CN112662680B - 番茄黄化转绿基因SlRHBDD2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄黄化转绿基因SlRHBDD2编码区的cDNA序列，SEQ ID No.1及其编码蛋白氨基酸序列SEQ ID No.2。本发明通过图位克隆技术从番茄早期叶色黄化突变体“cely403”中克隆控制番茄叶色的基因SlRHBDD2,功能互补试验证明SlRHBDD2是控制番茄叶色黄化转绿的基因。该基因控制的叶色黄化转绿性状，早期子叶与心叶呈黄绿色，叶绿素含量降低，净光合速率下降；后期叶片转为绿色，叶绿素含量、净光合速率恢复，因而可作为苗期标记用于番茄新品种选育过程子代的早期选择，如核雄性不育系的苗期鉴定，也可在种子生产和纯度鉴定等方面应用，具有良好的应用前景。

Description

番茄黄化转绿基因SlRHBDD2及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种番茄黄化转绿基因SlRHBDD2及其应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum L.)属于茄科番茄属，是全世界栽培最为普遍的蔬菜之一，在我国蔬菜生产与消费中也占有重要地位。叶片光合作用效率是决定番茄产量和品质的关键因素。而光合作用的高效依赖于叶绿素的合成和叶绿体的正常发育，因此研究叶绿素代谢和叶绿体发育过程具有深刻的意义。

叶色是一种重要的农艺性状，正常情况下，植物叶片呈绿色。当植物受外界环境或自身遗传等影响导致叶绿体发育缺陷、叶绿素合成受阻，便会产生叶色突变，如白化、黄化、浅绿、条纹等表型。叶色突变体是研究叶绿体结构与发育、叶绿素的合成与降解、光形态建成、光合作用机理、基因表达调控等方面的理想材料，同时，一些叶色突变体具有光合“午休”减弱，光合效能提高等优良性状，可用于遗传育种。此外，叶色的变异具有易于肉眼鉴别、不受环境影响等特点，叶色突变体可作为苗期标记性状用于品种纯度快速鉴定，简化良种繁育步骤，在番茄品种选育中有良好的应用前景，例如番茄雄性不育植株的鉴定。番茄具有明显的杂种优势，雄性不育系是利用杂种优势的重要途径，但目前报道的番茄细胞质雄性不育系大多找不到保持系，而配制核雄性不育的两用系需要去除约50％的可育株，费时费力。快速有效鉴别不育株是提高生产力的关键，利用苗期叶色突变作为基因标记是一个很有效的方法。但目前克隆的叶色突变体控制基因大多局限在拟南芥或水稻等模式植物上，例如从缺失色素叶色突变体中分离鉴定出多个控制叶绿素合成和叶绿体发育的基因。如拟南芥的叶绿素酸酯a氧化酶基因(Oster等2000)、叶绿体核糖体小亚基17基因(Schultes等2000)以及水稻的镁-螯合酶H亚基基因，RSA基因等(Jung等2003；Su等2012)等。

目前，只有少数的番茄控制叶色突变体的基因被报道，尤其是叶色逐渐转绿突变体。叶色逐渐转绿突变体是指叶片发育早期叶绿素含量降低，到成熟期叶绿素含量基本恢复正常的一类突变体(Archer and Bonnett,1987)。不同于叶片白化、黄化突变体，这类突变是非致死的，且不影响植株开花结果与最终产量，是实际育种中作为形态学标记性状的理想材料，在杂交育种、新品种繁育、种子纯度鉴定等各方面均有良好的而应用前景。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种新的番茄黄化转绿基因SlRHBDD2，该基因具有番茄叶色控制功能，可利用该基因创建具有黄化转绿标记的突变体植株，用于苗期鉴定雄性不育株系或转育优异性状的株系。

本发明首先提供一种分离的番茄黄化转绿基因SlRHBDD2的cDNA编码序列。一种番茄叶色控制基因SlRHBDD2,所述CDS区域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述基因核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中添加、替换或缺失一个或多个核苷酸而生产的突变体或等位基因核苷酸序列。

本发明还提供所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示.

