CN112625942A - 一种好氧反硝化菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种好氧反硝化菌及其应用。本发明假单胞菌JM22B6保藏编号为：GDMCC No:61212。综合形态学、生理生化、16SrRNA序列和基因组序列等分析，本发明菌株为假单胞菌属的一个新种。该菌株为一株新型好氧反硝化菌，能高效地脱除水体中的硝态氮、亚硝态氮和铵态氮，即培养12h，对亚硝态氮和铵态氮的脱除效率均为100％；培养24h，对硝态氮的脱除率为100％。此外，菌株22B6在亚硝态氮浓度14～280mg/L范围条件下，均有较好的脱氮效果。因此，假单胞菌JM22B6在硝态氮、亚硝态氮和铵态氮等氮素污染的废水，尤其是各类不同浓度亚硝态氮污染的废水脱氮处理上具有重要应用潜力。

Description

一种好氧反硝化菌及其应用

技术领域

本发明属微生物和环境工程技术领域，具体涉及一种好氧反硝化菌及其应用。

背景技术

随着国内水产养殖业的快速发展，高密度养殖模式越来越受到人们的青睐。然而，高密度养殖在满足人们对水产品需求的同时，也由于饲料的过量投入及抗菌药剂的频繁使用等因素，对养殖环境及周边生态环境造成严重的危害。一方面，本身养殖水体恶化，如过量的饵料、粪便及分泌物的积累，使水体中的铵态氮和亚硝态氮浓度升高，危害养殖动物的健康生长，影响水产养殖产量，提高养殖成本；另一方面，未经处理的养殖废水随意排放也对养殖周边的水体环境造成了严重污染。因此，如何高效、经济地脱除养殖废水中过量的无机氮素，具有重要的现实意义。

废水中含氮污染物的脱除主要有物理、化学和生物等三种方法，其中微生物脱氮技术克服了物理、化学脱氮工艺的一些缺陷，具有操作简单、适应范围广、处理效果好、基本上无二次污染等优点。因此，微生物脱氮技术已成为目前国内外应用最广泛的脱氮技术。目前，环境工程和污水、废水处理领域主要采用缺氧-好氧(Anoxic-Oxic,AO)脱氮、厌氧-缺氧-好氧(Anaerobic-Anoxic-Oxic,AAO)脱氮、间歇式(Sequencing Batch Reactor,SBR)脱氮、曝气生物滤池(Biological Aeration Filter,BAF)脱氮等工艺，这些脱氮工艺普遍将硝化过程和反硝化过程分阶段进行或在不同的反应器中实现。

近年来，随着对脱氮微生物的深入研究，研究人员发现某些菌株可以在好氧条件下进行反硝化作用，这类菌被称为好氧反硝化菌。大多数好氧反硝化菌会表现出异养硝化能力，这种同时兼具异养硝化和反硝化功能的菌被称为异养硝化-好氧反硝化菌(Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification Bacteria，HN-AD)。鉴于在水产养殖过程中养殖水体的溶氧量需要维持在一定范围，以保证养殖动物的健康生长，因此，好氧反硝化脱氮菌在养殖废水脱氮上具有很好的应用价值。

好氧反硝化菌在生理生化和系统发育上存在多样性，据文献报道，好氧反硝化细菌主要分布于假单胞菌属(Pseudomonaceae)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)、芽胞杆菌属(Bacillus)等属，且相关国家发明专利也较多。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种好氧反硝化菌。

本发明的第二个目的在于提供一种具有脱氮功能的活菌制剂。

本发明的第三个目的在于提供上述好氧反硝化菌或具有脱氮功能的活菌制剂的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种好氧反硝化菌，命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)JM22B6，其于2020年9月20日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No:61212。

所述假单胞菌JM22B6从鳙鱼和南美白对虾混合养殖池塘水中分离筛选得到，具有以下特征：

1.形态特征：假单胞菌JM22B6，革兰氏阴性菌，NA培养基上30℃培养48h，菌落呈米黄色、边缘不规则、微凸起，表面光滑、不透明，菌落直径大小2-3mm。细胞呈长杆状，大小为(0.3×2.4)μm，具有单根的极端生鞭毛；

2.生理生化特征：假单胞菌JM22B6生长盐浓度为0-8.0％，9％以上不能正常生长，最适盐浓度为0-2.0％；生长pH为6.0-11.0，最适为7.5；生长温度为15-45℃，最适为28-37℃。氧化酶和接触酶均为阳性，淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶均为阴性。API 20NE结果显示，假单胞菌JM22B6的β-葡萄糖苷酶、精氨酸双水解酶、吲哚产生和硝酸盐还原酶均为阳性，β-半乳糖苷酶、明胶液化和尿素酶均为阴性，该菌株不能进行D-葡萄糖发酵产酸，能够利用D-葡萄糖、D-甘露醇、葡萄糖酸盐、癸酸、苹果酸和柠檬酸钠，不能利用N-乙酰-葡萄糖胺、D-麦芽糖、己二酸、L-阿拉伯糖、D-甘露糖和苯乙酸。API ZYM结果显示，假单胞菌JM22B6具有碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性，不具有α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖甙酶、β-岩藻糖甙酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等酶活性；

