JP2022144616A

JP2022144616A - ラクトバチラス・ヘルベティカスの検出方法

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Publication number: JP2022144616A
Application number: JP2021045695A
Authority: JP
Inventors: 隆志副島; Takashi Soejima
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2021-03-19
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2022-10-03
Anticipated expiration: 2041-03-19
Also published as: JP7708561B2

Abstract

【課題】試料中のラクトバチラス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｒｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）を特異的に検出し、高精度で定量することができる技術を提供する。
【解決手段】試料中のラクトバチラス・ヘルベティカスを検出及び／又は定量する方法であって、試料中の前記菌のＤＮＡ又はＲＮＡの特定配列における３７位から６２位までを含む領域を増幅することを含み、該特定配列の４８位から５３位までの塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む標識ＤＮＡプローブを用いること、及び前記標識ＤＮＡプローブ中の核酸のうち少なくとも該特定配列の５２位の塩基の位置に相当する核酸を構成する糖が架橋化されていることを特徴とする、方法。本方法は、前記試料が、ラクトバチラス・ガリナラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｒｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）を含む可能性がある場合にも好ましく適用できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料中に含まれるラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｒｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）を検出する方法に関する。

乳酸菌は古くからその発酵が人類に利用されてきたが、近年、死菌体であっても人体に有用な生理活性を示すものがあることが見出されている。特に、ラクトバチルス・ヘルベティカス（以下、「Ｌ．ヘルベティカス」とも記す）は、抗不安・抗ストレス作用、血圧調節作用、疲労回復効果、抗腫瘍効果、免疫賦活効果、学習記憶力向上効果など、多くの生理機能を有することが着目され、機能性食品等に配合させる例がみられている。

細菌を機能性食品や医薬の有効成分として配合するに際し、その菌体量を定量的に測定することは重要であり需要がある。
従来、細菌を検出・定量するために様々な方法が開発され実用化されており、その主要な方法の１つにＰＣＲ法等の核酸増幅法がある。これまでに本発明者は、デジタルＰＣＲ法を用いて死細胞を定量する方法を提案している（特許文献１）。

Ｌ．ヘルベティカスを遺伝子検査により菌種を同定し、また定量する方法としては、ＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃＳｐａｃｅｒ（ＩＳ）領域の配列特異性を利用して、インターカレ
ーター法によりＰＣＲを行う方法が提案されている（非特許文献１～２）。

特開２０１８－６８２１１号公報

J. Stsepetova et al., British Journal of Nutrition, 105, 1235-1244 (2011) B. Bottari et al., International Journal of Food Microbiology 160, 290-297 (2013)

しかしながら、Ｌ．ヘルベティカスはその近縁種であるラクトバチルス・ガリナラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｒｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、以下、「Ｌ．ガリナラム」とも記す
）とそのＩＳ領域の遺伝子配列がほぼ共通する。そのため、前述した方法ではＬ．ヘルベティカスをＬ．ガリナラムと区別して検出し、定量することは困難である。
かかる状況に鑑みて、本発明は試料中のラクトバチラス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｒｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）を特異的に検出し、高精度で定量することがで
きる技術を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、Ｌ．ヘルベティカスとＬ．ガリナラムのＩＳ領域に互いに相違する塩基配列を見出し、かかる配列がＬ．ヘルベティカスを特異的に検出することを可能にするだろうとの着想を得た。しかしながら、かかる塩基配列は１～２塩基というごく小さい相違点であるため、通常のＰＣＲ法では両者を区別して検出することはできなかった。
そこでさらに検討を重ねたところ、特定の塩基配列の位置にLNA（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）を有するＤＮＡプローブを用いて、特定領域の核酸増幅を行うと、
Ｌ．ヘルベティカスを特異的に検出・定量できることに想到し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、試料中のラクトバチラス・ヘルベティカスを検出及び／又は定量する方法であって、試料中の前記菌のＤＮＡ又はＲＮＡの配列番号１の３７位から６２位までを含む領域を増幅することを含み、配列番号１の４８位から５３位までの塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む標識ＤＮＡプローブを用いること、及び前記標識ＤＮＡプローブ中の核酸のうち少なくとも配列番号１の５２位の塩基の位置に相当する核酸を構成する糖が架橋化されていることを特徴とする、方法である。
本発明の好ましい態様では、前記プローブが、配列番号２の１位から１６位までの塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を少なくとも含む。
本発明の好ましい態様では、配列番号３に示す塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列を含むリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことにより前記領域の増幅を行う。

