CN113004253A - 二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物及其制备和在炎症性皮肤病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物小分子技术领域，具体公开了一种全新的二‑(苯并咪唑)‑1,2,3‑三唑衍生物及其制备和应用。本发明研究发现，所述的全新的化合物，在炎症性皮肤病方面具有优异的药效、较低的毒副作用，在炎症性皮肤病的药物开发方面具有良好的应用前景。

Description

二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物及其制备和在炎症性皮肤 病中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及到一种药物活性小分子。

背景技术

炎症性皮肤病，包括银屑病、副银屑病、玫瑰糠疹、皮肤型红斑狼疮等，是一类常见的由免疫细胞和角质形成细胞共同介导的皮肤病。这类疾病发病率高，患者人数众多，对人们的学习、生活、工作造成很大影响。天然免疫系统的异常应答、T淋巴细胞的异常激活、各种炎症性细胞因子及其靶细胞(角质形成细胞)在炎症性皮肤病发病机制中起到重要作用。其中，辅助性T细胞(TH细胞)免疫失衡导致的一系列炎症反应在炎症性皮肤病中较为常见。TH细胞在一些抗原提呈细胞及天然免疫细胞的刺激下，各细胞亚群之间的免疫平衡发生紊乱，导致白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等炎症细胞因子分泌异常，这些炎症细胞因子进一步作用于角质形成细胞，诱发皮肤屏障受损。已有研究证明，银屑病发病的关键机制为：银屑病患者皮损组织中异常活化和分化的T_H17及T_H1细胞增加，这些细胞通过分泌IL-17、IL-23、IFN-γ等炎症因子，促进角质形成细胞过度增殖，角质形成细胞亦可分泌多种炎性因子和趋化因子如IL-17C、TNF-α、IL-8、IL-1α/β、CCL20等，诱导并促进银屑病皮损形成。许多炎症性皮肤病无论原因如何复杂，在病变发生机制上绝大部分都涉及了炎症和免疫，因此免疫抑制或免疫调节是这类疾病治疗的主要手段。然而几乎所有免疫抑制剂均有较为明显和严重的副作用。近年来，生物治疗取得了快速发展，许多单克隆抗体、免疫球蛋白以及专门针对免疫分子的生物制剂越来越多，虽然疗效肯定，但费用高昂，不良反应也不容忽视，长期使用的安全性尚不明确。因此，研发新型的疗效高、副作用小、成本低的免疫抑制或调节药物意义尤为重大。

发明内容

本发明第一目的在于，提供一种全新结构的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物。

本发明第二目的在于，提供一种所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物的制备方法。

本发明第三目的在于，提供一种所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物在用于制备炎症性皮肤病方面的用途。

一种二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物，具有式1结构式；

所述的n、m独自为1～6的整数；

所述的R₁、R₂中，至少一个取代基为活性取代基，所述的活性取代基为羟基、烷氧基、羟基烷基或烷氧烷基。

本发明提供了一种具有全新结构的式1化合物，且发现该全新结构的化合物基于其分子内片段以及基团的分子内作用，能够意外地抑制炎症性T_H17、T_H1细胞的分化及相关细胞因子的分泌，促进T_H2细胞的分化及IL-4的分泌，并且抑制角质形成细胞的增殖；在炎症性皮肤病方面具有意料不到的药效活性，可用于炎症性皮肤病的小分子药物开发。

本发明中，所述的n为1～6的整数；优选为2～4的整数；进一步优选为3。

本发明中，所述的m为1～6的整数；优选为2～4的整数；进一步优选为3。

本发明研究意外地发现，在所述的二-(苯并咪唑)母核结构中，创新地在其端部修饰1,2,3-三唑环并控制环上至少含有一个所述的含氧活性基团，如此可基于分子内以及分子空间作用意外地增加对炎症性T_H17、T_H1细胞分化及相关细胞因子表达的抑制效果，并促进T_H2细胞的分化及IL-4的分泌，加强了对角质形成细胞增殖的抑制效果。

本发明中，所述的烷氧基为C₁～C₆烷氧基；例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等。

优选地，所述的羟基烷基为带有1个及以上羟基取代基的C₁～C₆烷基。例如，在1,2,3-三唑环上修饰有C₁～C₆的直链或者支链烷基，并在该直链或者支链的烷基取代有羟基。例如，所述的羟基烷基为羟甲基、羟乙基等。

