CN112997965A

CN112997965A - 一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

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Publication number: CN112997965A
Application number: CN202110252352.6A
Authority: CN
Inventors: 王瑚; 夏红飞; 马旭; 管纯一; 张璐
Original assignee: Institute Of Science And Technology National Health Commission
Current assignee: Institute Of Science And Technology National Health Commission
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2021-06-22

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA‑125a的小鼠模型及构建方法，本发明利用CRISPR/Cas9技术，在C57BL/6J小鼠中实现pre‑miRNA‑125a的基因组片段敲除。在小鼠基因组中设计一对用于片段敲除的sgRNA，在体外将两条sgRNA转录，与Cas9核酸酶共注射C57BL/6J小鼠受精卵，移入母体内发育成为原代(F0)小鼠；F0小鼠经鉴定与纯化后获得片段敲除的纯合个体。在纯合敲除小鼠中miRNA‑125a表达量显著降低。本发明提供了一种精确、高效、简便敲除miRNA‑125a的办法，可用于miRNA‑125a功能研究的小鼠模型，对实现其它miRNAs的片段敲除亦有参考价值。

Description

一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA-125a的小鼠模型及构建方法。

背景技术

基因的定点修饰技术是研究基因功能的重要手段之一，继早期的基因打靶后，目前研究者共发现了三代人工核酸内切酶。第三代人工核酸内切酶Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)因其操作简便、成本低廉、作用高效而得到了广泛应用[1]。其中，又以CRISPR/Cas9为迄今应用最广泛的基因编辑工具，它由crRNA和tracrRNA嵌合在一起的一条RNA链——sgRNA(singleguide RNA)和Cas9蛋白两部分组成。Cas9蛋白是一种核酸内切酶，包括RuvC和HNH两个活性中心，在sgRNA的指导下可以分别切割DNA的一条链，最终造成DNA双链断裂(DSB)[2]。在细胞对损伤的DNA进行修复过程中，会造成碱基的突变、插入或缺失，进而有造成该基因失活的可能。该技术诞生后不久，研究者很快就在哺乳动物细胞中成功实现了基因编辑[3,4]，随后又在多种生物体内得到了应用，成功获得了多种基因修饰后的生物[5]。

miRNA是一类长约22nt，具有广泛生物活性的ncRNA。成熟的miRNA主要通过与靶基因3’UTR上的靶点进行碱基互补配对实现对靶基因的表达调控，当它与靶点完全互补时，RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)会使mRNA发生降解；而当miRNA与靶点序列不完全互补时，RISC则能对mRNA的翻译起到抑制作用[6,7]。哺乳动物中，大多数编码蛋白质的mRNA都会受到miRNA的调控。已有研究显示miRNAs与早期妊娠密切相关。

miRNA-125a是一种在进化上高度保守的miRNA，在多种组织中都有表达，在细胞分化、个体发育等过程中发挥着重要调控作用[8]。研究已证实，miRNA-125a与生殖密切相关，有研究者发现，miRNA-125a在大鼠胚胎植入中存在差异表达[9]；此外，在pri-miRNA-125a编码基因中有两个SNPs，此外，在两个SNPs下游有一突变位点，该突变与这两个SNP共存能够增加复发性流产(RSA)的发生风险[10]。

包括miRNA在内的ncRNA直接在RNA水平上行使功能，因此生物体在对DSB进行修复时，少数几个碱基的改变可能无法完全使ncRNA失活。之前已有报道证实可以利用CRISPR/Cas9系统实现多基因的敲除[11]。采用该办法，有研究者在斑马鱼中注射Cas9蛋白mRNA和位于pre-miRNA-126a两侧的两条sgRNA，虽然效率还不甚理想，但是实现了对miRNA的片段敲除[12]。

为解决分别导入两条sgRNA效率不高的问题，我们对pX458载体进行了改造。pX458是一种sgRNA骨架和Cas9蛋白二合一的质粒，筛选标记为EGFP。我们体外合成一段双链DNA，包括U6启动子、酶切位点以及sgRNA骨架，将其插入到原载体中，即可获得同时表达两条sgRNA的改造载体，进而使实现高效基因组片段敲除成为可能。

