MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h。
抑菌实验：将含有1.5％琼脂的MRS肉汤培养基冷却至55℃左右，与指示菌悬液按一定比例混匀，使指示菌的活菌数在106CFU/mL或108CFU/mL数量级，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，于每孔注入200μL嗜酸乳杆菌LA85发酵液(活菌数为108CFU/mL数量级)，37℃过夜培养后，测量抑菌圈直径。结果如表2所示。
表2嗜酸乳杆菌LA85发酵液对病原菌的抑制作用
Figure BDA0002980431000000042
由上表可得，当指示菌浓度106CFU/mL时，嗜酸乳杆菌LA85对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的生长有非常强的抑制作用，尤其对大肠杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径达到44mm。当把指示菌浓度调整至108CFU/mL时，嗜酸乳杆菌LA85对三种病原菌仍表现出了较强的抑制作用。
实施例5嗜酸乳杆菌LA85细胞表面疏水性测定
将嗜酸乳杆菌LA85在MRS液体培养基种过夜培养，取20mL菌液离心、去上清，收集菌体，用PBS缓冲液清洗细胞2次后，用PBS重悬，充分振荡打散细胞，调整菌体浓度为OD600约1.0，取15mL菌液至试管，加入5mL二甲苯，以不加二甲苯的菌液为对照，然后充分振荡，静置20min后，出现分层，取下层水相，测定OD600，计算菌株疏水力(％)＝(1-At/A0)×100％，其中At为菌液与二甲苯混匀后水相OD600值，A0为菌液初始OD600值。
结果显示，嗜酸乳杆菌LA85菌体经二甲苯处理前后的OD600值分别为0.649和0.059，菌株对二甲苯疏水力为90.9％。表明菌株在肠黏膜表面具很强的黏附性，有助于菌株在肠道内更好的发挥益生功效。
实施例6嗜酸乳杆菌LA85的安全性评价
(1)对常见药物敏感性评价
将嗜酸乳杆菌LA85在MRS固体平板上划线活化后，挑取菌苔至生理盐水中制备菌悬液，调整菌悬液浓度为108CFU/mL，取100μL菌悬液，用无菌棉签均匀涂布于MRS固体平板上，将抗生素药敏试纸片有序置于平板表面，置于厌氧条件下，37℃培养24-36h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。
根据美国临床和实验标准协会CLSI的评价标准，得到菌株对17种常用抗生素敏感性结果，见表3，嗜酸乳杆菌LA85对这些药物敏感，说明该菌株安全，可潜在的用于生物制品或膳食补充剂。
表3嗜酸乳杆菌LA85对抗生素的敏感性
Figure BDA0002980431000000051
Figure BDA0002980431000000061
注：S-敏感；I-中度耐药。
(2)溶血性实验
以化脓性链球菌作为对照，对菌株进行溶血实验。化脓性链球菌接种于哥伦比亚琼脂平板培养后菌落周围出现透明的溶血圈，是乙型溶血(β溶血)；而嗜酸乳杆菌LA85接种于该培养基后，菌落周围未出现溶血圈，因此判断该菌株没有溶血性，不会产生溶血性危害。
实施例7嗜酸乳杆菌LA85的免疫调节功能
实验动物：SPF级BLAB/c，6-8周幼龄雄性小鼠。
动物饲喂：所有实验小鼠均饲养于塑料笼中，标准膳食，自由饮水。环境温度：23±1℃，湿度55±10％。
动物分组及益生菌干预：将小鼠随机分为2组，分别为对照组和嗜酸乳杆菌LA85干预组，每组12只小鼠。对照组：每只小鼠每天灌胃100μL 10％(w/v)脱脂奶粉；嗜酸乳杆菌LA85干预组：每只小鼠每天灌胃100μL含108CFU嗜酸乳杆菌LA85的10％(w/v)脱脂奶粉，持续喂养14天。
免疫组织样本制备：在14天饲养实验结束后，分别处死小鼠，取出小肠，解剖成段，固定在95％酒精中，然后将组织包埋在石蜡块中进行免疫荧光检测。
