CN102406927A - 一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，依次包括以下步骤：人二倍体细胞株的复苏和传代培养；人二倍体细胞株的多级生物反应器培养；接种乙型脑炎病毒毒株，进行病毒增殖培养；收获病毒培养液；病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加糖蛋白保护剂后，配制疫苗。本发明本发明采用人二倍体细胞作为细胞基质，安全且无外源因子污染；采用逐级线性放大的生物反应器培养，易于实现较低成本，较高质量安全性和稳定性的疫苗大规模化生产；每天抽样检测病毒收获液的滴度保证了所收获的病毒培养物的高表达，保证了生产质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种乙型脑炎灭活疫苗的生产方法。
背景技术
乙型脑炎主要是由三带喙库蚊叮咬传播，病毒通过蚊虫叮咬进入人体内首先在局部组织和淋巴结复制，扩散至其他部位进一步复制后产生病毒血症，在机体免疫力低下或某些脑组织损伤的情况下病毒通过血-脑脊液屏障，侵犯中枢神经系统而发生脑炎。一旦发病，该病的病死率和愈后后遗症的比例较高。目前，预防性接种疫苗是防治该病的有效手段。
目前，市场上广泛应用的主要有鼠脑纯化灭活疫苗，地鼠肾细胞灭活疫苗，乙型脑炎减毒活疫苗及Vero细胞灭活疫苗四种疫苗。鼠脑纯化灭活疫苗是将病毒接种感染小鼠后取其脑组织经过匀浆、澄清、去除杂蛋白、浓缩及灭活制备而成，疗效较为确切，但是由于脑组织残留和纯化问题，其大规模生产不易且成本过高。地鼠肾细胞灭活和减毒活疫苗疫苗制备过程中亦存在鼠源的性蛋白及生产中易出现污染等原因。而Vero细胞乙脑灭活疫苗虽说较易实现大规模的生产但存在DNA的残留问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供了一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法。
为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：
一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：人二倍体细胞株的复苏和传代培养：人二倍体细胞株经复苏、转瓶传代培养2～3代后，消化细胞并制备细胞悬液；
步骤二：人二倍体细胞株的多级生物反应器培养；将经复苏、传代培养和消化后制成的人二倍体细胞悬液进行二级以上的生物反应器线性放大技术培养；
步骤三：接种乙型脑炎病毒毒株，进行病毒增殖培养：生物反应器线性放大技术培养的最终生物反应器内的细胞密度达到106个/ml以上后，将细胞生长液更换为病毒维持液，并将乙型脑炎病毒毒株接种至其中，进行病毒增殖培养；
步骤四：收获病毒培养液：更换病毒维持液24小时后，收获病毒培养液，同时每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获15～25天；
步骤五：收获的病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加保护剂后，配制疫苗。
进一步的技术方案是，所述的人二倍体细胞株为WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一种，所述的乙型脑炎病毒毒株为P3株或SA14-14-2株。
进一步的技术方案是，所述的生物反应器为搅拌式生物反应器或摇摆式气液交替培养生物反应器。
进一步的技术方案是，所述病毒维持液为BME病毒维持液，所述保护剂为糖蛋白保护剂。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到106个/ml以上的细胞密度后，消化，洗脱，离心沉淀，收集及重悬细胞，并按照放大比例通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器培养。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级生物反应器中加入供细胞贴附的微载体和细胞悬液，所述一级生物反应器中加入的细胞悬液浓度为106个/ml以上，所述一级生物反应器培养的工作体积约10L，所述的放大比例为前一级生物反应器工作体积的10～20倍。
进一步的技术方案是，所述的每一级生物反应器中加入的微载体为颗粒状实心微球载体、多孔性微球载体、网状纤维结构载体和片状纤维结构载体中的任一种。
进一步的技术方案是，所述步骤四收获病毒培养液的方式为间隔式收获培养液或连续灌注式收获培养液。
进一步的技术方案是，所述的间隔式收获培养液具体为：间隔24～48小时收获培养体积80％～90％的病毒培养液后，继续补加BME维持液至原培养体积。
进一步的技术方案是，所述的连续灌注式收获培养液具体为：每天连续流出病毒培养液，并每天收获工作体积80％～90％的病毒培养液，同时连续等量补加BME维持液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用人二倍体细胞作为细胞基质，安全且无外源因子污染。
(2)本发明采用逐级线性放大的生物反应器培养，易于实现较低成本，较高质量安全性和稳定性的疫苗大规模化生产。
(3)本发明每天抽样检测病毒收获液的滴度保证了所收获的病毒培养物的高表达，保证了生产质量。
具体实施方式
实施例1
一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：人二倍体细胞株WI-38的复苏和传代培养：人二倍体细胞株WI-38经复苏、转瓶传代培养2代后，消化细胞并制备细胞悬液；
步骤二：人二倍体细胞株WI-38的多级生物反应器培养；将经复苏、传代培养和消化后制成的人二倍体细胞WI-38悬液进行二级的生物反应器线性放大技术培养；
