CN112625928B - 一株能增加酒类酿造香气的葡萄汁有孢汉逊酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能增加酒类酿造香气的葡萄汁有孢汉逊酵母菌株，属于生物工程技术领域。该葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)JNB‑HB‑66于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21227。该葡萄汁有孢汉逊酵母能够产β‑葡萄糖苷酶并且发酵过程中不产酒精不产气。在山楂酒酿造过程中，与酿酒酵母BCS103混菌发酵促进果香酯类物质的发生，增加了山楂酒中的温带水果香气，使山楂酒发酵后的风味更为丰富。该葡萄汁有孢汉逊酵母有望添加到其他食品饮料的生产中以丰富风味物质增加香气。

Description

一株能增加酒类酿造香气的葡萄汁有孢汉逊酵母菌株

技术领域

本发明涉及一株能增加酒类酿造香气的葡萄汁有孢汉逊酵母菌株，属于生物工程技术领域。

背景技术

在果酒工业化生产中,优良产香酵母菌株的筛选至关重要。食品工业中使用的植物材料中含有的与葡萄糖结合的香味比游离的香味多5倍，这使得这些结合的香味成为香料潜力。β-葡萄糖苷酶能增加酒类和果汁产品中的风味物质含量，更明显的β-葡糖苷酶活性主要存在于非酿酒酵母中。非酿酒酵母菌和酿酒酵母菌的最大区别就是非酿酒酵母菌具有产多种胞外水解酶的能力。这些酶可以加速酒的澄清和过滤、利于果汁色素的浸提以及芳香物质的释放和酒体的稳定性。非酿酒酵母存在于酒精发酵初期2-3天，随后便由于乙醇毒性消亡。近年来，β-葡萄糖苷酶的研究势头有增无减，除对其微生物体进行研究外，还扩展到其他领域，如食品增香、果酒增香等。当不易挥发的香味或苷元从糖分子中释放出来时可以促进果酒的香味，这种释放可以通过酸性水解或酶解发生。酸性水解在极低的pH值下发生，并导致糖苷元重排。β-葡萄糖苷酶与萜烯类香气前驱体有密切关系，使糖苷键合态变成游离态，所以β-葡萄糖苷酶的酶解是释放糖苷元的首选工业策略。

葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)在分类学上属于真核生物原界，真菌界，子囊菌门，酵母亚门，酵母纲，酵母目，酵母科，有孢汉逊酵母属。其在WL固体培养基中的菌落形态光滑、扁平状，并带有透明环。葡萄汁有孢汉逊酵母采用YPD培养基浓缩菌悬液形式培养接种。发酵温度控制在18～20℃，待相对密度低于0.996，残糖含量低于4g/L时，终止发酵。葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母混菌发酵，可以促进一些果香酯类物质的发生，增加葡萄酒中的温带水果香气。并且在玫瑰香葡萄酒增香方面具有一定的优势，可以增加玫瑰香葡萄特征香气的含量，例如2-苯乙醇、单萜醇等。葡萄汁有孢汉逊酵母菌株具有一定的酿酒环境耐受性，且不产硫化氢，混合发酵可调节果酒风味物质的种类和含量，因此具有一定的应用潜能。

发明内容

本发明提供了一种增加酒类香气的方法，并将其应用于山楂酒发酵中，以增加山楂酒独特的风味。

本发明的第一个目的是提供一株葡萄汁有孢汉逊酵母菌株(Hanseniasporauvarum)JNB-HB-66，已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21227，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的第二个目的是提供一种增加酒类酿造香气的方法。

在一种实施方式中，所述方法是将葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66用于酒类酿造。

在一种实施方式中，所述方法还将酿酒酵母(Saccharomyces bayanus)BCS103用于酒类酿造。

在一种实施方式中，所述方法是葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103同时添加、葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66添加后间隔2天添加酿酒酵母BCS103或葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66添加后间隔4天添加酿酒酵母BCS103。

在一种实施方式中，所述方法是葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103同时添加。

在一种实施方式中，所述方法是葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103的接种数量比为3:1、1:1或1:3。

在一种实施方式中，所述方法是葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103的接种数量比为1:1。

