CN112961243B

CN112961243B - 一种vegf抗体、重组aav病毒及其应用

Info

Publication number: CN112961243B
Application number: CN202110310119.9A
Authority: CN
Inventors: 刘明录; 韩庆梅; 强邦明; 王立新; 张传鹏; 金海锋; 冯建海; 卢永灿; 王亮; 李希鹏
Original assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: CN112961243A

Abstract

本发明提供一种VEGF抗体，所述抗体由人血清白蛋白信号肽Alb sp、重链、P2A连接子、人血清白蛋白信号肽Alb sp2、轻链依次串联；本发明还提供重组AAV病毒、以及上述VEGF抗体在抑制VEGF介导的内皮细胞增殖药物中的应用。本发明所述氨基酸和密码子优化后的VEGF抗体，其产生的抗体浓度更高，抑制人脐静脉内皮细胞的增殖效果高于另外两种对照VEGF抗体。

Description

一种VEGF抗体、重组AAV病毒及其应用

技术领域

本发明涉及一种VEGF抗体、重组AAV病毒及抑制VEGF介导的内皮细胞增殖药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

年龄相关性黄斑变性（Age-related Macular Degeneration, AMD）是一种主要由遗传和环境因素导致、与年龄相关的黄斑退行性疾病，是发达国家55岁以上人群致盲的首要因素，在我国发病率也逐年提高，已接近白种人群发病率。AMD分为湿性（新生血管性）和干性（无新生血管性）两种类型，以脉络膜上有或无新生血管为主要区别。目前湿性AMD的治疗主要是针对脉络膜新生血管（Choroidal Neo-Vascularization, CNV），治疗方式包括手术切除新生血管、光动力疗法（PhotoDynamic Therapy, PDT）及抗血管内皮生长因子（anti-Vascular Endothelial Growth Factor, anti-VEGF）药物治疗；干性AMD目前尚无有效治疗方法，虽然有研究表明早期可以通过抗氧化治疗(补充维生素C、E、β胡萝卜素和锌)延缓疾病进程。

针对抗血管内皮生长因子的药物主要有雷珠单抗、兰尼单抗以及包含VEGF抗体的腺相关病毒等。由于单克隆抗体单次注射发挥的作用有限，腺相关病毒具有可以连续提供蛋白质疗法的优点，使得AAV-VEGF的研究呈现火爆形式。CN104994882A利用腺相关病毒表达的是VEGF的抑制物Fms-相关酪氨酸激酶-1（sFLT-1）蛋白，对VEGF抗体涉及较少。CN111770999A中利用腺相关病毒表达VEGF相关抗体，对腺相关病毒进行了结构改造，以高效率靶向期望的视网膜细胞。US20200338146A1专利中也是对腺相关病毒进行结构改造，提高靶向视网膜细胞的效率。

现有技术中主要对腺相关病毒进行了改造，使其更有利于AMD疾病的治疗，对VEGF抗体的氨基酸序列也进行了部分优化，但主要表达的是VEGF的Fab段，很少使用整个抗体结构。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种VEGF抗体、重组AAV病毒及其在抑制VEGF介导的内皮细胞增殖药物中的应用，实现以下发明目的：优化VEGF的抗体序列，提高其表达的VEGF抗体浓度；抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种VEGF抗体，所述抗体由人血清白蛋白信号肽Alb sp、重链、P2A连接子、人血清白蛋白信号肽Alb sp2、轻链依次串联。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述重链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；所述轻链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。

所述P2A连接子由furin酶切位点RKRR和P2A蛋白组成；所述P2A蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

所述人血清白蛋白信号肽Alb sp的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，所述人血清白蛋白信号肽Alb sp2的氨基酸序列与Alb sp的氨基酸序列相比，缺少最开始的甲硫氨酸。

所述人血清白蛋白信号肽Alb sp的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述重链的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述轻链的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述P2A蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

