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CN112501130A - 抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备方法和应用 - Google Patents

抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备方法和应用 Download PDF

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CN112501130A
CN112501130A CN202011478707.5A CN202011478707A CN112501130A CN 112501130 A CN112501130 A CN 112501130A CN 202011478707 A CN202011478707 A CN 202011478707A CN 112501130 A CN112501130 A CN 112501130A
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Abstract

本发明公开了一种抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备方法和应用。所述杂交瘤细胞株2B2D7于2020年8月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2020134。本发明能够特异性分选到罗非鱼的CD3ε+T淋巴细胞群，为罗非鱼适应性免疫机制研究提供重要的免疫学工具。

Description

抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备方法 和应用
技术领域
本发明属于鱼类免疫学领域，具体涉及一种分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B2D7、单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
T淋巴细胞作为适应性免疫应答的主要执行者，发挥细胞免疫及免疫调节等功能，并对体内细菌、病毒等多种病原微生物的感染进行清除。T细胞表面糖蛋白CD3是一种成熟T细胞标志性的分化抗原，在T细胞的发育、激活及执行免疫功能等方面发挥着重要作用。CD3主要有γ、δ、ε、ζ和η链五条链，其中CD3ε链主要接受抗原刺激信号以及介导免疫信号的传递。CD3ε包含1个Ig样(免疫球蛋白样)结构域和1个ITAM结构域，能够与CD3γ、CD3δ和CD3ζ以及T细胞受体α/β和γ/δ异二聚体一起形成TCR-CD3复合物。TCR-CD3复合物的CD3亚单位包含两个确定的信号域，富含脯氨酸的序列和免疫酪氨酸活化基序(ITAMs)。在接受抗原刺激后，作为TCR的共受体，CD3ε复合物的ITAMs中的酪氨酸残基被下游LCK磷酸化，并募集ZAP70结合到CD3ε上后，T细胞活化衔接因子LAT被磷酸化，招募多个衔接因子和效应分子(如SLP76、PLCγ1等)，形成LAT信号传导复合物，从而介导下游信号通路的激活，包括mTOR、CaM、MAPK和NF-κB信号通路等。
在硬骨鱼中，早已克隆到CD3ε分子。硬骨鱼CD3ε同样包含着一个Ig结构域和ITAM活化基序，这提示我们硬骨鱼CD3ε作为T细胞的特异性分子标志的潜在可能以及在适应性免疫应答中的决定地位。然而，缺乏针对硬骨鱼类的抗体工具使得对硬骨鱼T细胞免疫机制的研究进展缓慢。由于跨膜蛋白的复杂性，目前仍然难以表达出大量保留完整天然结构和原有功能的蛋白，这使得传统单克隆抗体制备方法难以应用到T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备过程中。
近年来，罗非鱼(包括尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus)作为重要的淡水养殖经济鱼类，在中国乃至全球水产养殖业中的重要性日益显著，然而随着养殖规模的不断扩大，疾病所造成的危害也越来越突出，严重影响我国罗非鱼养殖产业的发展。对于罗非鱼免疫机制的研究迫在眉睫。因此，制备尼罗罗非鱼CD3ε单克隆抗体，探究T细胞介导的适应性免疫应答机制，对于鱼病防治，疫苗开发以及填补硬骨鱼适应性免疫进化研究具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明针对上述现有技术中的缺陷，提供了一株能够稳定分泌抗罗非鱼CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B2D7、单克隆抗体及其制备方法和应用，使其能够特异性识别到罗非鱼的T淋巴细胞群，为硬骨鱼的适应性免疫机制研究提供重要的免疫学工具。
