CN112876545A - 一种抗冻蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗冻蛋白及其制备方法和应用，属于微生物抗冻蛋白技术领域。本发明通过对从北极海冰中分离获得的细菌BSI20414基因组序列分析发现一个巨型粘附蛋白，从该蛋白序列中预测出一个抗冻结构域，利用基因工程手段对该结构域序列进行克隆表达，获得可溶性重组蛋白，经活性研究发现，该重组蛋白具有较高抗冻活性，具有抑制冰晶生长与重结晶功能，在结构保护和细胞保护等方面具有应用潜力，为低温保护剂开发提供候选。

Description

一种抗冻蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物抗冻蛋白技术领域，具体涉及一种北极海冰细菌来源的抗冻蛋白及其在低温保护方面的应用。

背景技术

冰冻圈约占地球总表面积的13%，主要分布在南北两极及高山冰川等区域，绝大部分时间均处于零度以下低温。此外，地球上其他地区也会季节性经历低温冰冻，而冰冻会导致冰晶的形成，影响细胞渗透压并对细胞产生物理损伤，给生命带来致命损害。极地海冰是一类极端的海洋生境，其温度、盐度和营养物质梯度变化显著，且由于冰晶的存在，对生存其中的生命而言极具挑战。由于特殊适应机制，海冰微生物得到科研和工业应用领域广泛的关注(Wang, Salem et al. 2019)。其中，抗冻蛋白便是一种重要的低温生存机制，不仅具有重要的研究价值，而且在生产实践中具有广泛的应用空间。

抗冻蛋白是一类能够与冰晶吸附结合而改变冰晶生长状态、抑制重结晶的蛋白质，能非依数性降低溶液冰点，具有热滞活性、抑制冰重结晶性、修饰冰晶形态等特性（Białkowska et al., 2020）。抗冻蛋白作为新型低温保护剂，在低温生物行业、食品、农业等领域的应用潜力巨大。随着低温生物技术、转基因技术等的快速发展，亟需对稀有菌毒种资源、人类细胞、器官和组织，以及各类种质资源实现高质量保存，就需要探索安全、高效、绿色的低温保护剂方案。因此，获得廉价、功能优良、具有生产潜力的抗冻蛋白意义重大。

研究最早也最成熟的是动物来源的抗冻蛋白，例如鱼类抗冻蛋白和昆虫抗冻蛋白。抗冻蛋白最先由加拿大科学家从南极海域中一种名为Nototheneniid的鱼类血清中分离（Devries and Wohlschlag, 1969）。在植物中也发现存在抗冻蛋白，但活性不如昆虫抗冻蛋白。细菌抗冻蛋白的发现比动物抗冻蛋白晚了近30年，目前对细菌抗冻蛋白的认识还不是很清楚，但细菌抗冻蛋白的优势明显，例如具有高度多样性、来源广泛、活性较好、克服了鱼类抗冻蛋白的腥味、以及来源可持续、成本低且适合工业放大生产。因此，细菌抗冻蛋白逐渐成为抗冻蛋白的重要研究和开发应用对象。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑制冰晶形成以及重结晶活性的抗冻蛋白，将其应用于细胞的低温保护，为细胞低温保护剂开发提供候选。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明通过对从北极海冰中分离获得的细菌BSI20414基因组序列分析发现一个巨型粘附蛋白，从该蛋白序列中预测出一个结构域，跟已知的M. primoryensis的抗冻蛋白结构域氨基酸序列相似性86.5%。利用基因工程手段对该结构域序列进行克隆表达，获得可溶性重组蛋白，经活性研究发现，该重组蛋白具有较高抗冻活性，浓度为1 mg/ml时热滞活性为-0.15℃。

因此，本发明提供了一种抗冻蛋白，由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或插入一个或多个氨基酸所获得的具有同等活性的蛋白质。

具体地，可通过现有的体外表达体系对所述抗冻蛋白进行生产制备，例如大肠杆菌表达系统。

本发明提供了一种编码所述的抗冻蛋白的基因序列，所述编码基因包含核心序列，所述核心序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

具体地，将所述核心序列克隆到表达质粒中，利用表达质粒携带的起始密码子、终止密码子实现抗冻蛋白的表达。表达质粒自身携带的标签序列使得表达出的融合蛋白中携带标签，有助于重组蛋白的分离纯化。

优选的，所述抗冻蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。该序列是在SEQ IDNo.1所示氨基酸序列基础上，其N端添加了GST标签序列、6×His和S标签，其C端添加了8×His。研究表明，该重组蛋白同样具有抗冻活性。该重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQID No.4所示。

