CN112941036B - 一种提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法。4种化合物及其组合物均对狂犬病毒在人二倍体MRC5细胞中的复制有显著的促进作用，增加人二倍体细胞狂犬病毒的产量，从而可以降低狂犬疫苗的生产成本；由于4种化合物均为小分子化合物，在后续狂犬疫苗纯化的工艺中可以被有效的清除，无安全性风险。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法。
背景技术
狂犬病是一种由狂犬病毒引起的人兽共患病，该病是以侵犯中枢神经系统为主的急性传染病，一旦发病，死亡率高达100%。狂犬病在全世界范围内流行，根据WHO的报道，2016年全球大约有6万人死于狂犬病，95%的死亡病例发生在亚洲和非洲。目前注射狂犬疫苗被认为是控制狂犬病最有效的方法。
目前世界上大量生产的狂完全疫苗有4种：第一种以vero细胞培养狂犬病毒，制备冻干灭活疫苗，但是由于vero细胞为猴源，需要控制宿主细胞基质中DNA的残留。第二种和第三种以地鼠肾和鸡胚培养狂犬病毒，同样存在外源DNA残留问题。第四种以人二倍体细胞作为宿主细胞进行培养，通过浓缩纯化制备狂犬疫苗。但是由于狂犬病毒无法很好的感染人二倍体细胞，导致这类疫苗产量很低价格高昂。
人二倍体细胞，顾名思义来源于人体组织。人用二倍体细胞系统经过数十年的研究，其生长特性，遗传稳定特性，致肿瘤阴性等特征被充分验证。更为重要的是人二倍体细胞本身源于人体，当用于疫苗生产时，其的残余成分不会成为超敏反应原。因此，从质量控制和安全性角度看，相比较其他细胞系，人二倍体细胞没有潜在的不安全隐患，是制备疫苗的理想细胞系。
但是相比较vero细胞，狂犬病毒在人二倍体细胞中的复制水平很低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法。本发明克服了狂犬病毒无法在人二倍体细胞中大量复制的缺陷，简单快速，安全有效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法，包括在培养体系中添加如下式I~式IV所示化合物中的一种或几种的组合物：
作为优选，提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法具体包括如下步骤：
步骤1）将人二倍体细胞在第一培养体系中进行培养，第一培养体系为含有式I~式IV所示化合物中的一种或几种的培养体系；
步骤2）在第一培养体系中接种狂犬病毒，进行培养；
步骤3）将步骤2）所得的人二倍体细胞在第二培养体系中进行培养，第二培养体系为含有式I~式IV所示化合物中的一种或几种的培养体系。
本发明经研究，使用在培养过程中加入化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV或其组合物，成功的提高了狂犬病毒在人二倍体MRC5细胞中的复制水平，为大量生产人二倍体细胞狂犬病毒灭活疫苗提供了新的方法。
作为优选，第一培养体系为含有式I~式IV所示化合物中的一种或两种的培养体系；
作为优选，第二培养体系为含有式I~式IV所示化合物中的一种或两种的培养体系。
作为优选，第一培养体系或第二培养体系中，式I~式IV所示化合物的浓度为0.25µM~4µM。
作为优选，第一培养体系或第二培养体系中，仅含有式I~式IV所示化合物中的一种，化合物的浓度如下：
式I所示化合物浓度为0.5～4 µM；
式II所示化合物浓度为0.5～4 µM；
式III所示化合物浓度为0.25～2 µM；
式IV所示化合物浓度为0.25～2 µM。
优选地，式I所示化合物浓度为1～4 µM；
式II所示化合物浓度为1～4 µM；
式III所示化合物浓度为0.5～2 µM；
式IV所示化合物浓度为0.5～2 µM。
在本发明具体实施例中，式I所示化合物浓度为0.5、1、2、4 µM；
式II所示化合物浓度为0.5、1、2、4 µM；
式III所示化合物浓度为0.25、0.5、1、2 µM；
式IV所示化合物浓度为0.25、0.5、1、2 µM。
作为优选，第一培养体系或第二培养体系中含有式I~式IV所示化合物中的两种，化合物的浓度如下：
式I所示化合物和式II所示化合物联合作用浓度为各0.25～2µM；
式III所示化合物和式IV所示化合物联合作用浓度为各0.1～1µM；
式I所示化合物和式IV所示化合物联合作用浓度为各0.25～2µM；
式III所示化合物和式II所示化合物联合作用浓度为各0.1～1µM。
优选地，式I所示化合物和式II所示化合物联合作用浓度为各0.5～2µM；
式III所示化合物和式IV所示化合物联合作用浓度为各0.25～1µM；
式I所示化合物和式IV所示化合物联合作用浓度为各0.5～2µM；
式III所示化合物和式II所示化合物联合作用浓度为各0.25～1µM。
在本发明具体实施例中，式I所示化合物和式II所示化合物联合作用浓度为各0.25、0.5、1、2µM；
式III所示化合物和式IV所示化合物联合作用浓度为各0.1、0.25、0.5、1µM；