步骤三：接种乙型脑炎病毒毒株P3，进行病毒增殖培养：生物反应器线性放大技术培养的最终生物反应器内的细胞密度达到106个/ml后，将人二倍体细胞WI-38生长液更换为BME病毒维持液，并将乙型脑炎病毒毒株P3接种至其中，进行病毒增殖培养；
步骤四：收获病毒培养液：更换BME病毒维持液24小时后，收获病毒培养液，同时每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获15天；
步骤五：收获的病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加糖蛋白保护剂后，配制疫苗。
进一步的技术方案是，所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株WI-38达到106个/ml的细胞密度后，消化，洗脱，离心沉淀，收集及重悬细胞，并按照放大比例通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器培养。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级生物反应器中加入供细胞贴附的颗粒状实心微球载体和人二倍体细胞WI-38悬液，所述一级生物反应器中加入的人二倍体细胞WI-38悬液浓度为106个/ml，所述一级生物反应器培养的工作体积约10L，所述的放大比例为前一级生物反应器工作体积的10倍。
进一步的技术方案是，所述步骤四收获病毒培养液的方式为间隔式收获培养液，具体为：间隔24小时收获培养体积80％的病毒培养液后，继续补加BME维持液至原培养体积。
实施例2
一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：人二倍体细胞株MRC-5的复苏和传代培养：人二倍体细胞株MRC-5经复苏、转瓶传代培养3代后，消化细胞并制备细胞悬液；
步骤二：人二倍体细胞株MRC-5的多级生物反应器培养；将经复苏、传代培养和消化后制成的人二倍体细胞MRC-5悬液进行三级的生物反应器线性放大技术培养；
步骤三：接种乙型脑炎病毒毒株P3，进行病毒增殖培养：生物反应器线性放大技术培养的最终生物反应器内的人二倍体细胞MRC-5密度达到107个/ml后，将人二倍体细胞MRC-5生长液更换为BME病毒维持液，并将乙型脑炎病毒毒株P3接种至其中，进行病毒增殖培养；
步骤四：收获病毒培养液：更换BME病毒维持液24小时后，收获病毒培养液，同时每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获25天；
步骤五：收获的病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加糖蛋白保护剂后，配制疫苗。
进一步的技术方案是，所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株MRC-5达到107个/ml的细胞密度后，消化，洗脱，离心沉淀，收集及重悬细胞，并按照放大比例通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器培养。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级生物反应器中加入供细胞贴附的多孔性微球载体和人二倍体细胞MRC-5悬液，所述一级生物反应器中加入的人二倍体细胞MRC-5悬液浓度为106个/ml，所述一级生物反应器培养的工作体积约10L，所述的放大比例为前一级生物反应器工作体积的20倍。
进一步的技术方案是，所述步骤四收获病毒培养液的方式为间隔式收获培养液，具体为：间隔48小时收获培养体积90％的病毒培养液后，继续补加BME维持液至原培养体积。
实施例3
一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：人二倍体细胞株2BS的复苏和传代培养：人二倍体细胞株2BS经复苏、转瓶传代培养2代后，消化细胞并制备细胞悬液；
步骤二：人二倍体细胞株2BS的多级生物反应器培养；将经复苏、传代培养和消化后制成的人二倍体细胞2BS悬液进行二级的生物反应器线性放大技术培养；
步骤三：接种乙型脑炎病毒毒株SA14-14-2，进行病毒增殖培养：生物反应器线性放大技术培养的最终生物反应器内的人二倍体细胞2BS密度达到106个/ml后，将人二倍体细胞2BS生长液更换为BME病毒维持液，并将乙型脑炎病毒毒株SA14-14-2接种至其中，进行病毒增殖培养；
步骤四：收获病毒培养液：更换BME病毒维持液24小时后，收获病毒培养液，同时每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获15天；
步骤五：收获的病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加糖蛋白保护剂后，配制疫苗。
进一步的技术方案是，所述的生物反应器为摇摆式气液交替培养生物反应器。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株2BS达到106个/ml的细胞密度后，消化，洗脱，离心沉淀，收集及重悬细胞，并按照放大比例通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器培养。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级生物反应器中加入供细胞贴附的片状纤维结构载体和人二倍体细胞2BS悬液，所述一级生物反应器中加入的人二倍体细胞2BS悬液浓度为106个/ml，所述一级生物反应器培养的工作体积约10L，所述的放大比例为前一级生物反应器工作体积的10倍。
进一步的技术方案是，所述步骤四收获病毒培养液的方式为连续灌注式收获培养液，具体为：每天连续流出病毒培养液，并每天收获工作体积80％的病毒培养液，同时连续等量补加BME维持液。