在一种实施方式中，所述方法是将葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103的菌种活化培养成种子液，调整种子液浓度不小于5×10⁸CFU/mL，以6％(v/v)接种总量接种于酒类酿造原料中，20-30℃，培养5-10天。

本发明的第三个目的是提供含有所述葡萄汁有孢汉逊酵母的微生物菌剂。

在一种实施方式中，所述微生物菌剂含有菌浓不小于5×10⁸CFU/mL葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66。

在一种实施方式中，所述微生物菌剂含有菌浓不小于5×10⁸CFU/mL酿酒酵母BCS103。

在一种实施方式中，所述微生物菌剂葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103菌浓相同。

本发明的第三个目的是提供上述葡萄汁有孢汉逊酵母菌株在山楂酒发酵中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是提高山楂酒中的风味物质种类。

在一种实施方式中，所述风味物质包括但不限于丙酸乙酯、乙酸异丁酯、反-2-庚烯醛、1，3-二叔丁基苯、乙酸苏合香酯十二醛。

本发明的第四个目的是提供上述葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66或微生物菌剂在增加食品或饮品风味的应用。

本发明的第五个目的是提供所述增加酒类酿造香气的方法在酿酒领域的应用。

有益效果

本发明的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)JNB-HB-66CGMCCNo.21227与其他非酿酒酵母相比能够产β-葡萄糖苷酶并且发酵过程中不产酒精不产气，有助于延长其自身在发酵过程中的寿命，从而使得香气成分更加丰富持久；在山楂酒酿造过程中，与酿酒酵母BCS103混菌发酵可以促进果香酯类物质的发生。同时，与酿酒酵母(Saccharomyces bayanus)BCS103单独发酵相比，混菌发酵产物分析发现乙酸乙酯相对含量提高了8倍，乙酸异戊酯相对含量提高了3倍，己酸乙酯相对含量提高了3倍，辛酸乙酯相对含量提高了5倍。增加了山楂酒中的温带水果香气，使山楂酒发酵后的风味更为丰富。

生物材料保藏

葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)JNB-HB-66，分类命名为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)；已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21227，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为菌株葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66号的菌株形态。

图2为菌株葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66号的系统发育树。

图3为酒醅样品七叶苷显色结果。

图4为菌株产气情况分类图。

图5为山楂酒混菌发酵过程中的二氧化碳失重图；从上到下依次为：同时接种非酿酒酵母和BCS103，间隔2d接种非酿酒酵母和BCS103，间隔4d接种非酿酒酵母和BCS103。

具体实施方式

WL培养基(g/L)：酵母浸粉：4.0g，酪胨：5.0g，葡萄糖：50.0g，磷酸二氢钾：0.55g，氯化钾：0.425g，氯化钙：0.125g，硫酸镁：0.125g，氯化铁：0.0025g，硫酸锰：0.0025g，溴甲酚绿：0.022g，pH5.5±0.2(25℃)。

YPD液体培养基(g/L)：葡萄糖20.0g，蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g。

YPD培养基平板(g/L)：葡萄糖20.0g，蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g，琼脂粉20.0g。

TTC底层培养基(g/L)：葡萄糖50.5，蛋白胨10.0，酵母浸膏7.5，酸性磷酸钾5.0，硫酸镁2.0，柠檬酸1.35，氨苄青霉素1.0，调整pH在4.0以上，琼脂30.0。

TTC上层培养基(g/L)：葡萄糖0.5，琼脂15.0；灭菌后冷却后加入TTC 0.5。

扩增培养基：葡萄糖10.0％，蛋白胨5.0％，K₂HPO₄1.0％，MgSO₄0.5％，pH 7.2。

发酵培养基：蛋白胨2.0％，酵母浸粉1.0％，硝酸铵(NH₄NO₃)0.3％，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.4％，葡萄糖2.0％，蒸馏水配制，121℃灭菌25min。在温度降到60～70℃左右加入0.1％p-NPG。

50％糖水(g/L)：白砂糖500g。

实施例1筛选高产β－葡萄糖苷酶的葡萄汁有孢汉逊酵母菌株

(1)七叶苷高通量初步筛选β-葡萄糖苷酶产生菌

种子培养液的制备：先将白酒酒醅样品于28℃富集培养48h，然后进行浓度梯度稀释，每个梯度做三组平行。取适量稀释液涂布于添加氨苄的平板，置于28℃培养箱培养2～3d。根据形态学特征选取生长力较好且具有代表性的菌株加入YPD液体培养基中28℃过夜培养。

