CN112438160B - 枝瑚菌菌株及其应用以及用于人工培育枝瑚菌的母种培养基及其应用 - Google Patents
枝瑚菌菌株及其应用以及用于人工培育枝瑚菌的母种培养基及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及食用菌技术领域，公开了枝瑚菌菌株及其应用以及用于人工培养枝瑚菌的母种培养基及其应用。该枝瑚菌菌株为枝瑚菌属(Ramaria sp.)的一个菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：17783。该母种培养基含有土豆、菠萝、葡萄糖、氨基酸和维生素B。通过在本发明提供的母种培养基中对枝瑚菌进行母种的培养，相比于传统的PDA培养基，更有利于枝瑚菌的生长，具体体现在生长速度以及菌丝的健壮程度上。相比于其他的枝瑚菌，本发明提供的保藏号为CGMCC NO：17783的枝瑚菌具有更强的生长优势。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌技术领域，具体涉及一株枝瑚菌及其在人工培育枝瑚菌中的应用，以及一种用于人工培育枝瑚菌的母种培养基及其在人工培育枝瑚菌中的应用。
背景技术
野生枝瑚菌(Ramaria sp.)又名扫帚菌，刷把菌，属于非褶菌目，枝瑚菌科，枝瑚菌属，夏秋季节在山区多生于阔叶林或针叶林地上，该科各属含有很多别具风味的食用菌，是我国野生食用菌资源中宝贵的组成部分，据报导，枝瑚菌多糖等活性物质具有抑制肿瘤、抗氧化、清除自由基、免疫调节等功能，该类真菌很有研究价值。
目前，对于枝瑚菌的研究多限于资源调查或者大分子生物活性等方面的研究，未见枝瑚菌菌种配方优化和人工驯化栽培相关报道。本发明的发明人在人工驯化栽培枝瑚菌的过程中，发现枝瑚菌在真菌通用的PDA培养基中菌丝生长速度非常缓慢，且菌丝稀疏不均匀。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一株枝瑚菌菌株，进而提供了一种用于枝瑚菌人工培育的母种培养基，相比于其他的枝瑚菌，本发明提供的枝瑚菌具有更强的生长优势，特别是在本发明提供的母种培养基中。
为了实现上述目的，本发明一方面，提供一种枝瑚菌菌株，该枝瑚菌菌株为枝瑚菌属(Ramaria sp.)的一个菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：17783。
本发明第二方面，提供一种用于人工培育枝瑚菌的母种培养基，该母种培养基含有土豆、菠萝、葡萄糖、氨基酸和维生素B。
本发明第三方面，提供如上所述的母种培养基在人工培育枝瑚菌中的应用。
本发明第四方面，提供如上所述的保藏号为CGMCC NO：17783的枝瑚菌在人工培育枝瑚菌中的应用。
通过在本发明提供的母种培养基中对枝瑚菌进行母种的培养，相比于传统的PDA培养基，更有利于枝瑚菌的生长，具体体现在生长速度以及菌丝的健壮程度上。相比于其他的枝瑚菌，本发明提供的保藏号为CGMCC NO：17783的枝瑚菌具有更强的生长优势。
生物保藏
本发明的菌株被命名为枝瑚菌(Ramaria sp.)，并于2019年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO：17783，简称为菌株野生枝瑚菌1。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。
图1是本发明提供的枝瑚菌CGMCC NO：17783的子实体，图中箭头所示位置为其一级分支；
图2是为实施例1(A)和对比例1(B)培养的枝瑚菌菌丝生长状况；
图3为实施例4培养的枝瑚菌的菌丝生长状况；
图4为实施例7培养的枝瑚菌的菌丝生长状况。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中，未作相反说明的情况下，如本领域所公知的，为了避免杂菌污染，所进行的各种操作均优选在基本上无菌的条件(例如，经紫外杀菌后的环境)下进行，所用的各种工具和材料均为已经消毒过的，例如在110-130℃和0.12-0.18MPa下进行蒸汽灭菌20-80min后的。
一方面，本发明提供一种枝瑚菌菌株，该枝瑚菌菌株为枝瑚菌属(Ramaria sp.)的一个菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：17783。