所述VEGF抗体的全长核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

重组AAV病毒，所述重组AAV病毒中包括上述VEGF抗体的基因片段。

所述重组AAV病毒的制备方法，包括重组表达载体的构建，包装细胞系的培养、传代，腺相关病毒的包装，重组AAV病毒的浓缩与纯化。

所述包装细胞系的培养、传代，使用的包装细胞系为293T细胞，在细胞铺满瓶底的80%-90%时传代，传2-5代后的细胞用于转染；所述腺相关病毒的包装，目的质粒和pAAV-RC8、pHelper质粒的质量比为1:1:1。

上述VEGF抗体在制备抑制VEGF蛋白介导的内皮细胞增殖药物中的应用。

所述VEGF蛋白介导的内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

（1）氨基酸和密码子优化后的VEGF抗体，其产生的抗体浓度更高。

本发明所述pAAV-mab（VEGF）的病毒滴度调节至1×10¹¹vp/ml时，产生pAAV-mab（VEGF）中抗体的浓度为1259pg/ml，同样的病毒滴度下，pAAV-雷珠中抗体的浓度为1143pg/ml，pAAV-G6 Fab中抗体的浓度为1068pg/ml ，本发明pAAV-mab（VEGF）中抗体的浓度和pAAV-G6 Fab中抗体的浓度相比，提高了17.9%，可见，本发明mab（VEGF）产生的抗体浓度明显高于未优化的G6 Fab产生的抗体浓度。

（2）本发明所述优化后的VEGF抗体，抑制人脐静脉内皮细胞的增殖效果高于另外两种对照VEGF抗体。

当含有本发明VEGF抗体的重组AAV病毒与人脐静脉内皮细胞（HUVEC细胞）的数量比为20000:1时，对HUVEC细胞增殖的抑制率为53.02%；当含有本发明VEGF抗体的重组AAV病毒与人脐静脉内皮细胞（HUVEC细胞）的数量比为40000:1时，对HUVEC细胞增殖的抑制率为87.95%。

附图说明

图1为本发明VEGF抗体结构图；

图2为实施例2双酶切后的目的片段和载体片段；

图3为实施例4免疫荧光显微镜观察三种质粒的转染情况；

其中3a为免疫荧光显微镜观察的mab（VEGF）的转染情况；

3b为免疫荧光显微镜观察的雷珠的转染情况；

3c为免疫荧光显微镜观察的G6 Fab的转染情况；

图4为实施例6 的ELISA标准曲线图；

图5为实施例7的western blot检测VEGF抗体表达水平图

图6为本发明VEGF抗体与G6 Fab抗体的轻链核苷酸序列的对比；

图7为本发明VEGF抗体与G6 Fab抗体的重链可变区的核苷酸序列的对比。

具体实施方式

实施例1：VEGF抗体序列设计

按图1设计VEGF抗体结构，将抗体的重链和轻链通过P2A连接子进行连接，重链在基因序列的5’端，轻链在基因的3’端。

P2A连接子由furin酶切位点RKRR（精氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸）和P2A蛋白组成；经过furin酶切去除残留在重链上的P2A残留的氨基酸。

所述P2A蛋白中包括GSG（甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸），位于P2A蛋白的最前端，P2A中加入GSG（甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸），提高P2A的酶切效率。

重链和轻链分别由可变区和恒定区组成，信号肽为人血清白蛋白的信号肽，位于重链和轻链的5’端。本发明中VEGF抗体命名为mab（VEGF），送上海捷瑞公司合成。其中mab（VEGF）全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其余各部分的氨基酸和核苷酸序列如下：

Alb sp（人血清白蛋白信号肽）的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，氨基酸序列为SEQID NO.6；

重链的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.7；

P2A的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，氨基酸序列为SEQ ID NO.8；

轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，氨基酸序列为SEQ ID NO.9；

Alb sp2的氨基酸序列比Alb sp的氨基酸序列少了最开始的甲硫氨酸，其余一致。

同时以雷珠单抗和G6 Fab序列作为对照组进行研究。雷珠单抗的核苷酸序列为SEQ ID NO.10，G6 Fab的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。

