CN113004134B - 一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素k2的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，对发酵液进行分离得到湿菌体，再冷冻干燥得到干菌体，将干菌体与棕榈油提取物混合2~4h，离心取上清液；将已经预处理的大孔树脂进行装柱，将上清液置于充满大孔树脂的分离柱中，使用第一洗脱剂除去杂油类物质，然后使用第一解析剂将维生素K2从大孔树脂上洗脱下来得到洗脱液；得到的洗脱液进行浓缩得到浓缩液；将所述浓缩液置于容纳有反相硅胶的分离柱中，以第二洗脱剂除去杂质，再用第二解析剂洗脱，得到高纯度维生素K2产品，进行冷冻结晶即得到维生素K2晶体。本发明使用的棕榈油提取物存在于自然界中，获取较为简单且不会产生有机废液，大大减少对环境的污染。
Description
技术领域
本发明属于生物化学工程领域，涉及一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，特别涉及利用棕榈油提取物(如中链甘油三酯)和乙酸丁酯等试剂作为溶媒绿色高效的提取纳豆芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中的维生素K2的方法。
背景技术
维生素K2是2-甲基-3-烷基-1,4-萘醌的系列衍生物，根据C-3位置上异戊二烯个数的不同，可被分为14种，用MK-n表示(n指侧链上异戊二烯单元的个数)。随着对维生素K2功能研究的深入，发现它不仅能够促进血液的凝固、防治骨质疏松，还对神经退行性疾病及多种肿瘤具有较好的预治作用。在日本和欧美，早已经作为功能性食品和药品进行销售，预计到2025年维生素K的销售额将达到80多亿美元，市场前景广阔。
由于天然获得维生素K2和化学合成维生素K2两种方法具有产率较低，副产物多，反应条件复杂等问题，目前效果较好的维生素K2生产方法为微生物发酵法，纳豆芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌通过发酵之后产生大量的维生素K2，为了获得高纯度的MK-7，需将其从原料中分离出来，并应用各种纯化技术获得高纯度的VK2产品。分离纯化是生物加工过程中成本最大的一部分，微生物发酵获得的产品一般先经过浓缩，离心，干燥等方法处理，再通过大量有机试剂提取与纯化获得不同纯度的样品。以往使用的分离纯化溶剂大多为甲醇，四氢呋喃、二氯甲烷等毒性较高的有机试剂作为溶媒，需要多步操作才能获得纯度较高的维生素K2，在此过程中污染严重，产生大量废液，操作复杂，成本较高，且得到的产品无法直接用于人体食用。因此，使用天然油脂和绿色有机试剂高效低成本的分离纯化技术在维生素K2工业生产中十分重要。
发明内容
本发明的目的利用棕榈油提取物(中链甘油三酯)作为溶媒提取纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌干菌体内的维生素K2，之后利用乙醇以及乙酸丁酯为分离纯化的溶剂，两步法绿色高效的获得高纯度维生素K2。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，包括下列步骤：
步骤1：对微生物发酵生产法得到的发酵液进行分离得到湿菌体，再将湿菌体冷冻干燥得到富含维生素K2的干菌体；
步骤2：将干菌体与棕榈油提取物混合2～4h，然后对混合液离心取上清液，得到的上清液即为富含维生素K2的棕榈油提取物；
步骤3：将已经预处理的大孔树脂进行装柱，将富含维生素K2的棕榈油提取物置于充满大孔树脂的分离柱中，使用第一洗脱剂除去杂油类物质，然后使用第一解析剂将维生素K2从大孔树脂上洗脱下来得到洗脱液；
步骤4：对步骤3得到的洗脱液进行浓缩得到浓缩液；
步骤5：将所述浓缩液置于容纳有反相硅胶的分离柱中，以第二洗脱剂除去杂质，再用第二解析剂洗脱，得到高纯度维生素K2产品；
步骤6：对高浓度维生素K2溶液进行冷冻结晶，即得到维生素K2晶体。
优选的技术方案为：干菌体与棕榈油提取物的质量比例为1:1～1:20。
