CN112662658A - 固定化重组大肠杆菌利用l-苯丙氨酸生产l-苯丙酮酸 - Google Patents

Abstract

本发明公开了固定化重组大肠杆菌利用L‑苯丙氨酸生产L‑苯丙酮酸，属于生物催化技术领域。本发明采用吸附‑交联法，将表达来自奇异变形杆菌的L‑氨基酸脱氨酶PmiLAAD的重组大肠杆菌固定在硅藻土‑聚乙烯亚胺‑戊二醛的复合载体中，经优化后，用于L‑苯丙氨酸生产L‑苯丙酮酸。所得固定化细胞总酶活回收>60％。以固定化的大肠杆菌E.coli细胞做为生物催化剂催化L‑苯丙氨酸生产L‑苯丙酮酸的生物制备，底物浓度100g/L，反应时间16h，转化率在60％以上。将固定化细胞回收利用，重复反应8批，酶活没有明显下降，各批次底物转化率均大于50％。

Description

固定化重组大肠杆菌利用L-苯丙氨酸生产L-苯丙酮酸

技术领域

本发明涉及固定化重组大肠杆菌利用L-苯丙氨酸生产L-苯丙酮酸，属于生物催化技术领域。

背景技术

苯丙酮酸(PPA)是一种多功能有机酸，广泛应用于制药、食品、化学工业。传统的化学制备法环境污染严重,微生物发酵法产量低，对于生物转化法，一般采用D-氨基酸氧化酶(D-AAO)催化D-苯丙氨酸合成PPA，反应过程中生成毒性副产物过氧化氢。来自Proteus.sp的L-氨基酸脱氨酶(L-AADs)可特异性催化L-苯丙氨酸(PLA)氧化脱氨基合成PPA，不生成过氧化氢且PLA比D-苯丙氢酸价格便宜。因此，利用生物转化法是一种颇有前景的方法。

利用固定化技术对细胞处理，可增强酶与细胞的稳定性，提高细胞对有机溶剂、机械剪切力耐受，避免细胞破裂后内容物释放至反应体系，降低对产物纯化工艺造成的影响。目前，国内外在固定化细胞/酶催化领域研究较少，相关研究存在着总酶活回收率低、固定化酶制备成本高、催化活力不理想、稳定性差、底物浓度不高、有机溶剂耐受性差等问题，严重限制了固定化生物催化剂在生产α-酮酸中的应用。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种固定化重组大肠杆菌将L-苯丙氨酸转化为L-苯丙酮酸的方法。

[技术方案]

本发明提供了一种固定化重组大肠杆菌的方法以及利用固定化重组大肠杆菌将L-苯丙氨酸转化为L-苯丙酮酸的方法，该方法采用吸附-交联法，将重组大肠杆菌固定在硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛的复合载体中，用于L-苯丙氨酸生产L-苯丙酮酸。所述重组大肠杆菌来自奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶PmiLAAD，所述重组大肠杆菌优选E.coli BL21-pET-28a-PmiLAAD。所述硅藻土经过酸洗预处理。

固定化重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)培养能够表达来自奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的重组大肠杆菌，收集湿菌体，制备菌悬液；

(2)将硅藻土放入2M盐酸中浸泡，之后用去离子水洗涤至中性，再进行抽滤、烘干、过筛；

(3)向菌悬液中加入经过预处理的硅藻土，搅拌，再加入浓度为10％的聚乙烯亚胺水溶液，搅拌1-2h，加入浓度为25％的戊二醛水溶液，于室温下交联反应1-2h，抽滤，将抽滤得到的滤饼用pH8.0的PBS缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即获得含L-氨基酸脱氨酶基因的固定化重组大肠杆菌细胞；所述硅藻土加入量为菌悬液的8-20g/L(优选16g/L)，所述10％聚乙烯亚胺水溶液的用量为菌悬液体积的2-6％(优选3％)；所述25％戊二醛水溶液的用量以菌悬液体积计为2-6％(优选3％)。