优选地，所述的烷氧烷基为带有1个及以上烷氧取代基的C₁～C₆烷基。例如，在1,2,3-三唑环上修饰有C₁～C₆的直链或者支链烷基，并在该直链或者支链的烷基取代有烷氧基。例如，所述的烷氧烷基的结构为：

所述的R为直链或者直链的烷基，所述的n1为1～10的整数；当n1不为1时，所述的烷氧烷基为聚醚取代基。

作为优选，所述的R₁、R₂中，其中的一个为活性取代基，另一个取代基为H、所述的活性取代基、烷基、苯基、苄基或卤素。

作为优选，所述的R₁为氢；所述的R₂为羟基烷基。所述的羟基烷基优选为羟甲基、1-羟乙基、1-羟丙基、2-羟乙基、2-羟丙基或3-羟丙基。

最优选，所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物具有以下结构式(式1-A)；

本发明研究发现，该优选的全新化合物，在炎症性T_H17、T_H1细胞分化及相关细胞因子分泌的抑制、以及T_H2细胞的分化及IL-4分泌的促进，角质形成细胞增殖的抑制方面具有意料不到的药效和更低的毒副作用。

本发明还提供了一种所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物的制备方法，将式2所述的化合物和式3化合物经环合反应得到；

本发明中，所述的式2和式3的n、m和取代基的选取范围相同。

作为优选，环合反应的溶剂为甲醇。环合反应中添加有反应助剂，优选为Cu(I)源。例如，所述的Cu(I)源可基于反应体系中的Cu(II)源和还原剂反应得到。

本发明中，式2化合物由式4化合物和式5化合物发生酰胺化反应得到；

式4和式5的n、m的选取范围同式1。

本发明中，所述的酰胺化反应可基于现有手段实现。

作为优选，本发明中，所述的酰胺化反应过程中，预先将式4化合物和活化剂下活化，随后再和式5化合物反应。所述的活化剂优选为碳化二亚胺和1-羟基苯并三氮唑。

本发明中，所述的式4化合物由式6和式7化合物进行环合，随后再经酯水解得到；

所述的R₃为C₁～C₆的烷基，n的选取范围同式1。

本发明还提供了一种所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、共晶、酯、酰胺衍生物中的至少一种(本发明也称为活性成分)在用于制备炎症性皮肤病药物中的应用。

本发明中，将式1所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物作为活性成分，其能够有效抑制炎症性T_H17、T_H1细胞的分化及相关细胞因子的分泌，促进T_H2细胞的分化及IL-4的分泌，抑制角质形成细胞的增殖；在炎症性皮肤病的方面具有优异的药效和较低的毒副作用。

本发明中，对所述的式1结构式的药学可接受的盐、溶剂化合物以及和配体形成的共晶物、均属于本发明保护的范围。另外，将所述的式1化合物进行酯化或者酰胺化形成的变形化合物，也属于本发明保护的范围。

例如，所述的式1化合物的药学上可接受的盐可以是式1化合物的盐酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、苯甲磺酸盐、草酸盐、枸橼酸盐、硫酸盐等药学上可接受的任意形态的盐。

所述的式1化合物的溶剂化合物，例如可以是式1化合物的水化物等其他溶剂化物。

所述的式1化合物的共晶为式1活性化合物和其他药物配体形成的共晶。所述的药物配体例如为多羧酸类配体。

所述的式1化合物衍生的酯可以是基于所述的结构中的羟基进行酯基修饰的化合物，以期达到前药设计、或者改善溶解性、改善药效等目的。

所述的式1化合物衍生的酰胺化合物可以是基于所述的结构中的伯氨基、仲氨基进行酰胺基修饰的化合物，以期达到前药设计、或者改善溶解性、改善药效的等目的。

本发明中，将所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物用作活性成分配合现有的药物制剂技术，用于制备药学上可接受的任何药物剂型；例如，用于制备皮肤透皮吸收外用制剂、注射制剂、口服制剂等。