本发明为解决上述技术问题所提供的技术方案如下：
一方面，提供了一株分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B2D7，且所述杂交瘤细胞株2B2D7于2020年8月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2020134。
还提供了一种上述杂交瘤细胞株2B2D7的制备方法，其括如下步骤：
采用包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的逆转录病毒对细胞进行感染；
将感染后的细胞作为抗原进行动物免疫；
动物免疫后进行细胞融合、细胞筛选和克隆，以获得所述杂交瘤细胞株2B2D7。
优选的，包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的逆转录病毒的制备过程包括：采用包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的质粒对细胞进行转染，以获得含有逆转录病毒的上清。
优选的，所述细胞包括BOSC细胞。
优选的，采用包含有尼罗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的病毒对NIH/3T3细胞进行转染。
还提供一种上述杂交瘤细胞株2B2D7分泌的抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体。
还提供一种上述单克隆抗体的制备方法，其包括如下步骤：
腹水制备：取小鼠，腹腔注射无菌石蜡油；
取权利要求1中所述的杂交瘤细胞株2B2D7进行重悬，然后对小鼠进行腹腔注射；
处死小鼠，采集腹水并离心，分装保存；
对腹水进行纯化，以获得所述抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体。
还提供一种上述单克隆抗体在硬骨鱼适应性免疫应答研究中的应用。
还提供一种上述单克隆抗体在特异性识别硬骨鱼的CD3ε蛋白中的应用。
还提供一种上述单克隆抗体在激活硬骨鱼T淋巴细胞中的应用。
还提供一种上述单克隆抗体在制备鱼病防治试剂/药物中的应用。
优选的，所述鱼病防治试剂/药物包括鱼病防治疫苗。
本发明首次采用逆转录病毒的方法将完整的尼罗罗非鱼CD3ε基因片段插入小鼠同源细胞系NIH/3T3，使得该细胞系在细胞表面上能够表达尼罗罗非鱼CD3ε蛋白，该蛋白最大程度的还原了天然状态下的活性尼罗罗非鱼CD3ε蛋白；并建立起由流式细胞术、间接免疫荧光法和半定量相结合的筛选系统，由此成功制备抗尼罗罗非鱼CD3ε的单克隆抗体，且充分保证了该单克隆抗体的特异性，为后续研究T淋巴细胞在硬骨鱼适应性免疫应答中的作用和机制提供了重要工具。
附图说明
图1为荧光显微镜、流式分析以及免疫荧光检测下NIH/3T3细胞的感染效果图；
图2为检测2B2D7孔内融合细胞培养上清与尼罗罗非鱼脾脏白细胞特异性结合的流式分析结果；
图3为荧光显微镜下单克隆抗体与尼罗罗非鱼淋巴细胞上的CD3ε蛋白特异性结合结果图；
图4为CD3ε+细胞群和CD3ε-细胞群中各类群细胞特异性表达基因的琼脂糖电泳结果图；
图5为感染前后CD3ε+T淋巴细胞的流式分析结果；
图6为脾脏白细胞、外周血白细胞、肠道白细胞、胸腺中CD3ε+细胞的流式分析结果；
图7为单克隆抗体在体外刺激T淋巴细胞后，S6、NF-κB p65和Erk1/2的磷酸化和总蛋白表达水平结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供了一株分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B2D7，所述杂交瘤细胞株2B2D7于2020年8月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2020134。且其中所述罗非鱼为尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)。
进一步的，上述杂交瘤细胞株2B2D7的制备方法包括如下步骤：
尼罗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因克隆：
①提取尼罗罗非鱼白细胞总RNA，选取质量合格的RNA逆转录合成cDNA模板备用；