优选的技术方案为：步骤2中，将干菌体与棕榈油提取物混合后，置于摇床上以转速200～300rpm/min，处理2～4h。
优选的技术方案为：步骤2中，混合液置于落地冷冻离心机，以转速7500～9000rpm离心10～20min。
优选的技术方案为：步骤3中，先用体积分数为95％的乙醇浸泡大孔树脂，然后打开玻璃柱的下端旋塞，将大孔树脂沿着一玻璃棒加入玻璃柱中，装填完毕后，轻轻敲击玻璃柱使其装填均匀，并使气泡逸出；所述大孔树脂为大孔树脂HPD417、大孔树脂HPD722、大孔树脂GDX-10和大孔树脂GDX-502中的一种。
优选的技术方案为：第一洗脱剂为体积分数为80％～100％的乙醇，洗脱速率为0.01～0.015柱体积/min；第一洗脱剂为乙酸丁酯，洗脱速率为0.05～0.06柱体积/min。
优选的技术方案为：步骤4采用旋转蒸发浓缩法，使用的仪器为旋转蒸发仪，通过真空泵使蒸发烧瓶处于负压状态，密封减压至400～600毫米汞柱，水浴加热温度为75℃～95℃，旋转速度为60～120rpm/min，旋蒸至乙酸乙酯全部蒸发即可结束。
优选的技术方案为：步骤5中，反相硅胶需要提前在130℃～140℃的环境下烘干0.5h～2h，之后使用乙酸丁酯浸泡2h以上。
优选的技术方案为：第二洗脱剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比5:2组成的混合液，流速为0.001～0.0015柱体积/min。
优选的技术方案为：第二解析剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比3:2组成的混合液，流速为0.001～0.0015柱体积/min。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、现有的维生素K2分离纯化方法需要使用大量的有毒试剂(包括甲醇、四氢呋喃、正己烷、二氯甲烷等)，会产生大量的有机废液，对环境造成了较大的污染，本发明使用的棕榈油提取物存在于自然界中，获取较为简单且不会产生有机废液，大大减少对环境的污染。
2、本发明的提取剂棕榈油提取物(中链甘油三酯)作为一种食用油，其提取物中链甘油三酯仅由饱和脂肪酸构成，凝固点低，室温下为液体，粘度小。与大豆油比较，中链甘油三酯完全是无臭、无色的透明液体。与普通的油脂和氢化油脂相比，中链甘油三酯不饱和脂肪酸的含量极低，氧化稳定性非常好，在高温和低温下都特别稳定，同时中链甘油三酯与维生素具有良好的互溶性，利用其作为溶媒提取出来的产品不用担心有机化学物质的残留。
3、现有的维生素K2分离纯化方法需要进行多个步骤，需要使用到大孔树脂、分子筛、硅胶等提取中介，使用四种以上的有机试剂，本发明的分离纯化方法只需要使用乙醇和乙酸丁酯两种绿色有机试剂、大孔树脂和反相硅胶两种提取中介，大大节省了分离纯化工艺的成本，也减少了对环境的污染。
附图说明
图1为中链甘油三酯-辛酸结构简式。
图2为富含维生素K2的棕榈油提取物的HPLC液相色谱。
图3为高效液相色谱图1，使用乙酸丁酯溶液作为解析剂在大孔树脂中分离维生素K2。
图4为高效液相色谱图2，使用乙酸丁酯：乙醇为3：2的混合溶液在反相硅胶中纯化维生素K2。
图5为本发明制得的黄色的维生素K2晶体。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-5。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法
利用棕榈油提取物(中链甘油三酯)作为溶媒一步提取干菌体内维生素K2，两步法分离纯化高纯度的维生素K2，主要包括如下步骤：
(1)菌株种子培养。纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌在发酵之前需要进行种子液培养得到一定数量的纯种菌液。
(2)发酵培养基的制备。通过发酵实验反馈结果不断优化发酵培养基成分，选择最佳的发酵培养基配方用于发酵。