七叶苷显色反应：将50μL种子培养液接种到1mL七叶苷中，28℃培养箱培养72h。初步判定菌株的产酶能力，选取显色程度为最高酶活性(深黑色)、高酶活性(黑色)和中酶活性(深灰色)的菌株进行下一步的酶活测定。初步筛选到90株β-葡萄糖苷酶产生菌。七叶苷高通量筛选结果如图3所示。

(2)对硝基苯基葡萄糖苷(p-NPG)水解法复筛

提取粗酶液：将(1)中初步筛选获得的90株β-葡萄糖苷酶产生菌活化，活化后的菌液以5％(v/v)的接种量接种于扩增培养基中，28℃、180rpm培养72h得到扩培液。将扩培液以10％(v/v)的接种量接种到发酵培养基中，28℃、180rpm培养72h后获取发酵液。量取发酵液，8000rpm离心8min，取上清液，即为糖苷酶粗酶液，4℃条件下保存。

测定酶活性：将100μL糖苷酶粗酶液、375μL柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 5.0)和125μL1mmol/L的p-NPG混合均匀，40℃水浴30min后立即加入0.5mL的1mol/LNa₂CO₃终止反应。使用酶标仪在波长400nm处测定吸光值。根据标准曲线计算β-葡萄糖苷酶活性。

表1菌株β-葡萄糖苷酶活性结果

实施例2筛选发酵过程中不产气的葡萄汁有孢汉逊酵母

杜氏小管产气：配制YPD液体培养基1L，分装到90个试管中，每个试管中分装10mL，并加入杜氏小管进行灭菌。无菌条件下在每个试管中加入500μL的50％糖水，同时再将实施例1步骤(1)初步筛选到的90株菌株活化后以5％(v/v)的接种量接入。在28℃培养箱静置培养24h，观察各菌株的产气情况，挑选出不产气的菌株。(图4)

表2菌株杜氏小管产气结果

实施例3筛选发酵过程中不产酒精的葡萄汁有孢汉逊酵母

TTC平板显色：将实施例1步骤(1)中初步筛选到的90株菌株活化，选取适量的菌液点涂到TTC底层培养基上，28℃倒置培养2d。之后在长有菌落的平板上层再倒入TTC上层培养基，28℃避光培养2～3h，观察显色反应。结果见表2。

表3菌株的TTC显色程度分类

实施例4发酵产物闻香实验

对实施例1步骤(1)中初步筛选到的90株菌株在桃汁和梨汁中分别发酵产生的香气进行了闻香实验，部分结果如下表所示。

表4菌株在梨汁与桃汁发酵中的香气特点

实施例5葡萄汁有孢汉逊酵母的生物学鉴定

步骤1：种子培养液的制备：综合实施例1～4各项指标，选出16株菌株进行菌种鉴定。将这16株菌以2％(v/v)接种量接种于YPD液体培养基中活化，28℃、180rpm培养24h得到种子培养液。

步骤2：取适量培养液离心1min(12000rpm，4℃)，弃尽上清液，得到适量菌体(菌总数约为10⁷cfu/mL)，用天根酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。用酵母ITS通用引物对正向引物ITS1、反向引物ITS4扩增基因组DNA。PCR反应条件为：94℃预变性5min后进入以下循环：94℃变性45s，55℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。产物送往天霖生物科技有限公司测序。

步骤3：进行测序比对，测序结果显示66号菌株的16S rDNA序列与NCBI中的Hanseniaspora uvarum MN371863.1同源性最高，相似度达99.72％。系统发育树见图2，确定所筛选得到的酵母在分类学上属于葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum酵母，将其命名为Hanseniaspora uvarum JNB-HB-66，并保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21227。在平板上菌落形态如图1所示，菌落为乳白色，表面光滑，湿润，粘稠，易挑起，菌落大小适中。

实施例6葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66与酿酒酵母BCS103混菌发酵在山楂酒中应用

葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66与酿酒酵母BCS103不同接种比例、接种间隔时间混种发酵，总接种量为6％(v/v)。