②设计用于PCR扩增的引物对组，该引物对组包括：正向引物F1以及反向引物R1，其中，正向引物F1序列为CCGAAGATCTGCCACCATGCTCAGCATGGGTGTC(即SEQ ID NO.1所示核苷酸序列)，反向引物R1序列为CGGAATTCCTATCCCATCCTGTTGACC(即SEQ ID NO.2所示核苷酸序列)，配制扩增反应体系，按程序扩增得到扩增产物，并对扩增产物进行胶回收，所得回收产物即为分离的尼罗罗非鱼CD3ε基因(以下为“CD3ε基因”)；“分离的”是指，该基因已从天然状态下位于其两侧的DNA序列中分离出来，以及，指该基因已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中与其伴随的蛋白质分开；
本步骤中，扩增反应体系为30-50μL，按体积计，包括4-5％正向引物F1，4-5％反向引物R1，45-50％2×PrimerSTAR DNA Polymerase，4-5％cDNA模板，剩余为dH2O；
扩增程序：95-98℃、10-12s，55-58℃、10-15s，70-75℃、8-10s，32-40个循环；再加入1μLrTaq后72℃下保温20min；
扩增得到的尼罗罗非鱼CD3ε基因片段序列如SEQ ID NO.3所示，且所述序列与奥利亚罗非鱼Oreochromis aureusCD3ε序列同源性为90.17％，与伯氏朴丽鱼同源性Haplochromisb urtoni为87.59％，与斑马拟丽鱼Maylandia zebra同源性为87.43％。
尼罗罗非鱼CD3ε基因表达载体构建：
①取4.5μL回收产物与载体连接体系(0.5μL PMD19T vector，5μL solutionⅠ)混合，12-18℃下连接10-15h，以获得第一连接体系；
②将10μL的第一连接体系加入到50μL DH5α感受态细胞中，冰上转化30min后，42℃水浴45s并置于冰上2min；
③加入200-400μL新鲜的LB液体培养基，37℃恒温震荡培养1h；取50-200μL悬液涂布培养在含有氨苄抗性的LB固体培养基中，37℃恒温培养过夜；
④挑选阳性单克隆菌测序后，提取包含CD3ε基因的PMD19T质粒(即CD3ε-PMD19T质粒)，同时将CD3ε-PMD19T质粒和pMIGR1空质粒各取1μg分别加入双酶切体系(包含1μLBglⅡ，1μLEcoRⅠ，4μL 3.1buffer，dH2O补齐至40μL)，37℃酶切4h，对应获得两种酶切产物；
⑤两种酶切产物各取4.5μL与DNA连接体系(1μL T4 DNA Ligase，1μL T4 DNALigase Buffer)混合，15-18℃下连接10-12h，以获得第二连接体系；
⑥将第二连接体系加入50-100μL DH5α感受态细胞中，冰上转化30min，在42℃水浴热激40-45s，冰上放置2min，加入300-500μL新鲜的LB培养基，振荡培养1h；
⑦取50-200μL菌液涂布培养到含有氨苄抗性的LB固体培养基中，培养过夜，次日挑取阳性单克隆菌株；
⑧对阳性单克隆菌株进行扩大培养，再进行质粒提取，以获得包含CD3ε基因的逆转录病毒表达载体(即pMIGR1-CD3ε质粒)。
逆转录病毒制备：
①从液氮中取出冻存的BOSC细胞，解冻后进行细胞复苏和细胞传代，以获得BOSC传代细胞；BOSC细胞传代次数为1-3次；
②取500μL胰酶，于37℃下消化BOSC传代细胞，再用5mL DMEM培养基重悬细胞，1000rpm下离心3min，弃上清，得消化后的BOSC细胞沉淀，再将所得到的消化后的BOSC细胞沉淀用DMEM培养基重悬并计数，并在每个60mm培养板(dish)上接种2×106-2.5×106个消化后的BOSC细胞，以完成细胞种板；
③待培养板(dish)上培养的BOSC细胞汇合度达到75-85％左右时，弃掉培养上清，缓慢加入3mL含有25μM氯喹的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)，放入37℃培养箱中；
④在EP管中加入3μg逆转录病毒表达载体(即pMIGR1-CD3ε质粒)、1.5μgpCL-ECO质粒、30μL 2.5M CaCl2，用灭菌水将体积补至500μL，以获得混合体系；然后用玻璃管缓慢向EP管中的混合体系中吹打气泡，且吹打气泡过程中缓慢滴加500μL 2×HEBS缓冲液，以获得转染体系；
⑤将1mL的转染体系混匀后逐滴均匀加入细胞培养皿中，轻轻晃匀，以进行转染；
⑥转染8h后弃去上清，缓慢加入3mL DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)，并定期更换DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)1-2次；