本发明的枝瑚菌菌株CGMCC NO：17783于2017年9月分离自房山区蒲洼乡东村。
根据本发明，尽管相比于其他的枝瑚菌，本发明提供的枝瑚菌菌株CGMCC NO：17783在常规的食用菌培养基，例如，PDA培养基中进行培养更具有优势，但经过本发明的发明人研究，获得了一种更适用于枝瑚菌菌株CGMCC NO：17783的人工培养枝瑚菌的母种培养基，其含有土豆、菠萝、葡萄糖、氨基酸和维生素B。使用该母种培养基对枝瑚菌进行培养时，枝瑚菌菌丝生长速度更快、菌丝更健壮，气生菌丝更均一，颜色更佳(一般认为黄白色为最佳颜色)，并甚至有菌核出现。当使用该培养基用于所述枝瑚菌菌株CGMCC NO：17783的培养时，相比于其他的枝瑚菌菌株，具有更强的生长优势。
基于如上的发现，第二方面，本发明提供了一种用于人工培育枝瑚菌的母种培养基，该母种培养基含有土豆、菠萝、葡萄糖、氨基酸和维生素B。
公知的，一般食用菌的母种培养基是指菌种的试管斜面培养基，术语“母种”是指直接从子实体组织分离、孢子分离等所得到的菌丝体纯培养物，及其转接的菌种，也称一级种。
尽管将枝瑚菌在如上的母种培养基中进行母种培养，即可提高枝瑚菌的生长速度以及菌丝的健壮程度，改善菌丝颜色，而对于母种培养基中各组分的含量没有特别的限定。但本发明的发明人在研究中进一步发现，当相对于100g的所述土豆，所述菠萝的含量为40-80g，所述葡萄糖的含量为10-30g，所述氨基酸的含量为30-70mg，所述维生素B的含量为5-15mg，优选的，相对于100g的所述土豆，所述菠萝的含量为50-70g，所述葡萄糖的含量为15-25g，所述氨基酸的含量为40-60mg，所述维生素B的含量为8-12mg时，枝瑚菌菌丝生长速度更快、菌丝更健壮、气生菌丝更均匀一致，菌丝颜色更佳。
菠萝(学名：Ananas comosus)，是热带水果之一。福建和台湾地区称之为旺梨或者旺来，新马一带称为黄梨，内地及香港称作菠萝。有70多个品种，岭南四大名果之一。本发明中所述菠萝可以为市售的各种菠萝，对此并没有特别的限制。但本发明的发明人发现，选择合适成熟度的菠萝能够进一步促进枝瑚菌的生长，优选的，所述菠萝的成熟度为7-9，其中，所述成熟度是指根据中国农业标准NY/℃450-2001的成熟度标准来划分的。
根据本发明，所述氨基酸可以为能够用作食用菌培养基的氨基酸，优选的，所述氨基酸为极性氨基酸，更优选为带正电荷的氨基酸，例如，赖氨酸、天冬氨酸和组氨酸，最优选的，所述氨基酸为赖氨酸。本发明的发明人发现，当所述氨基酸为赖氨酸时，更能够促进枝瑚菌的生长。
根据本发明，所述维生素B可以为常规的各种B族维生素，例如，可以为但不限于VB1、VB2、VB12等。但本发明的发明人发现，当所述维生素B为VB1时，更能够促进枝瑚菌的生长。
根据本发明，所述母种培养基还可以含有琼脂，优选的，相对于100g的所述土豆，所述琼脂的含量为10-30g，优选为15-25g。
根据本发明，所述母种培养基还可以含有水，优选的，相对于100g的所述土豆，水的含量为500-1500ml，优选为800-1200ml。
根据本发明一种优选的实施方式，所述母种培养基含有土豆、菠萝、葡萄糖、氨基酸、维生素B、琼脂和水。
根据本发明一种优选的实施方式，所述母种培养基由土豆、菠萝、葡萄糖、氨基酸、维生素B、琼脂和水组成。
根据本发明一种优选的实施方式，所述母种培养基由土豆、成熟度为7-9的菠萝、葡萄糖、赖氨酸、维生素B1、琼脂和水组成。
根据本发明，所述母种培养基的制备方法可以按照PDA培养基的制备方法进行，具体的，选择无发芽、腐烂土豆，洗净去皮，切成正方体(1厘米边长左右)，菠萝洗净去皮，切成正方体(1厘米边长左右)，备用，在不锈钢锅内加水(1200ml)，加热，称取切好的土豆、菠萝加入锅中，煮沸(30min)，用纱布过滤(4层)，将滤液放入不锈钢锅加热；称取葡萄糖、氨基酸、维生素B和琼脂，分别均匀倒入锅内，边倒边搅拌，直至全部融化后停火。选用洁净、完整无损的玻璃试管进行分装(培养基装液量为试管的1/4)，用硅胶塞封口，放置于灭菌锅内进行灭菌，灭菌结束后，让培养基慢慢冷却到70℃左右时再取出摆放斜面，斜面的顶端距硅胶塞40-50mm，待培养基凝固后收起，即为所述培养基，可用于枝瑚菌母种培养。
由如上所述的本发明的母种培养基的制备方法可以看出，所述土豆和菠萝并非是直接将土豆和菠萝粉碎用作制备培养基的原料，而是通过洗切、蒸煮并过滤后得到的滤液。但需要说明的是，本发明的母种培养基中各组分的用量所基于的土豆的含量是指洗切后并蒸煮前的土豆的量，菠萝的含量也是指洗切后并蒸煮前的菠萝的量。