近交系是指一个动物群中，任何个体基因组中99％以上的等位位点为纯合；C57BL/6J小鼠是一种常见的近交系，以57号母鼠和52号公鼠交配为起源，因其遗传背景清晰，被广泛应用于遗传学研究中。

总的来讲，相较编码基因而言，目前基于CRISPR/Cas9技术实现miRNAs片段敲除的研究较少；特别地，并未有基于CRISPR/Cas9技术片段敲除miRNA-125a的C57BL/6J小鼠的构建方法的相关报道。

参考文献

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[4]Mali P,Yang L,Esvelt K M,et al.RNA-Guided Human Genome Engineeringvia Cas9[J].Science,2013,339(6121):823.

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[10]Hu Y,Liu C M,Qi L,et al.Two common SNPs in pri-miR-125a alter themature miRNA expression and associate with recurrent pregnancy loss in a Han-Chinese population[J].Rna Biology,2011,8(5):861-872.

[11]Zhou J,Shen B,Zhang W,et al.One-step generation of differentimmunodeficient mice with multiple gene modifications by CRISPR/Cas9 mediatedgenome engineering[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,46(1):49-55.

[12]Xiao A,Wang Z,Hu Y,et al.Chromosomal deletions and inversionsmediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish[J].Nucleic Acids Research,2013,41(14):e141.

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于CRISPR/Cas9技术片段敲除miRNA-125a的C57BL/6J小鼠的构建方法。考虑到一个或数个碱基的改变可能不会对非编码RNA的表达产生显著影响，该方法同时向受精卵中注射两条sgRNA，能够实现pre-miRNA-125a的片段敲除。因此，本发明提供了一种精确、高效、简便敲除miRNA-125a的办法，可用于miRNA-125a功能研究的小鼠模型，对实现其它miRNAs的片段敲除亦有参考价值。本发明主要包括以下内容：

本发明的第一个方面，提供了一种基于CRISPR/Cas9技术构建的C57BL/6J模型小鼠，该模型小鼠为miRNA-125a敲除小鼠。

进一步，敲除区域为pre-miRNA-125a中的一部分，包括miRNA-125a-5p及3p的一部分和茎环结构的全部，全长42bp。

本发明的第二个方面，提供了一种建立miRNA-125a敲除小鼠模型的方法，包括以下步骤：

(1)针对C57BL/6J小鼠pre-miRNA-125a，设计敲除策略，敲除区域包括：miRNA-125a-5p及3p的一部分和茎环结构的全部，全长42bp；

(2)采用CRISPR/Cas9基因编辑方法，获得F0代小鼠；

(3)将阳性F0代小鼠和野生型C57BL/6J交配、繁育，最终得到具有miRNA-125a敲除阳性纯合小鼠。

进一步，实现42bp的片段敲除需要一对sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：1～2所示。

进一步，所述CRISPR/Cas9基因编辑方法包括分别设计和构建sgRNA1和sgRNA2，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；并将两条体外转录的sgRNA与Cas9蛋白共同进行原核注射，注射后的受精卵植入母鼠子宫获得F0(嵌合体)。

进一步，纯化小鼠时，F0(嵌合体)先与野生型交配，得到F1，F1再与野生型交配得到碱基序列相同的F2(杂合子)，同窝F2互相交配得到纯合敲除的F3。

所述阳性F1代小鼠用于保种建系，不同的保种建系之间原则上不允许交配。

本发明的第三个方面，提出了一种鉴定miRNA-125a敲除小鼠的方法，包括以下步骤：

(1)剪取少量小鼠组织，提取基因组DNA；

(2)针对拟敲除位点设计一对PCR扩增引物；

(3)以待检测小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物测序验证。

进一步，所述组织选自脚趾、尾巴或耳朵。

进一步，所述扩增引物包含sgRNA1和sgRNA2拟敲除位点。

进一步，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示。

根据本发明实施例的效果，在F3代中得到的miRNA-125a敲除阳性纯合小鼠基因组中pre-miRNA-125a区域内实现了42bp的纯合缺失，缺失位置和碱基序列均与预测一致。