3.16S rRNA和基因组序列分析：采用HiPure细菌DNA提取试剂盒，提取假单胞菌JM22B6的基因组DNA，对其16S rRNA序列进行扩增测定，并将其送至上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序，菌株22B6的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。经BLAST比对分析，假单胞菌JM22B6的16S rRNA与Pseudomonas mendocina NBRC 14162^T相似性最高，为98.5％。将菌株JM22B6与16S rRNA序列相似度最高的P.mendocina NBRC 14162^T进行基因组比较分析，结果显示，两株菌的平均核苷酸相似度(ANI)和DNA-DNA杂交值(dDDH)分别为84.6％和29.0％；

综合菌株的形态特征、生理生化特征、16S rRNA序列和基因组序列分析结果，本发明菌株JM22B6属于假单胞菌属的一个新种，具体为Pseudomonas sp:JM22B6。

一种具有脱氮功能的活菌制剂，其含有上述假单胞菌(Pseudomonas sp.)JM22B6。假单胞菌JM22B6作为活性成分。

上述好氧反硝化菌或具有脱氮功能的活菌制剂在水体脱氮处理中的应用。

所述的氮包括但不限于硝态氮、亚硝态氮或铵态氮。本发明菌株假单胞菌JM22B6能快速高效地脱除水体中的硝态氮、亚硝态氮和铵态氮，即在培养12h时，该菌株对亚硝态氮和铵态氮的脱除效率均达100％；在培养24h时，该菌株对硝态氮的脱除率达100％。

所述的脱氮的方式为好氧反硝化。

所述的水体可以是任意氮含量超标的废水，亚硝态氮浓度在14～280mg/L之间。本发明菌株假单胞菌JM22B6在亚硝态氮浓度为14～280mg/L范围条件下，对亚硝态氮的脱除率均在80.0％以上。由此说明，假单胞菌JM22B6在低浓度和高浓度的亚硝态氮污染的水体中均有较好的脱氮效果，即该菌株能应用于各种不同亚硝态氮浓度污染的水体脱氮处理。

附图说明

图1为Pseudomonas sp.JM22B6的菌落形态图。

图2为Pseudomonas sp.JM22B6透射电镜下的细胞形态图。

图3为Pseudomonas sp.JM22B6在以硝态氮为唯一氮源条件下的脱氮特性结果图。

图4为Pseudomonas sp.JM22B6在以亚硝态氮为唯一氮源条件下的脱氮特性结果图。

图5为Pseudomonas sp.JM22B6在以铵态氮为唯一氮源条件下的脱氮特性结果图。

图6为Pseudomonas sp.JM22B6在不同亚硝态浓度条件下的脱氮效果图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但不是对本发明的限制。

实施例1：假单胞菌JM22B6的分离纯化和保藏

样品采集自广东省江门市台山市年丰公司广海镇养殖基地(N21°56′31″；E112°46′16″)的鳙鱼和南美白对虾混合养殖池塘水。养殖水样品1mL，梯度稀释10^-1，10^-2，10^-3和10^-4后，取200μL 10^-2、10^-3和10^-4的稀释液涂布于脱氮菌分离筛选所用的选择性培养基上，30℃培养箱中培养。肉眼观察菌落形态，挑取菌落形态上有差异的单菌落，分别划线纯化，将已纯化的菌落接种至5mL的R2A液体培养集中，30℃，180rpm培养，进行后续甘油管保存，由此得到菌株JM22B6。

选择性培养基配方如下：琥珀酸钠0.025g，二水合柠檬酸钠0.025g，NaNO₂0.0069g，KNO₃ 0.0101g，(NH₄)₂SO₄ 0.0066g，Na₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，15g琼脂，pH 7.4，定容至1000mL，121℃，15min，高温高压灭菌。制板时添加体积比1％的复合碳源和体积比0.2％的微量元素混合液。

复合碳源：D-葡萄糖13.8g，D-果糖13.8g，D-乳糖13.8g，90％乳酸12.8mL，甘露醇14.0g，无水乙醇14.0mL，甘油12.6mL，苯甲酸钠9.6g，水杨酸9.2g，无水乙酸钠19.0g，溶于1000mL水中，pH 7.4，0.22μm滤膜过滤除菌。