式I所示化合物和式IV所示化合物联合作用浓度为各0.25、0.5、1、2µM；
式III所示化合物和式II所示化合物联合作用浓度为各0.1、0.25、0.5、1µM。
在本发明提供的具体实施例中，第一培养体系的基础培养基为无血清MEM培养基。但第一培养体系的基础培养基并非限定于此，本领域技术人员认可的基础培养基种类均在本发明保护范围之内。
在本发明提供的具体实施例中，第二培养体系的基础培养基为含有1%小牛血清的MEM培养基。但第二培养体系的基础培养基并非限定于此，本领域技术人员认可的基础培养基种类均在本发明保护范围之内。
作为优选，步骤1）或步骤3）中所述培养为在细胞工厂、转瓶或反应器中培养。
作为优选，步骤1）中，培养的条件为：37℃、5%CO2。
优选地，步骤1）中，培养的条件为：37℃、5%CO2培养1~3h。
在本发明提供的具体实施例中，步骤1）中，培养的条件为：37℃、5%CO2培养2h。
作为优选，步骤2）中，狂犬病毒的MOI值为0.05~0.6；培养的条件为：34℃、5%CO2。
优选地，步骤2）中，培养的条件为：34℃、5%CO2培养3~5h。
在本发明提供的具体实施例中，步骤2）中，狂犬病毒的MOI值为0.5或0.05；培养的条件为：34℃、5%CO2培养4h。
作为优选，步骤3）中，培养的条件为：34℃、5%CO2培养。
优选地，步骤3）中，培养的条件为：34℃、5%CO2培养6~10天。
在本发明提供的具体实施例中，步骤3）中，培养的条件为：34℃、5%CO2培养7天。
在本发明具体实施例中，人二倍体细胞为MRC5细胞。但本发明并非限定于此，其它的人二倍体细胞的种类也在本发明的保护范围之内。
在本发明具体实施例中，狂犬病毒为狂犬病毒PM株。但本发明并非限定于此，其它的狂犬病毒的种类也在本发明的保护范围之内。
本发明提供了4种化合物及其组合物提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法，本发明的优势如下：
4种化合物及其组合物均对狂犬病毒在人二倍体MRC5细胞中的复制有显著的促进作用，增加人二倍体细胞狂犬病毒的产量，从而可以降低狂犬疫苗的生产成本；
由于4种化合物均为小分子化合物，在后续狂犬疫苗纯化的工艺中可以被有效的清除，无安全性风险。
附图说明
图1：化合物I~IV或其组合物对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响。
具体实施方式
本发明公开了一种提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
表1 四种化合物对应分子式
本发明提供的一种提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法中所用试剂、仪器等均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
取对数生长期28-31代的MRC5细胞0.4×108个接种于500mL含有10%小牛血清的MEM培养基中，37℃、5%CO2转瓶培养5天，观察细胞覆盖率为80%左右，用无血清MEM培养基清洗细胞表面3次。向细胞中加入200mL用无血清MEM培养基稀释的化合物I，终浓度分别为0.5µM、1 µM、2 µM、4 µM，37℃、5%CO2转瓶培养2h。向培养液中接入狂犬病毒PM株，MOI为0.5，34℃、5%CO2转瓶4h。倒掉原培养液，向细胞中加入500mL含有1%小牛血清的MEM培养基维持液，并同时添加化合物I，终浓度分别为0.5µM、1 µM、2 µM、4 µM，34℃、5%CO2转瓶培养7天。
7天后收取培养上清进行病毒FFU检测。
实施例2：化合物II对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响
取对数生长期28-31代的MRC5细胞0.4×108个接种于500mL含有10%小牛血清的MEM培养基中，37℃、5%CO2转瓶培养5天，观察细胞覆盖率为80%左右，用无血清MEM培养基清洗细胞表面3次。向细胞中加入200mL用无血清MEM培养基稀释的化合物II，终浓度分别为0.5µM、1 µM、2 µM、4 µM，37℃、5%CO2转瓶培养2h。向培养液中接入狂犬病毒PM株，MOI为0.5，34℃、5%CO2转瓶4h。倒掉原培养液，向细胞中加入500mL含有1%小牛血清的MEM培养基维持液，并同时添加化合物II，终浓度分别为0.5µM、1 µM、2 µM、4 µM，34℃、5%CO2转瓶培养7天。
7天后收取培养上清进行病毒FFU检测。
实施例3：化合物III对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响