本発明によれば、試料中のＬ．ヘルベティカスを特異的に検出し、高精度で定量することができる。本発明の方法は、Ｌ．ガリナラムが存在下であってもＬ．ヘルベティカスの正確な定量を実現できる。

実施例１：被検試料中のＬ.ヘルベティカスの死菌体の濃度と、ＬＮＡプローブを用いたデジタルＰＣＲ法による測定値との関係を表す標準線。比較例１：被検試料中のＬ.ヘルベティカスの死菌体の濃度と、ＴａｑＭａｎプローブを用いたデジタルＰＣＲ法による測定値との関係を表す標準線。

次に、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。

本発明の方法は、試料中のＬ．ヘルベティカスのＤＮＡ又はＲＮＡの、ＩＳ領域（配列番号１）の特定の塩基配列領域を増幅することを含む。増幅する領域の塩基配列は、配列番号１の３７位から６２位までを含み、好ましくは３２位から６７位を含み、より好ましくは１３位から１９１位を含む。
この領域はＬ．ヘルベティカスに特異的にみられる遺伝子配列であるため、かかる領域の増幅により該菌を検出することができる。

本発明の方法では、配列番号１の４８位から５３位までの塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む標識ＤＮＡプローブを用いる。前記塩基配列は、配列番号２の７～１２位に相当する。
ＤＮＡプローブの長さは、前記塩基配列を含む限りにおいて特に限定されず、好ましくは１５～３５塩基、より好ましくは１６～３０塩基、さらに好ましくは１７～２５塩基である。また、プローブは、前記塩基配列の５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列を有してもよいが、通常は５’側には配列番号１の４７位から５’側の連続する配列を、３’側には配列番号１の５４位から３’側の連続する配列を有する。

配列番号１の４８位から５３位までの塩基配列の領域は、Ｌ．ヘルベティカスのＩＳ領域中の、Ｌ．ガリナルムと相違する塩基を含む領域である。Ｌ．ガリナルムはＬ．ヘルベティカスと遺伝子的にごく近縁にあり、ＩＳ領域もほぼ同じである。そのため、ＤＮＡプ
ローブがその相違する塩基を含むようにして、検出の特異性を高める必要がある。
本発明者は、Ｌ．ヘルベティカスとＬ．ガリナルムとでは、ＩＳ領域において少なくとも配列番号５２位の塩基で相違することを見出した。

そのため、１塩基での相違でもプローブの感度を高めるべく、本発明に用いるＤＮＡプローブは、その中の核酸のうち少なくとも配列番号１の５２位の塩基の位置に相当する核酸を構成する糖は架橋化されているものを用いる。本発明に用いるＤＮＡプローブは、好ましくは配列番号１の５０位から５２位、より好ましくは４９位から５３位、さらに好ましくは４８位から５３位の塩基の位置に相当する核酸を構成する糖が架橋化されているものを用いる。

また、ＤＮＡプローブは、配列番号２の１位から１６位までの塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を少なくとも含むことが好ましい。前記塩基配列は、配列番号１の４２～５７位に相当する。

ここで、架橋化は、拡散を構成する糖（リボース）の２’位と４’位の炭素原子間が架橋された態様（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＬＮＡ）、又はＢｌｉｄｇｅｄ
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＢＮＡ）とも呼ばれる）を指す。具体的な架橋の態様としては、２’４’－ＢＮＡ（ＬＮＡ）、３’－Ａｍｉｎｏ－２’４’－ＢＮＡ等の５員環架橋、２’４’－ＢＮＡ^ＮＣ（Ｍｅ）等の６員環架橋、２’４’－ＢＮＡ^ＣＯＣ等の７員環架橋等が挙げられる。
ＬＮＡ修飾されたＤＮＡプローブは、ターゲット部位と１塩基異なるだけでも相補的な塩基間の相互作用が弱まり、結合しにくくなる。一方で、ターゲット部位と相補的な配列の場合は二本鎖の安定性が上がりＴｍ値が大きくなる。そのため、ターゲット部位の塩基配列とプローブとの相補性の有無で核酸増幅の差が大きくなり、検出の感度が上がる。