本发明在G6 Fab的核苷酸序列基础上进行了优化，本发明和G6 Fab的轻链和重链的核苷酸序列的对比见附图6和7。

实施例2：重组表达载体的构建

分别将委托合成的mab（VEGF）、雷珠单抗、G6 Fab的序列用NotI、HindIII进行双酶切，获得具有粘性末端的目的片段。同时将载体pAAV-pCAG-wpre（购自addgene公司）进行NotI、HindIII双酶切，获得线性化载体片段（见图2），用T4连接酶连接目的片段和线性化载体片段，转化到E.coli(Top10)，经测序正确后，使用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pAAV-mab（VEGF）、pAAV-雷珠、pAAV-G6 Fab。本发明中提取到的重组表达载体pAAV-mab（VEGF）的浓度为350ng/ul，pAAV-雷珠的浓度为325ng/ul，pAAV-G6 Fab的浓度为315ng/ul。

实施例3：包装细胞系的培养、传代

本发明使用的包装细胞系为293T细胞。从液氮罐中取出冻存的293T细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到50ml离心管中，加入生理盐水，使总体积为50ml，混匀后在1500 rpm下离心 5 min。去掉上清，加入5 ml新鲜的高糖DMEM（含10% FBS）培养基重悬细胞，转入T75瓶中，每个瓶中补足到10ml高糖DMEM（含10% FBS）培养基。将培养瓶平稳放入37℃、5 %CO₂的培养箱中培养。第二天观察细胞存活率，并更换培养基。以后每天观察细胞生长情况，在细胞铺满瓶底的80%-90%时传代，传代后细胞用于转染。

实施例4：腺相关病毒的包装

当传代（复苏后的3代）后293T细胞铺板达到80%-90%时，用于转染。

转染试剂的准备：在5ml离心管中，分别配制A管与B管试剂（Tube A and Tube B）

配好后，放置5min，然后将A管缓慢加入B管，混合均匀。室温放置20min，形成脂质体-DNA混合物。将混合物加入培养瓶中，轻微混匀。置于37℃，5%CO₂培养箱中培养24-48h，用免疫荧光显微镜观察转染情况（如图3），收取全部上清和细胞，转移至50ml离心管，4000g离心30min，去除上清。加入2mL PBS混匀，放在-80℃反复冻融5次，使细胞充分裂解。

实施例5 重组AAV病毒的浓缩与纯化

1）细胞分离：将充分裂解后的细胞中，加入Benzonase 酶切断宿主染色体DNA，降低样品粘度。

2）澄清：4000g离心30min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。

3）浓缩更换缓冲液，将收集到的腺病毒溶液使用中空纤维浓缩，更换为离子交换的缓冲液。使用SOURCE 15Q，其缓冲液为20mM Tris，pH 8.0。

4）阴离子交换纯化，使用SOURCE 15Q ，采用400mM NaCl溶液洗脱。洗脱后腺病毒在高盐缓冲液中。

本发明中浓缩纯化后的pAAV-mab（VEGF）的病毒滴度为2.36×10¹¹vp/ml，pAAV-雷珠的病毒滴度为2.12×10¹¹vp/ml，pAAV-G6 Fab的病毒滴度为1.98×10¹¹vp/ml。

将三种病毒滴度调至1×10¹¹vp/ml，进行实施例6-8的试验。

实施例6 利用ELISA试剂盒检测VEGF抗体表达水平

检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温。

1) 准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。

2) 将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口。

3) 浸泡酶标板：加入300µl 1×洗液静置浸泡30 秒。弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。

4) 加标准品：将标准品分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，加到对应的孔中。空白孔加入100µl培养基。

5）加样本：样本孔加入 100µl含有病毒的上清液。

6) 加检测抗体孵育：每孔加入50 μl 稀释的检测抗体(1:100 稀释)。保证步骤4、5、6 连续加样，不要间断。加样过程在 15 分钟内完成。使用封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 2 小时。

