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CN113061192A - 一类对pd-1受体具有高亲和力的pdl1融合蛋白及其作为t细胞抑制剂的应用 - Google Patents

一类对pd-1受体具有高亲和力的pdl1融合蛋白及其作为t细胞抑制剂的应用 Download PDF

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CN113061192A CN202110390981.5A CN202110390981A CN113061192A CN 113061192 A CN113061192 A CN 113061192A CN 202110390981 A CN202110390981 A CN 202110390981A CN 113061192 A CN113061192 A CN 113061192A
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Abstract

本发明公开了一类对PD‑1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白及其作为T细胞抑制剂的应用。该高亲和力PDL1融合蛋白可作为一种新型T细胞抑制剂，与天然PDL1分子相比，该高亲和力PDL1融合蛋白具有良好的生物学活性，且对PD‑1受体的结合能力更强，可更有效的抑制T细胞活化，该新型T细胞抑制剂可应用于以T细胞过度活化和免疫病理损伤为特征的疾病治疗领域，属于抗自身免疫病药物制备技术领域。

Description

一类对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白及其作为T细 胞抑制剂的应用
技术领域
本发明属于融合蛋白药物制备技术领域，涉及一类对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白及其作为T细胞抑制剂的应用。
背景技术
免疫系统的生理功能是免疫防御、免疫自稳和免疫监视。免疫系统实现上述功能的前提是识别“自己”和“非己”成分，对“非己”成分产生免疫应答并清除之；对“自己”成分则不产生应答，维持耐受。某些病理情况下，机体可对自身抗原产生应答，即为自身免疫；自身免疫应答的质和量发生异常，且自身耐受机制遭破坏，自身反应性T细胞和自身反应性B细胞可被激活，攻击并破坏自身组织细胞，导致机体出现病理改变和相应临床表现，即为自身免疫病(autoimmune disease，AID)，例如类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发病硬化症(MS)等疾病。对于大部分AID而言，免疫失衡导致的T细胞过度活化和免疫病理损伤是其主要发病机制。AID治疗常用药物主要是激素、免疫抑制剂等，长期使用毒副作用较大；近年来，以TNF-α、IL-6等细胞因子为靶点的单抗类药物以及各种JAK抑制剂是AID治疗的新进展，但由于AID发病机制中各个因素形成复杂网络，针对单一细胞因子或信号分子为靶点难以达到长期、稳定的疗效。因此，我们需要改变治疗思维，从“点”向“面”转换，尝试找到以T细胞活性调控为靶点的AID治疗新方法。
程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)是活化的T细胞表面表达的最重要的免疫检查点分子之一，与其配体PDL1分子结合后向胞内转导抑制信号，可抑制T细胞活化增殖，有利于维持机体免疫自身稳定，从而防止过度免疫损伤和AID的发生，PD-1/PDL1通路是目前最有前景的AID治疗靶点之一。
申请人课题组前期研究成果表明，如能以过度活化的T细胞PD-1受体为靶点，通过外源PDL1分子适当强化机体自身反应性T细胞的抑制性信号，有望对AID产生良好的治疗效果，甚至可应用于多种以T细胞过度活化和免疫病理损伤为主要发病机制的疾病治疗领域。但是，由于AID的病变呈持续、反复发作过程，且天然PDL1分子与PD-1受体的结合能力有限，使用天然PDL1分子存在使用量大、成药性低等缺点，不利于后期转化应用。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一类对PD-1受体具有高亲和力的新型PDL1融合蛋白及其作为T细胞抑制剂的应用，该PDL1融合蛋白对T细胞PD-1受体有更高亲和力，且能够更有效的抑制T细胞活化，有望应用于治疗以T细胞过度活化和免疫病理损伤为特征的疾病。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一类对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白，所述对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示；
编码所述高亲和力的PDL1融合蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11或SEQ.ID.NO.12所示。
本发明还公开了上述的对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白作为T细胞抑制剂的应用。