在一种实施方式中，步骤(1)，将重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体用pH8.0的PBS缓冲液悬浮，获得菌悬液；所述菌悬液中湿菌体含量为20-150g/L。

在一种实施方式中，步骤(2)将硅藻土放入2M盐酸中浸泡4h，之后用去离子水洗涤至中性，再进行抽滤、65℃烘干、过40目筛。

在一种实施方式中，步骤(1)，湿菌体的获得方法如下：将重组大肠杆菌接种至含终浓度0.1g/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养12-16h，以体积浓度2％的接种量转接至新的含终浓度0.1g/ml卡那霉素TB液体培养基中，于37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀值0.6-0.8，再加入终浓度0.4mM的IPTG，25℃条件下诱导14h，离心，获得湿菌体细胞。

本发明还提供利用固定化重组大肠杆菌将L-苯丙氨酸转化为L-苯丙酮酸的方法，包括步骤：以含L-氨基酸脱氨酶的重组大肠杆菌固定化细胞为催化剂、加入L-苯丙氨酸为底物，以pH＝8的PBS缓冲液为反应液共同构成反应体系，在20-40℃，200-500rpm(优选35℃，200rpm)条件下反应16h，即获得L-苯丙酮酸。所述反应液还可以替换为转化液，其组成是：NaCl 8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L。

进一步，所述催化剂用量为20-100g/L反应体系，底物浓度100g/L反应体系。

[有益效果]

本发明提供了一种固定化L-氨基酸脱氨酶基因工程菌微生物细胞的方法，所得固定化细胞总酶活回收>60％。以固定化的大肠杆菌E.coli细胞做为生物催化剂催化L-苯丙氨酸生产L-苯丙酮酸的生物制备，底物浓度100g/L，反应时间16h，转化率在60％以上。将固定化细胞回收利用，重复反应8批，酶活没有明显下降，各批次底物转化率均大于50％。本发明反应过程无需外源辅酶添加，在酮酸的工业化生产中具有极高应用价值。

附图说明

图1为固定化细胞的重复批次

图2为固定化细胞制作完成后的形态

图3为固定化细胞的扫描电镜图

具体实施方式

下面结合具体实施对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

重组大肠杆菌E.coli BL21-pET-28a-PmiLAAD的构建方法参见专利CN110643585A：《一种利用氨基酸脱氨酶生产α-酮-β-甲基正戊酸的方法》。

酶活定义为：1个酶活力单位是指在30℃，pH＝8.5下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

游离细胞中酶活的测定方法：将15mL浓度约为40g L^-1的L-苯丙氨酸溶液(用pH为8.0的Tris缓冲液溶解)于30℃预热10min。然后，称取0.5g左右的湿菌体于250mL锥形瓶中，并加入14.5mL缓冲液，吹吸混匀菌体后保鲜膜封口预热10min(与L-苯丙氨酸溶液同时预热)，随后迅速将预热的L-苯丙氨酸溶液倒入预热的菌体混悬液中，保鲜膜封口后置于30℃、200rpm的摇床中反应30min。反应完成后，取适量反应液快速离心、稀释，并利用高效液相色谱检测L-苯丙酮酸。

固定化细胞中酶活的测量方法为：将15mL浓度约为40g L^-1的L-苯丙氨酸溶液(用pH为8.0的Tris缓冲液溶解)于30℃预热10min。然后，称取0.5g左右的固定化菌体于250mL锥形瓶中，并加入14.5mL缓冲液，吹吸混匀菌体后保鲜膜封口预热10min(与L-苯丙氨酸溶液同时预热)，随后迅速将预热的L-苯丙氨酸溶液倒入预热的菌体混悬液中，保鲜膜封口后置于30℃、200rpm的摇床中反应30min。反应完成后，取适量反应液快速离心、稀释，并利用高效液相色谱检测L-苯丙酮酸。

L-苯丙酮酸的高效液相色谱检测方法：液相色谱柱：Aminex HPX-87H，300×7.8nm，流动相：稀硫酸溶液，流速：0.6mL/min，柱温：35℃，产物出峰时间：9min，检测波长：210nm。