(3)发酵过程调控。将步骤(1)中的种子液接种于步骤(2)配置的发酵培养基中。发酵温度35-40℃，保持转速为200～600rpm，如需通入空气，通气量控制在1-5vvm。发酵过程中实时监控发酵的温度，发酵罐压力以及菌体的生长速率，如发现培养体系中泡沫较多，随时添加灭菌的消泡剂进行消泡，总添加体积在培养体系的0.0001％-0.001％之间。
(4)干菌体的制备。将微生物发酵生产法得到的纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液分离得到湿菌体，再将湿菌体置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到富含维生素K2的纳豆芽孢杆菌干菌体。
(5)棕榈油提取物萃取纳豆芽孢杆菌干菌体内的维生素K2。将干菌体与棕榈油提取物按一定比例混合，摇床上充分混匀，搅拌混匀时间一般为2～4h，再将混合液置于落地冷冻离心机离心取上清液，得到的上清液即为富含维生素K2的棕榈油提取物。
(6)对已经预处理的大孔树脂进行装柱，取步骤(5)中得到的富含维生素K2的棕榈油提取物置于充满大孔树脂的分离柱中，使用洗脱剂一除去杂油类物质，后使用解析剂一将维生素K2从大孔树脂上洗脱下来。
(7)将步骤(6)得到的富含维生素K2的乙酸丁酯溶液浓缩。
(8)将步骤(7)中浓缩得到的维生素K2溶液置于充满反相硅胶的分离柱中，以洗脱剂二除去杂质，再用解析剂二得到高纯度维生素K2产品。
(9)将步骤(8)得到的高浓度的维生素K2溶液收集后置于-20℃的冰箱里冷冻结晶，即可得到纯度较高的维生素K2晶体。
所述步骤(1)中的种子液培养基为葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH为7.0～7.5。
所述步骤(1)中的培养条件为摇床温度25℃～37℃，摇床转速为100-250rpm。
所述步骤(1)中的种子制备过程中传代次数为2-4次，每次接种量为1-5％。
所述步骤(2)中的发酵培养基配方为甘油28g/L，蛋白胨55g/L，酵母提取物6g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4 1g/L，CaCl2 0.1g/L，pH为7.0～7.5。
所述步骤(2)中的发酵培养基在使用前需要进行灭菌，主要的灭菌方法包括高温湿热灭菌、除菌膜过滤等方法。
所属步骤(3)中发酵的接种量为1％～5％。
所述步骤(3)中摇瓶发酵时,摇瓶装液量为15％-25％，转速为100-250rpm。
所述步骤(3)中采用发酵罐大规模培养时，装液量为50％-85％，搅拌转速200-500rpm，通入无菌空气时通气量为1-10vvm，发酵温度为30℃～37℃。
所述步骤(4)中的湿菌体与发酵液分离方法主要使用的是落地冷冻离心机离心法，将50～100ml发酵液置于400ml离心杯中，将离心机的转子完成配平，离心机离心的转速为8000～10000rpm，离心时间为10～20min，倒出上清，保留沉淀在离心杯底部的湿菌体。
所述步骤(4)中冷冻干燥的温度为-20℃～-80℃，真空度为0～10mtor,冷冻干燥时间为24h～72h，至块状湿菌体呈粉末状干菌体，干燥后的含水量为1％～10％。
所述步骤(5)中干菌体和棕榈油提取物的比例为1:1～1:20(干菌体不需要进行如破壁等预处理，因为-80℃冷冻真空干燥和下步骤的乙醇溶液会使大部分菌体发生破壁)。
所述步骤(5)中摇床培养的转速为200～300rpm/min，。
所述步骤(5)中离心机离心的转速为7500～9000rpm，离心时间为10～20min。
所述步骤(6)中使用湿法装柱，先用洗脱剂浸泡大孔树脂，打开玻璃柱的下端旋塞，将大孔树脂沿着玻璃棒缓缓加入玻璃柱中，装填完毕后，轻轻敲击柱子使其装填均匀，并使气泡逸出。由于湿法装柱不易产生气泡，对物质的分离效果更好，故我们选择湿法装柱。
所述步骤(6)中大孔树脂HPD722需要提前使用95％的乙醇浸泡6h以上。
所述步骤(6)的上样量为15-25ml(5-10％柱体积)。
所述步骤(6)的洗脱剂一为80％～100％乙醇，洗脱速率为0.01～0.015柱体积/min.