本发明的第四个方面，提出了一种对miRNA-125a敲除小鼠进行脱靶验证的方法，包括以下步骤：

(1)针对sgRNA1和sgRNA2，每条sgRNA选择三个预测概率较大的潜在脱靶位点，每个潜在脱靶位点设计一对PCR扩增引物；

(2)选择纯化完成的纯合敲除及野生对照F3小鼠，剪取组织提取基因组DNA；

在本发明的具体实施方式中，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9～20所示。

根据本发明实施例的效果，随机选择纯合敲除及野生对照小鼠各3只，每只小鼠验证两条sgRNA共6个潜在脱靶位点，所有检测结果均未发现脱靶。

本发明的第五个方面，提出了一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建miRNA-125a敲除小鼠模型的sgRNA，包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA2的序列如SEQ ID NO:2所示。

附图说明

图1是T7E1验证sgRNA活性结果图；

图2是阳性纯合片段敲除小鼠鉴定结果图；其中，图A是sgRNA1和sgRNA2在pre-miRNA-125a序列中的切割位点；图B是F3中WT纯合小鼠切割位点处测序结果图；图C是F3中KO纯合小鼠切割位点处测序结果图；

图3是RT-qPCR检验敲除效率图；其中，图A是雄性小鼠睾丸组织miRNA-125a-5p的相对表达水平；图B是雄性小鼠睾丸组织miRNA-125a-3p的相对表达水平；

图4是潜在脱靶位点检验图；其中图A是sgRNA1的潜在脱靶位点检验图；图B是sgRNA2的潜在脱靶位点检验图；OT1～OT3：三个不同的潜在脱靶位点1～3：三只WT小鼠；4～6：三只KO小鼠；7：正常序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1设计sgRNA

分析序列以获取合适的sgRNA，利用网站(http://crispr.mit.edu)分析小鼠pre-miRNA-125a中的可用序列。选择了2条sgRNA(SEQ ID NO:1、2)作为片段敲除，具体如下：

SEQ ID NO:1序列为(sgRNA1)：CTCACAGGTTAAAGGGTCTC(5’→3’)

SEQ ID NO:2序列为(sgRNA2)：GGGTCACAGGTGAGGTTCTT(5’→3’)

根据上述两条sgRNA，设计带接头的靶标序列及其互补序列，具体如下：SEQ IDNO:3序列为(sgRNA1-F)：gtttgCTCACAGGTTAAAGGGTCTC(5’→3’)

SEQ ID NO:4序列为(sgRNA1-R)：aaacGAGACCCTTTAACCTGTGAGc(5’→3’)

SEQ ID NO:5序列为(sgRNA2-F)：gtttGGGTCACAGGTGAGGTTCTT(5’→3’)

SEQ ID NO:6序列为(sgRNA2-R)：aaacAAGAACCTCACCTGTGACCC(5’→3’)

实施例2构建表达载体

一)质粒线性化

将lentiCRISPR V2载体按表1所示体系酶切：

表1酶切体系

37℃酶切过夜，加入loading buffer至终浓度不低于1×后，利用0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化酶切产物，将线性DNA条带切胶回收，胶回收步骤如下(Omega公司商品化试剂盒)：

1、切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，加入等体积的胶溶液GSB，于65℃金属浴中5-10min，使之完全溶化。

2、将胶溶液分次全部加入离心柱中静置1min，12000rpm离心1min，弃流出液。

3、加入300μL GSB洗涤离心柱，12000rpm离心1min，弃流出液。

4、加入650μL溶液WB，12000rpm离心1min，弃流出液；重复一遍。

5、12000rpm离心2min，彻底去除残留的WB。

6、将离心柱置于一干净离心管中，在柱中央加入10-30μL去离子水，室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱DNA，定量后于-20℃保存。

