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CN112458189A - 一种用于单增李斯特菌荧光raa检测的引物和探针序列及其应用 - Google Patents

一种用于单增李斯特菌荧光raa检测的引物和探针序列及其应用 Download PDF

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CN112458189A CN202011152224.6A CN202011152224A CN112458189A CN 112458189 A CN112458189 A CN 112458189A CN 202011152224 A CN202011152224 A CN 202011152224A CN 112458189 A CN112458189 A CN 112458189A
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周冬根
罗洁
应清界
俞雪钧
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Ningbo International Travel Health Care Center Ningbo Customs Port Outpatient Department
Original Assignee
Ningbo International Travel Health Care Center Ningbo Customs Port Outpatient Department
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Abstract

本发明提供一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列，根据单增李斯特菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间，可以实现单管现场、快速检测，具有特异性强、灵敏度高以及检测速度快的优势。

Description

一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其 应用
技术领域
本发明属于体外核酸检测领域，尤其是涉及一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用。
背景技术
单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。单增李斯特菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16％，有70％的人可短期带菌，4-8％的水产品、5-10％的奶及其产品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入未充分加热的食品而感染，约占85-90％的病例是由被污染的食品引起的。该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势，单增李斯特菌在食品卫生微生物检验中应引起足够的重视。
目前，单增李斯特菌检测方法包括传统的检测方法、免疫学检测以及分子生物学检测方法等。传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在症状时期检测到细菌的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于单增李斯特菌的检测。目前，国内外已建立的单增李斯特菌检测方法有实时PCR检测方法、半巢式PCR检测方法、LAMP检测方法等，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而LAMP方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用LAMP方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。RAA技术不依赖于PCR仪器的便捷性能，且检测时间较PCR方法或荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至高于，是革命性的技术突破，能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。在RAA反应过程中，单增李斯特菌DNA通过利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以DNA为模板合成目的产物。反应在39℃下进行20分钟。此外，RAA技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套RAA多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的。目前，国内外还没有公开用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其试剂盒的相关内容。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高以及检测速度快的用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列，根据单增李斯特菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，引物序列具体如下：
正向引物为5'-ACCAGCTGTAACTTTTTCGGTTCAAGCTATG-3'；
反向引物为5'-GTGTGGTTAAATCCAATTGCATGATAATCT-3'；
寡核苷酸探针：5'-AAGCCACCCATTATCATTGACCCAGTCACT(FAM-dT)C(THF)AC(BHQ-dT)AAGGATTTCCAACTT-3'；
其中：FAM：6-羧基荧光素；THF：四氢呋喃；BHQ：黑洞淬灭剂；phosph ate：3’进行磷酸化以中止延伸。
上述用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列在制备单增李斯特菌荧光RAA检测试剂盒中的应用。
上述单增李斯特菌荧光RAA检测试剂盒，该试剂盒包括RAA反应体系如下：RAA反应缓冲液25μl；10μM的正向引物2.1μl、10μM的反向引物2.1μl；10μM的探针0.6μl；DNA模板2μl；加15.5μl双蒸水至47.5μl，混合均匀，然后加入到有干粉(含重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP等，RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)货号：F00001,江苏奇天基因科技有限公司)的反应管中，再次混匀，最后各管加入2.5μl 280mM醋酸镁溶液并混匀。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；
2、不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；
3、探针法荧光RAA技术特有的优势，即特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。
综上所述，本发明首次公开了用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用，可以实现单管现场、快速检测，具有特异性强、灵敏度高以及检测速度快的优势。
说明书附图
图1为单增李斯特菌检测标准株。图中阳性扩增曲线分别为检测单增李斯特菌标准株ATCC 13932以及ATCC 19111以及阳性对照，阴性为阴性对照，横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。通过该图可以说明该检测方法能够检测到细菌标准菌株
图2为单增李斯特菌检测方法的特异性实验数据。图中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值，这10种特异性标准菌株均未有扩增曲线，说明该检测方法的特异性良好
具体实施方式
实施例1
针对于单增李斯特菌的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光RAA探针：
正向引物为5'-ACCAGCTGTAACTTTTTCGGTTCAAGCTATG-3'；
反向引物为5'-GTGTGGTTAAATCCAATTGCATGATAATCT-3'；
寡核苷酸探针
5'-AAGCCACCCATTATCATTGACCCAGTCACT(FAM-dT)C(THF)AC(BHQ-dT)AAGGATTTCCAACTT-3'；
其中：FAM：6-羧基荧光素；THF：四氢呋喃；BHQ：黑洞淬灭剂；phosph ate：3’进行磷酸化以中止延伸。
实施例2
一种用于检测单增李斯特菌的荧光RAA方法，包括以下步骤：
1、样本DNA的提取：单增李斯特菌标准菌株及分离菌株在脑心浸出液培养基中扩培18-24小时，加入DNA提取液(cador Pathogen 96 QIAcube HT试剂盒，德国凯杰公司)提取DNA，进行分装备用，冻存于-80℃；
2、以待检测样本DNA为模板，加入RAA反应液、酶混合液等配成RAA反应体系，进行扩增反应，其中反应体系如下：25μl RAA反应缓冲液；正向引物、反向引物(10μM)各2.1μl；0.6μl探针(10μM)；2μlDNA模板；加15.5μl双蒸水至47.5μl，混合均匀，然后加入到有干粉(含重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP等，RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)货号：F00001,江苏奇天基因科技有限公司)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μl 280mM醋酸镁溶液并混匀。将上述反应管放置于相应仪器中，在42℃反应20min。
其中，RAA反应液中含用于检测单增李斯特菌的正向引物为
5'-ACCAGCTGTAACTTTTTCGGTTCAAGCTATG-3'；
反向引物为5'-GTGTGGTTAAATCCAATTGCATGATAATCT-3'；
寡核苷酸探针：5'-AAGCCACCCATTATCATTGACCCAGTCACT(FAM-dT)C(THF)AC(BHQ-dT)AAGGATTTCCAACTT-3'；
其中：FAM：6-羧基荧光素；THF：四氢呋喃；BHQ：黑洞淬灭剂；phosph ate：3’进行磷酸化以中止延伸。
3、实验结束后保存检测数据文件；
4、质量控制
阴性对照：FAM通道无扩增曲线，且无Tt值；阳性对照：FAM通道有扩增曲线，Tt值均≤8min；以上两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验；
5、结果判读
5.1当FAM通道均有扩增曲线，质量控制正常时，可判定单增李斯特菌阳性；
5.2当FAM通道无扩增曲线，且Tt值显示为Undet或No Tt，质量控制正常时，可判定单增李斯特菌阴性；
实施例3
标准株检测实验
该实验验证该检测方法能否检测细菌标准株，采用上述实施例2方法检测经脑心浸出液培养基扩培的处于对数生长期的单增李斯特菌标准株ATCC 13932以及ATCC 19111，浓度约为5×108CFU/ml，实验结果参考图1。
实施例4
特异性实验
利用上述实施例2方法分别对沙门氏菌标准菌株ATCC 14028以及ATCC 35640、金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923以及ATCC 6538、肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC 700603、大肠杆菌标准菌株ATCC 11775、大肠杆菌O157:H7标准菌株NCTC 12900、福氏志贺氏菌标准菌株CMCC 51572以及副溶血弧菌标准菌株20553分别进行荧光反应检测和RAA基础扩增。荧光反应扩增结果表明，只有单增李斯特菌标准菌株检测出相应的特异性扩增曲线，其他细菌未见有相应的扩增，无交叉反应，实验结果参考图2。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波国际旅行卫生保健中心（宁波海关口岸门诊部）
<120> 一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
accagctgta actttttcgg ttcaagctat g 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtgtggttaa atccaattgc atgataatct 30
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aagccaccca ttatcattga cccagtcact amdtcthacb hdtaaggatt tccaactt 58