7) 洗涤：弃掉液体，每孔加入 300 μl 洗液洗板，洗涤 6 次。每次洗板，在吸水纸上拍干。

8) 加酶孵育：每孔加入 100 μl 稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100 稀释)。使用新的封板膜封板。300 转/分钟振荡，室温孵育 45 分钟。

9) 洗涤：重复步骤 7。

10) 加底物显色：每孔加入 100 μl 显色底物 TMB，避光，室温孵育 5 - 30 分钟。

11) 加终止液：每孔加入 100 μl 终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。

12) 检测读数：在 30 分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的 OD 值。校准后的 OD 值为450 nm的测定值减去630 nm的测定值。

本发明中利用ELISA试剂盒形成的标准曲线图如图4所示，pAAV-mab（VEGF）中抗体的浓度为1259pg/ml，pAAV-雷珠中抗体的浓度为1143pg/ml，pAAV-G6 Fab中抗体的浓度为1068pg/ml。由此可见，氨基酸优化后的mab（VEGF）产生的抗体浓度高于未优化的G6 Fab产生的抗体和雷珠单抗。

实施例7 western blot检测VEGF抗体表达水平

本发明中采用HepG2细胞表达的VEGF蛋白作为抗原，浓缩纯化后的病毒颗粒作为抗体进行 western blot检测。HepG2细胞用细胞裂解液裂解后提取全细胞蛋白并定量。将点样蛋白浓度调成一致后电泳分离、转膜。转膜后的硝酸纤维素膜用50 g/L脱脂奶粉缓冲封闭液4℃封闭过夜，将pAAV-mab（VEGF）、pAAV-雷珠、pAAV-G6 Fab以及购买的VEGF抗体（1:200稀释）作为一抗，分别加入不同的膜上室温振摇孵育2 h，洗膜30 min后加二抗(1:8000)室温振摇孵育1 h，再洗膜30 min除去未结合的二抗，暗盒显影，内参选用GAPDH。

结果如图5所示，pAAV-mab（VEGF）中抗体的含量比购买的VEGF量偏低，高于pAAV-雷珠和pAAV-G6 Fab的含量。

实施例8 含有VEGF抗体的病毒颗粒抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖

人脐静脉内皮细胞利用含有VEGF、rhFGF、rhEGF，不含BBE的EGM-2培养基培养，每个培养皿中接种1×10⁶个细胞，加入10ml培养基，在细胞铺板达到50%时进行实验，同时对细胞计数。不同的培养皿中分别加入500µl （病毒与细胞的数量比为20000:1）或1000µl（病毒与细胞的数量比为40000:1）pAAV-mab（VEGF）、pAAV-雷珠、pAAV-G6 Fab或相同的基础溶液，放在37℃、5%CO₂培养箱中培养2-3天，观察细胞的增殖情况并进行细胞数量测定。

所述基础溶液，为用来溶解病毒的溶液。

结果其细胞数量如下表所示，加入1000µl的pAAV-mab（VEGF）对HUVEC细胞增殖的抑制率高达87.95%。

上述表格中，细胞数量的单位为个。

可见，本发明pAAV-mab（VEGF）对HUVEC细胞增殖的抑制率明显高于pAAV-G6 Fab和pAAV-雷珠组的抑制率。

除非特殊说明，本发明采用的比例均为质量比，采用的百分比，均为质量百分比。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120> 一种VEGF抗体、重组AAV病毒及其应用

<130> 2021

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2181

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 1

atgaaatggg tgaccttcat ctctctgctg tttctctttt ccagcgcata cagtgaagta 60

cagttggtgg agagtggagg aggacttgtg caacctggag gatcccttag actttcatgt 120

gctgcctcag gcttcaccat aagcgactac tggattcatt gggttcgaca agcccctggc 180

aaaggtctgg aatgggtcgc tggcatcaca ccggccggcg ggtacactta ctacgcagat 240

tccgtgaaag gacgctttac catcagtgcc gatacatcta aaaatacagc ttatctccag 300

atgaactcac tccgtgctga ggacacagcc gtttactatt gtgctcggtt tgtatttttc 360

ctcccgtatg caatggatta ctggggacaa ggcactctgg tgaccgtttc ttctcggtcg 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac ctgtgacggt ctcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctccggg taggaagaga aggggatccg gcgcaacaaa cttctctctg 1440