根据本发明，所述枝瑚菌的母种培养基可以用于各种枝瑚菌的母种培养，但本发明的发明人发现，本发明提供的母种培养基更适用于枝瑚菌菌株CGMCC NO：17783的母种培养。
第三方面，本发明提供了如上所述的母种培养基在人工培养枝瑚菌中的应用。
优选的，所述枝瑚菌为保藏号为CGMCC NO：17783的枝瑚菌。
根据本发明一种优选的实施方式，所述母种培养基含有土豆、菠萝、葡萄糖、赖氨酸、维生素B1，相对于100g的所述土豆，所述菠萝的含量为50-70g，所述葡萄糖的含量为15-25g，所述赖氨酸的含量为40-60mg，所述维生素B1的含量为8-12mg。在该优选的实施方式下，枝瑚菌菌丝生长速度、菌丝健壮程度和气生菌丝的均一程度处于最佳状态，颜色黄白色，并有菌核出现。
第四方面，本发明提供了保藏号为CGMCC NO：17783的枝瑚菌在人工培育枝瑚菌中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
本发明的枝瑚菌于2019年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO：17783，简称为野生枝瑚菌1。
制备例1
本制备例用于说明枝瑚菌CGMCC NO：17783菌丝纯培养物的获得
将采集到的保藏编号为CGMCC NO：17783的子实体(如图1所示)，置于超净工作台，吹无菌风30min，操作人员双手用75％酒精消毒、操作工具等进行表面消毒和火焰灭菌，将枝瑚菌CGMCC NO：17783子实体用75％酒精棉球擦拭根部和主分支，进行表面消毒，用手掰下一级分支(如图1中箭头标志部位)，并将掰下来的分枝从基部向顶端用手掰开，使分枝一分两半，注意手不要碰到裸露的菌肉，用消毒好的镊子从一级分支基部夹取长0.3cm，宽0.2-0.3cm的菌肉，放入灭好菌的含有PDA斜面培养基试管内，菌肉组织放置于斜面中间，整个组织分离操作过程在酒精灯火焰20cm范围内完成。将含有组织的试管置于25℃条件下，暗培养，经过20天的培养，获得了野生枝瑚菌菌丝纯培养物。
制备例2
本制备例用于说明参比的菌丝纯培养物的获得
将同时采集的另一株枝瑚菌(参比枝瑚菌)的子实体，置于超净工作台，吹无菌风30min，操作人员双手用75％酒精消毒、操作工具等进行表面消毒和火焰灭菌，将参比枝瑚菌子实体用75％酒精棉球擦拭根部和主分支，进行表面消毒，用手掰下一级分支，并将掰下来的分枝从基部向顶端用手掰开，使分枝一分两半，注意手不要碰到裸露的菌肉，用消毒好的镊子从主枝基部夹取长0.3cm，宽0.2-0.3cm的菌肉，放入灭好菌的含有PDA斜面培养基试管内，菌肉组织放置于斜面中间，整个组织分离操作过程在酒精灯火焰20cm范围内完成。将含有组织的试管置于25℃条件下，暗培养，经过20天的培养，获得了参比野生枝瑚菌菌丝纯培养物。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的母种培养基及其在枝瑚菌母种培养上的应用
选择无发芽、腐烂土豆，洗净去皮，切成1边长厘米左右正方体，8成熟菠萝，洗净去皮，切成1边长厘米左右正方体，备用，在不锈钢锅内加水1200ml，加热，称取切好的土豆100g、菠萝60g加入锅中，煮沸30min，用4层纱布过滤，将滤液体积调至1000ml，放入不锈钢锅加热；称取葡萄糖20g，赖氨酸50mg，维生素B1 10mg，琼脂20g，分别均匀倒入锅内，边倒边搅拌，直至全部融化后停火。选用洁净、完整无损的18*180mm的玻璃试管进行分装，培养基装液量为试管的1/4，用硅胶塞封口，3支一把，用橡皮筋捆好，竖直放置于灭菌锅内进行灭菌，在温度121℃压力0.12MP条件下保持30min，灭菌结束后要自然冷却，待压力降到0MP时，打开放气阀，排出锅内气体，微微打开锅门，让培养基慢慢冷却到70℃左右时再取出摆放斜面，斜面的顶端距硅胶塞40-50mm，得到母种培养基。
待培养基凝固后和制备例1制备的装有野生枝瑚菌菌丝纯培养物的PDA玻璃试管一起放入超净工作台，无菌风吹30min后进行接种操作，双手表面要用75％酒精消毒，接种工具酒精消毒、火焰灭菌，用接种钩去掉枝瑚菌种源试管前端1cm左右培养基，切取大小为3mm*3mm*2mm的接种块，接种至上述试管母种培养基斜面中间位置，注意整个接种操作要在酒精灯火焰10-15cm范围内，将接好种的试管贴上标签，写明品种、名称、接种日期，放置于生化培养箱，调节温度至25℃，进行暗培养。记录菌丝的生长速度，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果如表1和图2(A)所示。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的母种培养基及其在枝瑚菌母种培养上的应用