优选地，所述PDL1融合蛋白为对T细胞PD-1受体具有高亲和力的PDL1分子胞外域和免疫球蛋白Ig分子Fc段连接组成的融合蛋白。
进一步优选地，该PDL1融合蛋白的PDL1分子胞外域包括IgV结构域和IgC结构域。
优选地，所述PD-1受体、PDL1分子和Ig分子Fc段均来源于人。
优选地，所用Ig分子包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD或IgM。
优选地，高亲和力PDL1融合蛋白含天然PDL1分子或天然PDL1分子中负责与PD-1受体特异性结合位点中发生一个或多个氨基酸突变的分子；
其中，所述未突变的天然PDL1分子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
发生一个或多个氨基酸突变的分子中，突变位置选自以下位置相对应的一个或多个氨基酸突变位点：26、56、58、66、113、115、117和120。
进一步优选地，其所述高亲和力PDL1融合蛋白为包含SEQ.ID.NO.1中对应的氨基酸序列，或者与SEQ.ID.NO.1序列具有至少95％序列相似性的氨基酸序列。
进一步优选地，所述高亲和力PDL1融合蛋白中的一个或多个氨基酸突变选自26D/E、56Y/F、58E/V、66Q/W、113R/T、115M/V、117S/A和120G/H中的一个或多个，或者选自26D/E、56Y/F、58E/V、66Q/W、113R/T、115M/V、117S/A和120G/H中的一个或多个的相应位点对应的保守性氨基酸突变。
本发明还公开了上述的对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白在制备抑制人免疫细胞过度活化的药物中的应用。
优选地，所述药物为作用靶点表达于活化T表面的PD-1受体的药物。
优选地，所述的药物是作用靶点为表达PD-1受体的免疫细胞的药物。
优选地，所述的药物为通过PD-1/PDL1信号通路抑制免疫细胞过度活化的药物。
优选地，免疫细胞过度活化涉及的适应症包括免疫病理损伤介导的疾病、自身免疫病和器官/组织移植排斥疾病。
优选地，免疫病理损伤介导的疾病包括脑型疟、病毒感染介导的免疫病理损伤。
优选地，自身免疫病包括银屑病、类风湿关节炎、幼年型关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、哮喘、克罗恩病、多发性肌炎、系统性血管炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎和干燥综合征等。
优选地，器官/组织移植排斥疾病包括肾脏、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、胸腺、造血干细胞等各类器官/组织移植导致的患者移植物抗宿主病或者宿主抗移植物病。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
PD-1/PDL1通路是调节T细胞活性最重要的免疫抑制信号之一，本发明对天然PDL1分子采用定点组合突变方式，提高其与PD-1受体的结合能力，其对活化T细胞的抑制能力更强，可最大限度提高PDL1融合蛋白抑制自身反应性T细胞活化程度的靶向治疗效果。在设计高亲和力PDL1融合蛋白的过程中，采用了基于蛋白质表征、同源建模、分子力学计算和分子动力学模拟的设计方法，与传统方法(如噬菌体/酵母展示技术)相比，该方法极大地提高了设计准确度，大大降低了工作量；对天然PDL1分子中负责与PD-1受体结合的关键氨基酸位点进行单点突变及组合突变，筛选出5种最有潜力的对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白；采用真核蛋白表达系统进行表达，以确保其能够正确折叠、修饰和维持生物学活性，蛋白印迹实验证实高亲和力PDL1融合蛋白可顺利表达；通过其抑制活化T细胞增殖实验，证实了高亲和力PDL1融合蛋白对活化T细胞具有良好的抑制能力；通过荧光偏振检测技术，证明了与天然PDL1分子相比，高亲和力PDL1融合蛋白对PD-1受体的亲和力确实有显著提升；该高亲和力PDL1融合蛋白有望应用于以T细胞异常活化和免疫病理损伤为主要发病机制的AID疾病治疗当中。
附图说明
图1为本发明的创新设计思路原理图：通过高亲和力PDL1融合蛋白强化T细胞PD-1抑制信号，降低T细胞活化程度；
图2为理论预测PDL1分子中负责与PD-1结合的8个关键氨基酸位点，即D26，Y56，E58，Q66，R113，M115，S117，G120；
图3为全基因合成人源PDL1-IgG4Fc融合基因(AB)及PDL1突变基因(A1-A5)示意图；
图4为PCR验证天然PDL1基因及PDL1突变基因；其中，a为天然PDL1和高亲和力PDL1突变基因A1-A5的PCR验证结果，泳道1-6对应天然PDL1和PDL1突变基因A1-A5扩增PDL1片段结果；b为天然PDL1融合基因扩增PDL1-IgG4Fc和IgG4Fc片段的PCR结果，泳道7为PCR扩增PDL1-IgG4Fc基因结果，泳道8为PCR扩增IgG4Fc基因结果；
图5为核酸内切酶验证PDL1-IgG4Fc融合基因及PDL1突变基因；其中，a为双酶切鉴定目的PDL1基因，泳道1-6对应Xhol I+EcoR I双酶切鉴定PDL1基因和高亲和力PDL1突变基因A1-A5；b为双酶切鉴定天然PDL1-IgG4Fc融合基因，泳道7对应EcoR I+Not I双酶切鉴定IgG4Fc基因，泳道8对应Xhol I+Not I双酶切鉴定PDL1-IgG4Fc基因；