进一步地，所述的番茄黄化转绿叶基因RHBDD2编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列中添加、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。

本发明还提供了利用番茄黄化转绿叶基因RHBDD2创建黄化转绿叶种质中的应用，具体为：利用RNAi、Crispr/Cas9基因敲除或沉默等方法降低番茄种质中SlRHBDD2基因表达水平创建获得黄化转绿叶种质。

进一步地，本发明提供上述DNA分子即突变基因在苗期鉴定待测植株是否为黄化转绿植株中的应用。

本发明通过图位克隆技术从番茄早期叶色黄化突变体“cely403”中克隆控制番茄叶色的基因SlRHBDD2,功能互补试验证明SlRHBDD2是控制番茄叶色黄化转绿的基因。形态与细胞学观察发现，本发明克隆的基因具有调控叶绿体发育，影响叶绿体数目，进而控制叶色的功能。利用该基因编码蛋白质氨基酸突变获得的黄化转绿叶色突变体，具有子叶黄化，心叶黄绿色，成熟叶片逐渐转绿，生长中后期叶色恢复正常，所以可以作为苗期选择标记应用于子代筛选、杂种纯度鉴定等。

本发明的优点在于：利用该基因可用于研究调控叶绿素代谢或叶绿体发育的相关基因功能。利用该基因创建的子叶黄化转绿特征可作为苗期标记用于番茄品种选育，特别是雄性不育系的选育，简化目标单株鉴定筛选步骤。尤其是后期叶片转绿的特点，不影响番茄正常结果收种，是番茄育种优良的材料。

附图说明

图1为番茄黄化转绿叶色突变体cely403叶色表型，其中，403是突变体，404是野生型。

图2为番茄突变体cely403与野生型不同生长时期株高(A)、叶长(B)、叶宽(C)等生长性状比较。

图3为番茄突变体cely403与野生型不同生长时期光合色素含量分析，其中A为叶绿素a，B为叶绿素b，C为类胡萝卜素含量，D为总叶绿素含量。

图4为番茄突变体cely403与野生型光合特性的比较，其中：A为净光合速率(P_n)、B为气孔导度(G₂)、C为胞间CO₂浓度(C_i)、D为蒸腾速率(T_r)。

图5为番茄野生型(A)，突变体cely403(B)以及SlRhbdd2转基因阳性(C)植株苗期形态比较。

图6为番茄SlRhbdd2基因在不同组织和器官的表达特性。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、番茄黄化转绿叶色突变体“cely403”的获得及性状鉴定

1.番茄黄化转绿叶色突变体“cely403”的获得

番茄黄化转绿叶色突变体来源于美国番茄种质资源库(TGRC)的品种“LA3320”高代自交系“T12404”，在田间种植过程中发现一株天然叶色突变植株，该突变体子叶黄化，苗期心叶呈黄绿色，后期叶片逐渐转绿，恢复正常。突变植株自交留种得到突变株系，经多代自交繁殖及选择，突变性状已稳定，将该突变体命名为“cely403”(Cotyledon and EarlyLeaf Yellowing)，该突变体由浙江大学农业与生物技术学院番茄研究组保存并对外提供。

2.番茄黄化转绿叶色突变体cely403的性状鉴定

播种突变体cely403和野生型404种子后，置于温周期25℃/20℃，光周期16h/8h的环境下培养，发芽后可见突变体子叶黄化，真叶呈黄绿色，野生型子叶与真叶均为正常的绿色(图1)。随着植株的生长，突变体成熟叶片逐渐转绿，仅心叶保持黄绿色。直到生长约50天，突变体逐渐恢复正常，心叶转绿，此后突变体长出的心叶都呈绿色，突变体正常开花结果。在不同时期观测突变体与野生型早期生长动态，发现突变体的长势偏弱，株高降低(图2A)；同时，突变体叶片的叶长、叶宽均比野生型小(图2B、2C)。