ＤＮＡプローブの標識は、特に限定されず、蛍光消光標識、化学発光物質、放射性物質、ビオチン、アルカリホスファターゼ、ジゴキシゲニン、ペルオキシダーゼなどが挙げられるが、蛍光消光標識が、検出・定量の手法が当該技術分野において確立されているため好ましい。
蛍光消光色素としては、特に限定されないが、フルオレセインまたはその誘導体（例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＥＴ等）、ローダミンまたはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、カルボキシローダミン、ｘ－ローダミン、スルホローダミン１０１酸クロリド）、ＢＯＤＩＰＹまたはその誘導体（例えば、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ等）、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（５ＩＡＢｋＦＱ、３ＩＡＢｋＦＱ）等が挙げられる。
また、標識は、通常、ＤＮＡプローブの３’末端及び／又は５’末端に修飾される。
また、標識化のためにリンカーやスペーサーなどが付加されてもよい。

本発明の方法の典型的な実施態様は、（１）試料を提供する工程、（２）試料中の前記菌のＤＮＡ又はＲＮＡの配列番号１の３７位から６２位までを含む領域を増幅する工程、（３）（２）で得られうる増幅産物に配列番号１の４８位から５３位までの塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む標識ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせ、標識を検出することにより該増幅産物量を検出・定量する工程、を含む。

（１）の試料としては、に制限はなく、例えば、食品、生体試料、ワクチン製剤、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等が挙げられる。
特に、機能性食品等の有効成分に含有させたＬ．ヘルベティカスの定量への適用が期待されることから、飲食品を被検試料とすることが好ましい。飲食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、発酵飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用
粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；チョコレート、キャラメル、キャンディ、ケーキ、ビスケット、クッキー等の菓子；殺菌ミルク、加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；経腸栄養食品等の高栄養流動食品、育児用ミルク、スポーツ飲料；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品が挙げられる。

試料は、常法により調製すればよい。例えば、核酸増幅反応に供するに先立ち、ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する処理を行ってもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する方法に特に制限はなく常法により行うことができ、市販のＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。

本発明により検出及び／又は定量されるラクトバチラス・ヘルベティカスは、生菌体及び死菌体を問わない。

本発明の好ましい態様では、試料が、他のラクトバチルス属細菌、例えばラクトバチラス・ガリナラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｒｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス
・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・
プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・
ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウ
ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）を含んでいてもよい。

特に、本発明の方法は、Ｌ．ヘルベティカスをＬ．ガリナラムと区別して検出することができる。言い換えると、本発明の方法は、試料中のＬ．ガリナラムを検出せず、Ｌ．ヘルベティカスを検出する方法である。そのため、試料がラクトバチラス・ガリナラムを含む可能性がある場合に、本発明は好適である。例えば、試料中にＬ．ガリナラムが１０^１０ｃｅｌｌｓ／ｇ以上存在する場合、またはＬ．ガリナラムがＬ．ヘルベティカスの１０^３倍以上存在する場合であっても、Ｌ．ヘルベティカスを特異的に検出できる。
なお、試料がＬ．ガリナラム等の他の細菌を「含む可能性がある」とは、測定前に含む疑いがあるだけで足り、測定した結果としてＬ．ガリナラムを含んでいないことが判明しても本発明の方法の範囲に含まれるものとする。

（２）の核酸増幅としては、ＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法、ＴＭＡ法等が挙げられる。これらの技術は既に当該技術分野において確立されており、目的に合わせて方法を選択することができる。本発明の方法に用いる核酸増幅法はＰＣＲ法、とりわけデジタルＰＣＲ法が好ましいが、これに限定されない。

核酸増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体が挙げられ、任意のものを使用できる。

（２）の核酸増幅及び（３）のＤＮＡプローブのハイブリダイズにおいては、温度、時間、サイクル数、ｐＨ、陽イオン濃度などの条件は、当該技術分野の常識に従って適宜調整すればよい。