所述步骤(6)的解析剂一为乙酸丁酯，洗脱速率为0.05～0.06柱体积/min。
所述步骤(7)中使用的浓缩方法为旋转蒸发浓缩法，使用的仪器为旋转蒸发仪。通过真空泵使蒸发烧瓶处于负压状态，密封减压至400～600毫米汞柱，水浴加热温度为75℃～95℃，旋转速度为60～120rpm/min，旋蒸至乙酸乙酯全部蒸发即可结束。
所述步骤(7)中旋蒸乙酸丁酯条件为真空状态下水浴加热至85℃～95℃。
所述步骤(8)的上样量为6-12ml。(10-20％柱体积)
所述步骤(8)中反相硅胶需要需要提前在130℃～140℃的环境下烘干0.5h～2h，之后使用乙酸丁酯浸泡2h以上。
所述步骤(8)中的洗脱剂二为乙酸丁酯:乙醇为5:2的混合液，流速为0.001～0.0015柱体积/min。
所述步骤(8)中的解析剂二为乙酸丁酯:乙醇为3:2的混合液，流速为0.001～0.0015柱体积/min。
所述步骤(9)中的结晶方法包括低温冷冻法、液相扩散法等。本研究使用的冷冻结晶方法将经过反相硅胶纯化后的样品浓缩后，加入少量甲醇，在-20℃～-25℃下冷冻18h～36h即可获得黄色晶体。
所使用中链甘油三酯的的理化性质和原料特性
| 酸值(mg KOH/g) | 0.02 | 相对密度 | 0.947 |
| 皂化值(mg KOH/g) | 333 | C8(辛酸)含量 | 60.3％ |
| 氢值(mg KOH/g) | 2 | C10(葵酸)链含量 | 39.6％ |
| 过氧化物值(mg KOH/g) | 0 | 其他杂质 | 0.1％ |
| 水分 | 0.02％ | 纯度 | 食用级(99％) |
棕榈油提取物(中链甘油三酯)作为一种食用油，其提取物中链甘油三酯仅由饱和脂肪酸构成，凝固点低，室温下为液体，粘度小。与大豆油比较，中链甘油三酯完全是无臭、无色的透明液体。与普通的油脂和氢化油脂相比，中链甘油三酯不饱和脂肪酸的含量极低，氧化稳定性非常好，在高温和低温下都特别稳定，同时中链甘油三酯与维生素具有良好的互溶性，利用其作为溶媒提取出来的产品不用担心有机化学物质的残留。故选择棕榈油提取物(中链甘油三酯)作为提取纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌胞内维生素K2的溶媒。本实验运用到棕榈油提取物(中链甘油三酯)由道勤生物科技(上海)有限公司生产。中链甘油三酯-辛酸结构简式如图1所示。
实施例2：一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法
首先对纳豆芽孢杆菌进行发酵，发酵得到的湿菌体进行冷冻干燥，得到纳豆芽孢杆菌干菌体，利用棕榈油提取物(中链甘油三酯)作为溶媒提取纳豆芽孢杆干菌体内的维生素K2，之后利用绿色无毒的乙醇以及乙酸丁酯作为分离纯化的溶剂，两步法绿色高效的获得高纯度维生素K2。具体如下：
在30L搅拌式反应器中发酵培养纳豆芽孢杆菌，装液量80％。以10％接种量接种种子培养液，37℃，250rpm发酵，过程中监控菌体浓度(OD法)培养培养至156小时后培养结束。将微生物发酵生产法得到的纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液利用落地冷冻离心机离心，离心的转速为10000rpm，离心时间为15min，得到湿菌体，再将湿菌体置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到富含维生素K2的纳豆芽孢杆菌干菌体。
取发酵得到的纳豆芽孢杆菌干菌体10g与100ml棕榈油提取物混合，混合物在摇床上混匀，搅拌混匀时间一般为2～4h，摇床培养的转速为200～300rpm/min,培养温度为35～40℃，再将混合液置于落地冷冻离心机离心取上清液，得到的上清液即为富含维生素K2的棕榈油提取物。将富含维生素K2的棕榈油提取物采用HPLC液相色谱检测，通过与标品对照确定维生素K2浓度，通过计算得到上述棕榈油溶液中维生素K2的浓度为323mg/L，证明乙酸丁酯作为溶媒提取纳豆芽孢杆菌干菌体中的维生素K2效果良好。具体如图2所示。