取对数生长期28-31代的MRC5细胞0.4×108个接种于500mL含有10%小牛血清的MEM培养基中，37℃、5%CO2转瓶培养5天，观察细胞覆盖率为80%左右，用无血清MEM培养基清洗细胞表面3次。向细胞中加入200mL用无血清MEM培养基稀释的化合物III，终浓度分别为0.25µM、0.5 µM、1µM、2 µM，37℃、5%CO2转瓶培养2h。向培养液中接入狂犬病毒PM株，MOI为0.5，34℃、5%CO2转瓶4h。倒掉原培养液，向细胞中加入500mL含有1%小牛血清的MEM培养基维持液，并同时添加化合物III，终浓度分别为0.25µM、0.5 µM、1µM、2 µM，34℃、5%CO2转瓶培养7天。
7天后收取培养上清进行病毒FFU检测。
实施例4：化合物IV对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响
取对数生长期28-31代的MRC5细胞0.4×108个接种于500mL含有10%小牛血清的MEM培养基中，37℃、5%CO2转瓶培养5天，观察细胞覆盖率为80%左右，用无血清MEM培养基清洗细胞表面3次。向细胞中加入200mL用无血清MEM培养基稀释的化合物IV，终浓度分别为0.25µM、0.5 µM、1µM、2 µM，37℃、5%CO2转瓶培养2h。向培养液中接入狂犬病毒PM株，MOI为0.5，34℃、5%CO2转瓶4h。倒掉原培养液，向细胞中加入500mL含有1%小牛血清的MEM培养基维持液，并同时添加化合物IV，终浓度分别为0.25µM、0.5 µM、1µM、2 µM，34℃、5%CO2转瓶培养7天。
7天后收取培养上清进行病毒FFU检测。
实施例5：化合物I和化合物II联用对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响
取对数生长期28-31代的MRC5细胞0.4×108个接种于500mL含有10%小牛血清的MEM培养基中，37℃、5%CO2转瓶培养5天，观察细胞覆盖率为80%左右，用无血清MEM培养基清洗细胞表面3次。向细胞中分别加入用无血清MEM培养基稀释的化合物I和化合物II各100mL，终浓度分别为0.25µM和0.25µM、0.5 µM和0.5 µM、1 µM和1 µM、2 µM和2 µM，37℃、5%CO2转瓶培养2h。向培养液中接入狂犬病毒PM株，MOI为0.5，34℃、5%CO2转瓶4h。倒掉原培养液，向细胞中加入500mL含有1%小牛血清的MEM培养基维持液，并同时分别添加化合物I和化合物II，终浓度分别为0.25µM和0.25µM、0.5 µM和0.5 µM、1 µM和1 µM、2 µM和2 µM ，34℃、5%CO2转瓶培养7天。
7天后收取培养上清进行病毒FFU检测。
实施例6：化合物III和化合物IV联用对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响
取对数生长期28-31代的MRC5细胞0.4×108个接种于500mL含有10%小牛血清的MEM培养基中，37℃、5%CO2转瓶培养5天，观察细胞覆盖率为80%左右，用无血清MEM培养基清洗细胞表面3次。向细胞中分别加入用无血清MEM培养基稀释的化合物III和化合物IV各100mL，终浓度分别为0.1µM和0.1µM、0.25µM和0.25µM、0.5 µM和0.5 µM、1 µM和1 µM，37℃、5%CO2转瓶培养2h。向培养液中接入狂犬病毒PM株，MOI为0.5，34℃、5%CO2转瓶4h。倒掉原培养液，向细胞中加入500mL含有1%小牛血清的MEM培养基维持液，并同时分别添加化合物III和化合物IV，终浓度分别为0.1µM和0.1µM、0.25µM和0.25µM、0.5 µM和0.5 µM、1 µM和1 µM，34℃、5%CO2转瓶培养7天。
7天后收取培养上清进行病毒FFU检测。
实施例7：化合物I和化合物IV联用对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响
取对数生长期28-31代的MRC5细胞0.4×108个接种于500mL含有10%小牛血清的MEM培养基中，37℃、5%CO2转瓶培养5天，观察细胞覆盖率为80%左右，用无血清MEM培养基清洗细胞表面3次。向细胞中分别加入用无血清MEM培养基稀释的化合物I和化合物IV各100mL，终浓度分别为0.25µM和0.25µM、0.5 µM和0.5 µM、1 µM和1 µM、2 µM和2 µM，37℃、5%CO2转瓶培养2h。向培养液中接入狂犬病毒PM株，MOI为0.5，34℃、5%CO2转瓶4h。倒掉原培养液，向细胞中加入500mL含有1%小牛血清的MEM培养基维持液，并同时分别添加化合物I和化合物IV，终浓度分别为0.25µM和0.25µM、0.5 µM和0.5 µM、1 µM和1 µM、2 µM和2 µM ，34℃、5%CO2转瓶培养7天。
7天后收取培养上清进行病毒FFU检测。
实施例8：化合物III和化合物II联用对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响