ctgaaacaag ccggagatgt cgaagagaat cctggaccga agtgggtaac ctttatttcc 1500

cttctttttc tctttagctc ggcttattcc actggagaca tccagatgac acagtcccca 1560

tcatccctct ctgcatctgt gggagaccga gtcaccatca cttgtcgtgc ctcccaggat 1620

gtgagcaccg ccgtggcctg gtatcaacag aagcctggca aggcccccaa gctgctgatc 1680

tactccgcct ccttcctgta ctccggcgtg ccttccaggt tctccggctc cggctccggc 1740

accgacttca ccctgaccat ctcctcctta caacccgagg acttcgccac ctactactgc 1800

cagcagtcat acaccacccc ccctaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaagagg 1860

actgttgctg ctccatctgt ttttattttt ccaccatctg atgaacaact taaatctgga 1920

actgcttctg ttgtttgtct tcttaataat ttttatccaa gagaagctaa agttcaatgg 1980

aaagttgata atgctcttca atctggaaat tctcaagaat ctgttactga acaagattct 2040

aaagattcta cttattctct ttcttctact cttactcttt ctaaagctga ttatgaaaaa 2100

cataaagttt atgcttgtga agttactcat caaggacttt cttctccagt tactaaatct 2160

tttaatagag gagaatgtta g 2181

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 2

atgaaatggg tgaccttcat ctctctgctg tttctctttt ccagcgcata cagt 54

<210> 3

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 3

gaagtacagt tggtggagag tggaggagga cttgtgcaac ctggaggatc ccttagactt 60

tcatgtgctg cctcaggctt caccataagc gactactgga ttcattgggt tcgacaagcc 120

cctggcaaag gtctggaatg ggtcgctggc atcacaccgg ccggcgggta cacttactac 180

gcagattccg tgaaaggacg ctttaccatc agtgccgata catctaaaaa tacagcttat 240

ctccagatga actcactccg tgctgaggac acagccgttt actattgtgc tcggtttgta 300

tttttcctcc cgtatgcaat ggattactgg ggacaaggca ctctggtgac cgtttcttct 360

cggtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtctcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1347

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 4

ggatccggcg caacaaactt ctctctgctg aaacaagccg gagatgtcga agagaatcct 60

ggaccg 66

<210> 5

<211> 651

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 5

actggagaca tccagatgac acagtcccca tcatccctct ctgcatctgt gggagaccga 60

gtcaccatca cttgtcgtgc ctcccaggat gtgagcaccg ccgtggcctg gtatcaacag 120

aagcctggca aggcccccaa gctgctgatc tactccgcct ccttcctgta ctccggcgtg 180

ccttccaggt tctccggctc cggctccggc accgacttca ccctgaccat ctcctcctta 240

caacccgagg acttcgccac ctactactgc cagcagtcat acaccacccc ccctaccttt 300

ggccagggca ccaaggtgga gatcaagagg actgttgctg ctccatctgt ttttattttt 360

ccaccatctg atgaacaact taaatctgga actgcttctg ttgtttgtct tcttaataat 420

ttttatccaa gagaagctaa agttcaatgg aaagttgata atgctcttca atctggaaat 480

tctcaagaat ctgttactga acaagattct aaagattcta cttattctct ttcttctact 540

cttactcttt ctaaagctga ttatgaaaaa cataaagttt atgcttgtga agttactcat 600

caaggacttt cttctccagt tactaaatct tttaatagag gagaatgtta g 651

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 6

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser

<210> 7

<211> 449

<212> PRT

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Arg Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 8