⑦最后一次更换DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)的12h后收集上清，将该上清于1200rpm下离心5-10min，收集含有逆转录病毒的上清(即逆转录病毒悬液)，并分装保存于-80℃。
NIH/3T3细胞感染：
①从液氮中取出冻存的NIH/3T3细胞，解冻后进行细胞复苏和细胞传代，以获得NIH/3T3传代细胞；NIH/3T3细胞传代次数为1-3次；
②取500μL胰酶，于37℃下消化NIH/3T3传代细胞，再用5mL DMEM培养基重悬细胞，1000rpm下离心3min，弃上清，得消化后的NIH/3T3细胞沉淀，再将所得到的消化后的NIH/3T3细胞沉淀用DMEM培养基重悬并计数，并在每个100mm培养板(dish)上接种5.5×105-6×105个消化后的NIH/3T3细胞，以完成细胞种板；
③待培养板(dish)上培养的NIH/3T3细胞汇合度达到45-55％左右时，弃掉培养上清，缓慢加入5-10mL含有5μM聚凝胺(polybrene)的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)；
④每个培养板中加入550-650μL逆转录病毒悬液，轻轻混匀，放入37℃培养箱中培养，以完成NIH/3T3细胞感染；
⑤逆转录病毒感染4h后加入1-2mL不含聚凝胺(polybrene)的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)，混匀，以终止聚凝胺(polybrene)的作用，再定期更换成不含聚凝胺(polybrene)的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)1-2次；
⑥最后一次更换不含聚凝胺(polybrene)的DMEM培养基(1％双抗，10％FBS)的48h后离心，收集细胞沉淀，用500μL胰酶37℃消化所述细胞沉淀1min；再用5mL DMEM培养基重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清，将所得细胞沉淀用10mL PBS重悬，1000rpm离心3min，重复一次，最后用200μL PBS重悬细胞，以获得转染后的NIH/3T3细胞。
如图1所示，分别通过荧光显微镜、流式分析以及免疫荧光检测细胞转染后的转染效果，其中转染细胞在荧光显微镜下呈现绿色的阳性反应，表明转染后的NIH/3T3细胞在细胞表面上能够表达尼罗罗非鱼CD3ε蛋白；
动物免疫：
将转染后的NIH/3T3细胞作为抗原，采用腹腔注射的方式对动物进行免疫(所述动物包括小鼠)，每次的免疫剂量为107-2×107细胞/动物，免疫共分4次进行，前2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为1周。
细胞融合：
①动物免疫完成3天后脱颈椎处死动物，取出胸腺和脾脏，分别制备胸腺细胞悬液和脾脏细胞悬液；
②融合前一周复苏SP2细胞，融合前一天取适宜密度的SP2细胞传代到培养瓶中；融合时用10mL RPMI-1640(-)用力吹下SP2细胞；将脾脏细胞悬液与SP2脾细胞悬液以体积比10:1在离心管中混合均匀，1200rpm离心8min，弃去上清，并将两种细胞沉淀充分混匀成糊状；
③将装有已混匀成糊状的两种细胞沉淀的离心管管底置于37℃水浴预温的盛水烧杯中保温；吸取预热到37℃的PEG液l mL，在90s内均匀、缓慢、且全部滴加至所述离心管中，然后在水浴中静置90s；
④继续向所述离心管中分3-5次滴加已经预热到37℃的RPMI-1640(-)液10-15mL，使PEG稀释而失去作用；再补加RPMI1640(-)液至30-50mL，800rpm离心5-8min，弃去上清，得细胞沉淀；
⑤3mlGIT细胞培养液重悬上一步(即④)中所得细胞沉淀，得细胞重悬液，并冻存部分；且在剩余细胞重悬液中加入胸腺细胞悬液，混合均匀后获得融合细胞体系，再按照100μL/孔将融合细胞体系滴加到细胞培养孔板(如96孔板等)的孔中；
⑥将所述孔板放入37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养，培养过程中，在倒置显微镜下观察细胞生长状况，且待融合细胞长满1/3孔板时，离心收集融合细胞上清备用；
在倒置显微镜下观察发现，融合细胞生长状态良好、分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好，且具备无限分裂增生能力；
融合细胞筛选和克隆：