微量元素混合液：EDTA-Na 58.0g，ZnSO₄·7H₂O 3.9g，CaCl₂ 10.0g，MnCl₂·4H₂O1.0g，FeSO₄·7H₂O 10.0g，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g，CuSO₄·5H₂O 1.6g，CoCl₂·6H₂O1.6g，pH调至6.0，定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤。

实施例2：假单胞菌JM22B6的生理生化特征

如图1和图2所示，菌株JM22B6为革兰氏阴性菌，该菌株在NA培养基上培养48h时，其菌落形态特征为：米黄色，边缘不规则，微凸起，表面光滑、不透明。透射电镜观察其细胞形态特征为：大小为(0.3×2.4)μm，长杆状，有单根的极端生鞭毛。

将菌株JM22B6分别接种至NaCl质量浓度为0、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％和10.0％的NB培养基中，30℃，180rpm培养。将菌株JM22B6分别接种至pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和11.0的NB培养基中，30℃，180rpm培养。将菌株JM22B6接种至NA培养基上，分别放置10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃培养箱中培养。

试验结果显示，假单胞菌JM22B6生长盐浓度为0-8.0％，9％以上不能正常生长，最适盐浓度为0-2.0％，生长pH为6.0-11.0，最适为7.5。生长温度为15-45℃，最适为28-37℃。

API 20NE结果显示，假单胞菌JM22B6的β-葡萄糖苷酶、精氨酸双水解酶、吲哚产生和硝酸盐还原酶均为阳性，β-半乳糖苷酶、明胶液化和尿素酶均为阴性，该菌株不能进行D-葡萄糖发酵产酸，能够利用D-葡萄糖、D-甘露醇、葡萄糖酸盐、癸酸、苹果酸和柠檬酸钠，不能利用N-乙酰-葡萄糖胺、D-麦芽糖、己二酸、L-阿拉伯糖、D-甘露糖和苯乙酸。API ZYM结果显示，假单胞菌JM22B6具有碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性，不具有α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖甙酶、β-岩藻糖甙酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等酶活性。此外，该菌的氧化酶和接触酶均为阳性，淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶均为阴性。

实施例3：假单胞菌JM22B6的16S rRNA序列分析

采用HiPure细菌DNA提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司)提取菌株JM22B6的基因组DNA，用细菌16S rRNA基因扩增通用引物27F/1492R(27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3、1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)增得到PCR产物，并送至苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，测序结果与EzBioCloud网站数据库中的16S rRNA序列进行同源性比对分析，结果表明，菌株JM22B6与菌株Pseudomonas mendocina NBRC 14162^T的16S rRNA基因序列相似性最高，为98.5％，小于细菌种水平的阈值98.7％。基于以上结果分析，初步鉴定本发明菌株JM22B6为Pseudomonas属的一个新种，即Pseudomonas sp.。

实施例4：假单胞菌JM22B6的基因组序列分析

提取菌株JM22B6的基因组DNA，将其送至上海美吉生物医药科技有限公司进行基因组测序，测序结果分别采用SPAdes v3.11.1和CheckM 1.0.9进行基因组的组装和质量评估。采用EzBioCloud网站上的ANI Calculator计算JM22B6和P.mendocinaNBRC14162^T基因组的平均核苷酸相似度(ANI)；采用DSMZ网站上的Genome-to-Genome DistanceCalculator计算JM22B6和P.mendocina NBRC 14162^T的DNA-DNA杂交值(dDDH)。结果显示，菌株JM22B6与P.mendocina NBRC 14162^T的ANI和dDDH分别为84.6％和29.0％，该值均小于细菌种水平的ANI阈值95％和dDDH阈值70％。此结果进一步证实了菌株JM22B6为Pseudomonas属的一个新种。

综上所述，本发明的菌株JM22B6为Pseudomonas属的一个新种，命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)JM22B6，其于2020年9月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为：GDMCC No:61212。

实施例5：假单胞菌JM22B6的脱氮特性

将菌株JM22B6按1％接种量分别接种至以硝态氮、亚硝态氮或铵态氮为唯一氮源的培养基中，其中NO₃ ^--N初始浓度设置为140mg/L，NO₂ ^--N和NH₄ ⁺-N初始浓度均设置为50mg/L，30℃，120rpm培养。在硝态氮培养基中，分别在培养0、6、18、24、30、42、48h时取样，一部份培养液用于检测OD₆₀₀值，另一部份培养液离心取上清，用于后续NO₃ ^--N浓度测定。在亚硝态氮和铵态氮培养基中，分别在培养0、12、18、24、36h时取样，一部份培养液用于检测OD₆₀₀值，另一部分培养液离心取上清，分别用于后续NO₂ ^--N和NH₄ ⁺-N浓度测定。NO₃ ^--N浓度采用紫外分光光度法测定，NO₂ ^--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定，NH₄ ⁺-N浓度采用纳氏试剂分光光度法测定。