实施例4
一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：人二倍体细胞株KMB17的复苏和传代培养：人二倍体细胞株KMB17经复苏、转瓶传代培养3代后，消化细胞并制备细胞悬液；
步骤二：人二倍体细胞株KMB17的多级生物反应器培养；将经复苏、传代培养和消化后制成的人二倍体细胞KMB17悬液进行三级的生物反应器线性放大技术培养；
步骤三：接种乙型脑炎病毒毒株SA14-14-2，进行病毒增殖培养：生物反应器线性放大技术培养的最终生物反应器内的人二倍体细胞KMB17密度达到108个/ml后，将人二倍体细胞KMB17生长液更换为BME病毒维持液，并将乙型脑炎病毒毒株SA14-14-2接种至其中，进行病毒增殖培养；
步骤四：收获病毒培养液：更换BME病毒维持液24小时后，收获病毒培养液，同时每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获25天；
步骤五：收获的病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加糖蛋白保护剂后，配制疫苗。
进一步的技术方案是，所述的生物反应器为摇摆式气液交替培养生物反应器。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株KMB17达到108个/ml的细胞密度后，消化，洗脱，离心沉淀，收集及重悬细胞，并按照放大比例通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器培养。
进一步的技术方案是，所述步骤二的每一级生物反应器中加入供细胞贴附的网状纤维结构载体和人二倍体细胞KMB17悬液，所述一级生物反应器中加入的人二倍体细胞KMB17悬液浓度为108个/ml，所述一级生物反应器培养的工作体积约10L，所述的放大比例为前一级生物反应器工作体积的20倍。
进一步的技术方案是，所述步骤四收获病毒培养液的方式为连续灌注式收获培养液，具体为：每天连续流出病毒培养液，并每天收获工作体积90％的病毒培养液，同时连续等量补加BME维持液。
Claims (10)
1.一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：依次包括以下步骤：
步骤一：人二倍体细胞株的复苏和传代培养：人二倍体细胞株经复苏、转瓶传代培养2～3代后，消化细胞并制备细胞悬液；
步骤二：人二倍体细胞株的多级生物反应器培养；将经复苏、传代培养和消化后制成的人二倍体细胞悬液进行二级以上的生物反应器线性放大技术培养；
步骤三：接种乙型脑炎病毒毒株，进行病毒增殖培养：生物反应器线性放大技术培养的最终生物反应器内的细胞密度达到106个/ml以上后，将细胞生长液更换为病毒维持液，并将乙型脑炎病毒毒株接种至其中，进行病毒增殖培养；
步骤四：收获病毒培养液：更换病毒维持液24小时后，收获病毒培养液，同时每天抽样检测病毒培养液的滴度，每批次的培养液收获15～25天；
步骤五：收获的病毒培养液经灭活、超滤、纯化和添加保护剂后，配制疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的人二倍体细胞株为WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一种，所述的乙型脑炎病毒毒株为P3株或SA14-14-2株。
3.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的生物反应器为搅拌式生物反应器或摇摆式气液交替培养生物反应器。
4.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述病毒维持液为BME病毒维持液，所述保护剂为糖蛋白保护剂。
5.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述步骤二的每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到106个/ml以上的细胞密度后，消化，洗脱，离心沉淀，收集及重悬细胞，并按照放大比例通过密闭的管路系统接种至下一级生物反应器培养。
6.根据权利要求5所述的一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述步骤二的每一级生物反应器中加入供细胞贴附的微载体和细胞悬液，所述一级生物反应器中加入的细胞悬液浓度为106个/ml以上，所述一级生物反应器培养的工作体积约10L，所述的放大比例为前一级生物反应器工作体积的10～20倍。
7.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的每一级生物反应器中加入的微载体为颗粒状实心微球载体、多孔性微球载体、网状纤维结构载体和片状纤维结构载体中的任一种。
8.根据权利要求1所述的一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述步骤四收获病毒培养液的方式为间隔式收获培养液或连续灌注式收获培养液。
9.根据权利要求4或8所述的一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的间隔式收获培养液具体为：间隔24～48小时收获培养体积80％～90％的病毒培养液后，继续补加BME维持液至原培养体积。
10.根据权利要求4或8所述的一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法，其特征在于：所述的连续灌注式收获培养液具体为：每天连续流出病毒培养液，并每天收获工作体积80％～90％的病毒培养液，同时连续等量补加BME维持液。
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