实施例1：重组大肠杆菌的培养

将重组大肠杆菌E.coli BL21-pET-28a-PmiLAAD接种至含终浓度0.1g/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm培养12-16h，以体积浓度2％的接种量转接至新的含终浓度0.1g/ml卡那霉素TB液体培养基中，于37℃，200rpm条件下培养至OD值0.6-0.8，再加入终浓度0.4mM IPTG，5℃条件下诱导14h，离心，去上清，获得湿菌体细胞。

实施例2：固定化材料的筛选

采用不同材料对重组大肠杆菌进行固定化，观察固定化细胞的转化率以及稳定性。分别是：

1：聚乙烯醇-海藻酸钠(SA-PVA)；

2：琼脂(Agar)；

3：卡拉胶(Carrageenan)；

4：活性炭-戊二醛(AC-GA)；

5：硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛(DME-PEI-GA)。

制备方法如下：

1：聚乙烯醇-海藻酸钠

1.0g湿菌体悬浮于5mL生理盐水形成菌悬液，将菌悬液与15mL海藻酸钠-聚乙烯醇混合溶液混匀，所得混合物中，海藻酸钠终质量浓度为30g/L，聚乙烯醇终质量浓度为100g/L。利用注射器将所得混合物缓慢滴入到200mL浓度3.0％的CaCl₂溶液中，室温中放置8h使其硬化。倾去CaCl₂溶液，生理盐水洗涤固定化细胞3次，于4℃冰箱保存备用。

2：琼脂

取1g湿菌体溶于10mL 15％的琼脂溶液中(50℃溶解)，搅拌后将其混合液倒入无菌的平皿中凝固，之后将其切成0.5×0.5×0.5cm的小块，用蒸馏水洗涤三次后，4℃下保存备用。

3：卡拉胶

取1g湿菌体溶于10mL 3％(w/v)的卡拉胶溶液(在50℃溶解)，搅拌后将其混合液倒入无菌的平皿中凝固，之后将其切成0.5×0.5×0.5cm的小块，用蒸馏水洗涤三次后，4℃下保存备用。

4：活性炭-ZIF-8-戊二醛

(1)将1.0g大肠杆菌湿菌体悬浮于20mL生理盐水中，加入0.72g活性炭(AC)，搅拌20min；

(2)加入0.12mL、7.5mM GA溶液，再搅拌10min；

(3)制备的固定化细胞通过过滤回收，并在4℃下保存至使用。

5：硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛。

(1)在20mL含1g大肠杆菌湿菌体的生理盐水中，加入硅藻土0.06g，搅拌0.5h；硅藻土经过预处理：将硅藻土放入2M盐酸中浸泡4h，之后用去离子水洗涤至中性，再进行抽滤、放入65℃烘箱内烘干、过40目筛；

(2)加入0.8mL的PEI溶液(10％，v/v)，用1M盐酸预调至pH8.5，搅拌1h，搅拌过程中加入0.2mLGA溶液(25％，v/v)，再搅拌1h，溶液颜色变为橙色；

(3)将硅藻土-PEI-GA固定化液经过滤并收集固定化细胞，将固定化细胞在生理盐水中洗涤3次，在4℃保存至使用。

将按照上述5种方法制备的固定化细胞分别投入反应，以pH＝8的PBS缓冲液为反应液，与固定化细胞、底物共同构成反应体系，固定化细胞用量为50g/L反应体系，底物浓度100g/L反应体系，反应条件为：反应液pH为8.0，温度35℃，反应时间16h，转速200rpm。反应结束后，利用高效液相色谱测定L-苯丙酮酸的产量，计算转化率(产量与底物量之比)，结果如表1所示，硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛作为固定化载体能够取得最好的结果。

表1不同材料固定化细胞的转化率

实施例3：固定化细胞的条件优化

根据实施案例2中固定化材料的筛选结果，最终选择硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛来固定化细胞，方法如下：