实施例2、番茄黄化转绿叶色突变体叶绿素含量与光合特性比较

播种后不同时期，分别从突变体和野生型中随机选取长势一致的单株各12株，挑选生长点下充分展开的第二片真叶，剪成2～3cm，称取0.2g浸泡于25mL丙酮和乙醇的混合液(体积比95％丙酮∶无水乙醇＝2：1)，密封避光，置26℃下暗培养24h。用紫外分光光度计测定提取液在470nm、645nm和663nm 3个波长下的OD值，重复3次。根据Livchtenthaler改进的Arnon计算方法，分别算出叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量，总叶绿素含量为叶绿素a和叶绿素b之和。结果显示，与野生型相比，在生长前期，突变体叶片叶绿素a和叶绿素b含量均显著降低，而类胡萝卜素含量没有明显差异(图3)。播后15d时，野生型叶片的叶绿素a含量为1.13mg/g，突变体仅有0.94mg/g；野生型的叶绿素b含量为0.53mg/g，突变体则低至0.39mg/g。生长35d突变体和野生型叶绿素含量的差异与15d相似，且叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量突变体中显著低于野生型的。而到生长后期55d时，突变体和野生型的叶绿素a含量分别为1.54mg/gFW和1.57mg/gFW、叶绿素b含量分别为1.36mg/gFW和1.37mg/gFW、类胡萝卜素含量两者均为0.17mg/gFW，两者间没有明显差异，突变体基本恢复正常(图3)。叶绿素含量测定结果与叶色表型一致。

播种后不同时期，挑选突变体和野生型生长点下第二片完全展开的真叶，使用LI-6400便携式光合仪，测量其净光合速率，进行统计分析。使用LI-6400便携式光合仪，测量其净光合速率(P_n)、气孔导度(G₂)、胞间CO₂浓度(C_i)、蒸腾速率(T_r)等指标。结果表明，生长30d时，突变体的净光合速率与野生型相比显著降低，野生型的净光合速率有14.28μmol CO₂ m^-2s^-1，突变体仅有9.45μmol CO₂ m^-2s^-1。但生长至50d时，突变体已经恢复正常，净光合速率与野生型没有差异(图4)。净光合速率的变化与叶绿素含量的差异变化一致。此外，突变体的胞间CO₂浓度显著高于野生型，但气孔导度、蒸腾速率与野生型相比没有明显差异(图4)。

实施例3、番茄黄化转绿叶色突变性状的遗传分析及基因定位

1、番茄黄化转绿叶色突变性状的遗传分析

将突变体cely403与野生型404杂交获得F₁代，自交获得F₂代，利用F₂代分离群体进行遗传分析。结果表明，F₁代植株叶色为绿色，为野生型表型；播种F₂代，共统计483棵植株叶色，其中叶色正常与叶色黄化的植株数量为378和105，卡方检验结果(X²＝2.57<X² _0.05,1＝3.84)符合3:1的分离比，以上结果重复三次，实验结果均表明该突变性状受隐性单基因控制。

2、番茄黄化转绿叶色突变性状的基因定位

利用F₂代分离的叶色正常与叶色黄化群体，从中随机挑选20个叶色正常植株和20个叶色黄化植株，提取基因组DNA分别构建DNA混池，以403、404为亲本，F₂代叶色黄化池(405-Y)、叶色正常池(405-G)进行BSA测序。测序比对并利用ANNOVAR进行注释，检测两个亲本间纯合差异的标记，共筛选出20961个SNP位点和3576个InDel位点。再以亲本404作为参考亲本，分别计算两个子代池在纯合差异位点的All-index(SNP-index和InDel-index)。为了直观体现两个子代池间差异的区域，计算两个子代All-index的差值：△(All-index)＝Allindex(S2)-Allindex(S1)。选择1Mb为窗口，1kb为步长，计算每个窗口中△(All-index)的平均值来反应△(All-index)分布。根据计算的All-index和△(All-index)，在全基因组范围内挑选出All-index在两子代池中差异显著，并且△(All-index)在一定置信水平下，大于阈值的窗口作为候选区间。结果显示，差异位点主要集中在3号染色体，其他染色体上仅有少量位点存在差异，将3号染色体超过阈值区域定位首要候选区间。