将得到的富含维生素K2的棕榈油提取物15ml置于充满大孔树脂HPD722的分离柱中，使用约150ml 80％的乙醇除去杂油类物质，洗脱杂质流速控制在0.5ml/min，之后使用约60ml乙酸丁酯将维生素K2从大孔树脂上洗脱下来，利用HPLC液相色谱确定维生素K2的浓度与纯度。统计实验数据后得到，使用乙醇和乙酸丁酯作为洗脱剂经过大孔树脂分离纯化得到的维生素K2的纯度可达到75％。高效液相色谱图如图3所示，使用乙酸丁酯溶液作为解析剂在大孔树脂中分离维生素K2。
为了方便下一步的操作，将上述步骤得到的富含维生素K2的乙酸丁酯溶液真空旋转蒸发，通过真空泵使蒸发烧瓶处于负压状态，密封减压至500毫米汞柱，水浴加热温度为85℃，旋转速度为90rpm/min，浓缩维生素K2溶液。浓缩后的溶液液置于充满反相硅胶的分离柱中，乙酸丁酯：乙醇为5：1的混合溶液作为洗脱剂取出杂质，流速为0.001柱体积/min，接着使用乙酸丁酯：乙醇为3：2的混合溶液作为解析剂解析反相硅胶中维生素K2，得到纯度达到95％以上的维生素K2溶液。通过计算得到经过上述分离纯化操作以后溶液中维生素K2的浓度为420mg/L。高效液相色谱图如图4所示，使用乙酸丁酯：乙醇为3：2的混合溶液在反相硅胶中纯化维生素K2.
将经过反相硅胶纯化后的样品浓缩后，加入少量甲醇，在-25℃下冷冻18h即可获得黄色的维生素K2晶体，如图5所示。
实施例3：一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法
一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，包括下列步骤：
步骤1：对微生物发酵生产法得到的发酵液进行分离得到湿菌体，再将湿菌体冷冻干燥得到富含维生素K2的干菌体；
步骤2：将干菌体与棕榈油提取物混合2h，然后对混合液离心取上清液，得到的上清液即为富含维生素K2的棕榈油提取物；
步骤3：将已经预处理的大孔树脂进行装柱，将富含维生素K2的棕榈油提取物置于充满大孔树脂的分离柱中，使用第一洗脱剂除去杂油类物质，然后使用第一解析剂将维生素K2从大孔树脂上洗脱下来得到洗脱液；
步骤4：对步骤3得到的洗脱液进行浓缩得到浓缩液；
步骤5：将所述浓缩液置于容纳有反相硅胶的分离柱中，以第二洗脱剂除去杂质，再用第二解析剂洗脱，得到高纯度维生素K2产品；
步骤6：对高浓度维生素K2溶液进行冷冻结晶，即得到维生素K2晶体。
优选的实施方式为：干菌体与棕榈油提取物的质量比例为1:1。
优选的实施方式为：步骤2中，将干菌体与棕榈油提取物混合后，置于摇床上以转速200rpm/min，处理2h。
优选的实施方式为：步骤2中，混合液置于落地冷冻离心机，以转速7500rpm离心10min。
优选的实施方式为：步骤3中，先用体积分数为95％的乙醇浸泡大孔树脂，然后打开玻璃柱的下端旋塞，将大孔树脂沿着一玻璃棒加入玻璃柱中，装填完毕后，轻轻敲击玻璃柱使其装填均匀，并使气泡逸出；所述大孔树脂为大孔树脂HPD417。
优选的实施方式为：第一洗脱剂为体积分数为80％％的乙醇，洗脱速率为0.01柱体积/min；第一洗脱剂为乙酸丁酯，洗脱速率为0.05柱体积/min。
优选的实施方式为：步骤4采用旋转蒸发浓缩法，使用的仪器为旋转蒸发仪，通过真空泵使蒸发烧瓶处于负压状态，密封减压至400毫米汞柱，水浴加热温度为75℃℃，旋转速度为60rpm/min，旋蒸至乙酸乙酯全部蒸发即可结束。
优选的实施方式为：步骤5中，反相硅胶需要提前在130℃的环境下烘干0.5h，之后使用乙酸丁酯浸泡2h以上。
优选的实施方式为：第二洗脱剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比5:2组成的混合液，流速为0.001柱体积/min。
优选的实施方式为：第二解析剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比3:2组成的混合液，流速为0.001柱体积/min。
实施例4：一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法
一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，包括下列步骤：
步骤1：对微生物发酵生产法得到的发酵液进行分离得到湿菌体，再将湿菌体冷冻干燥得到富含维生素K2的干菌体；