免疫荧光检测分泌IgA细胞数量：用直接免疫荧光法测定小鼠小肠组织切片中IgA分泌细胞数量，组织学切片在二甲苯中浸泡，再在乙醇中水化，在室温用1％的牛血清蛋白蛋白封闭液孵育30min，然后在37℃条件下将组织切片与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗IgA特异性抗体在0.01M PBS缓冲液中共同孵育30min，孵育结束后用PBS溶液洗涤3次，用荧光显微镜观察10个视野中阳性荧光细胞数量，实验结果见表4。
表4嗜酸乳杆菌LA85对小鼠小肠产生IgA细胞的影响
Figure BDA0002980431000000062
注：*表示与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.001)。
血清细胞因子检测：处死小鼠后，收集血液，并在4℃过夜凝固，然后用2000rpm，10min离心从血液中提取血清，用ELISA试剂盒分别测定不同处理组小鼠血清中IL-12和IFN-γ的含量，结果见表5。
表5小鼠血清中IL-12和IFN-γ细胞因子检测
Figure BDA0002980431000000071
注：*表示与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。
结果显示，小鼠在饲喂嗜酸乳杆菌LA85 14天后，小肠内产IgA细胞的数量增加，同时提高了小鼠血清中IL-12水平，降低了IFN-γ的水平。胃肠道中IgA在保护粘液表面免受致病性菌感染和致癌方面起着积极的作用；IL-12是在细菌及其代谢产物刺激下，巨噬细胞释放的一种细胞因子，主要作用是增强细胞免疫能力，在抗肿瘤免疫中发挥正向调节作用；IFN-γ，一种Th1型细胞因子，在宿主中有多个功能，主要在细胞免疫反应中释放，参与抗肿瘤和抗感染反应。综上所述，用嗜酸乳杆菌LA85饲喂小鼠后，可以调节小鼠体内免疫相关的细胞因子水平，对小鼠起免疫调节作用。
实施例8含嗜酸乳杆菌LA85益生菌固体饮料的制备
含嗜酸乳杆菌的益生菌固体饮料由以下原料制备而成：菊粉(43％)、低聚果糖(20％)、脱脂乳粉、赤藓糖醇、麦芽糊精、蓝莓水果粉、嗜酸乳杆菌、乳双岐杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。制备此固体饮料的具体方法为：称取麦芽糊精按1：4～1：6重量比投入70℃温水中，充分搅拌至完全溶解后过80目筛，得到浆液待用；称取菊粉、低聚果糖、脱脂乳粉、赤藓糖醇、蓝莓水果粉，投入沸腾制粒机中，设置温度65℃，引风频率28Hz，混料20min至均匀，得到混合物料；更改设置沸腾制粒机温度至55℃，引风频率28Hz，将混合浆液在压力0.1MPa，流速80r/min条件下喷入沸腾制粒机中的混合物料中，喷浆时间50min至物料出现颗粒度均匀的状态，得到造粒体；更改设置沸腾制粒机温度65℃，引风频率25Hz，将造粒体干燥20min后停止加热，待料温降至50℃以下后收料；将所收料与嗜酸乳杆菌、乳双岐杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌均匀混合后分装。并对3个批次固体饮料的活菌量进行活菌检测，结果表明本发明的益生菌固体饮料，其益生菌活菌量大于1×1010CFU/g。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），其特征在于：所述的嗜酸乳杆菌为保藏编号为CGMCC No.21802的嗜酸乳杆菌 LA85。
2.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在食品领域中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的食品领域包括保健食品、含活性乳酸菌的食品或发酵食品。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的保健食品包括微生态制剂。
5.一种食品，其特征在于：所述的食品包含权利要求1所述的嗜酸乳杆菌。
6.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在制备免疫调节药物中的应用。
7.一种免疫调节药物，其特征在于：所述的免疫调节药物包含权利要求1所述的嗜酸乳杆菌。
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