图6为蛋白印迹实验检测PDL1融合蛋白和高亲和力PDL1融合蛋白，其中AB为天然PDL1融合蛋白，A1B-A5B分别为PDL1突变基因A1-A5对应的高亲和力PDL1融合蛋白；
图7为高亲和力PDL1融合蛋白的生物学活性验证；各组添加亚适剂量ConA(1μg/ml)刺激人外周血T细胞活化增殖，然后分别加入不同浓度的天然PDL1融合蛋白和高亲和力PDL1融合蛋白，CCK-8法检测各组细胞增殖情况；
图8为荧光偏振检测技术测定高亲和力PDL1融合蛋白(A2B)与PD-1受体亲和力。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
采用基于蛋白质表征、同源建模、分子力学计算和分子动力学模拟进行高亲和力PDL1融合蛋白设计，对天然PDL1分子中负责与PD-1受体结合的关键氨基酸位点进行单点突变及组合突变，筛选出5种最有潜力的对PD-1具有高亲和力的PDL1融合蛋白，并进行真核蛋白表达和蛋白印迹验证；通过细胞学实验证实了高亲和力PDL1融合蛋白对活化T细胞的抑制作用更加明显；荧光偏振实验证明了其对高亲和力PDL1融合蛋白对PD-1受体的亲和力确实有显著提升，从而得到了一种有潜力的新型T细胞抑制剂。
参见图1，为本发明的创新设计思路原理图：通过高亲和力PDL1融合蛋白强化T细胞PD-1抑制信号，降低T细胞活化程度；本发明基于以上研究结果提出如下假设：在以T细胞异常活化和免疫病理损伤为特征的自身免疫病治疗中，针对PD-1/PDL1信号通路，高亲和力PDL1融合蛋白对PD-1受体具有更强的亲和力，其对活化T细胞的抑制能力也更强，该融合蛋白作为一种新型T细胞抑制剂，有望应用于以T细胞异常活化为主要特征的自身免疫病治疗当中。
本发明构建了一种新型T细胞抑制剂-对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白，与天然PDL1分子相比，该融合蛋白对活化T细胞表达的PD-1受体具有更强的亲和力，对于抑制T细胞活化效果也更好，有望应用于T细胞异常活化介导的疾病治疗当中。
1、基于蛋白质表征、同源建模、分子力学计算和分子动力学模拟的高亲和力PDL1融合蛋白设计
1.1蛋白结合能与突变后结合能改变分析
从PDB数据库下载PD-1/PDL1晶体结构数据，利用Discovery Studio 2016(以下简称DS)软件，分析PD-1/PDL1结合区域的结合能，对PDL1结合域上所有氨基酸做无义突变，计算得到每个位点的结合能改变，筛选得到PDL1分子中8个负责与PD-1受体结合的关键氨基酸位点，结果如图2所示分别为26D、56Y、58E、66Q、113R、115M、117S和120G，作为后一步的设计参考。
1.2结构分析以及能量最小化运算
在Pymol软件中对PD-1/PDL1的结构中结合能改变较为突出的位点和其附近的位点做结构分析，之后再将修改后的结构模型用DS软件做能量最小化运算，导出运算后的结构数据。
1.3结合能计算及突变位点组合
将改变后的蛋白结构数据上传至EMBL-EBI数据库计算其结合能，并与原始结构的结合能进行对比，最后综合所有单点突变的结合能数据，筛选优化后得到最优的突变组合。选取5个最佳的PDL1高亲和力突变组合，分别命名为A1，A2，A3，A4，A5，最终结果如表1所示。
表1理论预测的高亲和力PDL1融合蛋白组合
Figure BDA0003016689790000051
该方法获得的PDL1突变蛋白并不能保证其具有良好的生物学活性和更高的对PD-1受体亲和力，需要进行下一步的验证。
2、高亲和力PDL1-IgG4Fc融合基因合成及验证
2.1设计PDL1-IgG4Fc融合基因和高亲和力PDL1突变基因
PDL1融合蛋白基本结构是由人PDL1分子胞外域和人免疫球蛋白IgG4分子Fc段(hinge-CH2-CH3)连接而成，PDL1段为其功能结构域，负责与PD-1受体结合；IgG4Fc段赋予融合蛋白便于纯化、稳定性强、半衰期长等优点；IgG4Fc和IgG1Fc是目前最常用的两种融合蛋白药物结构，前者与免疫细胞Fc受体结合力较低，其介导ADCC(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity)和CDC(complement-dependent cytotoxicity)作用较弱，适合本课题要求；同时将IgG4Fc铰链区的半胱氨酸突变为丝氨酸，以防止二硫键的产生，进一步降低Fc段导致的副作用。
查询NCBI资料库，查找人源PDL1序列(GeneBank：AH005273.2)和人IgG4Fc序列(GeneBank：AAB59394.1)，设计PDL1-IgG4Fc融合基因(核苷酸序列参见SEQ IDNO.1)和突变PDL1基因A1-A5(核苷酸序列参见SEQ IDNO.2-6)，送北京奥科生物技术有限责任公司进行全基因序列合成，并插入在T载体中。
2.2 PCR验证产物
合成以下引物：
PDL1 F：5-’AGTCTCGAGAGTATGAGGAT-3’
PDL1 R：5-’ACTGAATTCACTCCTTTCAT-3’
IgG4Fc F：5’-AGTGAATTCAGTGAGTCCAA-3’
IgG4Fc R：5’-ACTGCGGCCGCACTTCATTT-3’