步骤2：将干菌体与棕榈油提取物混合4h，然后对混合液离心取上清液，得到的上清液即为富含维生素K2的棕榈油提取物；
步骤3：将已经预处理的大孔树脂进行装柱，将富含维生素K2的棕榈油提取物置于充满大孔树脂的分离柱中，使用第一洗脱剂除去杂油类物质，然后使用第一解析剂将维生素K2从大孔树脂上洗脱下来得到洗脱液；
步骤4：对步骤3得到的洗脱液进行浓缩得到浓缩液；
步骤5：将所述浓缩液置于容纳有反相硅胶的分离柱中，以第二洗脱剂除去杂质，再用第二解析剂洗脱，得到高纯度维生素K2产品；
步骤6：对高浓度维生素K2溶液进行冷冻结晶，即得到维生素K2晶体。
优选的实施方式为：干菌体与棕榈油提取物的质量比例为1:20。
优选的实施方式为：步骤2中，将干菌体与棕榈油提取物混合后，置于摇床上以转速300rpm/min，处理4h。
优选的实施方式为：步骤2中，混合液置于落地冷冻离心机，以转速9000rpm离心20min。
优选的实施方式为：步骤3中，先用体积分数为95％的乙醇浸泡大孔树脂，然后打开玻璃柱的下端旋塞，将大孔树脂沿着一玻璃棒加入玻璃柱中，装填完毕后，轻轻敲击玻璃柱使其装填均匀，并使气泡逸出；所述大孔树脂为大孔树脂HPD722。
优选的实施方式为：第一洗脱剂为体积分数为100％的乙醇，洗脱速率为0.015柱体积/min；第一洗脱剂为乙酸丁酯，洗脱速率为0.06倍柱体积/min。
优选的实施方式为：步骤4采用旋转蒸发浓缩法，使用的仪器为旋转蒸发仪，通过真空泵使蒸发烧瓶处于负压状态，密封减压至600毫米汞柱，水浴加热温度为95℃，旋转速度为120rpm/min，旋蒸至乙酸乙酯全部蒸发即可结束。
优选的实施方式为：步骤5中，反相硅胶需要提前在140℃的环境下烘干2h，之后使用乙酸丁酯浸泡2h以上。
优选的实施方式为：第二洗脱剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比5:2组成的混合液，流速为0.0015柱体积/min。
优选的实施方式为：第二解析剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比3:2组成的混合液，流速为0.0015柱体积/min。
实施例5：一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法
一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，包括下列步骤：
步骤1：对微生物发酵生产法得到的发酵液进行分离得到湿菌体，再将湿菌体冷冻干燥得到富含维生素K2的干菌体；
步骤2：将干菌体与棕榈油提取物混合3h，然后对混合液离心取上清液，得到的上清液即为富含维生素K2的棕榈油提取物；
步骤3：将已经预处理的大孔树脂进行装柱，将富含维生素K2的棕榈油提取物置于充满大孔树脂的分离柱中，使用第一洗脱剂除去杂油类物质，然后使用第一解析剂将维生素K2从大孔树脂上洗脱下来得到洗脱液；
步骤4：对步骤3得到的洗脱液进行浓缩得到浓缩液；
步骤5：将所述浓缩液置于容纳有反相硅胶的分离柱中，以第二洗脱剂除去杂质，再用第二解析剂洗脱，得到高纯度维生素K2产品；
步骤6：对高浓度维生素K2溶液进行冷冻结晶，即得到维生素K2晶体。
优选的实施方式为：干菌体与棕榈油提取物的质量比例为1:10。
优选的实施方式为：步骤2中，将干菌体与棕榈油提取物混合后，置于摇床上以转速250rpm/min，处理3h。
优选的实施方式为：步骤2中，混合液置于落地冷冻离心机，以转速8000rpm离心15min。
优选的实施方式为：步骤3中，先用体积分数为95％的乙醇浸泡大孔树脂，然后打开玻璃柱的下端旋塞，将大孔树脂沿着一玻璃棒加入玻璃柱中，装填完毕后，轻轻敲击玻璃柱使其装填均匀，并使气泡逸出；所述大孔树脂为大孔树脂GDX-10。
优选的实施方式为：第一洗脱剂为体积分数为90％的乙醇，洗脱速率为0.012柱体积/min；第一洗脱剂为乙酸丁酯，洗脱速率为0.055柱体积/min。
优选的实施方式为：步骤4采用旋转蒸发浓缩法，使用的仪器为旋转蒸发仪，通过真空泵使蒸发烧瓶处于负压状态，密封减压至500毫米汞柱，水浴加热温度为85℃，旋转速度为90rpm/min，旋蒸至乙酸乙酯全部蒸发即可结束。
优选的实施方式为：步骤5中，反相硅胶需要提前在135℃的环境下烘干1h，之后使用乙酸丁酯浸泡2h以上。