采用流式细胞术对融合细胞进行检测筛选，具体包括如下步骤：
①取健康尼罗罗非鱼的脾脏，清洗、研磨、过200目筛绢，2000rpm离心5min，弃去上清，得细胞沉淀，用L15培养基重悬所得的细胞沉淀，并添加到percoll分离液(4mL 52％percoll+4mL 34％percoll)上，于500g，23℃下离心35min，取中间的白色环状层细胞，经L15培养基清洗后即得到白细胞；
②用FACS Buffer(PBS,2％FBS)重悬白细胞，得白细胞悬液，且在细胞培养孔板的孔中按照100μL/孔添加白细胞悬液，培养预定时间后收集白细胞悬液，2500rpm离心3min，弃去上清，得白细胞沉淀；
③在白细胞沉淀中加入已收集的融合细胞上清作为一抗体系，室温下孵育30min，对照孔加入SP2细胞培养上清；将完成孵育的一抗体系于2500rpm下离心3min，弃去上清，得细胞沉淀，再用FACS Buffer清洗所得细胞沉淀两次；
④在细胞培养孔板的孔中按照50μL/孔添加Goat Anti-Mouse IgG H&L(AlexaFluor 647)(1:2000)荧光二抗，冰上避光孵育30min；
⑤将上述④中完成孵育的二抗体系于2500rpm下离心3min，弃去上清；取200μLFACS Buffer重悬上述③中再次清洗后的一抗细胞沉淀，再次离心，所得细胞沉淀重复清洗一次；按200μL FACS Buffer/孔将细胞沉淀重悬，并采用流式细胞术筛选出阳性孔；
如图2所示，流式分析结果表明：检测到2B2D7孔细胞分群明显，表明该孔融合细胞能够分泌抗体，并且此抗体能够识别某一类群细胞表面的蛋白；
对阳性孔内融合细胞进行克隆，其具体包括如下步骤：
①脱颈椎处死小鼠，无菌条件下取出胸腺，在200目网筛上研磨，并用RPMI-1640溶液吹打形成胸腺细胞悬液；
②将上述胸腺细胞悬液于1000rpm下离心5min，去上清，再用预热的GIT培养液重悬；
③把阳性孔中的细胞用血球记数板记数，然后用培养液以10倍梯度稀释，取出100个融合细胞，并放入胸腺细胞悬液中，用滴管吹打均匀，再按照100μL/孔滴加到96孔板等细胞培养孔板的孔中；再放入37℃的CO2培养箱中培养；
④待克隆后的融合细胞长至1/3孔满，收集上清，通过流式细胞术检测各孔细胞培养上清，检测出的阳性孔内的细胞即为杂交瘤细胞株2B2D7，且如图2所示，检测得知CD3ε阳性细胞群占淋巴细胞群总数的31.2％左右，说明该杂交瘤细胞株2B2D7分泌的单克隆抗体能够识别并结合到尼罗罗非鱼的T淋巴细胞群；再对所述杂交瘤细胞株2B2D7冻存备用。
实施例2：
本实施例提供了一种实施例1中所得杂交瘤细胞株2B2D7分泌的抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体，且所述单克隆抗体的制备过程包括如下步骤：
腹水制备：取10周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射500μL无菌石蜡油；10天后，取生长状态良好的杂交瘤细胞株2B2D7，PBS洗掉培养基，300μL无菌PBS重悬细胞，每只小鼠腹腔注射2×105个细胞；每天观察免疫小鼠，待小鼠腹部隆起，行动不便时脱颈椎处死免疫小鼠，并采集腹水；将腹水2000rpm离心5min，取中间淡黄色的腹水，分装保存于-80℃。
抗体纯化：取200μLrProtein G Agarose于15mL离心管中，PBS洗三遍，再加入500μL分装保存的腹水并用PBS稀释至8mL，4℃孵育过夜；PBS清洗珠子6遍后，500μL 0.1Mglycine-HCl(pH 2.8)洗脱，以获得所述抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体，并在加入1/10体积的1M Tris-HCl(pH 8.5)中和pH值后分装保存于-80℃。
实施例3：
本实施例提供了一种实施例2中所述单克隆抗体在硬骨鱼适应性免疫应答研究中的应用。
实施例4：
本实施例提供了一种实施例2中所述单克隆抗体在特异性识别硬骨鱼的CD3ε蛋白中的应用。
实施例5：
本实施例提供了一种实施例2中所述单克隆抗体在激活硬骨鱼T淋巴细胞中的应用。
实施例6：
本实施例提供了一种实施例2中所述单克隆抗体在制备鱼病防治试剂/药物中的应用，且所述所述鱼病防治试剂/药物包括鱼病防治疫苗。
实施例2中所述单克隆抗体的间接免疫荧光法鉴定，其包括如下步骤：