3、候选基因预测及序列比对分析

在整个基因组范围内挑选差异显著的SNP或InDel位点，子代绿色池中All-index小于等于0.5，且挑选子代黄化池中All-index大于等于0.8的位点作为SNP、InDel候选位点。根据定位结果，对候选区间内的所有预测基因进行分析，结合候选基因的表达特性，获得一个编码含菱形结构域蛋白(Rhomboid domain-containing protein 2；SlRhbdd2)。其定位于高尔基体中，在突变体中该基因5’UTR区发生A→T突变。

实施例4、功能互补实验证实SlRhbdd2为控制叶色黄化转录的目标基因

1.表达载体构建

根据SlRhbdd2基因编码区全长cDNA序列(SEQ ID No.1)，合成特异引物对：上游引物SlRhbdd2 F：5’-CCGGGATCCATGAGAGGAGGAGATATAGAAAGC-3’(SEQ ID No.3)以及下游引物SlRhbdd2 R：5’-CGCTCTAGAGGTTAATTGCCATCACCG-3’(SEQ ID No.4)下划线为酶切位点)。利用高保真酶进行PCR扩增，PCR产物纯化后与pCAMBIA1301载体一同用BamH I和Xba I进行双酶切，纯化后在16℃连接12h。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化的细菌涂布于含有50mg·L^-1Spec和50mg·L^-1Str的筛选平板上，挑斑摇菌，菌液PCR筛选阳性克隆，送公司测序验证正确后获得过表达载体，再进行摇菌，提取质粒待用，该载体命名为pCAMBIA1301-35S::Sl Rhbdd2。

2.转基因番茄获得以及验证

将目的载体转化农杆菌GV1301，提取重组农杆菌的质粒送去测序，证明该重组农杆菌为阳性。利用“叶盘法”将pCAMBIA1301-35S::Sl Rhbdd2转入番茄突变体自交系“cely403”，同时转化pCAMBIA1301空白载体作为对照，通过PCR和GUS检测，共获得21株阳性转SlRhbdd2的植株，鉴定单拷贝插入的纯合过量表达转基因番茄。

3.转SlRhbdd2基因番茄植株表型观察

将SlRhbdd2转基因阳性番茄、野生型404以及突变体cely403种子播种育苗，在正常生长条件下生长至15天后观察，持续观察不同基因型番茄叶片颜色的动态变化，每隔5天检测一次叶绿素含量以及光合特性。结果发现，突变体cely403幼苗子叶黄化，在30天前(4叶1心)期心叶呈黄绿色，后期逐渐转为正常的绿色。而阳性转基因植株番茄叶色苗期并没有呈现黄化现象，同野生型植株叶色一致。说明互补载体能够完全恢复“cely403”的突变早期叶片黄化的表型(图5)。

利用比色法分析过表达植株、野生型植株以及突变体植株叶片的叶绿素含量发现：播后20d时野生型叶片的总叶绿素平均含量为1.78mg/g，突变体“cely403”叶片仅有1.08mg/g，而“cely403”的SlRhbdd2基因过表达植株叶片总叶绿素平均含量为1.67mg/g，恢复到了野生型的水平。

实施例5番茄SlRhbdd2基因的表达特性

利用qRT-PCR技术，比较了SlRhbdd2基因在番茄各组织以及不同生长时期叶片中的表达情况，从图6可以看出，其在叶片中的表达水平显著地高于其他器官中，而且在幼叶中的表达水平也高于成熟以及衰老叶片，这从一个侧面也证实了其主要在叶片发育过程发挥作用。

以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

无锡迪茉得生物种业科技有限公司

<120> 番茄黄化转绿基因SlRHBDD2及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum L.