本发明还提供了一种制备所述的抗冻蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的基因片段克隆到pET42a载体中，得到重组质粒；

(2)将重组质粒转入大肠杆菌宿主中，诱导表达，分离获得所述的抗冻蛋白。

将所述基因片段克隆到pET42a载体的多克隆位点中，研究表明，pET42a载体能够实现SEQ ID No.2所示的基因片段在大肠杆菌宿主中可溶性表达。

具体的，宿主细胞为E. coli BL21、E. coli Rosetta、E. coli BL21 plysS。表达量以E. coli BL21(DE3)最佳。

优选的，诱导表达的条件为：25℃下添加1mM IPTG诱导表达12小时。

本发明提供的抗冻蛋白具有抑制冰晶生长与重结晶功能，在结构保护和细胞保护等方面具有应用潜力。因此，本发明提供了其在制备低温保护剂中的应用。具体的，所述抗冻蛋白作为细胞低温保护剂使用。所述低温是指温度范围0℃及以下低温。

本发明提供了所述的抗冻蛋白在食品低温保存中的应用。具体的，包括食品保鲜、保持食品结构与口感等食品领域。

本发明提供了所述的抗冻蛋白在生物医学样品低温保存中的应用。

本发明具备的有益效果：

本发明提供了一种新的具有较高抗冻活性的抗冻蛋白，该蛋白具有抑制冰晶生长与重结晶功能，在结构保护和细胞保护等方面具有应用潜力，为低温保护剂开发提供候选。

附图说明

图1为pET42a-R1质粒图谱。

图2为重组蛋白MaAFP的SDS-PAGE检测图，从左到右泳道依次为蛋白marker、阴性对照全细胞裂解液、阴性对照上清、全细胞裂解液、全细胞裂解液上清、纯化洗脱液、50 mM咪唑洗脱液、100 mM咪唑洗脱前部分收集液、100 mM咪唑洗脱后部分收集液。

图3为不同保留温度下MaAFP热滞活性。

图4为不同浓度下MaAFP抑制重结晶的效果。

图5为MaAFP对琼脂糖结构的保护作用，融化前（A）与融化后（B）的对照。

图6为MaAFP对人肺癌细胞低温冻存的保护作用，其中(A)为荧光显微镜下细胞图，(B)为细胞存活率。

图7为MaAFP对人肺癌细胞冻融后活性的保护效果，其中(A)为复苏1小时后的细胞活性，(B)为复苏2小时后的细胞活性，(C)为复苏后3小时的细胞活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中的细菌BSI20414为课题组前期从北极海冰中分离获得一株耐盐、耐低温细菌，属于Marinomonas arctica，发表于文章Liao et al., 2020, Complete genomesequence of Marinomonas arctica BSI20414, a giant antifreeze protein-producing bacterium isolated from Arctic sea ice. Marine Genomics。

实施例1

1、菌株分离与基因分析

对细菌BSI20414进行基因组测序，通过序列分析发现一个巨型粘附蛋白，从该蛋白序列中预测出一个结构域，跟另一个物种M. primoryensis的抗冻蛋白结构域具有一定的序列相似性（氨基酸序列相似性86.5%）。然而，从M. ushuaiensis中发现的一个序列跟M. primoryensis的抗冻蛋白结构域同样具有相似性，但由于缺乏跟冰结合的残基，因而不具有抗冻蛋白活性。这意味着仅仅基于序列并不能说明具有抗冻蛋白活性。同时，抗冻蛋白具有基因水平转移特性，即便是同一个物种，不同菌株之间也存在抗冻蛋白存在与否的差异，因此也不能通过种属归类推测是否具有抗冻蛋白。这也是寻找抗冻蛋白的难点之一。

2、抗冻蛋白结构域克隆与表达研究

针对疑似抗冻蛋白结构域，通过深入比较分析，寻找最有可能的3段序列作为出发点（R1，R2，R3，序列信息见序列表SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6），以pET28a、pET42a为载体构建了6个重组质粒：pET28a-R1、pET28a-R2、pET28a-R3、pET42a-R1、pET42a-R2、pET42a-R3，且测试了在3个不同表达宿主E. coli BL21(DE3)、E. coli Rosetta、E. coli BL21(DE3) plysS中的表达情况。