（２）の核酸増幅においては、通常前述した標識ＤＮＡプローブの他に核酸増幅に必要な成分を含む試薬を用いる。かかる成分としては、行う核酸増幅反応により異なり、それぞれ公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ反応を用いる場合、標識ＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーセット、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩を少なくとも含むことが好ましい。目的の実験に応じて各成分の濃度は適宜調整すればよい。
これらの必要な成分を混合してあるいは個別に含む試薬を、Ｌ．ヘルベティカスを検出
するためのキットとしてもよい。

プライマーセットは、配列番号１の３７位から６２位までを含む領域を増幅することができるものであれば特に限定されず、任意に設計すればよい。例えば、フォワードプライマーとして配列番号３に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片と、リバースプライマーとして配列番号４に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片を用いることができる。

（３）の検出・定量の態様としては、特に限定されないが、例えばプローブの標識に蛍光標識を用いた場合は、プローブに由来する蛍光シグナルをケミルミフォトメータなどの装置によって検出することにより核酸増幅の有無を判別することができる。そして、蛍光強度を測定することにより、核酸増幅産物を定量し、常法により細菌数に換算することができる。

以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［１］試料の調製
（１）Ｌ．ヘルベティカス死菌懸濁液の調製
Ｌ．ヘルベティカスＭＣＣ－１８４８ NITE BP-01671株の凍結乾燥菌体を０．５％ラ
クトース含有ＭＲＳブロスにて嫌気培養した。培養液１ｍＬを１５ｍＬ試験菅に分注し、オートクレーブ処理（８７℃、１ｍｉｎ）を行い、死菌体を調製した。その後、４５℃まで自然冷却し、さらに水冷で２５℃まで冷却した。その後、冷却遠心処理（６０００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）し、上清を除去後、死菌体ペレットを０．８ｍＬの０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ８０－ＰＢＳに懸濁した。該死菌体を鏡検法にてカウントし、３．１×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＬ．ヘルベティカス死菌死菌体懸濁液を得た。

（２）Ｌ．ガリナラム死菌懸濁液の調製
（１）と同様にして、Ｌ．ガリナラムＡＴＣＣ３３１９９株の凍結乾燥菌体を用いて、１．３×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＬ．ガリナラム死菌体懸濁液を得た。

（３）標準試料の調製
Ｌ．ヘルベティカスフリーかつＬ．ガリナラムフリーの殺菌処理済の脱脂粉乳３ｇを５０ｍＬ滅菌チューブに採取し、２７．０ｍＬの０．１％Ｔｗｅｅｎ８０－ＰＢＳを加えて１０倍希釈した。その１ｍＬを１５ｍＬ滅菌チューブに分取し、９ｍＬの０．１％Ｔｗｅｅｎ８０－ＰＢＳを加えることでさらに１０倍希釈し、最終的に１００倍希釈液を調製し、これをスタンダード用検体マトリックスとした。
次に、（１）で調製したＬ．ヘルベティカス死菌体懸濁液を、前記スタンダード用検体マトリックスで希釈して、１．０８×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ希釈懸濁液を得た。これをスタンダード用検体マトリックスで１００倍希釈し１．０８×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの標準試料（１濃度）を調製した。同様に希釈を行い、Ｌ．ヘルベティカス死菌体の標準試料（５点濃度；０、５．３８×１０^６、１．０８×１０^７、２．１５×１０^７、４．３×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。

（４）Ｌ．ガリナラム死菌体含有試料の調製
（２）で調製したＬ．ガリナラム死菌体懸濁液を、（３）で調製したスタンダード用検体マトリックスにて１５倍希釈し８．６×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＬ．ガリナラム含有脱脂粉乳１００倍希釈液を調製した。
２．実験方法