作为优选，所述的炎症性皮肤病包括但不限于银屑病、副银屑病、玫瑰糠疹、皮肤型红斑狼疮。

有益效果

本发明提供了一种全新的化合物，且发现该全新的化合物在抑制炎症性T_H17、T_H1细胞的分化及相关细胞因子的分泌，促进T_H2细胞的分化及IL-4的分泌，抑制角质形成细胞过度增殖方面具有意料不到的技术效果。此外，本发明所述的全新的式1化合物，不仅仅是药效方面具有良好的效果，还在毒副作用、物理性质等方面具有优势，例如，本发明所述的化合物具有良好的溶解性和稳定性，具有更低的毒副作用。本发明在炎症性皮肤病的药物开发方面具有良好的应用前景。

附图说明

一、实施例1和对比例1部分的附图：其中：

图1-1为实施例1合成的式1-A(TD-02)的HPLC图；

图1-2为实施例1合成的式1-A(TD-02)的H-NMR图；

图1-3～图1-9分别为对比例1制得的TD-01、TD-03、TD-04、TD-05、TD-06、TD-07、TD-08的H-NMR图；

二、实施例2部分的附图：其中：

图2-1化合物16及八种小分子化合物处理前后银屑病患者CD4⁺T细胞中miR-210的表达(n＝4)。^*P<0.05，^**P<0.01。

图2-2不同浓度化合物16、TD-02、TD-05及TD-07处理前后正常人CD4⁺T细胞中T_H17、T_H1、T_H2细胞亚群比例(A)及对应的细胞因子IL-17A、IFN-γ、IL-4基因mRNA的表达水平(B)，(n＝4)。^*P<0.05，^**P<0.01。

图2-3不同浓度化合物16、TD-02、TD-05及TD-07对角质形成细胞(HaCaT细胞)增殖的影响(n＝5)。^*P<0.05，^**P<0.01。

三、实施例4部分的附图

图3-1TD-02外用显著改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损。(A)各组小鼠皮损中miR-210的表达；(B,C)各组小鼠炎症性皮损的大体(B)及病理(C)改变；(D,E)各组小鼠皮损中表皮厚度(D)及炎性细胞浸润情况(E)。^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001图3-2TD-02外用可改善小鼠银屑病样皮损中的炎症紊乱。(A,B)各组小鼠皮损中T_H17及T_H1细胞浸润比例流式图及统计图；(C-E)各组小鼠皮损中il17a、ifng及il4的mRNA表达。^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001

四、实施例5部分的附图

图4(图4-1～4-12)为脏器组织形态显微镜图(标尺均为50μm)。

具体实施方式

实施例1：式1-A的合成：

本发明中，以式1-A合成为例，其合成线路(反应式)如下：

合成步骤为

反应所用溶剂DMF、THF经过CaH₂无水处理，EtOH经过金属Na无水处理。所用核磁共振仪均为Bruker DPX 400-MHz。

步骤(1)：5-对甲基哌嗪-2-硝基苯胺(4)的合成：

室温下，于100mL圆底烧瓶中称入6.0g 5-氯-2-硝基苯胺(2)和7.5g无水K₂CO₃，氮气保护下加入18mL无水DMF，然后滴入4.2g 4-甲基哌嗪(3)，将该反应体系升温至110℃反应12h。待原料2完全消失后将反应液降至室温，用水(500mL)稀释反应液后再用乙酸乙酯(500mL*3)萃取水相，所得有机相用水(300mL)洗涤。合并有机相，无水硫酸镁干燥，减压浓缩得粗品。向该粗品中加入15mL甲醇，加热至60℃使固体全部溶解后缓慢降至室温。约60min后，固体不再析出，过滤得4.9g黄色固体化合物4，产率为60％。

步骤(2)：4-氨基-3-硝基苄基亚氨酸乙酯(7)的合成：

于500mL三口圆底烧瓶中加入3.0g 4-氨基-3-硝基苯腈，然后加入300mL无水EtOH剧烈搅拌使固体溶解。冰浴下，向上述溶液持续通入HCl气体(浓硫酸滴入氯化钠固体中)10h以上，直至不再产生固体为止。继续搅拌过夜，抽滤得4.1g黄色粉末状固体化合物7，产率91％。

步骤(3)：4-对甲基哌嗪-1,2-二苯胺(5)的合成：

室温下，于100mL单口圆底烧瓶中称入4.0g化合物4和2.0g钯碳(10％)，抽真空后加入无水EtOH(45mL)，剧烈搅拌，充入氢气，反应过夜。抽滤除去钯碳，减压浓缩得3.5g淡黄色固体化合物5，产率100％。该产物须现制现用，不可久放。