通过研究发现，克隆到pET28a载体上的3段序列均不能获得有效表达，而更换到pET42a载体上携带GST标签后，仅有R1片段能实现可溶性表达，R2和R3片段都显示为包涵体，为无活性非正确折叠产物。通过对表达温度、诱导剂浓度、转速、表达时间等因素进行正交实验优化后，pET42a-R1能在上述3个表达宿主中获得可溶性表达，表达量以E. coli BL21(DE3)最佳，而其余重组体系均不能通过优化实现可溶性表达。重构的pET42a-R1质粒图谱如附图1所示。

pET42a-R1表达产物命名为MaAFP，通过SDS-PAGE进行验证，并利用亲和纯化层析柱对融合表达的组氨酸标签进行特异性亲和纯化，得到电泳纯的重组抗冻蛋白，浓度为1mg/mL（附图2）。

3、抗冻蛋白活性研究

3.1 利用差示扫描量热仪（DSC）对纯化后的MaAFP抗冻蛋白开展热滞活性检测，发现浓度为1 mg/mL在保留温度－0.15℃时得到的热滞活性最大，为1.61℃（附图3）。与已知的细菌抗冻蛋白相比，按照单位活性计算MaAFP属于高活性抗冻蛋白，例如报道来自Colwellia sp. SLW05的高活性抗冻蛋白在0.14 mM浓度时热滞活性为4℃，约为3.8 g/mL对应4℃。

3.2 通过低温显微镜下检测MaAFP抗冻蛋白抑制重结晶的活性。具体做法：以100℃/min 快速降温至－50℃，等温1min使其保持稳定，后以10℃/min升温至－30℃，再以1℃/min升温至－18℃，等温30min，使冰晶慢慢长大。通过以BSA（牛血清蛋白）作为对照，观察到添加了0.7 mg/ml和1mg/ml的MaAFP明显抑制了冰晶重新分布和生长，而BSA对照出现了冰晶的重新生长（附图4）。该结果表明MaAFP具有抑制冰重结晶的功能。

4、抗冻蛋白应用研究

由于抗冻蛋白的抑制冰晶生长与重结晶功能，在结构保护和细胞保护等方面具有应用潜力，可能在包括食品保鲜、保持食品结构与口感等食品领域，以及低温医学领域等在内的诸多领域具有广泛应用价值。

（1）结构保护

以琼脂糖特殊结构为例子，展示MaAFP抗冻蛋白对其结构的保护作用。具体做法：制备1.5%的琼脂糖凝胶，在室温条件下分别加入PBS缓冲液（对照1）、添加1mg/ml BSA的PBS缓冲液（对照2）、添加1mg/ml MaAFP的PBS缓冲液（实验组），加入1滴染色液后混匀，凝固后冻存于－20℃过夜，取出放室温下融化，结果发现MaAFP抗冻蛋白能很好的保护琼脂糖凝胶网状结构，防止冰晶对网状结构的破坏，从而在化冻的过程中维持凝胶不塌陷。而两个对照组均呈现不同程度的塌陷和变形，并最终发生倒塌（附图5）。

（2）细胞保护

以人肺癌细胞A549为例，开展细胞保护实验。具体做法： A549细胞的冷冻保护在4种条件下进行：对照组1：未经冷冻的A549细胞（fresh）；对照组2：A549+5% DMSO溶液；实验组1：AFP (70ug/ml)和5% DMSO的溶液；实验组2：AFP (100ug/ml)和5% DMSO的溶液。

所有组别中A549细胞从贴壁培养物中获得（倒去培养基，用PBS冲洗两遍，再用胰蛋白酶将细胞从培养瓶壁上冲下来。离心2分钟，倒去上清），按比例加入相应的F12-K培养基、DMSO、和AFP，以获得所需的最终浓度和细胞密度，放置在没有添加培养基的低温瓶中，冷冻液终体积为1ml。将低温样品瓶放在冷冻容器中，以1度每分钟的速率慢速降温至-80，再转入液氮-196保存4小时，后水浴37度复温。将细胞稀释为合适密度，混合荧光染色剂AOPI，取100ul在计数板上进行技术。每个样品重复三次，每次取6个不同视野。同时，将细胞继续培养3小时，用CCK-8试剂盒检测冻存后细胞生长活性状态，每隔1小时检测细胞生长的OD₄₅₀值。