（５）Ｌ．ヘルベティカス及びＬ．ガリナラムのＤＮＡ抽出
（３）で調製したＬ．ヘルベティカス死菌体の標準試料と、（４）で調製したＬ．ガリナラム含有試料をそれぞれ０．２ｍＬマイクロチューブに採取し、冷却遠心処理（８０００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃）し、上清を除去した。ペレットに市販ジルコニアーズビーズ（φ＝０．５ｍｍを４５０ｍｇ、φ＝３．０ｍｍを４５０ｍｇ)を入れ、ボルテックスの最
大回転数にて延べ２ｍｉｎ撹拌し、各菌体の細胞壁を破砕処理した。その後、ゲノムＤＮＡ抽出キットＱｕｉｃｋＧｅｎｅＳＰｋｉｔＤＮＡｔｉｓｓｕｅＣａｔ. Ｎｏ. Ｓ
Ｐ－ＤＴ（ＫＵＲＡＢＯ製）を用いマニュアルに従い、各菌体のＤＮＡ精製溶液を０．２ｍＬずつ得た。

［２］Ｌ．ヘルベティカスの検出及び定量
（１）実施例１：Ｌ．ヘルベティカスの検出及び定量
以下の手順でデジタルＰＣＲを行い、Ｌ．ヘルベティカスのＩＳ領域の特異塩基配列を増幅した。
［１］（５）で得たＬ．ヘルベティカスのＤＮＡ精製溶液をＴＥバッファーにて６倍希釈した。その２μＬを、表１に示すＰＣＲマスターミックス１８μＬに添加・混合した（１０倍希釈）。該混合液１３．６μＬをデジタルＰＣＲサーマルサイクラー（Applied Biosystems製、Model: ProFlex Dual Flat）用デジタルＰＣＲチップに充填した。

その後、各デジタルＰＣＲチップをデジタルＰＣＲサーマルサイクラー（Applied Biosystems製、Model: ProFlex Dual Flat）にセットし、表２に示すサーマルサイクルを実施した。

デジタルＰＣＲ後に、専用のチップリーダーを用いて緑色蛍光を発するウェル数及びその蛍光強度を計測し、各チップについて増幅産物の測定を行った。その増幅産物の測定結果に基づき、ポアソン分布に従ってデジタルＰＣＲに供した各試料に含まれるＬ．ヘルベティカスのＩＳ領域の特異塩基配列のコピー数を専用のクラウド型解析ソフトを用いて算出した。

（２）実施例２：特異性の確認
Ｌ．ヘルベティカスのＤＮＡ精製溶液に代えて［１］（５）で得たＬ．ガリナラムのＤＮＡ精製溶液を用いた他は、（１）と同様にデジタルＰＣＲを行った。

（３）結果
（１）でＬ．ヘルベティカス死菌体の標準試料から抽出したＤＮＡを鋳型としてデジタルＰＣＲを行ったときの、実施例１の標準曲線を図１にそれぞれ示す。標準試料中のＬ．ヘルベティカス死菌体濃度に正比例してＰＣＲ増幅産物が検出されたことから、本発明の方法により該菌を定量的に検出できることが分かる。
さらに、（２）でＬ．ガリナラム死菌体含有試料から抽出したＤＮＡを鋳型としてデジタルＰＣＲを行ったときの増幅産物量を（１）で得た標準曲線に照らして算出した菌体量の測定値を表３に示す。実施例２ではＬ．ガリナラムは検出されなかった。
一方、比較例１のＴａｑＭａｎプローブを用いた方法でも死菌体濃度に正比例してＰＣ
Ｒ増幅産物が検出されたが（図２）、比較例２でＬ．ガリナラムが検出・定量されたことから、該プローブではＬ．ヘルベティカスの特異的な検出はできないことが分かる。
これらのことから、本発明の方法によりＬ．ヘルベティカスをＬ．ガリナラムと高精度に区別して定量的に検出できることが分かる。

Claims

試料中のラクトバチラス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｒｕｓｈｅｌｖｅｔ
ｉｃｕｓ）を検出及び／又は定量する方法であって、
試料中の前記菌のＤＮＡ又はＲＮＡの配列番号１の３７位から６２位までを含む領域を増幅することを含み、
配列番号１の４８位から５３位までの塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む標識ＤＮＡプローブを用いること、及び
前記標識ＤＮＡプローブ中の核酸のうち少なくとも配列番号１の５２位の塩基の位置に相当する核酸を構成する糖が架橋化されていることを特徴とする、方法。
前記プローブが、配列番号２の１位から１６位までの塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を少なくとも含む、請求項１に記載の方法。
配列番号３に示す塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列を含むリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことにより前記領域の増幅を行う、請求項１又は２に記載の方法。