优选的实施方式为：第二洗脱剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比5:2组成的混合液，流速为0.0012柱体积/min。
优选的实施方式为：第二解析剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比3:2组成的混合液，流速为0.0012柱体积/min。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (7)
1.一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：对微生物发酵生产法得到的纳豆芽孢杆菌发酵液或枯草芽孢杆菌发酵液进行分离得到湿菌体，再将湿菌体冷冻干燥得到富含维生素K2的干菌体；
步骤2：将干菌体与棕榈油提取物混合2~4h，然后对混合液离心取上清液，得到的上清液即为富含维生素K2的棕榈油提取物；
步骤3：将已经预处理的大孔树脂进行装柱，将富含维生素K2的棕榈油提取物置于充满大孔树脂的分离柱中，使用第一洗脱剂除去杂油类物质，然后使用第一解析剂将维生素K2从大孔树脂上洗脱下来得到洗脱液；
步骤4：对步骤3得到的洗脱液进行浓缩得到浓缩液；
步骤5：将所述浓缩液置于容纳有反相硅胶的分离柱中，以第二洗脱剂除去杂质，再用第二解析剂洗脱，得到高纯度维生素K2产品；
步骤6：对高纯度维生素K2产品进行冷冻结晶，即得到维生素K2晶体；
第一洗脱剂为体积分数为80%~100%的乙醇，洗脱速率为0.01~0.015柱体积/min；第一解析剂为乙酸丁酯，洗脱速率为0.05~0.06柱体积/min；
第二洗脱剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比5:2组成的混合液，流速为0.001~0.0015柱体积/min；
第二解析剂由乙酸丁酯和乙醇按照体积比3:2组成的混合液，流速为0.001~0.0015柱体积/min；
所述棕榈油提取物为中链甘油三酯；
所述大孔树脂为大孔树脂HPD417、大孔树脂HPD722、大孔树脂GDX-10和大孔树脂GDX-502中的一种。
2.根据权利要求1所述的利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，其特征在于：干菌体与棕榈油提取物的质量比例为1:1~1:20。
3.根据权利要求1所述的利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，其特征在于：步骤2中，将干菌体与棕榈油提取物混合后，置于摇床上以转速200~300 rpm/min，处理2~4h。
4.根据权利要求1所述的利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，其特征在于：步骤2中，混合液置于落地冷冻离心机，以转速7500~9000 rpm离心10~20 min。
5.根据权利要求1所述的利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，其特征在于：步骤3中，先用体积分数为95%的乙醇浸泡大孔树脂，然后打开玻璃柱的下端旋塞，将大孔树脂沿着一玻璃棒加入玻璃柱中，装填完毕后，轻轻敲击玻璃柱使其装填均匀，并使气泡逸出。
6.根据权利要求1所述的利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，其特征在于：步骤4采用旋转蒸发浓缩法，使用的仪器为旋转蒸发仪，通过真空泵使蒸发烧瓶处于负压状态，密封减压至400~600毫米汞柱，水浴加热温度为75℃~95℃，旋转速度为60~120rpm/min，旋蒸至乙酸乙酯全部蒸发即可结束。
7.根据权利要求1所述的利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素K2的方法，其特征在于：步骤5中，反相硅胶需要提前在130℃~140℃的环境下烘干0.5h~2h，之后使用乙酸丁酯浸泡2h以上。
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