Claims (4)

1.一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列，其特征在于：根据单增李斯特菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，引物序列具体如下：
正向引物为5'-ACCAGCTGTAACTTTTTCGGTTCAAGCTATG-3'；
反向引物为5'-GTGTGGTTAAATCCAATTGCATGATAATCT-3'；
寡核苷酸探针：5'-AAGCCACCCATTATCATTGACCCAGTCACT/FAM-dT/C/THF/AC/BHQ-dT/AAGGATTTCCAACTT-3'；其中：FAM：6-羧基荧光素；THF：四氢呋喃；BHQ：黑洞淬灭剂；phosphate：3’进行磷酸化以中止延伸。
2.一种根据权利要求1所述的用于单增李斯特菌荧光RAA检测的引物和探针序列在制备单增李斯特菌荧光RAA检测试剂盒中的应用。
3.一种用于单增李斯特菌荧光RAA检测的，其特征在于：包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括有权利要求1所述的引物对和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：RAA反应体系如下：RAA反应缓冲液25μl；10μM的正向引物2.1μl、10μM的反向引物2.1μl；10μM的探针0.6μl；DNA模板2μl；加15.5μl双蒸水至47.5μl，混合均匀，然后加入到有干粉的反应管中，再次混匀，最后各管加入2.5μl280mM醋酸镁溶液并混匀。
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