二)sgRNA退火

将合成的sgRNA的F片段和R片段分别用ddH₂O溶解，配制成10μM的溶液；sgRNA片段进行磷酸化并退火，反应体系配制如表2所示：

表2反应体系

在PCR仪上设置如下程序：

37℃ 30min

95℃ 5min

95℃→25℃ 5℃/min

4℃ hold

退火后的产物-20℃保存。

三)连接

将线性化后的载体和退火后的双链sgRNA oligo使用T4 DNA连接酶连接，体系如表3所示。

表3连接体系

室温连接2h，全部连接产物转化50μL Stbl-3感受态细胞。

四)转化

1、冰浴。将-80℃保存的stbl-3感受态大肠杆菌在冰上解冻，融化后取1μL溶于高压水的质粒，加入50μL感受态细胞中(0.1ng质粒即能使100μL感受态细胞饱和)，冰浴30min。

2、热激。将感受态细胞于42℃金属浴中热激60-90s后迅速放冰上2-3min。

3、复苏。向感受态细胞中加入不含抗生素的LB液体培养基500μL，以180rpm的转速在37℃恒温摇床中复苏1h。

4、涂板。离心弃去多余培养基，吹吸剩余的培养基使大肠杆菌重悬，将转化后的大肠杆菌均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃恒温摇床中倒置培养过夜。

五)抽提质粒

挑取阳性单克隆菌，用人U6启动子通用引物(序列：5’-CCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3’)测序，对测序正确的阳性菌株扩大培养并抽提质粒提取质粒步骤如下(北京全式金生物技术有限公司，以下操作均为室温)：

1、取5-10mL菌液在2mL离心管中以12000rpm转速分次离心，收集沉淀。

2、每管加入500μL RB(含RNase A)，吹打悬浮细菌沉淀，形成均一的细菌悬液。

3、加入500μL LB，上下轻柔翻转4-6次，使菌体充分裂解。

4、加入700μL NB，轻轻翻转混合5-6次，静置2min，12000rpm离心5min。

5、取上清液加入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃流出液。

6、加入650μL WB，12000rpm离心1min，弃流出液。

7、12000rpm离心2min。

8、将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL 60-70℃预热的EB或去离子水(pH>7.0)，室温静置1min。

9、12000rpm离心1min，洗脱DNA，定量。

六)采用上述方法分别连接两条sgRNA，对测序正确的阳性菌株扩大培养并抽提质粒。

实施例3sgRNA活性验证

一)常规培养小鼠肝脏AML12细胞，铺12孔板，待汇合度约为80％时转染构建好的LentiCRISPR V2载体，每孔质粒转染1.5μg。

二)配制含有2μg/mL嘌呤霉素(puro)的完全培养基。转染24h后，换成含有puro的筛选培养基，继续正常培养48h；此时可以观察到未转染质粒的对照孔细胞逐渐死亡，换作正常完全培养基继续培养，培养至基本长满后即可提取细胞基因组DNA，利用PCR扩增含有sgRNA靶区间的目标片段，PCR引物设计为F:5’-GAGCTGGGGTGTCTTCTCTG-3’(SEQ ID NO:7)，R:5’-CAGCAGGAACAACAGGACAA-3’(SEQ ID NO:8)。PCR扩增体系如表4所示。

表4 PCR扩增体系

PCR循环：

取3μL PCR产物，加入6×loading buffer使其终浓度不低于1×，1％琼脂糖凝胶电泳检测，以观察到单一明亮的DNA条带为宜。对电泳检测合格的PCR产物进行DNA浓度定量。

三)全部PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，胶回收目标条带，溶于适量无菌水；取目标PCR产物酶切验证，配制体系如表5所示。