选择无发芽、腐烂土豆，洗净去皮，切成1边长厘米左右正方体，8成熟菠萝，洗净去皮，切成1边长厘米左右正方体，备用，在不锈钢锅内加水1200ml，加热，称取切好的土豆100g、菠萝50g加入锅中，煮沸30min，用4层纱布过滤，将滤液体积调至1000ml，放入不锈钢锅加热；称取葡萄糖25g，赖氨酸40mg，维生素B1 12mg，琼脂20g，分别均匀倒入锅内，边倒边搅拌，直至全部融化后停火。选用洁净、完整无损的18*180mm的玻璃试管进行分装，培养基装液量为试管的1/4，用硅胶塞封口，3支一把，用橡皮筋捆好，竖直放置于灭菌锅内进行灭菌，在温度121℃压力0.12MP条件下保持30min，灭菌结束后要自然冷却，待压力降到0MP时，打开放气阀，排出锅内气体，微微打开锅门，让培养基慢慢冷却到70℃左右时再取出摆放斜面，斜面的顶端距硅胶塞40-50mm，得到母种培养基。
待培养基凝固后和制备例1制备的装有野生枝瑚菌菌丝纯培养物的PDA玻璃试管一起放入超净工作台，无菌风吹30min后进行接种操作，双手表面要用75％酒精消毒，接种工具酒精消毒、火焰灭菌，用接种钩去掉枝瑚菌种源试管前端1cm左右培养基，切取大小为3mm*3mm*2mm的接种块，接种至上述试管母种培养基斜面中间位置，注意整个接种操作要在酒精灯火焰10-15cm范围内，将接好种的试管贴上标签，写明品种、名称、接种日期，放置于生化培养箱，调节温度至25℃，进行暗培养。记录菌丝的生长速度，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果如表1所示，图未示出。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的母种培养基及其在枝瑚菌母种培养上的应用
选择无发芽、腐烂土豆，洗净去皮，切成1边长厘米左右正方体，8成熟菠萝，洗净去皮，切成1边长厘米左右正方体，备用，在不锈钢锅内加水1200ml，加热，称取切好的土豆100g、菠萝70g加入锅中，煮沸30min，用4层纱布过滤，将滤液体积调至1000ml，放入不锈钢锅加热；称取葡萄糖15g，赖氨酸60mg，维生素B1 8mg，琼脂20g，分别均匀倒入锅内，边倒边搅拌，直至全部融化后停火。选用洁净、完整无损的18*180mm的玻璃试管进行分装，培养基装液量为试管的1/4，用硅胶塞封口，3支一把，用橡皮筋捆好，竖直放置于灭菌锅内进行灭菌，在温度121℃压力0.12MP条件下保持30min，灭菌结束后要自然冷却，待压力降到0MP时，打开放气阀，排出锅内气体，微微打开锅门，让培养基慢慢冷却到70℃左右时再取出摆放斜面，斜面的顶端距硅胶塞40-50mm，得到母种培养基。
待培养基凝固后和制备例1制备的装有野生枝瑚菌菌丝纯培养物的PDA玻璃试管一起放入超净工作台，无菌风吹30min后进行接种操作，双手表面要用75％酒精消毒，接种工具酒精消毒、火焰灭菌，用接种钩去掉枝瑚菌种源试管前端1cm左右培养基，切取大小为3mm*3mm*2mm的接种块，接种至上述试管母种培养基斜面中间位置，注意整个接种操作要在酒精灯火焰10-15cm范围内，将接好种的试管贴上标签，写明品种、名称、接种日期，放置于生化培养箱，调节温度至25℃，进行暗培养。记录菌丝的生长速度，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果如表1所示，图未示出。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的母种培养基及其在枝瑚菌母种培养上的应用
按照实施例1的方法进行枝瑚菌CGMCC NO：17783的培养，不同的是，将菠萝的成熟度替换为5。记录菌丝的生长速度，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果如表1和图3所示。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的母种培养基及其在枝瑚菌母种培养上的应用