步骤(4)：化合物8的合成：

室温下，于250mL单口圆底烧瓶中称入2.8g化合物5和3.4g化合物7，加入无水EtOH(40mL)和AcOH(20mL)后加热至100℃回流4h。反应完毕，冰浴下冷却，减压浓缩除去溶剂得到红棕色固体。将该固体溶于水(30mL)中，冰浴下滴加浓氨水(20mL)，静置过夜。过滤滤出固体，用20mLAcOH/MeOH的混合溶剂溶解上述固体(AcOH：MeOH＝1:9)，滤除不溶物后减压浓缩得3.5g化合物8，产率73％。

步骤(5)：4-羟基丁酸(11)的合成：

室温下，于250mL单口圆底烧瓶中称入10.2gγ-丁内酯(10)，接着加入纯净水(120mL)开始搅拌。冰浴下向上述反应液慢慢加入NaOH固体4.8g，然后升温至100℃回流过夜。停止加热，冷却至室温，用稀盐酸调节溶液PH至5左右，乙酸乙酯(150mL*3)萃取，有机相用无水硫酸镁干燥。减压浓缩得7.9g化合物11，产率65％。

步骤(6)：4-羟基丁酸苄酯(12)的合成：

氮气保护下，于250mL单口圆底烧瓶中依次称入6.2g化合物11、2.9g氢氧化钠和0.9g四丁基溴化铵，加入丙酮(60mL)后缓慢滴入10.8g溴化苄，加热至65℃回流过夜。停止加热，向上述体系加入15mL水淬灭反应，依次用饱和的NaHSO₄(20mL)、NaHCO₃(20mL)、NaCl(20mL)溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥。减压脱去溶剂得粗产物，经硅胶柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)纯化，得到4.5g淡黄色油状化合物12，产率40％。

步骤(7)：化合物13的合成：

氮气保护下，于100mL单口圆底烧瓶中依次称入3.4g化合物12、4.6g三苯基膦、2.2g间羟基苯甲醛和THF(30mL)，降至0℃，搅拌下滴加3.6g偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)。上述反应液持续搅拌2h后，加入水(5mL)淬灭反应，乙酸乙酯(40mL*3)萃取，无水硫酸镁干燥有机相。减压浓缩得黄色油状粗品，经硅胶柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)纯化，得到3.1g亮黄色油状化合物13，产率60％。

步骤(8)：化合物9的合成：

室温下，于100mL单口圆底烧瓶中称入1.5g化合物8和0.8g钯碳(10％)，抽真空后加入无水EtOH(40mL)，充入氢气反应过夜。滤除钯碳，减压浓缩得1.4g砖红色化合物9，产率100％。化合物9须现制现用，不可久放。

步骤(9)：化合物14的合成：

室温下，于500mL单口圆底烧瓶中称入1.2g化合物9和1.1g化合物13，加入硝基苯(120mL)作为反应溶剂加热至145℃反应24h。降至室温，向反应液中加入石油醚直至不再产生沉淀，约150mL。滤出固体并将其溶于甲醇，再次滤除不溶物，收集滤液，减压浓缩得1.6g红棕色固体化合物14，产率70％。

步骤(10)：化合物15的制备：

室温下，于50mL单口圆底烧瓶中依次称入0.8g化合物14、0.6g无水碳酸钾，以DMF(20mL)和纯净水(20mL)做反应溶剂，加热至90℃反应2h。冷却至室温，减压浓缩除去溶剂后得到黄色固体，将该固体溶于水，用稀盐酸调节PH至5左右，乙酸乙酯(20mL*3)洗涤。收集水相，减压浓缩得到0.8g化合物15的粗品，粗产率超100％。

步骤(11)：化合物16的合成：

室温下，于50mL单口圆底烧瓶中依次称入0.4g化合物15的粗品、0.2g碳化二亚胺、0.1g1-羟基苯并三氮唑和10mL无水DMF，搅拌下加入90mg三乙胺后反应60min，最后滴入82mg 1-叠氮丙胺，反应过夜。减压浓缩，经硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇＝5:1)纯化，收集产物，再经制备色谱分离，得到50mg化合物16，产率12％。