参见图3基因示意图，分别用不同引物组合验证基因，结果如图4所示，为PCR验证天然PDL1基因及PDL1突变基因；其中，a为天然PDL1和高亲和力PDL1突变基因A1-A5的PCR验证结果，泳道1-6对应天然PDL1和PDL1突变基因A1-A5扩增PDL1片段结果；b为天然PDL1融合基因扩增PDL1-IgG4Fc和IgG4Fc片段的PCR结果，泳道7为PCR扩增PDL1-IgG4Fc基因结果，泳道8为PCR扩增IgG4Fc基因结果，说明合成的目的基因正确无误。
2.3酶切验证
参见图3基因示意图，分别用核酸内切酶对质粒进行双酶切，结果如图5所示，其中，a为双酶切鉴定目的PDL1基因，泳道1-6对应Xhol I+EcoR I双酶切鉴定PDL1基因和高亲和力PDL1突变基因A1-A5；b为双酶切鉴定天然PDL1-IgG4Fc融合基因，泳道7对应EcoR I+Not I双酶切鉴定IgG4Fc基因，泳道8对应Xhol I+Not I双酶切鉴定PDL1-IgG4Fc基因，说明合成的目的基因正确无误。
3、真核系统表达高亲和力PDL1融合蛋白
3.1表达目的蛋白
复苏293A细胞，待细胞生长状况良好后开始实验，细胞融合度为80-90％时，开始转染步骤(以24孔板为例)；
(1)用50μl无血清培养基稀释0.8μg天然PDL1基因T载体和高亲和力PDL1突变基因T载体，轻轻吹吸3-5次混匀，室温静置5min；
(2)轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μl无血清培养基稀释2.0μl LipofectamineTM2000转染试剂，轻轻吹吸3-5次混匀，室温静置5min；
(3)混合转染试剂和质粒稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温静置20min；
(4)转染复合物加入到24孔细胞板中，100μl/孔，前后轻摇细胞板混合均匀；
(5)将细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养6h左右，进行换液，换成含10％血清的普通培养基，在37℃，5％CO2孵育箱中继续培养；
(6)48-72h后，收集细胞培养液上清，蛋白印迹法检测目的基因表达；
(7)待目的蛋白大量表达后，使用Protein A纯化目的蛋白。
3.2目的蛋白纯化
(1)样品准备；将培养上清与结合缓冲液1：1混合，过滤(防止堵塞纯化柱)；
(2)平衡纯化柱：用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A纯化柱；
(3)上样：将准备好的细胞培养上清上样，根据纯化柱的结合能力考虑上样量的体积；
(4)洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗纯化柱，直至结合液中不含蛋白；
(5)收集目的蛋白：用洗脱液过纯化柱，同时收集漏出液(约3-4ml/管)，直至漏出液中不含蛋白。测定各收集管中的蛋白含量，合并蛋白管。(注意：收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0的Tris-HCl缓冲液，防止目的蛋白在过酸的环境下失活)；
(6)纯化柱再生：用5-10倍体积的再生液再生纯化柱；
(7)PBS透析收集目的蛋白。
3.3 Western blot验证目的蛋白的表达
BCA法蛋白定量(具体步骤参照试剂盒说明书)，计算蛋白浓度；
(1)处理蛋白样品：加入5×Loading Buffer，95℃～100℃加热5min，-20℃保存。
(2)配制SDS-PAGE胶
(3)上样电泳，蛋白样品20μg/孔，100V，电泳1.5h；
(4)转膜，PVDF膜，400mA恒流条件下电转120min；
(5)含5％脱脂牛奶的TBST溶液封闭1h；
(6)抗体孵育：将HRP标记小鼠抗人IgG4Fc单克隆抗体稀释至工作浓度，4℃孵育过夜；
(7)洗膜：1×TBST洗膜3次，每次5min；
(8)ECL显色，采集图像。
实验结果如图6所示，泳道1为天然PDL1融合蛋白(AB)，泳道2-6为高亲和力PDL1融合蛋白(A1B-A5B)，蛋白成功表达。
4、高亲和力PDL1-IgG4Fc融合蛋白亲和力检测
4.1 T细胞增殖模型
分离人PBMC中的T细胞，将T细胞按2×105个/孔的密度接种至96孔板；以不同浓度的ConA刺激T细胞增殖，通过CCK-8法检测T细胞增殖情况，建立不同浓度ConA激活的T细胞增殖曲线；确定亚适剂量的ConA刺激条件(既可刺激T细胞活化增殖，又不至于刺激过于强烈而无法抑制其活化状态)；此部分实验已完成，确定ConA刺激的亚适剂量为1μg/ml。
4.2高亲和力PDL1融合蛋白抑制T细胞活化增殖能力
将T细胞按2×105个/孔的密度接种至96孔板，分为无干预组、天然PDL1融合蛋白干预组、高亲和力PDL1融合蛋白A1B-A5B干预组，设置蛋白浓度梯度0-30μg/ml，添加亚适剂量浓度的ConA(1μg/ml)，共孵育4d；通过CCK-8法，检测不同浓度天然PDL1融合蛋白及A1B-A5B对T细胞增殖的抑制作用，评估各蛋白的体外生物学活性，初步筛选对活化T细胞具有更高抑制能力的PDL1突变体。
实验结果如图7所示，高亲和力PDL1融合蛋白具有良好的生物学活性，可以抑制T细胞活化增殖，有潜力作为新型T细胞抑制剂。
5、高亲和力PDL1-IgG4Fc融合蛋白亲和力检测