结果：通过染色计算细胞死活率如图6所示，红色代表死亡的细胞，绿色代表活细胞，经过上述处理后，跟对照相比，添加了AFP的处理能明显提高细胞存活率。通过细胞计数与统计，发现对照的细胞平均存活率为70.3%，添加了70 ug/ml、100 ug/ml AFP的保护剂能将细胞存活率提高到95.9%和92.2%。这两个浓度的AFP彼此差异不显著。

通过继续培养检测细胞活性与生长，得到的结果如图7所示，培养1小时后，以新鲜不经过冻融的细胞作为阳性对照（对照1），只添加5% DMSO作为保护剂的冻存处理作为阴性对照（对照2），发现阴性对照显著降低了细胞活性（体现为OD₄₅₀维持在较低水平），而添加了70 ug/ml、100 ug/ml AFP的保护组的OD₄₅₀显著高于对照2，但在培养1小时后略低于未经冻融、同样添加了AFP的组，而在培养2小时、3小时后100ug/ml AFP的保护组OD450快速增加，甚至超过了对照1和不经过冻融的100ug/ml AFP添加组。这个结果表明，添加了AFP的保护组在冻融后细胞活性在最初经历较小幅度的下降，但在后续的培养中快速恢复，且远超过不添加AFP的对照。综合上述两方面实验结果，证明AFP对细胞存活与活性均有很好的保护作用，意味着具有开发为细胞低温保护剂的潜力。

序列表

<110> 中国极地研究中心（中国极地研究所）

上海理工大学

<120> 一种抗冻蛋白及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> 海洋单胞菌(Marinomonas arctica)

<400> 1

Asp Ser Ala Thr His His Asp Tyr Asn Tyr Asp Gln Trp His Gln Phe

1 5 10 15

Gly Ser Gly Asn Asp Gln Ile Val Ile Asp Asn Asp Val Glu Lys Trp

20 25 30

Leu Asp Ala Gly Asp Gly Asp Asn Ser Ile Tyr Val Gly Asp Asp Val

35 40 45

Asn Arg Asn Asn Ser Ala Gly Ile Lys Thr Gly Ser Gly Asp Asp Asp

50 55 60

Ile Phe Val Lys Asp Asn Val Asp Ser Thr Ile Gln Thr Gly Gly Gly

65 70 75 80

Asn Asp Arg Val Gln Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Asn Gly Tyr His Ser

85 90 95

Ala His Ile Asn Leu Gly Asp Gly Asp Asn Asn Leu Ile Ile Lys Asn

100 105 110

Asp Val Asn Asn Tyr Ser Thr Val His Ser Gly Ser Gly Asp Asp Val

115 120 125

Val Ser Ile Gly Asp Asp Val Arg Tyr Asp Ala Asp Ile Gln Leu Gly

130 135 140

Asp Gly Asn Asp Arg Leu Thr Ile Gly Asp Lys Ile Glu Lys Glu Val

145 150 155 160

Ser Ile Asn Leu Gly Ser Gly Asn Asp Val Leu Val Val Gly Gly Lys

165 170 175

Val Ser Asp Glu Ala Trp Val Asp Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ser Val

180 185 190

Trp Phe Glu Ser Tyr Ser Arg Ser Asp Tyr Asn Ser Asp Lys Asp Gly

195 200 205

Ile Lys Ser Arg Phe Ala Asn Phe Glu Asn Phe Lys Phe Ser Asp Gly

210 215 220

Thr Val Ile Gly Asn Ala Ser Ala Phe Asp Gly Ser Ser Val Ser Gly

225 230 235 240

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> 海洋单胞菌(Marinomonas arctica)

<400> 2

gattctgcaa ctcaccacga ttataattat gatcaatggc atcagtttgg ttcaggtaat 60

gatcaaattg ttatcgataa tgacgttgaa aagtggcttg atgcaggaga tggagataac 120

tcaatttatg ttggagacga tgtaaataga aataattcag caggtatcaa aacaggtagt 180

ggtgatgatg atatctttgt taaagataat gttgatagca ctatacaaac tggtggcggt 240

aacgatcgtg tccagatagg ttatgacttg ggtaatggtt atcatagtgc acatatcaac 300

ttaggtgatg gtgataataa tttgatcatc aaaaatgatg tcaacaatta ttcaacagtc 360

cattcaggct ctggtgatga tgttgtctcg attggtgatg atgttagata tgacgccgac 420

atacagttgg gtgatggtaa tgatcgacta actatcggcg ataaaattga gaaagaggtt 480

tcgatcaacc ttggttcagg taatgatgtt ctggtagtcg gtgggaaggt atcagatgaa 540

gcatgggtcg atggtggatc gggttctgat tctgtatggt ttgaatccta ctcgcggtct 600

gactacaact cagataaaga tggaattaaa tcgcgttttg ctaacttcga aaactttaag 660

ttctcggatg gcaccgtgat tgggaatgct tcagcattcg atggaagtag tgtttctggc 720

<210> 3

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu

245 250 255

Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Asp Ser Ala Thr His His Asp Tyr Asn