步骤1：挑取菌株JNB-HB-66接种于10mLYPD液体培养基，28℃培养24h培养成种子培养液。挑取菌株BCS103接种于10mLYPD液体培养基，28℃培养24h培养成种子培养液。

步骤2：调整两菌种浓度为5×10⁸CFU/mL，JNB-HB-66与BCS103按接种比例3:1、1:1或1:3；接种时间为同时接种、间隔2d或间隔4d。其中空白对照组为BCS103单独发酵。种子培养液以6％(v/v)接种总量接种于装有200mL山楂汁250mL三角瓶中。控制发酵温度为25℃，发酵8d。

步骤3：进行二氧化碳失重的测定，

二氧化碳失重测定方式：接菌之后先测定每个发酵三角瓶的初始重量，之后每隔24h再测定一次重量，每天观察失重克数，直到最后一天与前一天相比失重克数小于0.5g则意味着发酵完成。将每天的发酵失重克数列表，做出二氧化碳失重曲线图(图5)。

表5酵母菌混种发酵实验结果(JNB-HB-66与BCS103)

根据表5显示，葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66与酿酒酵母BCS103的最适发酵方式为同时接种，该发酵方式下二氧化碳第一天失重克数最大，达到2.29g。

步骤4：发酵产物成分分析。

分别对单独接种BCS103菌株和同时接种JNB-HB-66与BCS103菌株且接种比例为1:1的发酵产物进行分析，分析方法采用GC-MS技术检测山楂酒中的风味物质。

由BCS103菌株单独发酵山楂酒的风味物质分析以及JNB-HB-66与BCS103混菌发酵山楂酒的风味物质分析可知，混菌发酵新增了一些风味物质，这些物质对增加山楂酒香气的贡献很大，结果如下表所示，比如相对含量0.03％的丙酸乙酯(菠萝香味)、相对含量0.02％的乙酸异丁酯(成熟水果香味)、相对含量0.02％的反-2-庚烯醛(青草香气)、相对含量0.03％的1，3-二叔丁基苯(芳香气味)、相对含量0.11％的乙酸苏合香酯(强烈的绿叶以及栀子花香)和相对含量0.02％的十二醛(松叶油和橙油的强烈香气)；同时，乙酸乙酯相对含量提高了8倍，乙酸异戊酯相对含量提高了3倍，己酸乙酯相对含量提高了3倍，辛酸乙酯相对含量提高了5倍。这些气味使得山楂酒的风味层次增多，构建了山楂酒特征风味，对于增加酒体香气的平衡性、复杂性和典型性具有重要的作用。

表6发酵产物成分分析

对比例1：

表7酵母菌混种发酵实验结果(阿氏丝孢酵母与BCS103)

具体实施方式同实施例6，区别在于选择6号(阿氏丝孢酵母)与BCS103混合发酵，根据表7结果显示，发酵速度整体都较葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum JNB-HB-66相比慢了28％(图5)。

对比例2：

表8酵母菌混种发酵实验结果(戴尔凯氏有孢圆酵母与BCS103)

具体实施方式同实施例6，区别在于选择17号(戴尔凯氏有孢圆酵母)与BCS103混合发酵，根据表8结果显示，发酵速度较葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum JNB-HB-66相比慢了27.5％(图5)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）JNB-HB-66，已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 21227。

2.一种增加酒类酿造香气的方法，其特征在于，将权利要求1所述葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66用于酒类酿造。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，酒类酿造过程中还添加酿酒酵母BCS103。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103同时添加、葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66添加后间隔2天添加酿酒酵母BCS103或葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66添加后间隔4天添加酿酒酵母BCS103。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103同时添加。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103接种数量比为3:1、1:1或1:3。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和酿酒酵母BCS103的菌种活化培养成浓度不小于5×10⁸ CFU/mL的种子液，再接种于酒类酿造原料中，20-30℃，培养5-10天。

8.一种微生物菌剂，其特征在于，含有菌浓度不小于5×10⁸ CFU/mL的权利要求1所述的葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66和菌浓度不小于5×10⁸ CFU/mL酿酒酵母BCS103。

9.权利要求1所述的葡萄汁有孢汉逊酵母JNB-HB-66或权利要求8所述微生物菌剂在增加食品或饮品风味中的应用。

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