荧光偏振检测技术(fluorescence polarization immune assay，FPIA)：当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。如果分子小，分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。方法：
(1)FITC标记的PD-1分子为示踪底物，PDL1融合蛋白通过与示踪底物的结合影响其信号值，选用96孔黑色平底半区板，总反应体积为40μl；
(2)通过测量不同浓度梯度的示踪多肽的信号值确定其最低浓度后，以不同浓度的PDL1融合蛋白滴定该浓度示踪多肽，室温孵育20min，检测荧光偏振值；
(3)曲线通过Origin软件拟合得到不同FITC标记PD-1与PDL1融合蛋白亲和力Kd值，挑选Kd值最小者为高通量筛选体系示踪多肽，以上述确定最低浓度为筛选体系所用浓度。
结果参见图8，以A2B为例，荧光偏振实验证实，与天然PDL1融合蛋白相比，高亲和力PDL1融合蛋白(A2B)对PD-1受体的亲和力提高了4倍以上。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 佰思巢（上海）生物科技有限公司
<120> 一类对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白及其作为T细胞抑制剂的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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275 280 285
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
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<210> 7
<211> 1442
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020
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gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 1140
ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200
taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 1320
gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380
cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaatgaag tgcggccgca 1440
gt 1442
<210> 8
<211> 1442
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtctcgaga gtatgaggat atttgctgtc tttatattca tgacctactg gcatttgctg 60
aacgcattta ctgtcacggt tcccaaggag ctatatgtgg tagagtatgg tagcaatatg 120
acaattgaat gcaaattccc agtagaaaaa caattagacc tggctgcact aattgtcttc 180
tgggttatgg aggataagaa cattatttga tttgtgcatg gagaggaaga cctgaaggtt 240
cagcatagta gctacagaca gagggcccgg ctgttgaagg accagctctc cctgggaaat 300
gctgcacttc agatcacaga tgtgaaattg caggatgcag gggtgtacac atgcatgatc 360
agctatggtc acgccgacta caagcgaatt actgtgaaag tcaatgcccc atacaacaaa 420
atcaaccaaa gaattttggt tgtggatcca gtcacctctg aacatgaact gacatgtcag 480
gctgagggct accccaaggc cgaagtcatc tggacaagca gtgaccatca agtcctgagt 540
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ctgagaatca acacaacaac taatgagatt ttctactgca cttttaggag attagatcct 660
gaggaaaacc atacagctga attggtcatc ccagaactac ctctggcaca tcctccaaat 720
gaaaggagtg aattcagtga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccgtg cccagcacct 780
gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 840
atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 900
gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960
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Claims (17)

1.一类对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白，其特征在于，
所述对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示；
编码所述高亲和力的PDL1融合蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11或SEQ.ID.NO.12所示。
2.权利要求1所述的对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白作为T细胞抑制剂的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PDL1融合蛋白为对T细胞PD-1受体具有高亲和力的PDL1分子胞外域和免疫球蛋白Ig分子Fc段连接组成的融合蛋白。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，该PDL1融合蛋白的PDL1分子胞外域包括IgV结构域和IgC结构域。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PD-1受体、PDL1分子和Ig分子Fc段均来源于人。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所用Ig分子包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD或IgM。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，高亲和力PDL1融合蛋白含天然PDL1分子或天然PDL1分子中负责与PD-1受体特异性结合位点中发生一个或多个氨基酸突变的分子；
其中，所述未突变的天然PDL1分子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
发生一个或多个氨基酸突变的分子中，突变位置选自以下位置相对应的一个或多个氨基酸突变位点：26、56、58、66、113、115、117和120。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，其所述高亲和力PDL1融合蛋白为包含SEQ.ID.NO.1中对应的氨基酸序列，或者与SEQ.ID.NO.1序列具有至少95％序列相似性的氨基酸序列。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述高亲和力PDL1融合蛋白中的一个或多个氨基酸突变选自26D/E、56Y/F、58E/V、66Q/W、113R/T、115M/V、117S/A和120G/H中的一个或多个，或者选自26D/E、56Y/F、58E/V、66Q/W、113R/T、115M/V、117S/A和120G/H中的一个或多个的相应位点对应的保守性氨基酸替换。
10.权利要求1所述的对PD-1受体具有高亲和力的PDL1融合蛋白在制备抑制人免疫细胞过度活化的药物中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物为作用靶点表达于活化T表面的PD-1受体的药物。
12.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的药物是作用靶点为表达PD-1受体的免疫细胞的药物。
13.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过PD-1/PDL1信号通路抑制免疫细胞过度活化的药物。
14.如权利要求10～13中任意一项所述的应用，其特征在于，免疫细胞过度活化涉及的适应症包括免疫病理损伤介导的疾病、自身免疫病和器官/组织移植排斥疾病。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，免疫病理损伤介导的疾病包括脑型疟、病毒感染介导的免疫病理损伤。
16.如权利要求14所述的应用，其特征在于，自身免疫病包括银屑病、多发性硬化、类风湿关节炎、幼年型关节炎、系统性红斑狼疮、哮喘、克罗恩病、多发性肌炎、系统性血管炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎和干燥综合征等。
17.如权利要求14所述的应用，其特征在于，器官/组织移植排斥疾病包括肾脏、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、胸腺、造血干细胞等各类器官/组织移植导致的患者移植物抗宿主病或者宿主抗移植物病。
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EP4374005A2 (en) Human fibronectin type iii protein scaffolds

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