275 280 285

Tyr Asp Gln Trp His Gln Phe Gly Ser Gly Asn Asp Gln Ile Val Ile

290 295 300

Asp Asn Asp Val Glu Lys Trp Leu Asp Ala Gly Asp Gly Asp Asn Ser

305 310 315 320

Ile Tyr Val Gly Asp Asp Val Asn Arg Asn Asn Ser Ala Gly Ile Lys

325 330 335

Thr Gly Ser Gly Asp Asp Asp Ile Phe Val Lys Asp Asn Val Asp Ser

340 345 350

Thr Ile Gln Thr Gly Gly Gly Asn Asp Arg Val Gln Ile Gly Tyr Asp

355 360 365

Leu Gly Asn Gly Tyr His Ser Ala His Ile Asn Leu Gly Asp Gly Asp

370 375 380

Asn Asn Leu Ile Ile Lys Asn Asp Val Asn Asn Tyr Ser Thr Val His

385 390 395 400

Ser Gly Ser Gly Asp Asp Val Val Ser Ile Gly Asp Asp Val Arg Tyr

405 410 415

Asp Ala Asp Ile Gln Leu Gly Asp Gly Asn Asp Arg Leu Thr Ile Gly

420 425 430

Asp Lys Ile Glu Lys Glu Val Ser Ile Asn Leu Gly Ser Gly Asn Asp

435 440 445

Val Leu Val Val Gly Gly Lys Val Ser Asp Glu Ala Trp Val Asp Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Asp Ser Val Trp Phe Glu Ser Tyr Ser Arg Ser Asp

465 470 475 480

Tyr Asn Ser Asp Lys Asp Gly Ile Lys Ser Arg Phe Ala Asn Phe Glu

485 490 495

Asn Phe Lys Phe Ser Asp Gly Thr Val Ile Gly Asn Ala Ser Ala Phe

500 505 510

Asp Gly Ser Ser Val Ser Gly Leu Glu His His His His His His His

515 520 525

His

<210> 4

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ggttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720

ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780

gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtattg agggacgcgg gtccatggat 840

tctgcaactc accacgatta taattatgat caatggcatc agtttggttc aggtaatgat 900

caaattgtta tcgataatga cgttgaaaag tggcttgatg caggagatgg agataactca 960

atttatgttg gagacgatgt aaatagaaat aattcagcag gtatcaaaac aggtagtggt 1020

gatgatgata tctttgttaa agataatgtt gatagcacta tacaaactgg tggcggtaac 1080

gatcgtgtcc agataggtta tgacttgggt aatggttatc atagtgcaca tatcaactta 1140

ggtgatggtg ataataattt gatcatcaaa aatgatgtca acaattattc aacagtccat 1200

tcaggctctg gtgatgatgt tgtctcgatt ggtgatgatg ttagatatga cgccgacata 1260

cagttgggtg atggtaatga tcgactaact atcggcgata aaattgagaa agaggtttcg 1320

atcaaccttg gttcaggtaa tgatgttctg gtagtcggtg ggaaggtatc agatgaagca 1380

tgggtcgatg gtggatcggg ttctgattct gtatggtttg aatcctactc gcggtctgac 1440

tacaactcag ataaagatgg aattaaatcg cgttttgcta acttcgaaaa ctttaagttc 1500

tcggatggca ccgtgattgg gaatgcttca gcattcgatg gaagtagtgt ttctggcctc 1560

gagcaccacc accaccacca ccaccactaa 1590

<210> 5

<211> 552

<212> DNA

<213> 海洋单胞菌(Marinomonas arctica)