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 9

<211> 216

<212> PRT

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 9

Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser

20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr

85 90 95

Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 10

<211> 2175

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 10

atgaaatggg tgaccttcat ctctctgctg tttctctttt ccagcgcata cagtcaggtt 60

caattgcagc agcctggagc agaattggta aagcctgggg catctgtcaa gatgtcttgc 120

aaagcgtctg gatatacctt cacatcatat aatatgcatt gggttaaaca aacccctgga 180

agaggcttgg agtggatagg ggcaatttac cccggaaacg gcgacacatc ttataatcag 240

aaatttaagg gaaaggcgac tcttaccgcc gataaatcta gcagcaccgc ctatatgcag 300

ctctcatcac tgaccagcga agactctgcg gtctattact gcgccagaag cacctactac 360

ggcggagact ggtactttaa tgtttgggga gccggcacaa cagtgactgt cagcgctgcg 420

tcgaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aacctgtgac ggtctcgtgg 540

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1140

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380

aagagcctct ccctgtctcc gggtaggaag agaaggggat ccggcgcaac aaacttctct 1440

ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cgaagtgggt aacctttatt 1500

tcccttcttt ttctctttag ctcggcttat tcccaaattg tgctctctca gtctccagcc 1560

attctgagtg ccagcccagg ggaaaaggta actatgactt gtagggccag tagcagcgtt 1620

agttatattc attggttcca gcagaaaccg ggatcttcac caaagccttg gatttatgca 1680

acctctaatc ttgccagcgg agttcccgtg cggtttagcg gaagcggttc tggaacaagc 1740

tacagtctca caattagtcg cgtggaggct gaggacgctg caacttacta ctgccagcag 1800

tggacctcta acccacctac tttcggcggt ggaacaaagc tggaaatcaa aaggactgtt 1860

gctgctccat ctgtttttat ttttccacca tctgatgaac aacttaaatc tggaactgct 1920

tctgttgttt gtcttcttaa taatttttat ccaagagaag ctaaagttca atggaaagtt 1980

gataatgctc ttcaatctgg aaattctcaa gaatctgtta ctgaacaaga ttctaaagat 2040

tctacttatt ctctttcttc tactcttact ctttctaaag ctgattatga aaaacataaa 2100

gtttatgctt gtgaagttac tcatcaagga ctttcttctc cagttactaa atcttttaat 2160

agaggagaat gttag 2175

<210> 11

<211> 2175

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 11

atgaaatggg tgaccttcat ctctctgctg tttctctttt ccagcgcata cagtgaagtg 60

cagttagtgg agagcggtgg ggggttggtc cagccaggcg gaagcctacg gctgtcctgt 120

gctgcctcag gcttcaccat aagcgactac tggattcatt gggttcgaca agcccctggc 180

aaaggtctgg aatgggtcgc tggcatcaca ccggccggcg ggtacactta ctacgcagat 240

tccgtgaaag gacgctttac catcagtgcc gatacatcta aaaatacagc ttatctccag 300

atgaactcac tccgtgctga ggacacagcc gtttactatt gtgctcggtt tgtatttttc 360

ctcccgtatg caatggatta ctggggacaa ggcactctgg tgaccgtttc ttctcggtcg 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac ctgtgacggt ctcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

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tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

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gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

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gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

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gataatgctc ttcaatctgg aaattctcaa gaatctgtta ctgaacaaga ttctaaagat 2040

tctacttatt ctctttcttc tactcttact ctttctaaag ctgattatga aaaacataaa 2100

gtttatgctt gtgaagttac tcatcaagga ctttcttctc cagttactaa atcttttaat 2160

agaggagaat gttag 2175

Claims

1.一种编码VEGF抗体的核酸，其特征在于：所述核酸的序列为序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.重组AAV病毒，其特征在于：所述重组AAV病毒中包括权利要求1所述的核酸。

3.根据权利要求2所述的重组AAV病毒的制备方法，其特征在于：所述重组AAV病毒的制备方法，包括重组表达载体的构建，包装细胞系的培养、传代，腺相关病毒的包装，重组AAV病毒的浓缩与纯化；

4.权利要求1所述的核酸在制备抑制VEGF蛋白介导的内皮细胞增殖药物中的应用。