步骤(12)：TD-02(式1-A)的合成：

将化合物16(50mg，0.08mol，1.0eq),IM1(11mg,0.06mmol,1.0eq)溶于1mLMeOH中，然后加入五水硫酸铜(2mg，0.008mol，0.1eq)，Sodium ascorbate(4.75mg,0.024mmol,0.3eq)室温搅拌过夜。反应结束后，将反应液通过制备薄层板分离纯化(MeOH:NH3H2O＝15：1)，得到淡黄色固体20mg，收率：34％。TD-02的HPLC图见图1-1所示；H-NMR见图1-2所示。

对比例1：

和实施例1相似的方式，变换步骤(11)的1-叠氮丙胺为二胺、或者变换步骤(12)中的IM1；分别合成以下对比化合物，其相应的H-NMR图见图1-3至图1-9；

实施例2：

采用实施例1和对比例1合成的化合物，进行药效评价：

1)九种小分子化合物对miR-210表达的影响

收集4例寻常型银屑病患者外周血，密度梯度离心并用磁珠分离CD4⁺T细胞后分别予以2μM化合物16以及TD-01至TD-08小分子化合物溶液及相应体积溶剂处理，48小时后收集细胞，提取细胞total RNA，采用real-time PCR检测miR-210的表达。结果发现：与溶剂处理的对照组相比，化合物16、TD-02、TD-05、TD-07处理后全部4例银屑病患者CD4⁺T细胞中成熟miR-210的表达均显著降低，且TD-02对miR-210的抑制作用在四种化合物中最强，而TD-05及TD-07对miR-210的抑制作用较化合物16稍弱；TD-01、TD-03、TD-04、TD-06及TD-08对银屑病CD4⁺T细胞中成熟miR-210的表达无显著性影响(图2-1)。因此，我们选择TD-02、TD-05及TD-07进一步进行功能筛选。

2)化合物16、TD-02、TD-05及TD-07对不同亚群CD4⁺T细胞的影响

收集正常人外周血，磁珠分选CD4⁺T细胞，用抗CD3抗体和抗CD28抗体活化24小时(hrs)后，分别加入0nM、20nM、100nM、200nM、500nM及1μM化合物16、TD-02、TD-05及TD-07溶液，继续培养48hrs。收集细胞，采用流式细胞术检测各组中不同CD4⁺T细胞亚群(T_H1、T_H2及T_H17)的比例，采用Real-time PCR检测各组细胞中相应的细胞因子IFN-γ、IL-17A及IL-4的mRNA表达水平。结果显示：不同浓度的化合物16及TD-02均可抑制CD4⁺T细胞中T_H17、T_H1细胞比例及IL-17A、IFN-γ分泌，促进T_H2细胞比例及IL-4分泌，且TD-02作用强于化合物16(图2-2A,B)，而TD-05及TD-07对不同亚群CD4⁺T细胞比例及细胞因子分泌无明显影响(图2-2A,B)。

3)化合物16、TD-02、TD-05及TD-07对角质形成细胞增殖的影响

本实验采用人角质形成细胞系HaCaT细胞。处理12hrs前，将HaCaT细胞接种于96孔板，于37℃、5％CO₂培养箱中培养12h。当细胞生长至80％-90％融合度时，向角质形成细胞中分别加入0nM、20nM、100nM、200nM、500nM、1μM化合物16、TD-02、TD-05及TD-07溶液，继续培养24hrs。在培养结束前4hrs，向各孔中加入10μL CCK8溶液继续培养4hrs。于450nm波长处检测细胞增殖情况。结果显示：化合物16及TD-02可以显著抑制HaCaT细胞增殖，且抑制效果呈浓度依赖性，TD-02对HaCaT细胞增殖的抑制作用较化合物16更强，而TD-05、TD-07对HaCaT细胞增殖无明显影响(图2-3)。

本实施例证明，以上九种小分子化合物中，TD-02表现出优于其他化合物的作用：TD-02意外地有效抑制成熟miR-210的表达，从而抑制T_H17、T_H1细胞分化及细胞因子分泌，促进T_H2细胞分化及IL-4分泌；同时TD-02亦可显著抑制角质形成细胞增殖。为了进一步探索TD-02对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症反应及病理改变的影响，我们进行了如下研究。