取健康尼罗罗非鱼的脾脏，分离得到白细胞，用5mL PBS重悬白细胞；取适宜密度的重悬白细胞，用细胞涂片机制成细胞滴片，并经过甲醇固定5min；加入100μL 1％BSA，37℃封闭1h；PBST洗两遍，PBS洗一遍，每次5min；在孔板的孔内加入100μL实施例1中阳性孔内的杂交瘤细胞上清，对照孔用SP2细胞培养上清，37℃孵育1h；PBST洗两遍，PBS洗一遍，每次5min；加入100μL Alexa Fluor 488(1：800)荧光二抗，37℃孵育1h；PBST洗两遍，PBS洗一遍，每次5min；加一滴Hoechst 33342染料色封片剂，荧光显微镜下镜检。
结果表明，如图3所示，约有1/2的细胞在荧光显微镜下呈现绿色的阳性反应，表明杂交瘤细胞能分泌单克隆抗体，且该单克隆抗体能够与尼罗罗非鱼淋巴细胞上的CD3ε蛋白特异性结合。
实施例2中所述单克隆抗体的半定量法鉴定，其包括如下步骤：
取健康尼罗罗非鱼的脾脏，分离得到白细胞，用5mL L15培养基重悬白细胞；取100μL白细胞悬液加入到96V型孔板，2500rpm离心3min；去上清，加入实施例1中阳性孔内的杂交瘤细胞上清作为一抗，对照孔用SP2细胞培养上清，室温下孵育1h；2500rpm离心3min，弃去上清，200μL FACS Buffer(L15,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得沉淀重复清洗一次；每孔加入50μL Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor 647)(1：1000)荧光二抗，冰上避光孵育30min；2500rpm离心3min，弃去上清，200μL FACS Buffer(L15,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得沉淀重复清洗一次；分选阳性细胞群和阴性细胞群，2500rpm离心5min分别得到阳性细胞和阴性细胞，分别提取总RNA并对应反转录成cDNA模板；取定量的阳性细胞和阴性细胞的cDNA模板分别进行PCR反应，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，调整阳性和阴性细胞的β-actin一致。
如图4电泳结果所示，阳性群(即CD3ε+)中的CD3ε以及TCRβ基因表达量极高，同时B细胞特异性基因IgM和IgD未有表达，而阴性群(即CD3ε-)未有CD3ε基因表达但有极高的B细胞特异性基因的表达，表明该单克隆抗体能够特异性识别硬骨鱼(如尼罗罗非鱼)的CD3ε蛋白，准确定位到T淋巴细胞群，且能准确分选出硬骨鱼(如尼罗罗非鱼)的CD3ε阳性细胞群。
T淋巴细胞在无乳链球菌感染后细胞群变化实验，其包括如下步骤：
取健康的尼罗罗非鱼腹腔注射7×105CFU/mL的无乳链球菌，作为感染组，另外取健康状况一致的尼罗罗非鱼注射相同剂量的PBS，作为对照组；在感染第8天后分别分离感染组和对照组脾脏的白细胞；分别取2mL FACS Buffer(PBS,2％FBS)重悬感染组和对照组脾脏的白细胞，得到感染组和对照组的白细胞悬液；孔板的孔内分别加入100μL感染组和对照组的白细胞悬液，2500rpm离心3min；弃上清，每孔加入100μL实施例1中已收集的融合细胞上清作为一抗，室温下孵育1h；2500rpm离心3min，弃去上清，200μL FACS Buffer(L15,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得细胞沉淀重复清洗一次；加入50μLanti-mouse IgG GoatAnti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor 647)(1：2000)荧光二抗，冰上避光孵育30min；2500rpm离心3min，弃去上清，200μL FACS Buffer(L15,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得沉淀重复清洗一次；200μL FACS Buffer/孔将细胞重悬，进行流式检测。
如图5所示，经流式分析，在无乳链球菌感染8天后，CD3ε+T细胞在总淋巴细胞的比例从感染前的34.4％上升至感染后的83.7％，说明感染后T淋巴细胞数目急剧增加，表明感染过程中，施例2中的单克隆抗体所识别的CD3ε+T淋巴细胞参与适应性免疫应答，并在抗菌免疫过程中发挥重要作用。
T淋巴细胞在尼罗罗非鱼各组织中的分布检测，其包括如下步骤：
取一尾健康的尼罗罗非鱼，分别取外周血、脾脏、胸腺和肠的白细胞。
对于外周血，先取2mL抗凝剂(15mM柠檬酸钠,450mM NaCl,0.1M葡萄糖,10mMEDTA,pH 7.0)加入抽取的外周血中，2000rpm离心5min，弃上清，所得沉淀用3mL L15培养基重悬，得到白细胞；
对于脾脏组织，按照实施例1中方法分离脾脏白细胞；