表5反应体系

在PCR仪上设置如下程序：

95℃ 5min

95℃→85℃ 2℃/s

85℃→25℃ 0.2℃/s

4℃ hold

向体系中加入T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)0.5μL，T7EⅠ可切割不完全配对的DNA，37℃反应15-30min；立即向体系中加入6×loading buffer使其终浓度不低于1×，1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否有短带产生并拍照保存，观察所产生短带的亮度差异。sgRNA活性验证结果如图1所示，1～4为4条sgRNA活性检验结果，3&4为sgRNA1和sgRNA2经T7E1酶切验证结果。

实施例4体外转录及原核注射

一)载体线性化及纯化

构建完成的pUC57-sgRNA表达载体需要再次线性化才能作为体外转录的模板，在载体的MCS区选择Dra I限制性内切酶进行酶切，使质粒线性化，酶切体系参照实施例2。

酶切完成后的线性化DNA模板进行后续纯化操作。

线性化DNA模板需要用等体积的苯酚氯仿混合物进行纯化，具体操作如下：首先利用等体积的苯酚氯仿混合物抽提酶切产物中的DNA，取水相再用等体积的氯仿抽提两次以去除其中残留的苯酚；再向其中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠溶液(pH＝5.2)和2倍体积的无水乙醇，-20℃静置30min以沉淀其中的DNA；12000rpm离心15min，弃去上清，再加入500μL 75％的乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心15min；空气干燥离心管中的沉淀，用无菌水溶解，调整浓度至0.5-1μg/μL。

二)体外转录

利用T7 RNA合成试剂盒(NEB公司)进行体外转录，体系如表6所示。

表6转录体系

37℃孵育4h或16℃孵育过夜，向其中加入20μL无核酸酶的水以及2μL DNaseI，37℃孵育15min，将反应产物用ZYMO R1017 RNA回收纯化试剂盒纯化，测浓度后-80℃备用。

三)原核注射

将Cas9 NLS蛋白(NEB)调整浓度至100ng/μL，体外转录并纯化的sgRNA调整浓度至30ng/μL，等体积混合后作为注射液胞浆注射制备转基因小鼠。

实施例5KO小鼠的鉴定及纯化

一)KO小鼠鉴定

剪取少量小鼠组织(脚趾、尾巴或耳朵)，利用鼠尾直接PCR试剂盒(美国bimake公司)快速提取基因组DNA，具体步骤如下：

将小鼠组织(小鼠1个脚趾或1～2mm鼠尾)置于无核酸酶的PCR管中，每管加入Protease plus 2μL及Buffer L 100μL，混匀后置PCR仪中，55℃消化15～30min，95℃反应5min使酶失活，消化液离心，取上清，-20℃保存；即为小鼠基因组DNA，可作为后续PCR反应模板。小鼠鉴定所需PCR引物序列如下：

F:5’-GAGCTGGGGTGTCTTCTCTG-3’(SEQ ID NO:7)

R:5’-CAGCAGGAACAACAGGACAA-3’(SEQ ID NO:8)

PCR体系设置如表7所示。

表7 PCR体系

PCR循环：

取3μL PCR产物，加入6×loading buffer使其终浓度不低于1×，1％琼脂糖凝胶电泳检测，以观察到单一明亮的DNA条带为宜。对电泳检测合格的PCR产物进行T7E1酶切或直接测序验证。

二)KO小鼠的纯化

原核注射后的受精卵发育而来的小鼠记为原代(F0)小鼠，仔鼠出生7～10d后，取小鼠脚趾，提取基因组DNA予以验证，因F0代小鼠一般为嵌合体，其基因组DNA的PCR产物进行T7E1酶切验证。

酶切阳性的F0代小鼠同WT进行交配，后代仔鼠取脚趾，PCR后测序鉴定F1代基因型。F1代小鼠大多数为杂合子，选择其中符合预期基因型的小鼠，与野生型再交配一代，F2代小鼠性成熟后进行同窝自由交配；根据孟德尔分离定律，F3代中出现野生型、杂合子和纯合子的比例大约为1:2:1。部分F3代小鼠鉴定结果如图2所示。