按照实施例1的方法进行枝瑚菌CGMCC NO：17783的培养，不同的是，将赖氨酸替换为等量的天冬氨酸。记录菌丝的生长速度，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果如表1所示，图未示出。
实施例6
本实施例用于说明本发明提供的母种培养基及其在枝瑚菌母种培养上的应用
按照实施例1的方法进行枝瑚菌CGMCC NO：17783的培养，不同的是，将VB1替换为等量的VB12。记录菌丝的生长速度，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果如表1所示，图未示出。
实施例7
本实施例用于说明本发明提供的母种培养基及其在枝瑚菌母种培养上的应用
按照实施例1的方法进行枝瑚菌的培养，不同的是，将枝瑚菌CGMCC NO：17783替换为制备例2制备的参比枝瑚菌。记录菌丝的生长速度，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果如表1和图4所示。
实施例8
本实施例用于说明参比的母种培养基及其在枝瑚菌母种培养上的应用
按照实施例1的方法进行枝瑚菌CGMCC NO：17783的培养，不同的是，将本发明提供的母种培养基替换为PDA培养基。记录菌丝的生长速度，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果如表1所示。
对比例1
本对比例用于说明参比的母种培养基及其在枝瑚菌母种培养上的应用
按照实施例8的方法进行枝瑚菌的培养，不同的是，将枝瑚菌CGMCC NO：17783替换为制备例2制备的参比枝瑚菌。记录菌丝的生长速度，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果如表1和图2(B)所示。记录菌丝长满试管的时间，菌丝健壮程度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性，以及是否有菌核出现，结果见表1。
表1
注：菌丝健壮程度列和气生菌丝通过肉眼观察，并粗略估算健壮菌丝或均一菌丝占总菌丝的百分比；
菌核的有无可通过光学显微镜进行观察；
菌丝生长速度：菌丝长满试管培养基表面时结束培养，并计算平均生长速度作为菌丝生长速度。
由以上实施例可看成，相比于其他的枝瑚菌，本发明提供的枝瑚菌CGMCC NO：17783无论是在PDA培养基上还是本发明提供的母种培养基上均具有一定的生长优势。特别是在本发明提供的母种培养基上，菌丝生长速度，气生菌丝颜色，气生菌丝均一性能够有较大的改善，特别是当本发明提供的培养基选择特定组分的情况下，能够得到进一步改善，且有菌核出现。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种母种培养基在人工培养枝瑚菌中的应用，其特征在于，所述母种培养基含有土豆、菠萝、葡萄糖、氨基酸和维生素B；其中，相对于100g的所述土豆，所述菠萝的含量为40-80g，所述葡萄糖的含量为10-30g，所述氨基酸的含量为30-70mg，所述维生素B的含量为5-15mg；枝瑚菌菌株为枝瑚菌属(Ramaria sp.)的一个菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：17783。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，相对于100g的所述土豆，所述菠萝的含量为50-70g，所述葡萄糖的含量为15-25g，所述氨基酸的含量为40-60mg，所述维生素B的含量为8-12mg。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述菠萝为根据中国农业标准NY/℃450-2001的成熟度标准的程度为7-9的菠萝。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述氨基酸为极性氨基酸。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述维生素B选自维生素B1、维生素B2和维生素B12中的一种或多种。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述母种培养基还含有琼脂和水。
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