对于肠道组织，首先充分研磨，过200目筛绢收集细胞组分，将未研磨的组织块用5mL PBS(0.37mg/mL EDTA，0.14mg、mL DTT)冰上处理30min，PBS清洗后于10mL D-PBS(0.2mg/ml Collagenase,5％FBS)室温连续震荡消化2h，收集细胞组分，将所有细胞组分汇集，于percoll密度梯度离心分离白细胞；
对于胸腺组织，直接研磨过200目筛绢，得到细胞悬液；
分别取1mL FACS buffer(PBS,2％FBS)重悬各组织的白细胞，各组织白细胞重悬液分别取100μL加入96V型孔板，2500rpm离心3min，弃上清；对应孔内加入实施例1中已收集的融合细胞上清作为一抗，对照组用SP2培养上清，室温下孵育1h；2500rpm离心3min，弃去上清，200μL FACS Buffer(L15,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得沉淀重复清洗一次；加入50μL Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor 647)(1：2000)荧光二抗/孔，冰上避光孵育30min；2500rpm离心3min，弃去上清，200μL FACS Buffer(L15,2％FBS)重悬细胞，再次离心，所得沉淀重复清洗一次；200μL FACS Buffer/孔将细胞重悬，进行流式检测。
如图6所示，脾脏白细胞、外周血白细胞、肠道白细胞、胸腺细胞中CD3ε+T淋巴细胞的占比分别为31.3％、25.4％、16.3％以及59.9％，说明实施例2中的单克隆抗体所识别的CD3ε阳性细胞广泛分布于尼罗罗非鱼的多种组织，并且其分布具有组织差异性。
实施例2中所述单克隆抗体体外激活T淋巴细胞实验，其具体包括如下步骤：
取健康尼罗罗非鱼的脾脏分离白细胞，2mL D-PBS重悬细胞沉淀并均分为4份，每份500μL置于1.5mL离心管，28℃静息30min；4管分别分为Resting、5min、15min、45min，Resting不加刺激，其他三管分别加入1μg/mL实施例2中所述纯化后的单克隆抗体，并分别刺激5min、15min、45min；刺激结束后，每管立即加入500μL预冷的D-PBS混匀终止反应，冰上放置1min；10000rpm离心1min，弃上清，每管加入40μL NP-40裂解液(1‰蛋白酶抑制剂，1‰PMSF，1％磷酸化酶抑制剂)重悬细胞，冰上裂解30min；12000rpm，4℃离心10min，取上清，加入10μL 5×SDS loading buffer，混匀后于沸水浴煮5min，得到各组样品；
将各组样品进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔加入10μL；首先保持恒定电流40mA，待样品跑至浓缩胶与分离胶分界线时将电流增大至80mA，参考预染maker位置跑至合适位置停止；
恒定电压100V下120min，样品转移至NC膜，期间转膜装置置于冰上；
将NC膜于10mL PBST含4％脱脂奶粉室温下封闭1h；
PBST清洗后将膜按照目的蛋白大小剪开，分别放入一抗溶液，4℃孵育过夜；
PBST清洗3次，每次10min；
10mL PBST含4％脱脂奶粉以1:30000加入goat-anti rabbit IgG H&Lconjugated with Alexa Fluor 790(Abcam)，室温孵育1h；
PBST清洗3次，每次10min；
使用Odyssey CLX成像系统扫描NC膜。
如图7所示，实施例2中所述单克隆抗体可在体外激活T淋巴细胞，且刺激后mTOR通路的S6、NF-κB通路的NF-κB p65和MAPK通路的Erk1/2的总蛋白水平不变，但磷酸化水平显著上调，表明实施例2中所述单克隆抗体能够有效的体外激活尼罗罗非鱼的T淋巴细胞。
综上所述，本发明首次采用逆转录病毒的方法将完整的尼罗罗非鱼CD3ε基因片段插入小鼠同源细胞系NIH/3T3，使得该细胞系在细胞表面上能够表达尼罗罗非鱼CD3ε蛋白，该蛋白最大程度的还原了天然状态下的活性尼罗罗非鱼CD3ε蛋白，并建立起由流式细胞术、间接免疫荧光法和半定量相结合的筛选系统，由此成功制备了抗尼罗罗非鱼CD3ε的单克隆抗体，且充分保证了该单克隆抗体的特异性，为后续研究淋巴细胞在硬骨鱼适应性免疫应答中的作用和机制提供了重要工具。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
序列表
<110> 华东师范大学
<120>抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备方法和应用