取对数生长期28-31代的MRC5细胞0.4×108个接种于500mL含有10%小牛血清的MEM培养基中，37℃、5%CO2转瓶培养5天，观察细胞覆盖率为80%左右，用无血清MEM培养基清洗细胞表面3次。向细胞中分别加入用无血清MEM培养基稀释的化合物III和化合物II各100mL，终浓度分别为0.1µM和0.1µM、0.25µM和0.25µM、0.5 µM和0.5 µM、1 µM和1 µM，37℃、5%CO2转瓶培养2h。向培养液中接入狂犬病毒PM株，MOI为0.5，34℃、5%CO2转瓶4h。倒掉原培养液，向细胞中加入500mL含有1%小牛血清的MEM培养基维持液，并同时分别添加化合物III和化合物II，终浓度分别为0.1µM和0.1µM、0.25µM和0.25µM、0.5 µM和0.5 µM、1 µM和1 µM，34℃、5%CO2转瓶培养7天。
7天后收取培养上清进行病毒FFU检测。
试验例1：实施例1-8的检测结果
同时设计了对照组，对照组除了不加化合物I~IV外其余操作均与实验组相同。检测结果如下：
表2：化合物I~IV或其组合物对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响
通过以上结果可以得到如下结论，化合物I~IV或其组合物均对狂犬病毒在人二倍体MRC5细胞中的复制有显著的促进作用，相比对照组病毒的FFU可以提高一个数量级，对人二倍体细胞狂犬病毒产量的提高有显著效果。
试验例2：化合物I~IV或其组合物在生物反应器中的应用
使用Cytodex1微载体培养，使用7.5L生物反应器，培养体积5L，微载体使用量：5g/L，生物反应器内微载体用PBS缓冲液洗换3遍后，生物反应器安装灭菌。
MRC5细胞与PM毒种混悬接种生物反应器内，同时加入I~IV或其组合物，终浓度如下：
组1：化合物I 1µM；
组2：化合物II 1µM；
组3：化合物III 0.5µM；
组4：化合物IV0.5µM；
组5：化合物I和化合物II联合作用各0.5µM；
组6：化合物III和化合物IV联合作用各0.25µM；
组7：化合物I和化合物IV联合作用各0.5µM；
组8：化合物III和化合物II联合作用各0.25µM；
组9：对照组（除了不加化合物I~IV外其余操作均与实验组相同）。
Cytodex1微载体接种细胞数：20细胞/球，PM株接种病毒MOI=0.05，细胞培养与病毒增殖阶段：使用10%小牛血清培养液灌流培养，每天1~2个体积，细胞培养5~6天，细胞增殖4~5倍，期间生物反应器控制参数：转速：40~60rpm，温度：37℃，pH：7.2，DO%：40~60%，流量：0.1~0.5L/min。细胞长满后生物反应器用无血清培养液进行洗换，洗换完毕后更换0.1%维持培养液灌流培养，每天1~2个体积，期间生物反应器控制参数：转速：40~60rpm，温度：34℃，pH：7.4，DO%：40~60%，流量：0.1~0.5L/min。
收获7天样品进行FFU检测。结果如表3所示。
表3：化合物I~IV或其组合物在生物反应器培养中对狂犬病毒在MRC5细胞中复制的影响
通过以上结果可以得到如下结论，利用上述化合物I~IV或其组合物培养狂犬病毒，可以有效的放大到生物反应器中，对人二倍体细胞生产狂犬病毒大规模培养有显著效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种提高狂犬病毒在人二倍体细胞中复制水平的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1）将人二倍体细胞在第一培养体系中进行培养；
步骤2）在第一培养体系中接种狂犬病毒，进行培养；
步骤3）将步骤2）所得的人二倍体细胞在第二培养体系中进行培养；
其中，所述第一培养体系或第二培养体系中含有式I~式IV所示化合物中的任意一种，所述化合物的浓度为：式I所示化合物浓度为0.5～4 µM；式II所示化合物浓度为0.5～4 µM；式III所示化合物浓度为0.25～2 µM；式IV所示化合物浓度为0.25～2 µM；
或者，所述第一培养体系或第二培养体系中含有式I~式IV所示化合物中的两种，所述化合物的浓度为：式I所示化合物和式II所示化合物联合作用浓度为各0.5～2µM；式III所示化合物和式IV所示化合物联合作用浓度为各0.25～1µM；式I所示化合物和式IV所示化合物联合作用浓度为各0.5～2µM；式III所示化合物和式II所示化合物联合作用浓度为各0.25～1µM；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）或步骤3）中所述培养为在细胞工厂、转瓶或反应器中培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述培养的条件为：37℃、5%CO2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述培养的条件为：34℃、5%CO2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述狂犬病毒的MOI值为0.05~0.6；所述培养的条件为：34℃、5%CO2。
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