将重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体用10mL、pH8.0的PBS缓冲液悬浮，获得菌悬液，菌悬液中湿菌体含量为50g/L；分别向菌悬液中加入0.04g、0.08g、0.12g、0.16g、0.2g经过预处理的硅藻土(将硅藻土放入2M盐酸中浸泡4h，之后用去离子水洗涤至中性，再进行抽滤、放入65℃烘箱内烘干、过40目筛)，在室温(25-30℃)，400rpm条件下用磁力搅拌器搅拌0.5h，再加入10％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液，用1M盐酸预调至pH 8.5，并搅拌1h，最后加入0.2mL的25％戊二醛水溶液，于室温下交联反应1h，抽滤，滤饼用pH8.0的PBS缓冲液清洗两次，再抽滤去除缓冲液，获得固定化细胞。

之后，对固定化细胞进行酶活测量，以游离细胞的酶活为100％，分别对不同硅藻土添加量下，固定化细胞的酶活进行测量，与游离细胞酶活之比即为相对酶活。结果如表2所示，优选硅藻土添加量为16g/L。

表2不同硅藻土添加量对固定化细胞相对酶活的影响

实施例4：固定化细胞生产L-苯丙酮酸

将重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体用10mL、pH8.0的PBS缓冲液悬浮，获得菌悬液，菌悬液中湿菌体含量为50g/L；向菌悬液中加入0.16g经过酸预处理的硅藻土(将硅藻土放入2M盐酸中浸泡4h，之后用去离子水洗涤至中性，再进行抽滤、放入65℃烘箱内烘干、过40目筛)，在室温(25-30℃)，400rpm条件下用磁力搅拌器搅拌0.5h，再加入10％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液，用1M盐酸预调至pH 8.5，并搅拌1h，最后加入0.2mL的25％戊二醛水溶液，于室温下交联反应1h，抽滤，滤饼用pH8.0的PBS缓冲液清洗两次，再抽滤去除缓冲液，获得固定化细胞。固定化细胞的照片如图2所示，扫描电镜图如图3所示。

将50g/L的固定化菌体和100g/L的底物悬浮于20ml的转化液中(转化液组成：NaCl8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L)进行转化反应，反应液pH为8.0，温度35℃，反应时间24h，转速200rpm。24h后取部分反应液离心，将离心得到的上清液进行过滤处理后，用高效液相色谱仪检测L-苯丙酮酸的含量，并计算固定化细胞转化L-苯丙氨酸的转化率。第一批次反应结束之后，将固定化细胞通过抽滤回收，进行下一批反应，重复反应10批，结果如图1所示。

对照例1不对硅藻土进行预处理

将重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体用10mL、pH8.0的PBS缓冲液悬浮，获得菌悬液，菌悬液中湿菌体含量为50g/L；分别向菌悬液中加入0.16g未经预处理的硅藻土，在室温(25-30℃)，400rpm条件下用磁力搅拌器搅拌0.5h，再加入10％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液，用1M盐酸预调至pH 8.5，并搅拌1h，最后加入0.2mL的25％戊二醛水溶液，于室温下交联反应1h，抽滤，滤饼用pH8.0的PBS缓冲液清洗两次，再抽滤去除缓冲液，获得固定化细胞。

将50g/L的固定化菌体和100g/L的底物悬浮于20ml的转化液中(转化液组成：NaCl8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L)进行转化反应，反应液pH为8.0，温度35℃，反应时间24h，转速200rpm。24h后取部分反应液离心，将离心得到的上清液进行过滤处理后，用高效液相色谱仪检测L-苯丙酮酸的含量，并计算固定化细胞转化L-苯丙氨酸的转化率。测得未经过预处理的硅藻土固定化细胞转化率为41.21％，经过预处理的硅藻土转化率为68.35％。