实施例6敲除效率检验

取纯合KO小鼠睾丸提取总RNA，以WT小鼠相应器官总RNA为对照，实时定量检测miRNA-125a表达量，并将结果进行统计学分析。

一)组织总RNA提取

采用“TRIzol-氯仿抽提，异丙醇沉淀”的办法提取组织中的总RNA，以备下一步检测使用，提取流程如下：

1、取绿豆大小的组织于1.5mL离心管中，每管加入500μL TRIzol，用匀浆机将组织匀浆，室温静置30min。

2、4℃，12000rpm离心5min，将上清转移进一个新的RNase-free的1.5mL离心管。

3、每管加入三氯甲烷100μL(体积为TRIzol的1/5)，盖盖后剧烈震荡15s；可见溶液充分乳化、无分层，室温静置5min。

4、4℃，12000rpm离心15min。

5、取出离心管，可观察到溶液上层为无色的水层(含RNA)，中间为白色的蛋白层，下层为红色的有机层；吸取上清转移至另一新的RNase-free离心管中。

6、加入异丙醇，体积与上清液相同(也可加入1μL糖原助沉)，颠倒离心管，使液体充分混匀，室温静置10min。

7、4℃，12000rpm离心10min，此时离心管底部一般会出现沉淀。

8、弃去上清，沿管壁加入RNase-free水配制的75％乙醇1mL，颠倒洗涤。

9、4℃，12000rpm离心5min。

10、吸去上清，在超净台室温吹干沉淀；用适量RNase-free水充分溶解沉淀，于NP80上定量后置-80℃保存。

二)RT-qPCR检测细胞系中miRNAs的表达量

1、miRNAs逆转录。以上述细胞系总RNA为模板，分别进行逆转录和实时荧光定量PCR检测其中的miRNA-125a-5p、3p及U6(内参)的表达量。首先采用茎环引物对特定miRNA进行逆转录，逆转录体系设置如表8所示。

表8逆转录体系

70℃反应10min，立即冰浴2min，之后每孔加入表9所示的试剂。

表9逆转录体系

42℃ 30min，70℃ 10min，85℃ 5min。逆转录产物稀释10倍用于实时荧光定量检测。

2、实时荧光定量扩增。实时荧光定量采用SYBR Green法，实验时每个因子重复3孔，同组设置3个生物学重复，体系设置如表10所示。

表10 RT-qPCR反应体系

在7500Fast Real-Time PCR System上设置如下程序：

Melting curve analysis

3、数据分析。查看每个样品孔的扩增情况，导出相应的阈值循环数，即Ct值。采用2^-ΔΔCt法计算miRNA相对量。

采用上述方法分别检测各标本中miRNA-125a-5p、miRNA-125a-3p及U6(内参)的Ct值，计算miRNA-125a-5p/3p的表达量；实验时每个因子重复3孔，同组设置3个生物学重复。结果如图3所示，结果显示，阳性敲除单克隆细胞系中miRNA-125a-5p、miRNA-125a-3p的表达量均显著下降。

实施例7潜在脱靶位点检验

根据sgRNA1及sgRNA2的序列，利用网站(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)查找其潜在脱靶位点，在搜索结果中，每条sgRNA选择3个潜在脱靶位点；针对每个潜在脱靶位点设计PCR扩增引物。所有选择的PCR扩增引物序列如下：

sgRNA1-OT1-F:5’-GGACATGAAGGCCTAAGGAATAG-3’(SEQ ID NO:9)

sgRNA1-OT1-R:5’-ACAGAGACAGAGAGACAGAGAG-3’(SEQ ID NO:10)

sgRNA1-OT2-F:5’-TGAAGACTCTGCCATCATCAC-3’(SEQ ID NO:11)

sgRNA1-OT2-R:5’-AGGACTCTGAAGGACCAAGA -3’(SEQ ID NO:12)

sgRNA1-OT3-F:5’-CCTAAGAGCTGCCTAGCTTATTT-3’(SEQ ID NO13)