<400> 1

atggctctga cattgcagca aaacaataca ataagcatga acttcagatc gccgcatcat 60

cactctgcaa aatccacaca cccaaatttc tcttttacaa atgaaaacac aaaaaaacag 120

aaacttcata tggaaaaccc aaagagtcgc cgcatcagtc tgcaaagatc aggccaaaac 180

caactggttc agaatcagaa actcccaccc aaaaccaaac tccaagctct tgaaactgtc 240

attaggaact tagaaatgac tgtgaaaaat ggcactgata tttacgaccc acaaatattt 300

gcatcccttt tagaaacatg ctttcaattg caggctattg atcatggtgt ccgtgttcat 360

gaactcattc ccgagaagct tttacgtaaa aacgtgggca tttcatcgaa gctgattagg 420

ctttacgcct gcagtggaca aactcagaag gcccatcaac tgtttgataa aatgcctaag 480

agaaatacct cagcatttcc ttggaattcg attatatcgg ggtatgctga gaagggtttg 540

tttgaagatg cgttagccat gtattttcag atggtggaag agggtgtaga gcctgattgt 600

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cttgttgata tgtattcaaa atgtggtgat attgttaagg ctcaaaagct ctttgatcaa 780

attgggacaa aggatttggt ttcttggaat tcaatgctca ttggatacat gaggcatgag 840

cttgtaacta aggcgttaaa cctgtttcgt cttatgatac gtgatggaat agaacctgac 900

tctgtttcta tatcagcatt acttgttgcc agaatacctt tctcaattgg gaaacaaatt 960

catggatggg ttcatcgtcg agggactaat caagagttgt ccattgttaa ctcattggtt 1020

gatttctatg cagaccaaaa gaagttgaag caagtgagat ggttgtttga aaatatgcat 1080

gaacgggatg tagtgtcatg gaattcagtc atttcagctc attccaagca ttgtgaagcc 1140

ctgttgtact ttgagaagat ggtgaaatct ggtgacctac cggacagtgt cacattcgtg 1200

tctttgttgt cggcatgtgc tcatttaggg aaactagagg acgcggagag gctgtttaga 1260

gctatgcaag agaggtatga tattagtcca aggatggaac attatagttg tatggtaaat 1320

ctatatggga ggttaggatt gatagacaaa gcttttgatt ttgtaatgaa gagaatggaa 1380

tttgaagctg gaccaacagt ttggggtgca ttgttatatg cttgctacag acatggcaat 1440

gttaaaatag gagagttagc tgcgcaacat ctgttcgagt tggagccaga taatgaccac 1500

aattttgagc ttttgatgaa gatttataga aatgctggtc taacagagaa tgtacagaga 1560

ataaagctaa tgatgataga acggggattg gattctccga taccatatga aagacattga 1620

<210> 2

<211> 539

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum L.

<400> 2

Met Ala Leu Thr Leu Gln Gln Asn Asn Thr Ile Ser Met Asn Phe Arg

1 5 10 15

Ser Pro His His His Ser Ala Lys Ser Thr His Pro Asn Phe Ser Phe

20 25 30

Thr Asn Glu Asn Thr Lys Lys Gln Lys Leu His Met Glu Asn Pro Lys

35 40 45

Ser Arg Arg Ile Ser Leu Gln Arg Ser Gly Gln Asn Gln Leu Val Gln

50 55 60

Asn Gln Lys Leu Pro Pro Lys Thr Lys Leu Gln Ala Leu Glu Thr Val

65 70 75 80

Ile Arg Asn Leu Glu Met Thr Val Lys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Asp