<400> 5

gttagtagct ctaattctca gcttgatgat tttgaactga cggcatctat taatactaat 60

ggtgtaaatg atgatttgat tggtaccaca gatgaatctg ttattgttgg aggttccggt 120

gacgatttct tgtctggtac tactggggaa gattcgttat tgggtaactc tggcgatgat 180

gtgttgtttg gtggtaatga tcaagtttca gataccctga cgggaggcgc tggtaacgat 240

atctttatat tgaatgacac agcagatgtg tcaaatatcg atattattac cgattttaac 300

gcggctgagg acgcattaga tttaactgat ctgttaacag gaatagaagg agaccctggt 360

aaagatgccg atgttgatgc gattaccaaa ttcttaacag agaacgttaa ggtaacagat 420

ggacatgtta aagttggggg cgaggatgtg gctgaatttg gttctgcttc tagtttcgat 480

tctaacttgg atggttcagt gtcatcgact gactcgatca aagttatcta caatgaccaa 540

gagtacaaca tc 552

<210> 6

<211> 1455

<212> DNA

<213> 海洋单胞菌(Marinomonas arctica)

<400> 6

gattctgcaa ctcaccacga ttataattat gatcaatggc atcagtttgg ttcaggtaat 60

gatcaaattg ttatcgataa tgacgttgaa aagtggcttg atgcaggaga tggagataac 120

tcaatttatg ttggagacga tgtaaataga aataattcag caggtatcaa aacaggtagt 180

ggtgatgatg atatctttgt taaagataat gttgatagca ctatacaaac tggtggcggt 240

aacgatcgtg tccagatagg ttatgacttg ggtaatggtt atcatagtgc acatatcaac 300

ttaggtgatg gtgataataa tttgatcatc aaaaatgatg tcaacaatta ttcaacagtc 360

cattcaggct ctggtgatga tgttgtctcg attggtgatg atgttagata tgacgccgac 420

atacagttgg gtgatggtaa tgatcgacta actatcggcg ataaaattga gaaagaggtt 480

tcgatcaacc ttggttcagg taatgatgtt ctggtagtcg gtgggaaggt atcagatgaa 540

gcatgggtcg atggtggatc gggttctgat tctgtatggt ttgaatccta ctcgcggtct 600

gactacaact cagataaaga tggaattaaa tcgcgttttg ctaacttcga aaactttaag 660

ttctcggatg gcaccgtgat tgggaatgct tcagcattcg atggaagtag tgtttctggc 720

tattcggtaa ccgttaatat ttcagattta gcatcagatg aaacgctatc aagcgttgtt 780

attaatggcg tccctgaggg cgctaaattg caacaaaatg gtattgatct cgctgtaaat 840

gatgatggaa cctataccgt ttctgttgat agtggtgtta cttcaataga caacctaatg 900

gtcgttagta gctctaattc tcagcttgat gattttgaac tgacggcatc tattaatact 960

aatggtgtaa atgatgattt gattggtacc acagatgaat ctgttattgt tggaggttcc 1020

ggtgacgatt tcttgtctgg tactactggg gaagattcgt tattgggtaa ctctggcgat 1080

gatgtgttgt ttggtggtaa tgatcaagtt tcagataccc tgacgggagg cgctggtaac 1140

gatatcttta tattgaatga cacagcagat gtgtcaaata tcgatattat taccgatttt 1200

aacgcggctg aggacgcatt agatttaact gatctgttaa caggaataga aggagaccct 1260

ggtaaagatg ccgatgttga tgcgattacc aaattcttaa cagagaacgt taaggtaaca 1320

gatggacatg ttaaagttgg gggcgaggat gtggctgaat ttggttctgc ttctagtttc 1380

gattctaact tggatggttc agtgtcatcg actgactcga tcaaagttat ctacaatgac 1440

caagagtaca acatc 1455

Claims (10)

1.一种抗冻蛋白，其特征在于，所述抗冻蛋白为由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或插入一个或多个氨基酸所获得的具有同等活性的蛋白质。

2.如权利要求1所述的抗冻蛋白，其特征在于，所述抗冻蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

3.一种如权利要求1所述的抗冻蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因包含核心序列，所述核心序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求3所述的抗冻蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

5.如权利要求1或2所述的抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的基因片段克隆到pET42a载体中，得到重组质粒；

(2)将重组质粒转入大肠杆菌宿主中，诱导表达，分离获得所述的抗冻蛋白。

6.如权利要求5所述的抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，宿主细胞为E. coli BL21、E. coli Rosetta、E. coli BL21 plysS。

7.如权利要求5所述的抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，诱导表达的条件为：25℃下添加1mM IPTG诱导表达12小时。

8.如权利要求1或2所述的抗冻蛋白在制备低温保护剂中的应用。

9.如权利要求1或2所述的抗冻蛋白在食品低温保存中的应用。

10.如权利要求1或2所述的抗冻蛋白在生物医学样品低温保存中的应用。

Images