对照例2不对聚乙烯亚胺进行调pH处理

将重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体用10mL、pH8.0的PBS缓冲液悬浮，获得菌悬液，菌悬液中湿菌体含量为50g/L；分别向菌悬液中加入0.16g未经预处理的硅藻土，在室温(25-30℃)，400rpm条件下用磁力搅拌器搅拌0.5h，再加入10％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液，并搅拌1h，最后加入0.2mL的25％戊二醛水溶液，于室温下交联反应1h，抽滤，滤饼用pH8.0的PBS缓冲液清洗两次，再抽滤去除缓冲液，获得固定化细胞。

将50g/L的固定化菌体和100g/L的底物悬浮于20ml的转化液中(转化液组成：NaCl8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L)进行转化反应，反应液pH为8.0，温度35℃，反应时间24h，转速200rpm。24h后取部分反应液离心，将离心得到的上清液进行过滤处理后，用高效液相色谱仪检测L-苯丙酮酸的含量，并计算固定化细胞转化L-苯丙氨酸的转化率。

聚乙烯亚胺不经过pH处理(pH＝13)，直接用于固定化细胞制备，测得固定化细胞转化率为45.15％，相比于经过pH处理的固定化细胞转化率(68.35％)下降了23.2％。

Claims (9)

1.一种固定化重组大肠杆菌的方法，其特征在于，将重组大肠杆菌固定在硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛的复合载体中，用于催化L-苯丙氨酸生得到L-苯丙酮酸，所述重组大肠杆菌表达来自奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶PmiLAAD，所述硅藻土经过酸洗预处理。

2.根据权利要求1所述的一种固定化重组大肠杆菌的方法，其特征在于，固定化重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)培养能够表达来自奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的重组大肠杆菌，收集湿菌体，制备菌悬液；

(2)将硅藻土放入2M盐酸中浸泡，之后用去离子水洗涤至中性，再进行抽滤、烘干、过筛；

(3)向菌悬液中加入经过酸预处理的硅藻土，搅拌，再加入浓度为10％的聚乙烯亚胺水溶液，搅拌1-2h，加入浓度为25％的戊二醛水溶液，于室温下交联反应1-2h，抽滤，将抽滤得到的滤饼用pH8.0的PBS缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即获得含L-氨基酸脱氨酶基因的固定化重组大肠杆菌细胞；所述硅藻土加入量为菌悬液的8-20g/L，所述10％聚乙烯亚胺水溶液的用量为菌悬液体积的2-6％；所述25％戊二醛水溶液的用量以菌悬液体积计为2-6％。

3.根据权利要求2所述的一种固定化重组大肠杆菌的方法，其特征在于，步骤(1)，将重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体用pH8.0的PBS缓冲液悬浮，获得菌悬液；所述菌悬液中湿菌体含量为20-150g/L。

4.根据权利要求2所述的一种固定化重组大肠杆菌的方法，其特征在于，步骤(2)将硅藻土放入2M盐酸中浸泡4h，之后用去离子水洗涤至中性，再进行抽滤、65℃烘干、过40目筛。

5.根据权利要求2所述的一种固定化重组大肠杆菌的方法，其特征在于，步骤(1)，湿菌体的获得方法如下：将重组大肠杆菌接种至含终浓度0.1g/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养12-16h，以体积浓度2％的接种量转接至新的含终浓度0.1g/ml卡那霉素TB液体培养基中，于37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀值0.6-0.8，再加入终浓度0.4mM的IPTG，25℃条件下诱导14h，离心，获得湿菌体细胞。

6.应用权利要求1-5任一项所述方法得到的固定化重组大肠杆菌。

7.利用权利要求6所述固定化重组大肠杆菌将L-苯丙氨酸转化为L-苯丙酮酸的方法，其特征在于，包括步骤：以含L-氨基酸脱氨酶的重组大肠杆菌固定化细胞为催化剂、加入L-苯丙氨酸为底物，以PBS缓冲液为反应液共同构成反应体系，在20-40℃，200-500rpm条件下反应获得L-苯丙酮酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应液替换为转化液，其组成是：NaCl8g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L。

9.根据权利要求7所述的一种固定化重组大肠杆菌的方法，其特征在于所述催化剂用量为20-100g/L反应体系，底物浓度100g/L反应体系。

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