85 90 95

Pro Gln Ile Phe Ala Ser Leu Leu Glu Thr Cys Phe Gln Leu Gln Ala

100 105 110

Ile Asp His Gly Val Arg Val His Glu Leu Ile Pro Glu Lys Leu Leu

115 120 125

Arg Lys Asn Val Gly Ile Ser Ser Lys Leu Ile Arg Leu Tyr Ala Cys

130 135 140

Ser Gly Gln Thr Gln Lys Ala His Gln Leu Phe Asp Lys Met Pro Lys

145 150 155 160

Arg Asn Thr Ser Ala Phe Pro Trp Asn Ser Ile Ile Ser Gly Tyr Ala

165 170 175

Glu Lys Gly Leu Phe Glu Asp Ala Leu Ala Met Tyr Phe Gln Met Val

180 185 190

Glu Glu Gly Val Glu Pro Asp Cys Tyr Thr Phe Pro Arg Ala Leu Lys

195 200 205

Ala Cys Gly Gly Val Gly Leu Ile His Val Gly Glu Glu Val His Arg

210 215 220

His Val Ile Arg Arg Gly Phe Gly Ser Asn Gly Phe Ile Leu Asn Ala

225 230 235 240

Leu Val Asp Met Tyr Ser Lys Cys Gly Asp Ile Val Lys Ala Gln Lys

245 250 255

Leu Phe Asp Gln Ile Gly Thr Lys Asp Leu Val Ser Trp Asn Ser Met

260 265 270

Leu Ile Gly Tyr Met Arg His Glu Leu Val Thr Lys Ala Leu Asn Leu

275 280 285

Phe Arg Leu Met Ile Arg Asp Gly Ile Glu Pro Asp Ser Val Ser Ile

290 295 300

Ser Ala Leu Leu Val Ala Arg Ile Pro Phe Ser Ile Gly Lys Gln Ile

305 310 315 320

His Gly Trp Val His Arg Arg Gly Thr Asn Gln Glu Leu Ser Ile Val

325 330 335

Asn Ser Leu Val Asp Phe Tyr Ala Asp Gln Lys Lys Leu Lys Gln Val

340 345 350

Arg Trp Leu Phe Glu Asn Met His Glu Arg Asp Val Val Ser Trp Asn

355 360 365

Ser Val Ile Ser Ala His Ser Lys His Cys Glu Ala Leu Leu Tyr Phe

370 375 380

Glu Lys Met Val Lys Ser Gly Asp Leu Pro Asp Ser Val Thr Phe Val

385 390 395 400

Ser Leu Leu Ser Ala Cys Ala His Leu Gly Lys Leu Glu Asp Ala Glu

405 410 415

Arg Leu Phe Arg Ala Met Gln Glu Arg Tyr Asp Ile Ser Pro Arg Met

420 425 430

Glu His Tyr Ser Cys Met Val Asn Leu Tyr Gly Arg Leu Gly Leu Ile

435 440 445

Asp Lys Ala Phe Asp Phe Val Met Lys Arg Met Glu Phe Glu Ala Gly

450 455 460

Pro Thr Val Trp Gly Ala Leu Leu Tyr Ala Cys Tyr Arg His Gly Asn

465 470 475 480

Val Lys Ile Gly Glu Leu Ala Ala Gln His Leu Phe Glu Leu Glu Pro

485 490 495

Asp Asn Asp His Asn Phe Glu Leu Leu Met Lys Ile Tyr Arg Asn Ala

500 505 510

Gly Leu Thr Glu Asn Val Gln Arg Ile Lys Leu Met Met Ile Glu Arg

515 520 525

Gly Leu Asp Ser Pro Ile Pro Tyr Glu Arg His

530 535

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgggatcca tgagaggagg agatatagaa agc 33

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgctctagag gttaattgcc atcaccg 27

Claims (3)

1.番茄黄化转绿叶基因SlRHBDD2在创建黄化转绿叶种质中的应用，所述SlRHBDD2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：利用RNAi、Crispr/Cas9基因敲除或敲低方法降低种质中SlRHBDD2基因表达水平创建获得黄化转绿叶种质。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述种质为番茄。

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