sgRNA1-OT3-R:5’-GGTGTCTTTCTGGAGGGTTATC-3’(SEQ ID NO:14)

sgRNA2-OT1-F:5’-CTGCATTACCTCACACCCTTAG-3’(SEQ ID NO:15)

sgRNA2-OT1-R:5’-CAGCTTACCCTGAGCACATTAG-3’(SEQ ID NO:16)

sgRNA2-OT2-F:5’-CAGAGGTATCTGTGGCCTTTC-3’(SEQ ID NO:17)

sgRNA2-OT2-R:5’-GAGCTATGTCTCCCAGGATTTC-3’(SEQ ID NO:18)

sgRNA2-OT3-F:5’-TACAGGTACTGGGTCCTTAGTT-3’(SEQ ID NO19)

sgRNA2-OT3-R:5’-AATGAGGCTGGGTTGGTATG-3’(SEQ ID NO:20)

分别以3只KO小鼠及3只野生对照小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增；扩增产物予以测序验证，结果如图4所示，所有检测的潜在脱靶位点均未发生脱靶现象。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 国家卫生健康委科学技术研究所

<120> 一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

<141> 2021-03-08

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcacaggtt aaagggtctc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggtcacagg tgaggttctt 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtttgctcac aggttaaagg gtctc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacgagacc ctttaacctg tgagc 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtttgggtca caggtgaggt tctt 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacaagaac ctcacctgtg accc 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagctggggt gtcttctctg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagcaggaac aacaggacaa 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggacatgaag gcctaaggaa tag 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acagagacag agagacagag ag 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgaagactct gccatcatca c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aggactctga aggaccaaga 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cctaagagct gcctagctta ttt 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggtgtctttc tggagggtta tc 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgcattacc tcacaccctt ag 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagcttaccc tgagcacatt ag 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagaggtatc tgtggccttt c 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gagctatgtc tcccaggatt tc 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tacaggtact gggtccttag tt 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aatgaggctg ggttggtatg 20

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas9技术构建的C57BL/6J模型小鼠，其特征在于，该模型小鼠为miRNA-125a敲除小鼠；优选的，敲除区域为pre-miRNA-125a中的一部分，包括miRNA-125a-5p及3p的一部分和茎环结构的全部，全长42bp。

2.建立miRNA-125a敲除小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)采用CRISPR/Cas9基因编辑方法，获得F0代小鼠；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，实现42bp的片段敲除需要一对sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑方法包括分别设计和构建sgRNA1和sgRNA2，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；并将两条体外转录的sgRNA与Cas9蛋白共同进行原核注射，注射后的受精卵植入母鼠子宫获得F0。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，纯化小鼠时，F0先与野生型交配，得到F1，F1再与野生型交配得到碱基序列相同的F2，同窝F2互相交配得到纯合敲除的F3。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，阳性F1代小鼠用于保种建系，不同的保种建系之间原则上不允许交配。

7.一种鉴定miRNA-125a敲除小鼠的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)剪取少量小鼠组织，提取基因组DNA；

(2)针对权利要求3中所述的敲除位点设计一对PCR扩增引物；

(3)以待检测小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物测序验证；

优选的，(1)中所述的组织选自脚趾、尾巴或耳朵；

优选的，(2)中所述扩增引物包含sgRNA1和sgRNA2拟敲除位点；

更为优选的，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示。

8.一种对miRNA-125a敲除小鼠进行脱靶验证的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)针对权利要求3中所述的一对sgRNA，每条sgRNA选择三个预测概率较大的潜在脱靶位点，每个潜在脱靶位点设计一对PCR扩增引物；

(2)选择权利要求5中所述的纯合敲除及野生对照F3小鼠，剪取组织提取基因组DNA；

优选的，(1)中所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9～20所示。

9.权利要求1或2所述的模型小鼠在生殖及妊娠相关疾病研究中的应用。

10.一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建miRNA-125a敲除小鼠模型的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA2如SEQ ID NO:2所示。