实施例3：TD-02软膏小试处方工艺：

1.空白基质优选组成及制备工艺

1.1基质组成

名称	优选组成1	优选组成2
			白凡士林	18.0g	19.0g
羊毛脂	1.0g	1.0g
			十六醇	1.0g	/

1.2制备工艺

称取处方量辅料至烧杯中，置60℃水浴中加热，搅拌至全溶，撤出水浴，室温冷却至固化，即得。

1.3性状考察

方法：将样品分别放置于室温、40℃恒温干燥箱、冰箱上室(2-8℃)以及冰箱下室(-20℃)条件下过夜，取出，观察性状变化。

结果：

40℃样品：未见明显融化，但粘度明显低于室温样品；室温放置30min后观察，与室温样品无明显差异；

2-8℃样品：与室温样品无明显差异；

-20℃样品：硬度增大，粘度明显高于室温样品，但是无硬块；室温放置30min后观察，与室温样品无明显差异；

2.小试处方组成以及制备工艺

2.1处方组成

2.2制备工艺

①取TD-02原料药碾碎，过8号筛，备用；

②称取处方量辅料至烧杯中，置60℃水浴中加热，搅拌至全溶，撤出水浴，室温冷却至固化，即得空白基质；

③称取处方量过筛后TD-02原料药加入空白基质中，搅拌均匀，分装，即得。

实施例4：外用TD-02的药效研究

采用实施例3获得的TD-02制剂，进行药效研究：

咪喹莫特(IMQ)涂抹小鼠背部皮肤，可以诱导银屑病样小鼠模型，小鼠背部皮肤出现银屑病样病理改变。因此，IMQ诱导银屑病模型用于研究银屑病发病机制和治疗药物已被广泛认可。我们选取6-8周龄健康雌性Balb/c小鼠42只，背部脱毛2×2cm，随机分为7组，每组6只，其中一组为正常对照小鼠，不做任何处理，其余6组按照下述方法进行实验：①IMQ组：每日上午背部外涂5％IMQ软膏80mg；②空白基质组：每日上午背部外涂5％IMQ软膏80mg，每日下午背部外涂空白基质软膏72mg，连续6天；③阳性对照组：每日上午背部外涂5％IMQ软膏80mg，每日下午背部外涂卡泊三醇软膏72mg，连续6天；④0.008％TD-02组：每日上午背部外涂5％IMQ软膏80mg，每日下午背部外涂0.008％TD-02 72mg，连续6天；⑤0.024％TD-02组：每日上午背部外涂5％IMQ软膏80mg，每日下午背部外涂0.024％TD-0272mg，连续6天；⑥0.08％TD-02组：每日上午背部外涂5％IMQ软膏80mg，每日下午背部外涂0.08％TD-02 72mg，连续6天。各组小鼠均隔天拍照并进行银屑病皮损的PASI评分，于第7天处死，取其背部皮损，行HE染色观察病理改变，同时提取RNA检测miR-210及炎细胞因子改变，分离真皮单细胞悬液行流式细胞术检测T_H17及T_H1细胞比例。结果显示：在造模第7天，与正常小鼠相比，IMQ组及空白基质组皮损中miR-210表达显著增高(图3-1A)；与空白基质组相比，miR-210在各TD-02处理组小鼠皮损中的表达均显著降低，且呈浓度依赖性(图3-1A)。外用TD-02软膏可显著改善IMQ诱导的小鼠炎症性皮损改变(包括大体改变及病理改变)，且0.08％TD-02组最为显著(图3-1B-E)。同时，外用TD-02软膏可显著抑制IMQ诱导的小鼠炎性皮损中T_H17、T_H1细胞浸润(图3-2A、B)，抑制IL-17A、IFN-γmRNA的表达，促进IL-4mRNA的表达(图3-2C-E)。

实施例5：TD-02软膏药代、毒理学研究

1品种基本情况

本次研究供试品为TD-02软膏(实施例3制备)，主要适应症为炎症性皮肤病的局部治疗。临床拟用给药途径为皮肤给药，临床拟用给药剂量每周不超过100g。

2药理毒理研究总结

TD-02软膏的非临床试验开展了毒理学研究：TD-02软膏毒理学研究采用了啮齿类(SD大鼠)作为实验系统，考察受试物经皮肤给药后的长期毒性作用，并在长毒试验中伴随进行血浆及皮肤的暴露量评估，确定受试物重复给药的毒性反应、毒性靶器官或靶组织。