<160>3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CCGAAGATCTGCCACCATGCTCAGCATGGGTGTC 32
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CGGAATTCCTATCCCATCCTGTTGACC 27
<210> 3
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ATGCTCAGCATGGGTGTCCAGGCCGTGCTCGTCGTCGTCCTCCTCGGCGTTGCTACCACGAAGGCTGAGGAGCCTGAAGACAAAGTGAAAATCTGGAGGACCAAAGTGACACTGACCTGTCCAGAAAAGGGGAATTGGTTTAAGCATAGTGAACGCCTCTTGAATAACAGTGATGTGGTGTATGCATTCACATATACCAGTAAAGGCACATACAGATGTGAATATGGCTCTGAGCAAAAATCTAAATATTATTTCCATGTTGAAGGAAATGTGTGTGAGGACTGCTTTGAGCTCGAAGGAAGCACATTGTTTATGGTCATCGTCGGGGACTTACTCCTGACAATAATTATGATGGTCATAGTCTACAGGTGCACTAACAAGAAAAGCTCAGCTGGACCTCCTCAACCTTCCAAAGCACCTCCTCGCTCTGGAGGCCGGGGTCCACCTGTCCCGTCTCCTGACTATGAGGCACTGAACCCTCAAACTCGGGCCCAGGACACTTACTCCATGGTCAACAGGATGGGATAG528

Claims (12)

1.一株分泌抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B2D7，其特征在于，所述杂交瘤细胞株2B2D7于2020年8月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2020134。
2.一种权利要求1所述杂交瘤细胞株2B2D7的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的逆转录病毒对细胞进行感染；
将感染后的细胞作为抗原进行动物免疫；
动物免疫后进行细胞融合、细胞筛选和克隆，以获得所述杂交瘤细胞株2B2D7。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的逆转录病毒的制备过程包括：采用包含有罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的质粒对细胞进行转染，以获得含有逆转录病毒的上清。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述细胞包括BOSC细胞。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，采用包含有尼罗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε基因的病毒对NIH/3T3细胞进行转染。
6.一种权利要求1中所述杂交瘤细胞株2B2D7分泌的抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体。
7.一种如权利要求6所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
腹水制备：取小鼠，腹腔注射无菌石蜡油；
取权利要求1中所述的杂交瘤细胞株2B2D7进行重悬，然后对小鼠进行腹腔注射；
处死小鼠，采集腹水并离心，分装保存；
对腹水进行纯化，以获得所述抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体。
8.一种如权利要求6所述的单克隆抗体在硬骨鱼适应性免疫应答研究中的应用。
9.一种如权利要求6所述的单克隆抗体在特异性识别硬骨鱼的CD3ε蛋白中的应用。
10.一种如权利要求6所述的单克隆抗体在激活硬骨鱼T淋巴细胞中的应用。
11.一种如权利要求6所述的单克隆抗体在制备鱼病防治试剂/药物中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述鱼病防治试剂/药物包括鱼病防治疫苗。
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