以硝态氮为唯一氮源的培养基：琥珀酸钠6.08g，KNO₃ 1.01g，Na₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，添加体积比0.2％微量元素混合液，pH 7.4，定容至1000mL，115℃，20min，高温高压灭菌。

以亚硝态氮为唯一氮源的培养基：琥珀酸钠2.5g，二水合柠檬酸三钠2.5g，NaNO₂0.24g，Na₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，添加体积比1％的复合碳源和体积比0.2％微量元素混合液，pH 7.4，定容至1000mL，115℃，20min，高温高压灭菌。

以铵态氮为唯一氮源的培养基：琥珀酸钠2.5g，二水合柠檬酸三钠2.5g，(NH₄)₂SO₄0.23g，Na₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，添加体积比1％的复合碳源和体积比0.2％微量元素混合液，pH 7.4，定容至1000mL，115℃，20min，高温高压灭菌。

如图3所示，菌株JM22B6对水体中初始浓度为140mg/L的NO₃ ^--N有很好的脱除效果，即在培养24h时，该菌OD₆₀₀为1.0，其对NO₃ ^--N的脱除效果已达100％。如图4和图5所示，菌株JM22B6对水体中初始浓度为50mg/L的NO₂ ^--N和NH₄ ⁺-N均能快速高效的进行脱除，即在培养12h时，该菌的OD₆₀₀分别为0.6和0.4，其对两种无机氮的脱除率均达100％。以上结果表明，假单胞菌JM22B6为一株具高效脱氮功能的新型好氧反硝化菌，其在水体脱氮中具有很大的应用潜力。

实施例6：假单胞菌JM22B6在不同亚硝态浓度条件下的脱氮效果

将菌株JM22B6按1％接种量分别接种至以亚硝酸钠为唯一氮源的培养基中，NO₂ ^--N初始浓度分别设置为3.5、7.0、14、42、70、84、140、168、210和280mg/L，同时以琥珀酸钠为唯一碳源，调整培养基中的C/N保持15不变，30℃，120rpm培养48h，取样测定菌液的OD₆₀₀，并取部分培养液离心取上清，后续采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定NO₂ ^--N浓度测定。

如图6所示，菌株JM22B6在NO₂ ^--N初始浓度为14-280mg/L的范围条件下，对亚硝态氮的脱除率均在80.0％以上，由此说明，菌株JM22B6能够在浓度范围较广的亚硝态氮浓度条件下进行生长和脱氮，其在低浓度和高浓度亚硝态氮污染的废水脱氮处理上具有很大的应用潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种好氧反硝化菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1375

<212> DNA

<213> 假单胞菌JM22B6(Pseudomonas sp. JM22B6)

<220>

<223> 16S rRNA序列

<400> 1

agtcgagcgg atgaagggag cttgctctct gattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct 60

aggaatctgc ctggtagtgg gggataacgt tccgaaagga acgctaatac cgcatacgtc 120

ctacgggaga aagcggggga tcttcggacc tcgcgctatc agatgagcct aggtcggatt 180

agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg 240

atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300

attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga 360

ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg tgttcggcta atatctgagt attttgacgt 420

taccgacaga ataagcaccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggtgc 480

aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcgcgtagg tggttcgtta agttggatgt 540

gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca tccaaaactg gcgagctaga gtacggtaga 600

gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg 660

cgaaggcgac cacctggact gatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 720

gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcaa ctagccgttg ggatccttga 780

gatcttagtg gcgcagctaa cgcattaagt tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 840

aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 900

gcaacgcgaa gaaccttacc tggccttgac atgctgagaa ctttccagag atggattggt 960

gccttcggga actcagacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020

tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct tgtccttagt taccagcacc tcgggtgggc 1080

actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1140

ggcccttacg gccagggcta cacacgtgct acaatggtcg gtacaaaggg ttgccaagcc 1200

gcgaggtgga gctaatccca taaaaccgat cgtagtccgg atcgcagtct gcaactcgac 1260

tgcgtgaagt cggaatcgct agtaatcgtg aatcagaatg tcacggtgaa tacgttcccg 1320

ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gctccagaaa gtaag 1375

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 27F

<400> 2

agagtttgat catggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1492R

<400> 3

tacggttacc ttgttacgac tt 22

Claims (7)

1.一种好氧反硝化菌，其特征在于：命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)JM22B6，其于2020年9月20日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:61212。

2.一种具有脱氮功能的活菌制剂，其特征在于：含有权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)JM22B6。

3.权利要求1所述的好氧反硝化菌或权利要求2所述的具有脱氮功能的活菌制剂在水体脱氮处理中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的氮包括但不限于硝态氮、亚硝态氮或铵态氮。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述的脱氮的方式为好氧反硝化。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述的水体是氮含量超标的废水。

7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述的水体的亚硝态氮浓度为14～280mg/L。

Images