2.1毒理学研究的总结

2.1.1毒理学研究概述

TD-02软膏毒理学研究采用了啮齿类(SD大鼠)作为实验系统，考察受试物经皮肤给药后的长期毒性作用，并在长毒试验中伴随进行血浆及皮肤的药物暴露量评估，确定受试物重复给药的毒性反应、毒性靶器官或靶组织。

2.1.2大鼠连续14天重复给药毒性伴随毒代动力学试验

选用SPF级SD大鼠作为实验系统，根据TD-02软膏临床拟用途径皮肤给药方法大鼠进行14天的重复给药毒性研究。选取雄性SD大鼠40只，按体重随机分为4组，每组10只动物。分别为TD-02软膏低剂量破损皮肤组；TD-02软膏中剂量破损皮肤组；TD-02软膏高剂量破损皮肤组(药物含量分别为0.000％、0.080％、0.240％、0.800％)，各组动物按10％体表面积给药，涂敷剂量约为0.03g/cm²，每日1次，每周7天，连续给药共14天(2周)。高剂量组分别于首次给药进行毒代动力学采血，末次给药进行毒代动力学采血和皮肤采集，考察TD-02软膏在SD大鼠体内的毒代动力学过程(AUC、tmax、t1/2等)

结果显示，(1)各组动物体重、血液学、凝血、血液生化及电解质、脏器系数和组织脏器形态(肉眼观察和显微镜下观察；见图4-1～图4～12)等均未见与受试物相关的异常改变(详见附表)；(2)以UPLC-MS/MS方法检测血浆及皮肤中TD-02的浓度。血浆定量下限为1mg/L，线性范围为1～64mg/L，全部样本中TD-02浓度均低于定量下限。在现有的检测条件下血浆中未检测出TD-02，提示药物全身暴露的风险较低。皮肤定量下限为5mg/L，线性范围为5～320mg/L，空白组皮肤30min未检测到TD-02，高剂量组皮肤30min样本浓度为26.61±8.69mg/L，含量为106.43±34.75mg/g；3h皮肤浓度为19.82±13.65mg/L，含量为79.26±54.62mg/g；24h皮肤浓度低于定量下限。根据药物局部给药的特性，提示药物能透过皮肤，且清除时间比较快，24小时内不会在皮肤中蓄积。

结论：本试验条件下，SD大鼠经皮肤给予TD-02软膏14天(2周)，未见受试物在体内有明显蓄积作用，未见明显毒性反应。

3综合评价

本次研究供试品为TD-02软膏，主要适应症为炎症性皮肤病的局部治疗。临床拟用给药途径为皮肤给药，临床拟用给药剂量每周不超过100g。本次研究通过TD-02软膏的临床前的初步药理毒理学研究评估，其中：

(1)毒理学研究显示，TD-02软膏连续14天重复皮肤给药的未见明显毒性反应，未见受试物在体内未产生蓄积作用。

附表1 TD-02软膏对动物体重的影响(单位：g，

)

附表2 TD-02软膏对大鼠血液学指标的影响(不包括毒代动物)

注：与空白对照组比较，⁺P≤0.05，⁺⁺P≤0.01。

附表3 TD-02软膏对大鼠生化指标的影响

注：与空白对照组比较，⁺P≤0.05。

附表4 TD-02软膏对大鼠电解质的影响

注：与空白对照组比较，⁺P≤0.05，⁺⁺P≤0.01。

附表5 TD-02软膏对大鼠凝血指标的影响

脏器形态见图4-1～4-12：

图4-1空白基质破损皮肤组(1M02号动物)肝脏。给药末期，HE染色，×200。肝细胞索排列有序，肝细胞未见变性、坏死，肝窦未见淤血。

图4-2空白基质破损皮肤组(1M02号动物)肾脏。给药末期，HE染色，×200。肾脏皮质、髓质结构清晰，肾单位形态结构正常，间质未见炎症细胞浸润。

图4-3空白基质破损皮肤组(1M02号动物)心脏。给药末期，HE染色，×200。心肌纤维染色均匀，横纹清楚，未见变性、坏死，间质未见出血、炎症细胞浸润。

图4-4空白基质破损皮肤组(1M02号动物)肺脏。给药末期，HE染色，×200。肺泡壁结构正常，间质未见炎症细胞浸润，肺泡腔内未见明显的渗出物。

图4-5空白基质破损皮肤组(1M02号动物)脾脏。给药末期，HE染色，×200。脾白髓、红髓结构清楚，未见淤血、纤维组织增生。

图4-6空白基质破损皮肤组(1M02号动物)破损皮肤。给药末期，HE染色，×100。皮肤表皮角化不全，棘层增厚，可见水疱及痂皮。

图4-7 TD-02软膏高剂量破损皮肤组(4M01号动物)肝脏。给药末期，HE染色，×200。肝细胞索排列有序，肝细胞未见变性、坏死，肝窦未见淤血。

图4-8 TD-02软膏高剂量破损皮肤组(4M01号动物)肾脏。给药末期，HE染色，×200。肾脏皮质、髓质结构清晰，肾单位形态结构正常，间质未见炎症细胞浸润。

图4-9 TD-02软膏高剂量破损皮肤组(4M01号动物)心脏。给药末期，HE染色，×200。心肌纤维染色均匀，横纹清楚，未见变性、坏死，间质未见出血、炎症细胞浸润。

图4-10 TD-02软膏高剂量破损皮肤组(4M01号动物)肺脏。给药末期，HE染色，×200。肺泡壁结构正常，间质未见炎症细胞浸润，肺泡腔内未见明显的渗出物。

图4-11 TD-02软膏高剂量破损皮肤组(4M01号动物)脾脏。给药末期，HE染色，×200。脾白髓、红髓结构清楚，未见淤血、纤维组织增生。

图4-12 TD-02软膏高剂量破损皮肤组(4M01号动物)破损皮肤。给药末期，HE染色，×100。皮肤表皮局灶性溃疡，角化不全，棘层增厚，可见痂皮。

附表6 TD-02软膏对大鼠脏器系数情况统计表

综上，本发明所述的式1-A化合物，具有优异的药效、且具有更低的毒副作用，可用于炎症性皮肤病的药物开发。

Claims (10)

1.一种二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物，其特征在于，具有式1结构式；

所述的n、m独自为1～6的整数；

所述的R₁、R₂中，至少一个取代基为活性取代基，所述的活性取代基为羟基、烷氧基、羟基烷基或烷氧烷基。

2.如权利要求1所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物，其特征在于，所述的烷氧基为C₁～C₆烷氧基；

优选地，所述的羟基烷基为带有1个及以上羟基取代基的C₁～C₆烷基；

优选地，所述的烷氧烷基为带有1个及以上烷氧取代基的C₁～C₆烷基。

3.如权利要求1所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物，其特征在于，所述的R₁、R₂中，其中的一个为活性取代基，另一个取代基为H、所述的活性取代基、烷基、苯基、苄基或卤素。

4.如权利要求1～3任一项所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物，其特征在于，所述的R₁为氢；所述的R₂为羟基烷基。

5.如权利要求1所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物，其特征在于，具有以下结构式；

6.一种权利要求1～5任一项所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物的制备方法，其特征在于，将式2所述的化合物和式3化合物经环合反应得到；

7.如权利要求6所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物的制备方法，其特征在于，环合反应的溶剂为甲醇；

环合反应中添加有反应助剂，为Cu(I)源。

8.如权利要求6所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物的制备方法，其特征在于，式2化合物由式4化合物和式5化合物发生酰胺化反应得到；

优选地，所述的酰胺化反应过程中，预先将式4化合物在活化剂下活化，随后再和式5化合物反应；

所述的活化剂优选为碳化二亚胺和1-羟基苯并三氮唑。

9.如权利要求8所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述的式4化合物由式6和式7化合物进行环合，随后再经酯水解得到；

所述的R₃为C₁～C₆的烷基。

10.一种权利要求1～5任一项所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、共晶、酯、酰胺衍生物中的至少一种在用于制备炎症性皮肤病药物中的应用；

优选地，将药学有效量的所述的二-(苯并咪唑)-1,2,3-三唑衍生物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、共晶、酯、酰胺衍生物中的至少一种和药学上可接受的辅料联合，用于制备药学上可接受的任意制剂；所述的制剂包括但不限于外用制剂、口服制剂或注射制剂；

优选地，所述炎症性皮肤病包括但不限于银屑病、副银屑病、玫瑰糠疹、皮肤型红斑狼疮。

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